CN115038794A - 在基于分区的测定中使用固定生物样品的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于在基于分区的测定中使用固定生物样品的组合物和方法。在至少一个实施例中，本公开提供了包含固定生物样品和包含在分区，如离散液滴中的解固剂的组合物。在一些实施例中，本公开提供能够催化切割固定生物样品中的交联体，特别是交联的核酸(如RNA)的解固剂化合物。

Description

在基于分区的测定中使用固定生物样品的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本发明要求于2019年12月23日提交的美国临时申请第62/952,670号和于2020年5月18日提交的美国临时申请第63/026,500号的优先权，其中的每一个以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开一般涉及包含固定生物样品和包含在分区中的解固剂的组合物和方法。
背景技术
包含多种生物分子的生物样品可以被处理用于各种目的，如检测疾病(例如癌症)或基因分型(例如物种鉴定)。已经开发了微流体技术用于将单独的生物样品(例如细胞)分隔成离散分区(例如，孔或液滴)。每个离散分区可以与其它分区隔离(例如，在液滴的情况下是流体隔离的)，使得能够精确控制分区中的相应环境，从而允许单独处理分区中的每个生物样品。离散分区中的生物样品可以被条形码编码并经受化学或物理过程，如加热、冷却或者化学反应。这允许每个离散分区包含其自身的可被定性或定量处理的单独测定。
生物样品不稳定。当生物样品从其存活的小生境中取出时，立即开始物理分解。分解程度由许多因素决定，包括时间、溶液缓冲条件、温度、来源(例如某些组织和细胞具有更高水平的内源性RNase活性)、生物应激(例如酶促组织解离可以激活应激反应基因)和物理操作(例如移液、离心)。降解包括重要的核酸分子(例如，RNA)、蛋白质，以及分子复合物的高阶3D结构、完整细胞、组织、器官和生物体。生物样品的不稳定性是它们与基于分区的测定(例如，基于液滴或基于孔的单细胞测定)一起使用的重要障碍。样品降解极大地限制了用宽范围的可用生物样品准确且可再现地使用此类测定的能力。
可以通过使用标准生物保存方法保存或固定样品来减轻生物样品不稳定性的问题，如低温保存、脱水(例如，在甲醇中)、高盐储存(例如，使用RNAssist或RNAlater)和/或产生共价交联的化学固定剂(例如，多聚甲醛或DSP)。在测定，特别是单细胞测定中使用这种固定生物样品的能力要求固定生物样品可以快速和有效地解固，使得可以在样品降解发生之前进行相关的测定。
发明内容
本公开提供了允许在单细胞测定(如基于分区的基因表达谱测定)中使用固定生物样品的组合物和方法。
在至少一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含固定生物样品和在离散分区(例如，在孔中、在液滴中，或封装在离散液滴中)提供的解固剂。
在至少一个实施例中，本公开提供了一种用于制备生物样品的方法，该方法包含：生成包含或封装固定生物样品和解固剂的离散分区(例如，孔或液滴)。在至少一个实施例中，该方法进一步包含在生成离散分区之前固定生物样品。在至少一个实施例中，当生物样品被固定时，在生成离散分区之前的时间量为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少1周、至少1个月、至少6个月，或更长。在至少一个实施例中，该方法进一步包含加热离散分区。
在至少一个实施例中，本公开提供了一种测定方法，其包含：(a)生成包含或封装固定生物样品、解固剂和测定试剂的离散分区(例如，孔或液滴)；和(b)检测来自测定试剂和解固生物样品的反应的分析物。在至少一个实施例中，该方法进一步包含在生成离散分区之前固定生物样品。在至少一个实施例中，当生物样品被固定时，在生成离散分区之前的时间量为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少1周、至少1个月、至少6个月，或更长。在至少一个实施例中，该方法进一步包含加热离散分区。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。在至少一个实施例中，固定生物样品是单细胞。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，固定生物样品已经用固定试剂固定，其中固定试剂是多聚甲醛(“PFA”)；任选地，其中固定剂是浓度为1％至4％PFA的PFA溶液。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，分区(例如，孔或液滴)进一步包含珠粒。在至少一个实施例中，珠粒包含或携带解固剂。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，离散分区(例如，孔或液滴)进一步包含测定试剂；任选地，其中测定试剂包含在珠粒中。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，离散分区(例如，孔或液滴)还任选地包含条形码，其中条形码作为支持物(例如，珠粒)的一部分被包含。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，解固剂能够通过用醛(例如，多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而去除在生物分子中形成的交联；任选地，通过用浓度为1％至4％PFA的多聚甲醛(“PFA”)溶液固定而在生物分子中形成交联。
在本公开的组合物和方法的至少一个实施例中，解固剂包含选自化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)或其组合的化合物，该化合物由本文别处公开的结构表示。在至少一个实施例中，组合物中解固剂化合物的浓度为约1mM至约500mM、约50mM至约300mM、或约50mM至约200mM；任选地，其中该浓度为约25mM至约200mM。
在至少一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含选自化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)及其组合的化合物：
Figure BDA0003777519330000031
在至少一个实施例中，本公开提供了包含固定生物样品和由结构(8)、(9)或(10)表示的化合物的组合物。
在包含化合物(8)、(9)或(10)的组合物的至少一个实施例中，固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。在至少一个实施例中，组合物提供在或封装在离散分区(例如，孔或液滴)中。在至少一个实施例中，离散分区进一步包含珠粒；任选地，其中珠粒包含或携带化合物(8)、(9)或(10)。
在至少一个实施例中，本公开提供了试剂盒，其包含：测定试剂；和解固剂组合物，其中组合物包含由结构(8)、(9)或(10)表示的化合物。
在试剂盒的至少一个实施例中，解固剂组合物包含在珠粒中。在至少一个实施例中，测定试剂包含在珠粒中；其中测定试剂包含条形码。在至少一个实施例中，试剂盒进一步包含固定试剂；任选地，其中固定试剂是多聚甲醛；任选地，其中固定试剂是1％至4％PFA的PFA溶液。
在至少一个实施例中，本公开提供了一种测定方法，其包含：(a)将固定细胞与包含解固剂和酶(例如蛋白酶)的解固溶液一起温育，从而生成解固细胞；(b)从解固溶液中分离解固细胞；(c)将解固细胞与测定试剂组合；以及检测来自测定试剂的反应的分析物。
在测定方法的至少一个实施例中，固定细胞已经用多聚甲醛(“PFA”)固定；任选地，用浓度为1％至4％的PFA固定。在至少一个实施例中，在温育之前细胞已被固定的时间量为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少3天、至少1周、至少1个月、至少6个月，或更长。
在测定方法的至少一个实施例中，解固剂为组合物，其包含选自化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)或其组合的化合物。在至少一个实施例中，酶是蛋白酶，如内肽酶、外肽酶或蛋白酶。在另一个实施例中，蛋白酶是冷活性的。在一个实施例中，冷活性蛋白酶在约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃具有活性。在另一个实施例中，冷活性蛋白酶在约5℃和约45℃之间，在约10℃和约40℃之间，在约15℃和约35℃之间，或在约20℃和约30℃之间具有活性。在至少一个实施例中，该蛋白酶在约50℃与约60℃之间的温度下具有最大活性。
在另一个实施例中，该蛋白酶是不耐热的并且在约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃或更高的温度下是无活性的。在另一个实施例中，蛋白酶在特定温度，例如在约50℃下在一段时间内灭活约10分钟(或更长)，或在特定温度，例如在约50℃、约55℃、约60℃或约65℃下在一段时间内灭活，例如在约50℃下约10分钟。在另一个实施例中，蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K、ArcticZymes蛋白酶、不耐热蛋白酶K(新英格兰生物实验室)及其任何组合。在美国临时申请第63/008,591号中进一步描述了使用冷活性蛋白酶制备生物样品的方案，该临时申请以全文引用的方式并入本文。在至少一个实施例中，组合物中解固剂化合物的浓度为约1mM至约500mM、约50mM至约300mM、或约50mM至约200mM；任选地，其中该浓度为约25mM至约200mM。
在测定方法的至少一个实施例中，将固定细胞与解固溶液在约50℃至60℃的温度下温育30至60分钟；任选地，其中在53℃下温育至少45分钟。
在测定方法的至少一个实施例中，将固定细胞与解固溶液在约15℃至60℃的温度下温育30至120分钟；任选地，其中在25℃下温育至少90分钟。
在测定方法的至少一个实施例中，该方法进一步包含与蛋白酶抑制剂在约60℃至约70℃的温度下温育约10至约20分钟；任选地，其中蛋白酶抑制剂是浓度为约1mM的PMSF。
在测定方法的至少一个实施例中，从解固溶液中分离解固细胞包含使溶液离心以提供解固细胞的沉淀。在至少一个实施例中，分离进一步包含将解固细胞的沉淀再悬浮于溶液中。
在测定方法的至少一个实施例中，测定试剂包含逆转录酶；任选地，其中测定试剂进一步包含用于cDNA合成的试剂。
在测定方法的至少一个实施例中，将解固细胞与测定试剂组合进一步包含生成包含或封装解固细胞和测定试剂的离散分区(例如，孔或液滴)；任选地，其中离散分区(例如，孔或液滴)进一步包含条形码，由此解固细胞的RNA被条形码标记。
附图说明
通过参考以下阐述说明性实施例(在说明性实施例中利用本公开的原理)的详细描述和附图(本文也称为“图”和“图”)，将获得对本公开的新颖特征和优点的更好理解，其中：
图1示出了用于将单独的生物颗粒分隔的微流体通道结构的实例。
图2示出了用于将携带条形码的珠粒递送至液滴的微流体通道结构的实例。
图3示出了用于将生物颗粒和试剂共分隔的微流体通道结构的实例。
图4示出了用于将珠粒受控分隔成离散液滴的微流体通道结构的实例。
图5示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。
图6示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。
图7描绘了如实例1中所述的用化合物(1)、(4)、(8)和(11)的解固剂处理的固定的PBMC样品相对于未处理样品的转录组映射的结果图。
图8描绘了如实例1中所述的由用化合物(1)、(4)和(8)的解固剂处理的转录组映射样品得到的相对转录组文库复杂度的图。
图9描绘了从用化合物(8)的解固剂处理的固定PBMC观察到的转录组映射图谱和从新鲜PBMC观察到的图谱的相关性图。R2＝0.882。
图10描绘了从未用解固剂处理的固定PBMC观察到的转录组映射图谱和从新鲜PBMC观察到的图谱的相关性图。R2＝0.658。
图11A、图11B和图11C描绘了来自单细胞3'-RT反应的cDNA电泳图谱图。图11A示出了用单细胞3'-RT试剂混合物分隔的新鲜细胞的图；图11B示出了用单细胞3'-RT试剂混合物和蛋白酶PK分隔的新鲜细胞的图；图11C示出了PFA固定细胞的图，PFA固定细胞在用单细胞3'-RT试剂混合物分隔之前，已经使用化合物(8)和PK进行大量解固处理，随后进行沉淀和洗涤。
图12A、图12B和图12C描绘了来自单细胞3'-RT反应的cDNA电泳图谱图。图12A：新鲜PBMC；图12B：4％PFA固定的仅用ArcticZymes蛋白酶处理的PBMC；图12C：用ArcticZymes蛋白酶和化合物(8)的解固剂处理的4％PFA固定的PBMC，如实例8所述。
图13描绘了与PFA固定细胞相比，在新鲜细胞中发现的不同PBMC细胞类型的细胞计数的图，PFA固定细胞经受如实例8中所述的用ArcticZymes蛋白酶和化合物(8)的解固剂的解固处理。
图14描述了与PFA固定的肾组织中发现的细胞类型相比，在新鲜肾组织中发现的不同细胞类型的细胞计数的图，PFA固定的肾组织经受如实例9中所述的用ArcticZymes蛋白酶和化合物(8)的解固剂的解固处理。
图15示出了示范性携带条形码的珠粒。
图16示出了另一示范性携带条形码的珠粒。
图17示出了示范性微孔阵列示意图。
图18示出了用于处理核酸分子的示范性微孔阵列工作流程。
图19示意性地绘示了标记剂的实例。
图20描绘了携带条形码的珠粒的实例。
图21A、图21B和图21C示意性地描绘了用于处理核酸分子的实例工作流程。
图22示出了以样品间基因表达计数的皮尔逊相关性(R2)计算的基因表达相关性。
图23示出了通过基因表达谱测定的PBMC细胞类型计数(固定和新鲜细胞)。图中单核细胞+CD14的1、2、3编号指示不同实验条件且相同编号方案用于相同图中的其它细胞类型。
具体实施方式
对于在本文和所附权利要求书中的描述，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多于一种蛋白质，并且提及“一种化合物”是指多于一种化合物。还应当注意，权利要求可以起草为排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在用作结合权利要求要素的叙述使用如“单独地”，“仅”等排他性术语或使用“负面”限制的先行基础。“包含(comprise/comprises/comprising)”、“包括(include/includes/including)”可互换使用并且并不意图是限制性的。还应当理解，在各种实施例的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，可以使用语言“基本上由…组成”或“由…组成”来可替代地描述实施例。
在提供值的范围的情况下，除非上下文另外明确规定，否则应理解，除非上下文另外明确规定，否则在那个范围的上限与下限之间的值的每个***整数和值的每个***整数的每十分之一以及那个范围中的任何其它所述或***值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于较小范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所述范围包括这些界限值中的一者或两者的情况下，排除所包括的界限值中的任(i)一者或(ii)两者的范围也包括于本发明中。例如，“1到50”包括“2到25”、“5到20”、“25到50”、“1到10”等。
通常，本文使用的命名法和本文描述的技术和程序包括本领域普通技术人员熟知和常用的那些，如常用技术和方法论描述于例如Green和Sambrook，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第四版)，1至3卷，冷泉港实验室，纽约冷泉港，2012(以下简称“Sambrook”)；和《分子生物学中的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》，F.M.Ausubel等人,编辑，最初由格林出版协会有限公司(GreenePublishing Associates,Inc.)和约翰威立父子出版有限公司(John Wiley&Sons,Inc.)以书的形式于1987年出版，并在2011年定期补充，并且现在可在期刊上获得在线格式为《分子 生物学中的当前方案》，00至130卷，(1987－2020)，由约翰威立父子出版有限公司在威立在线图书馆(以下简称“Ausubel”)中出版。
本公开中所参考的所有出版物、专利、专利申请和其它文献都以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的，其引用的程度就如同个别地指示将各个别出版物、专利、专利申请或其它文献以引用的方式并入以用于所有目的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而不旨在限制。出于解释本公开的目的，术语的以下描述将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，并且反之亦然。
A.使用固定试剂使生物样品稳定
用于保持生物样品完整性和限制分解的主要方法包括低温保存、脱水(例如，甲醇)、高盐储存(例如，使用RNAssist或RNAlater)，和用化学固定剂处理，化学固定剂通常在样品的生物分子中产生共价交联(例如，多聚甲醛)。这些用于使生物样品稳定的技术可以单独或组合使用，并且各自可以使用各种解固处理在不同程度上反转。
本文认识到需要用于分析来自固定生物样品(例如单独的细胞、细胞群体、组织样品和其它种类的生物样品)的多种细胞分析物(例如基因组、表观基因组、转录组、代谢物组和/或蛋白质组信息)的方法、组合物、试剂盒和***。然而，在基于分区的测定(例如，单细胞测定)中使用固定生物样品的能力需要快速且有效地使样品解固，以在降解发生之前获得用于处理的相关细胞分析物的通路。理想地，从解固生物样品获得的测定数据应与从新鲜样品获得的测定数据相同，或尽可能接近地类似于从其天然环境获得的样品。
本发明提供了用于处理固定生物样品以处理细胞分析物的方法、组合物、试剂盒和***。适用于本发明的细胞分析物包括但不限于细胞内和部分细胞内分析物。细胞分析物可以是蛋白质、代谢物、代谢副产物、抗体或抗体片段、酶、抗原、碳水化合物、脂质、大分子或其组合(例如蛋白聚糖)或其它生物分子。细胞分析物可以是核酸分子。细胞分析物可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。DNA分子可以是基因组DNA分子。细胞分析物可以包含编码或非编码RNA。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或者长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和rDNA衍生的小RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。
在一些情况下，细胞分析物与中间实体相结合，其中分析中间实体以提供关于细胞分析物和/或中间实体本身的信息。例如，中间实体(例如，抗体)可结合至部分细胞内分析物(例如，细胞表面受体)，其中处理中间实体以提供关于中间实体、部分细胞内分析物或两者的信息。在一个实施例中，该中间实体包含标识符(例如，条形码分子)，该标识符可以用于生成如本文进一步描述的条形码分子(例如，基于液滴的条形码编码)。
如本文所用，术语“分区”通常是指可适于容纳一种或多种物质或进行一种或多种反应的空间或体积。分区可以是物理隔室，例如液滴或孔(例如微孔)。分区可将空间或体积与另一空间或体积隔离。液滴可以是在与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，如例如水相中的胶囊或脂质体。分区可以包含一个或多个其它(内部)分区。在一些情况下，分区可以是可由跨多个和/或远程物理隔室的索引(例如，索引库)定义和标识的虚拟隔室。例如，物理隔室可包含多个虚拟隔室。
基于液滴的测定通常涉及分离的和在乳液中以离散液滴的形式分隔为单细胞的生物样品。离散液滴通常还包括样品的唯一标识符，其形式为也包含在离散液滴中的唯一寡核苷酸序列。离散液滴还可以包含用于从样品生成可检测的分析物(例如，3'cDNA序列)并提供关于其的有用信息(例如，RNA转录谱)的测定试剂。本文别处提供了用于进行基于液滴的测定的方法和组合物的进一步细节。
含有可用于基于分区的测定的生物样品的分区的制备涉及通常花费数小时至数天的许多步骤(例如，样品运输、组织解离、液相洗涤和转移、文库制备)。在该制备时间期间，解固生物样品将开始降解和分解，导致样品质量的显著损失并潜在地导致不反映样品的天然状态的测定结果。
本公开提供用于制备固定生物样品的组合物和方法，固定生物样品从生物收集点保持其完整性，但固定生物样品能够用解固剂提供或封装(例如，在离散液滴或离散孔中)，经历解固以生成能够经历基于分区的测定的分隔的(例如，封装的)解固生物样品。
如本文别处更详细提供的，在至少一个实施例中，组合物包含在离散分区中的固定生物样品和解固剂，例如提供在或封装在离散液滴中。在至少一个实施例中，制备这种组合物的方法包含：提供包含固定生物样品和解固剂的离散分区(例如，孔或液滴)(例如，生成包含或封装固定生物样品和解固剂的离散液滴)；任选地，其中该方法包含在分隔成离散分区(例如，生成离散液滴)之前固定生物样品。在另一个实施例中，本公开提供了一种测定方法，其中该方法包含(a)提供包含固定生物样品、解固剂和测定试剂的离散分区(例如，生成包含或封装固定生物样品、解固剂和测定试剂的离散液滴)；和(b)检测来自测定试剂和解固生物样品的反应的分析物。
如本文所公开的这些组合物和方法允许使用源自已经用多聚甲醛固定的组织样品、活检样品或血液样品的固定生物样品，并且可以包含单细胞的固定生物样品。本文公开的固定剂的稳定效果和解固剂的效率允许在提供离散分区(例如，生成离散液滴)之前样品固定的时间量为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少1周、至少1个月、至少6个月，或更长。
如上所述，本公开的组合物和方法可允许在基于单细胞分区的测定(例如，基于液滴或基于孔的测定)中使用宽范围的先前固定生物样品。如本文所用的术语“生物样品”是指包括生物分子，如核酸、蛋白质、碳水化合物和/或脂质的生物来源的任何样品。用于本公开的方法和组合物中的生物样品包括血液和其它生物来源的液体样品、固体组织样品，如组织样品(即，组织样本)、活检(即，活检样本)，或组织培养物或者由其衍生的细胞及其后代。这包括在从生物来源分离后已经以任何方式操作的样品，如通过用试剂(例如固定试剂，从而生成固定生物样品)处理；样品，如包埋在培养基(如石蜡)中的组织；切片的组织样品(例如，安装在固体基质如载玻片上的切片样品)；进行洗涤；或富集某些细胞群体，如癌细胞、神经元、干细胞等。该术语还涵盖已经富集了特定类型的分子(例如核酸、多肽等)的样品。“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样品(即，组织样本)、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样品”还包括从患者的癌细胞获得的样品，例如，从患者的癌细胞获得的包含多核苷酸和/或多肽的样品(例如，包含多核苷酸和/或多肽的细胞裂解物或其它细胞提取物)；和具有来自患者的细胞(例如，癌细胞)的样品。
经考虑用于本公开的组合物和方法中的生物样品可从另一样品衍生。生物样品可包括组织样品，如活检、核心活检、针吸出物或细针吸出物。生物样品还包括生物流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品，或者生物样品可以是皮肤样品、面颊拭子。生物样品可以是血浆或血清样品。生物样品可包括细胞或为无细胞样品。无细胞样品可以包括胞外多核苷酸。胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，所述身体样品可以选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜***物、痰、粪便和眼泪。
在基于分区的测定***(例如，基于液滴或基于孔的测定***)中使用固定生物样品的能力是本公开的组合物和方法的特征。如本文所用的关于生物样品的术语“固定”是指被保存免于衰变和/或降解的状态。“固定”是指产生固定的样品的过程，并且可以包括使生物样品内的生物分子与固定剂(或固定试剂)接触一段时间，由此固定剂导致共价键相互作用，如样品中生物分子之间的交联。“固定生物样品”是指已经与固定试剂或固定剂接触的生物样品。例如，甲醛固定生物样品已经与固定试剂甲醛接触。“固定细胞”或“固定组织”是指在足以允许或导致在生物样品中的生物分子之间形成分子内和分子间共价交联的条件下与固定剂接触的细胞或组织。
本文中，“解固”是指细胞、多个细胞、组织样品或任何其它生物样品的处理状态，其特征在于先前的固定状态，随后是先前固定状态的逆转。例如，解固细胞也可称为“先前固定”细胞。在一个实施例中，解固细胞的特征在于细胞或样品的生物分子中断裂或逆转的共价键，其中此类共价键先前通过用固定剂(例如多聚甲醛或PFA)处理而形成。
在一个实施例中，本文所述的方法、组合物、***和试剂盒提供解固细胞(例如，来自先前固定细胞)，其在用解固剂处理后(i)保持完整和/或(ii)保留细胞分析物。在另一个实施例中，完整的解固细胞保留足够量的细胞分析物，例如核酸分析物，用于下游处理，例如基于分区的条形码编码。在其它实施例中，本文所述的组合物、***和试剂盒允许制备多个解固细胞，其中来自所述多个解固细胞的解固细胞保留多种细胞分析物，例如核酸分析物。在另一个实施例中，解固细胞可以被进一步处理，例如，通过基于分区的条形码编码方法，以提供包含对应于来自所述解固细胞的所述多种细胞分析物的细胞分析物的序列的条形码编码的核酸分子。
一方面，本发明提供分析固定细胞的方法。在一个实施例中，该方法包含提供多个固定细胞，其中所述多个固定细胞中的固定细胞包含多个交联核酸分子。在另一个实施例中，该方法进一步包含用解固剂使所述固定细胞解固，以提供包含来自所述多个交联核酸分子的多个未交联核酸分子的解固细胞。在其它实施例中，所述多个交联核酸分子包含交联核糖核酸(RNA)分子和/或所述多个未交联核酸分子包含未交联核糖核酸(RNA)分子。
在一个另外的实施例中，该方法进一步包含从所述多个未交联核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个条形码编码的核酸分子。在另一个实施例中，在多个分区中执行生成。在另一个实施例中，多个分区是多个液滴或多个孔。在另一个实施例中，所述多个条形码编码的核酸分子中的条形码编码的核酸分子包含i)对应于所述多个所述未交联核酸分子中的未交联核酸分子或其互补序列的序列，和ii)条形码序列或其互补序列。在一个实施例中，所述对应于未交联核酸分子的序列是对应于未交联RNA分子的序列。在其它实施例中，条形码序列是分区特异性条形码序列。在另一个实施例中，所述多个分区的分区包含所述解固细胞和包含所述多个核酸条形码分子的支持物。在其它实施例中，支持物是珠粒(例如凝胶珠粒)。
在其它实施例中，所述多个固定细胞是多个多聚甲醛固定细胞，所述解固剂能够通过用醛、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而去除在生物分子中形成的交联，和/或所述解固剂能够通过用多聚甲醛固定而去除在生物分子中形成的交联。
在另一个实施例中，如本文进一步所述，所述解固剂包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。在其它实施例中，所述解固剂包含多于一种组分并且作为单独组合物中的单独组分或作为一种组合物的一部分提供。在一个另外的实施例中，所述解固剂进一步包含蛋白酶，其可任选地为不耐热的和/或冷活性的蛋白酶。
在另外的实施例中，所述固定细胞包含标记剂。在另一个实施例中，所述标记剂选自由以下组成的组：蛋白质、肽、抗体、亲脂性部分、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞接合物、T细胞受体接合物、B细胞受体接合物、前体、适体、单体、亲和体、darpin、蛋白质支架及其任何组合。在其它实施例中，标记剂包含报道寡核苷酸。在一个实施例中，报道寡核苷酸包含识别标记剂的报道序列。在其它实施例中，该方法进一步包含从所述报道寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子生成另外的条形码编码的核酸分子，其中所述多个条形码编码的核酸分子中的所述另外的条形码编码的核酸分子包含i)所述报道序列或其互补序列，和ii)所述条形码序列或其互补序列。
生物样品与固定剂接触以提供固定生物样品的时间量取决于温度、样品的性质和使用的固定剂。例如，生物样品可以与固定试剂接触72小时或更少(例如48小时或更少、24小时或更少、18小时或更少、12小时或更少、8小时或更少、6小时或更少、4小时或更少、2小时或更少、60分钟或更少、45分钟或更少、30分钟或更少、25分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少，或2分钟或更少)。
通常，生物样品(例如，细胞)与固定试剂(例如，多聚甲醛或PFA)的接触导致在生物样品中的生物分子之间形成分子内和分子间共价交联。在一些情况下，已知固定试剂甲醛在RNA、DNA和/或蛋白质分子内产生共价缩醛胺交联。固定试剂的实例包括但不限于醛固定剂(例如甲醛，通常也称为“多聚甲醛”，“PFA”和“***”；戊二醛；等)、亚氨酸酯，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯等。
由于固定而在生物分子(例如蛋白质、RNA、DNA)中形成交联极大地降低了在标准测定方法中检测(例如结合、扩增、测序、杂交)生物分子的能力。去除由固定试剂(例如，热、酸)诱导的交联的常用技术可引起对生物分子的进一步损害(例如，碱基损失、链水解、切割、变性等)。对固定组织样品的结果和去除加合物和/或交联的益处的进一步描述描述于美国专利第8,288,122号中，其以全文引用的方式并入本文。例如，广泛使用的固定试剂，多聚甲醛或PFA通过催化蛋白质中的碱性氨基酸(如赖氨酸和谷氨酰胺)之间的交联形成来固定组织样品。分子内和分子间交联都可以在蛋白质中形成。这些交联可以保存蛋白质二级结构并且也消除所保存的组织样品中的酶活性。
在一些实施例中，可用于本公开的方法中的固定剂或固定试剂是甲醛。当在固定剂的上下文中使用时，术语“甲醛”还指“多聚甲醛”(或“PFA”)和“***”，两者都是具有与甲醛组合物相关的特定含义的术语(例如，***是甲醛和甲醇的混合物)。因此，甲醛固定生物样品也可称为***固定的或PFA固定的。使用甲醛作为固定试剂来制备固定生物样品的方案和方法是本领域熟知的，并且可用于本公开的方法和组合物中。例如，用于制备固定生物样品的甲醛浓度的合适范围为0.1至10％、1至8％、1至4％、1至2％、3至5％或3.5至4.5％。在本公开的一些实施例中，使用终浓度为1％甲醛、4％甲醛或10％甲醛来固定生物样品。通常，将甲醛从更浓的储备溶液－例如35％、25％、15％、10％、5％PFA储备溶液中稀释。
经考虑在制备固定生物样品中可以组合使用多于一种的固定试剂。例如，在一些情况下，生物分子(例如，生物样品，如组织样本)与含有甲醛和戊二醛的固定试剂接触，并且因此接触的生物分子可包括由甲醛诱导的固定和戊二醛诱导的固定产生的固定交联。通常，用作固定试剂的戊二醛的合适浓度为0.1至1％。
B.解固剂与固定生物样品的使用
用于逆转使生物样品固定的效果的条件是本领域已知的，然而，这些条件往往是苛刻的。参见例如WO2001/46402；US2005/0014203A1，和US2009/0202998A1。例如，PFA处理的组织样品的处理包括在Tris缓冲液中加热至60至70℃数小时，但通常仅去除一部分固定剂诱导的交联。此外，苛刻的解固处理条件可导致对样品中的生物分子，特别是核酸的永久损伤。最近，提出了使用能够化学逆转由固定产生的交联的化合物的不太苛刻的解固技术和条件。参见例如Karmakar等人,“有机催化去除RNA和DNA碱基中的甲醛加合物(Organocatalytic removal of formaldehyde adducts from RNA and DNA bases)，”《自然-化学(Nature Chemistry)》，7:752-758(2015)；US 2017/0283860A1；和US 2019/0135774A1。
如本文所用，术语“解固剂”(或“去交联剂”)是指逆转固定和/或去除由先前使用固定试剂引起的样品中生物分子内部或之间的交联的化合物或组合物。在一些实施例中，解固剂是在去除固定样品中的交联方面起催化作用的化合物。在本公开的方法和组合物中用作解固剂的示范性化合物(1)至(15)包括下表1的化合物。
表1：示范性解固剂化合物
Figure BDA0003777519330000131
Figure BDA0003777519330000141
Figure BDA0003777519330000151
Figure BDA0003777519330000161
表1的至少一种解固剂，化合物(3)先前已显示催化分解在用甲醛处理的RNA中形成的缩醛胺和半缩醛胺加合物，并且与许多RNA提取和检测条件相容。参见例如Karmakar等人,“有机催化去除RNA和DNA碱基中的甲醛加合物，”《自然-化学》，7:752-758(2015)；和US2017/0283860A1。
脯氨酸是独特的氨基酸，其在5元环中含有仲胺，导致高亲核性。化合物(12)、(13)、(14)和(15)的脯氨酸类似物结构中的高亲核性连同近端胺或酸部分表明这些化合物(如化合物(1)至(11)，还有可以用作催化分解在甲醛固定的RNA和其它生物分子中形成的缩醛胺和半缩醛胺加合物。
化合物(1)至(6)、(12)和(14)是市售的。化合物(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)和(15)可以使用本领域公知的标准化学合成技术由市售试剂制备。参见例如Crisalli等人,“邻质子供体在腙形成催化中的重要性(Importance of ortho Proton Donors inCatalysis of Hydrazone Formation)，”《有机化学通讯(Org.Lett.)》2013,15,7,1646–1649。
如实例1所述，化合物(8)和(11)可以分别通过2步骤和4步骤合成制备。简言之，在制备化合物(8)中，化合物(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯是根据Guilard,R.等人,《合成(Synthesis)》，2008,10,1575-1579中所述的程序制备的。然后，通过(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯的前体化合物的酸水解来制备目标化合物(8)，(4-氨基吡啶-3-基)膦酸)。化合物(9)和(10)可以通过类似的简单程序制备。例如，化合物(9)可以通过2步骤由2-溴吡啶-3-胺(CAS登记号39856-58-1；西格玛奥德里奇，密苏里州圣路易斯)如以下方案所示。
Figure BDA0003777519330000171
化合物(10)类似地通过2步骤内由4-溴嘧啶-5-胺(CAS登记号849353-34-0；安比德公司，美国伊利诺伊州阿灵顿高地)，如下图所示。
Figure BDA0003777519330000172
脯氨酸类似物化合物(13)和(15)通过如实例10所述的从市售的受保护前体化合物的直接单步骤脱保护来制备。
因此，在本公开的组合物和方法的一些实施例中，组合物或方法中使用的解固剂可包含选自表1的化合物。例如，解固剂可包含化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)中的任一种的化合物，或表1的一种或多种化合物的组合。
表1的至少三种解固剂(即，由结构(8)、(9)或(10)表示的化合物)似乎是新的化合物结构。因此，在至少一个实施例中，本公开提供了包含选自化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)及其组合的化合物的组合物。此外，考虑到使用这些化合物作为解固剂的能力，在至少一个实施例中，本公开提供了包含固定生物样品和选自化合物(8)、(9)、(10)或其组合的化合物的新组合物。另外，经考虑在一些实施例中，包含化合物(8)、(9)、(10)或其组合的组合物、固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。在至少一个实施例中，组合物提供在或封装在离散分区(例如，孔或液滴)中。在至少一个实施例中，离散分区进一步包含珠粒；任选地，其中珠粒包含或携带化合物(8)、(9)、(10)或其组合。
C.在离散分区中将固定生物样品和解固剂分隔
本公开的组合物和方法可用于制备固定生物样品，固定生物样品与能够逆转样品中生物分子的固定状态的解固剂一起在离散分区中分隔，同时将其隔离在分区中。在一个实施例中，固定生物样品与解固剂一起提供在或封装在离散液滴中，解固剂能够逆转样品中生物分子的固定状态，同时将其隔离在液滴中。因此，在一些实施例中，本公开提供了用于制备生物样品的方法，该方法包含：提供包含固定生物样品和解固剂的离散分区。在一个实施例中，该方法包含：生成包含或封装固定生物样品和解固剂的离散液滴。该方法可进一步包含在提供离散分区(例如，生成离散液滴)之前将生物样品固定的步骤。
本领域描述了可用于将生物样品(例如，单独的细胞、细胞的生物分子内容物等)分隔成离散液滴的方法、技术和方案。所生成的离散液滴用作纳升规模的容器，其可以保持液滴内容物与乳液中其它液滴的内容物分离。在例如美国专利申请公开第2010/0105112号和第2019/0100632号中描述了用于在非水性或油乳液中产生包含或封装来自生物样品的单独的颗粒的稳定离散液滴的方法和***，出于所有目的其中的每一个以引用的方式并入本文。
简言之，通过将含有生物样品的水性流体的流动流引入与其不混溶的非水性流体的流动流中来实现包含或封装生物样品的乳液中的离散液滴，使得在两个流的连接处生成液滴(参见例如图1至3)。通过提供生物样品的一定浓度和/或流速的水流，可以控制所得液滴的占据率。例如，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，离散液滴各自含有少于一个生物颗粒。这样的流速确保被占据的液滴主要被单个样品(例如单细胞)占据。包含或封装生物样品的乳液中的离散液滴也使用包含通道区段的微流体结构来实现，通道区段具有与储器的通道接合点(参见例如图4至6)。
如本文所使用的，术语“生物颗粒”通常是指源自生物样品的离散生物***。生物颗粒可以是大分子。生物颗粒可以是小分子。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包含但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其它动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其它细胞类型，无论是源自单细胞或多细胞生物。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以从受试者的组织中获得。生物颗粒可以是硬化细胞。此类硬化细胞可以包括或不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种成分，但可以不包括细胞的其它成分。此类成分的实例是细胞核或细胞器。
在一些情况下，以这种方式形成的多个离散液滴中的液滴包含至多一个颗粒(例如，一个珠粒、一个细胞)。还可以控制流动和微流体通道结构以确保给定数量的单占据液滴、小于一定水平的未占据液滴，和/或小于一定水平的多占据液滴。
在本发明的另一方面，固定细胞和解固剂然后可以与其它试剂分隔(例如，在液滴或孔中)，用于处理本文所述的一种或多种分析物。在一个实施例中，固定细胞和解固剂可以用包含适于对一种或多种分析物进行条形码编码的核酸分子的支持物(例如，珠粒)来分隔。在另一个实施例中，核酸分子可以包括提供识别信息的核酸序列，例如条形码序列。
如本文所使用的术语“条形码”通常指传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。除了分析物的内源性特征(例如，分析物或末端序列的大小)之外，条形码可以是连接到分析物(例如，核酸分子)的标签或标签的组合。条形码可以是唯一的。条形码可以有多种不同的格式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式连接到分析物。可以在样品测序之前、期间和/或之后将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段。条形码可允许识别和/或定量单独的测序读段。
如本文所用，术语“条形码编码的核酸分子”通常是指由例如用核酸序列(例如，与核酸条形码分子所涵盖的核酸引物序列互补的核酸序列)处理核酸条形码分子产生的核酸分子。核酸序列可以是靶向序列(例如，由引物序列靶向)或非靶向序列。例如，在本文所述的方法、组合物、试剂盒和***中，细胞的核酸分子(例如信使RNA(mRNA)分子)与核酸条形码分子(例如，含有条形码序列和与mRNA分子的核酸序列互补的核酸引物序列的核酸条形码分子)杂交和逆转录产生具有对应于mRNA的核酸序列和条形码序列(或其反向互补序列)的序列的条形码核酸分子。条形码核酸分子可用作模板，如模板多核苷酸，其可被进一步处理(例如，扩增)和测序以获得靶向核酸序列。例如，在本文所述的方法和***中，条形码编码的核酸分子可被进一步处理(例如，扩增)和测序以获得mRNA的核酸序列。
如本文所使用的，术语“珠粒”通常是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以无规排列，如在无规共聚物中，和/或具有有序结构，如在嵌段共聚物中。交联可以经由共价、离子或诱导、相互作用或物理缠结进行。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由如单体或聚合物的分子(例如大分子)的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠粒可由聚合物材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。珠粒可以是用包含一种或多种聚合物的涂层覆盖的固体颗粒(例如，金属基颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。
图1示出了可用于生成离散液滴的示范性微流体通道结构100，离散液滴包含或封装来自生物样品(如单细胞)的生物颗粒。通道结构100可以包括在通道接合点110处连通的通道区段102、104、106和108。在操作中，包括来自生物样品114的悬浮颗粒(例如，细胞)的第一水性流体112沿着通道区段102传输到接合点110中，而与水性流体112不混溶的第二流体116(或“分隔流体”)从通道区段104和106中的每一者递送到接合点110以产生流入通道区段108中并且从接合点110流走的第一水性流体112的离散液滴118、120。通道区段108可以流体地偶联到出口储器上，在该出口储器中可以储存和/或收获这些离散液滴。生成的离散液滴可以包括来自生物样品114的单独的颗粒(如液滴118)，或者可以生成包括多于一个颗粒114的离散液滴(图1中未示出)。离散液滴可以不含有生物颗粒114(如液滴120)。每个离散液滴能够保持其自身内容物(例如，单独的生物样品颗粒114)与其它液滴的内容物的分离。
通常，第二流体116包含油，如氟化油，其包括有助于使所得液滴稳定的含氟表面活性剂。有用的分隔流体和氟表面活性剂的实例描述于例如美国专利申请公开第2010/0105112号中，出于所有目的其以引用的方式并入本文。
如图1所示的用于生成离散液滴的微流体通道可以偶联到各种不同的流体来源或接收组件中的任一种，包括储器、管道、歧管或其它***的流体组件。另外，微流体通道结构100可以具有其它几何形状，包括具有多于一个通道接合点的几何形状。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4或5个通道区段，每个通道区段携带在通道接合点相遇的生物样品颗粒、测定试剂和/或珠粒。
通常，用于生成离散液滴的流体被引导以经由一个或多个流体流动单元沿一个或多个通道或储器流动。流体流动单元可以包含压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体也可以或以其它方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
本领域普通技术人员将认识到，许多不同的微流体通道设计是可用的，其可与本公开的方法和组合物一起使用以提供含有固定生物样品颗粒、解固剂和/或具有条形码的珠粒和/或其它测定试剂的离散液滴。
将条形码与生物样品一起包含在离散液滴中提供了独特的标识符，其允许区分和单独分析来自生物样品的数据。可以在离散液滴中的生物样品之前、之后或同时递送条形码。例如，可以在液滴生成之前、之后或同时将条形码注入液滴中。可用于本公开的方法和组合物中的条形码通常包含核酸分子(例如，寡核苷酸)。核酸条形码分子通常经由支持物(如珠粒)递送至分区。在一些情况下，条形码核酸分子最初在生成离散液滴时与珠粒缔合，并且然后在向液滴施加刺激时从珠粒释放。可用于本公开的方法和组合物的携带条形码的珠粒在本文别处进一步详细描述。
用于将携带条形码的珠粒分隔成液滴的方法和***提供于美国专利第10480029号、第10858702号和第10725027号，美国专利公开第2019/0367997号和第2019/0064173号，以及国际申请第PCT/US20/17785号和第PCT/US20/020486号中，出于所有目的其中的每一个都以全文引用的方式并入本文。
图15绘示了携带条形码的珠粒的实例。核酸分子1502(如寡核苷酸)可以通过可释放的键1506(如例如二硫化物接头)偶联到珠粒1504。相同的珠粒1504可以偶联(例如，经由可释放的键)到一个或多个其它核酸分子1518、1520。核酸分子1502可以是或包含条形码。如本文别处所述，条形码的结构可包含许多序列元件。核酸分子1502可包含可用于后续处理的功能序列1508。例如，功能序列1508可包括一个或多个测序仪特异性流动细胞附着序列(例如，用于
Figure BDA0003777519330000211
测序***的P5序列)和测序引物序列(例如，用于
Figure BDA0003777519330000212
测序***的R1引物)。核酸分子1502可以包含用于对样品(例如，DNA、RNA、蛋白质、抗体等)进行条形码编码的条形码序列1510。在一些情况下，条形码序列1510可以是珠粒特异性的，使得条形码序列1510对于偶联到同一珠粒1504的所有核酸分子(例如，包括核酸分子1502)是共同的。可替代地或另外，条形码序列1510可以是分区特异性的，使得条形码序列1510对于偶联到被分隔成相同分区的一个或多个珠粒的所有核酸分子是共同的。核酸分子1502可以包含特异性引发序列1512，如mRNA特异性引发序列(例如，poly-T序列)、靶向引发序列和/或随机引发序列。核酸分子1502可以包含锚定序列1514以确保特异性引发序列1512在序列末端(例如mRNA的)杂交。例如，锚定序列1514可以包括随机的短核苷酸序列，如1-mer、2-mer、3-mer或更长的序列，其可以确保poly-T片段更可能在mRNA的poly-A尾的序列末端杂交。
核酸分子1502可以包含独特分子识别序列1516(例如，唯一分子标识符(UMI))。在一些情况下，独特分子识别序列1516可包含约5至约8个核苷酸。可替代地，独特分子识别序列1516可以压缩少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子识别序列1516可以是在偶联到单个珠粒(例如珠粒1504)的单独的核酸分子(例如1502、1518、1520等)上变化的独特序列。在一些情况下，独特分子识别序列1516可以是随机序列(例如，如随机N-mer序列)。例如，UMI可以提供被捕获的起始mRNA分子的唯一标识符，以便允许对原始表达的RNA的数量进行定量。可以理解，尽管图15示出了偶联到珠粒1504表面的三个核酸分子1502、1518、1520，但是单独的珠粒可以偶联到任何数量的单独的核酸分子，例如，从一到几十到几十万或甚至几百万个单独的核酸分子。单独的核酸分子的相应条形码可包含偶联到同一珠粒的不同的单独的核酸分子之间的共同序列片段或相对共同序列片段(例如1508、1510、1512等)和可变或独特序列片段(例如1516)。
生物颗粒(例如，细胞、固定细胞、解固细胞、DNA、RNA等)可以与携带条形码的珠粒1504一起共分隔。条形码编码的核酸分子1502、1518、1520可以从分区中的珠粒1504释放。例如，在分析样品RNA的上下文中，释放的核酸分子中的一个(例如1502)的poly-T片段(例如1512)可与mRNA分子的poly-A尾杂交。反转录可产生mRNA的cDNA转录物，但该转录物包括核酸分子1502的序列片段1508、1510、1516中的每一个。因为核酸分子1502包含锚定序列1514，它更可能与mRNA的poly-A尾的序列末端杂交并引发逆转录。在任何给定的分区中，单独的mRNA分子的所有cDNA转录物可包括共同的条形码序列片段1510。
然而，由给定分区内的不同mRNA分子制成的转录物可以在独特分子识别序列1512片段(例如，UMI片段)处变化。有利地，甚至在给定分区的内容物的任何后续扩增之后，不同UMI的数量可以指示源自给定分区并因此源自生物颗粒(例如细胞、固定细胞、解固细胞等)的mRNA的量。如上所述，可以对转录物进行扩增、清理和测序以识别mRNA的cDNA转录物的序列，以及对条形码片段和UMI片段进行测序。尽管描述了poly-T引物序列，但其它靶向或随机引发序列也可用于引发逆转录反应。类似地，尽管描述为将条形码编码的寡核苷酸释放到分区中，但在一些情况下，结合到珠粒(例如，凝胶珠粒)的核酸分子可用于杂交并捕获珠粒的固相上的mRNA，例如，以便促进RNA与其它细胞内容物分离。在此类情况下，可以在分区中或分区外(例如，批量)执行进一步的处理。例如，可以对珠粒上的RNA分子进行逆转录或其它核酸处理，可以将另外的接头序列添加到条形码编码的核酸分子，或可以进行其它核酸反应(例如，扩增、核酸延伸)。珠粒或其产物(例如，条形码编码的核酸分子)可以从分区收集，和/或汇集在一起并且后续经受清理和进一步表征(例如，测序)。本文描述的操作可以在任何有用或方便的步骤中执行。例如，可以在将样品引入到分区中之前、期间或之后将包含核酸条形码分子的珠粒引入到分区(例如，孔或液滴)中。可以对样品的核酸分子进行条形码编码，这可以发生在珠粒上(在核酸分子保持偶联到珠粒的情况下)或在核酸条形码分子释放到分区中之后。在来自样品的核酸分子保持附着于珠粒的情况下，可收集、汇集来自各种分区的珠粒并进行进一步处理(例如逆转录、接头附着、扩增、清理、测序)。在其它情况下，处理可以发生在分区中。例如，可在分区中提供足以进行条形码编码，接头附着，逆转录或其它核酸处理操作的条件，并在清理和测序之前进行。
图16示出了携带条形码的珠粒的另一个实例。核酸分子1605，如寡核苷酸，可以通过可释放的键1606(如例如二硫化物接头)偶联到珠粒1604。核酸分子1605可以包含第一捕获序列1660。相同的珠粒1604可以偶联(例如，经由可释放的键)到一个或多个包含其它捕获序列的其它核酸分子1603、1607。核酸分子1605可以是或包含条形码。如本文别处所述，条形码的结构可包含许多序列元件，如功能序列1608(例如，流动细胞附着序列、测序引物序列等)、条形码序列1610(例如，珠粒共有的珠粒特异性序列、分区共有的分区特异性序列等)和唯一分子标识符1612(例如，附着于珠粒的不同分子内的独特序列)或其部分序列。捕获序列1660可以被配置成附着于对应捕获序列1665。在一些情况下，对应捕获序列1665可以偶联到另一分子，该分子可以是分析物或中间载体。例如，如图16所绘示，对应捕获序列1665偶联到包含靶向序列1664的指导RNA分子1662，其中靶向序列1664被配置成附着于分析物。附着于珠粒1604的另一寡核苷酸分子1607包含第二捕获序列1680，其被配置成附着于第二对应捕获序列1685。如图16所绘示，第二对应捕获序列1685偶联到抗体1682。在一些情况下，抗体1682可以对分析物(例如，表面蛋白)具有结合特异性。可替代地，抗体1682可以不具有结合特异性。附着于珠粒1604的另一寡核苷酸分子1603包含第三捕获序列1670，其被配置成附着于第二对应捕获序列1675。如图16所绘示，第三对应捕获序列1675偶联到分子1672。分子1672可以或可以不被配置成靶向分析物。其它寡核苷酸分子1603、1607可以包含关于寡核苷酸分子1605描述的其它序列(例如，功能序列、条形码序列、UMI等)。虽然在图16中绘示了包含每个捕获序列的单个寡核苷酸分子，但是应当理解，对于每个捕获序列，珠粒可以包含一组一个或多个寡核苷酸分子，每个寡核苷酸分子包含捕获序列。例如，珠粒可以包含任何数量的一组或多组不同的捕获序列。可替代地或另外，珠粒1604可包含其它捕获序列。可替代地或另外，珠粒1604可包含较少类型的捕获序列(例如，两个捕获序列)。可替代地或另外，珠粒1604可以包含寡核苷酸分子，该寡核苷酸分子包含引发序列，如特异性引发序列，如mRNA特异性引发序列(例如，poly-T序列)、靶向引发序列，和/或随机引发序列，例如，以促进基因表达的测定。
图2示出了用于生成离散液滴的示范性微流体通道结构200，其包含或封装携带条形码的珠粒214以及生物样品颗粒216。通道结构200包括在通道接合点210处流体连通的通道区段201、202、204、206和208。在操作中，通道区段201将可以包括多个珠粒214(例如，携带条形码寡核苷酸的凝胶珠粒)的水性流体212沿着通道区段201运输到接合点210。所述多个珠粒214可以源自珠粒的悬浮液。例如，通道区段201可以连接到包含珠粒214的水性悬浮液的储器。通道区段202将包括多个生物样品颗粒216的水性流体212沿着通道区段202运输到接合点210中。多个生物样品颗粒216可以源自生物样品颗粒的悬浮液。例如，通道区段202可以连接到包含生物样品颗粒216的水性悬浮液的储器。在一些情况下，如本文在别处进一步描述的，在第一通道区段201或第二通道区段202中或者在这两个区段中的水性流体212可以包括一种或多种试剂。例如，在本公开的一些实施例中，其中生物样品颗粒是固定生物样品颗粒，分别递送生物样品和珠粒的第一和/或第二通道区段中的水性流体可包括解固剂。与水性流体212不混溶的第二流体218从通道区段204和206中的每一者递送至接合点210。当来自通道区段201和202中的一者的水性流体212和来自通道区段204和206中的一者的第二流体218(例如，氟化油)在通道接合点210相遇时，水性流体212在第二流体218中被分隔成离散液滴220并且沿着通道区段208从接合点210流走。通道区段208然后可以将封装生物样品颗粒和携带条形码的珠粒的离散液滴递送至流体地偶联到通道区段208的出口储器，在此它们可以被收集。
作为替代，通道段201和202可以在接合点210上游的另一个接合点处相遇。在此类接合点处，珠粒和生物颗粒可以形成混合物，所述混合物沿着另一个通道被引导至接合点210以产生液滴220。混合物可以以交替的方式提供珠粒和生物颗粒，使得例如液滴包含单个珠粒和单个生物颗粒。
使用如图2中例示的这种通道***，可以生成离散液滴220，其包含或封装生物样品的单独的生物颗粒和一个珠粒，其中该珠粒可以携带条形码和/或另一种试剂。还经考虑，在一些情况下，可使用图2的通道***生成离散液滴，其中液滴包括多于一个单独的生物样品颗粒或不包括生物样品。类似地，在一些实施例中，离散液滴可包括多于一个珠粒或不包括珠粒。离散液滴也可以完全未被占据(例如，没有珠粒或生物样品)。
在一些实施例中，期望珠粒、生物样品颗粒和生成的离散液滴以基本上规则的流速沿通道流动，生成含有单个珠粒和单个生物样品颗粒的离散液滴。常规流速和可用于提供此类常规流速的装置在本领域中是已知的，参见例如美国专利公开第2015/0292988号，其以全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，设定流速以提供具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的产率的含有单个珠粒和生物样品颗粒的离散液滴。
D.支持物
可以携带条形码和/或其它试剂的支持物可用于本公开的组合物和方法，并且可以包括但不限于多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合的珠粒。在一些实施例中，珠粒可以由可溶解、可破坏和/或可降解的材料制成，如包含水凝胶的凝胶珠粒。可替代地，在一些实施例中，珠粒是不可降解的。
在本公开的一些实施例中，在具有生物样品的离散分区中提供的珠粒是凝胶珠粒。在一个实施例中，与生物样品一起提供在或封装在离散液滴中的珠粒是凝胶珠粒。通常，可用于本文公开的实施例的珠粒包含水凝胶。此类凝胶珠粒可以由分子前体形成，如聚合或单体物质，其经历反应形成交联的凝胶聚合物。可用于本公开的另一种半固体珠粒是脂质体珠粒。在一些实施例中，所使用的珠粒可以是包含金属的固体珠粒，金属包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其它情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。通常，珠粒可以是任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形及其变体。
在实施例中使用的多个珠粒可以具有均匀的尺寸，或者它们可以包含不同尺寸的集合。在一些情况下，珠粒的直径为至少约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1000μm(1mm)或更大。在一些情况下，珠粒可具有小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠粒可具有在约40至75μm、30至75μm、20至75μm、40至85μm、40至95μm、20至100μm、10至100μm、1至100μm、20至250μm或20至500μm范围内的直径。
在一些实施例中，使用的珠粒是具有相对单分散尺寸分布的群体或多个珠粒。通常，当需要在分区(例如孔或离散液滴)内提供一致量的试剂时，使用相对一致的珠粒特征(如尺寸)提供每个分区的内容物的总体一致性。例如，可用于本公开的实施例中的珠粒可具有其横截面尺寸的变异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％，并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的尺寸分布。
可用于本公开的方法和组合物中的珠粒可包含一系列天然和/或合成材料。例如，珠粒可以包含天然聚合物、合成聚合物或天然和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原蛋白、角叉菜胶、卵叶车前子、***胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐树胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、海藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(三氟氯乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或其组合(例如，共聚物)。珠粒也可以由聚合物以外的材料形成，包含脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其它无机材料等。
虽然图1和图2已经就提供基本上单占据的离散液滴进行了描述，但是经考虑在某些实施例中提供多占据的离散液滴是合乎需要的，例如，含有来自生物样品的两个、三个、四个或更多个细胞的单个液滴，和/或多个不同的珠粒，如携带条形码核酸分子的珠粒和/或携带试剂(如解固剂或测定试剂)的珠粒。因此，如本文别处所述，可控制生物颗粒和/或珠粒的流动特性以提供此类多占据的液滴。特别地，可以控制在通道结构中使用的液体的流动参数以提供大于约50％、大于约75％，并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的给定液滴占据率。
在一些实施例中，可用于本公开的组合物和方法中的珠粒是能够将试剂(例如，解固剂和/或测定试剂)递送到含有生物样品颗粒的离散分区(例如，离散液滴)中的珠粒。在一些实施例中，可以将不同的珠粒(例如，含有不同的试剂)从不同的来源引入到通向共同的液滴生成接合点(例如，接合点210)的不同入口中。在此类情况下，可以控制进入通道或接合点的不同珠粒的流量和频率，以提供来自每个来源的珠粒的特定比率，同时确保将此类珠粒的给定配对或组合形成具有给定数量的生物颗粒的分区(例如，每个分区一个生物颗粒和一个珠粒)。
本文所述的离散液滴通常包含小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更少。在一些实施例中，生成的包含或封装来自生物样品的生物颗粒的离散液滴具有小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小的总体积。应当理解，液滴内的样品流体体积，例如包括共分隔的生物颗粒和/或珠粒，可以小于上述体积的约90％，小于上述体积的约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％，或小于约10％。
生成可用于本公开的组合物和方法的离散液滴的方法导致生成含有生物样品颗粒(例如，固定生物样品)和其它试剂(例如，解固剂)的离散液滴群体或多个离散液滴。通常，这些方法易于控制以提供任何合适数量的液滴。例如，可生成或以其它方式提供至少约1,000个离散液滴、至少约5,000个离散液滴、至少约10,000个离散液滴、至少约50,000个离散液滴、至少约100,000个离散液滴、至少约500,000个离散液滴、至少约1,000,000个离散液滴、至少约5,000,000个离散液滴、至少约10,000,000个离散液滴或更多个离散液滴。此外，多个离散液滴可以包含未占据的液滴和占据的液滴。
如本文别处所述，在本公开的组合物和方法的一些实施例中，所生成的包含或封装生物样品颗粒和任选地一种或多种不同珠粒的离散液滴还含有其它试剂。在一些实施例中，提供在液滴中或封装在液滴中的其它试剂包括裂解和/或解固剂，其用于释放和/或解固液滴内生物样品颗粒的生物分子内容物。在一些实施例中，裂解和/或解固剂可以在将生物样品颗粒引入微流体***的液滴生成接合点(例如接合点210)的同时或之前与生物样品悬浮液接触与生物样品悬浮液接触。在一些实施例中，试剂通过通道接合点上游的一个或多个额外通道引入。
在一些实施例中，生物样品颗粒可以与其它试剂共分隔。图3示出了用于将生物样品颗粒和其它试剂(包括裂解和/或解固剂)共分隔的微流体通道结构300的实例。通道结构300可以包括通道段301、302、304、306和308。通道段301和302在第一通道接合点309处连通。通道区段302、304、306和308在第二通道接合点310连通。在示范性的共分隔操作中，通道区段301可以将包括多个生物样品颗粒314(例如，固定生物样品)的水性流体312沿着通道区段301运输到第二接合点310。作为替代方案或除此之外，通道区段301可以运输珠粒(例如，携带条形码的珠粒)。例如，通道区段301可以连接至包含生物样品颗粒314的水性悬浮液的储器。在第二接合点310的上游并且紧接在到达其之前，通道段301可以在第一接合点309处与通道段302会合。通道区段302可以将水性流体312中的多种试剂315(例如，裂解剂或解固剂)沿着通道区段302运输到第一接合点309。例如，通道段302可以连接到包括试剂315的储器。在第一接合点309之后，通道区段301中的水性流体312可以将生物样品颗粒314和试剂315携带到第二接合点310。在一些情况下，通道段301中的水性流体312可以包括一种或多种试剂，所述一种或多种试剂可以是与试剂315相同或不同的试剂。与水性流体312不混溶的第二流体316(例如，氟化油)可以从通道区段304和306中的每一者递送至第二接合点310。当来自通道区段301的水性流体312和来自通道区段304和306中的每一者的第二流体316在第二通道接合点310相遇时，水性流体312在第二流体316中被分隔成离散液滴318，并且沿着通道区段308从第二接合点310流走。通道区段308可将离散液滴318递送到流体地偶联到通道区段308的出口储器，在出口储器处可收集离散液滴318以用于进一步分析。
生成的离散液滴可包括单独的生物样品颗粒314和/或一种或多种试剂315，这取决于通道区段302中包括什么试剂。在一些情况下，生成的离散液滴还可以包括携带条形码的珠粒(未示出)，如可以经由本文别处所述的其它通道结构添加。在一些情况下，离散液滴可以未被占据(例如，没有试剂、没有生物颗粒)。通常，本文所述的通道区段可偶联到多种不同的流体来源或接收组件中的任一种，包括储器、管道、歧管或其它***的流体组件。应当理解，微流体通道结构300可以具有其它几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于两个的通道接合点。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4、5个或更多个通道区段，每个通道区段携带在通道接合点相遇的相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物样品颗粒。可以控制每个通道段中的流体流动以控制将不同元素分离成液滴。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器引导流动。流体流动单元可以包含压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体也可以或以其它方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
图4示出了用于将珠粒受控分离成离散液滴的微流体通道结构的实例。通道结构400可以包括在通道接合点406(或交叉点)处与储器404连通的通道段402。储器404可以是腔室。如本文所使用的，对“储器”的任何提及也可以指“腔室”。在操作中，包含悬浮珠粒412的水性流体408可以沿通道段402输送到接合点406中以与和储器404中的水性流体408不混溶的第二流体410会合以产生流入储器404的水性流体408的液滴416、418。在接合点406处，水性流体408和第二流体410相遇，可以基于如接合点406处的流体动力、两种流体408、410的流速、流体特性以及通道结构400的某些几何参数(例如，w、h0、α等)等因素形成液滴。通过连续注入水性流体408从通道区段402通过接合点406，可以在储器404中收集多个液滴。
图5示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。微流体通道结构500可包含多个通道区段502和储器504。多个通道区段502中的每一个可与储器504流体连通。通道结构500可以包含在多个通道区段502与储器504之间的多个通道接合点506。每个通道接合点都可以是液滴生成点。来自图4中的通道结构400的通道段402和其组件的任何描述可以对应于通道结构500中的所述多个通道段502的给定通道段和其对应组件的任何描述。来自通道结构400的储器404和其组件的任何描述可以对应于来自通道结构500的储器504和其对应组件的任何描述。
图6示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。微流体通道结构600可以包含多个通道段602，这些通道段大体上围绕储器604的周边呈圆形布置。所述多个通道段602中的每个通道段可以与储器604流体连通。通道结构600可以包含多个通道段602与储器604之间的多个通道接合点606。每个通道接合点都可以是液滴生成点。来自图4中的通道结构400的通道段402和其组件的任何描述可以对应于通道结构600中的所述多个通道段602的给定通道段和其对应组件的任何描述。来自通道结构400的储器404和其组件的任何描述可以对应于来自通道结构600的储器604和其对应组件的任何描述。图4至6中描绘的微流体结构的其它方面，包括实现该微流体结构的***和方法，在美国公布的专利申请第20190323088号中提供，该专利申请以全文引用的方式并入本文。
一旦裂解和/或解固剂与固定生物样品颗粒在分区(例如，孔或液滴)中共分隔，这些试剂可以促进分区中生物样品颗粒的生物分子内容物的释放和解固。如本文别处所述，分区中释放的解固的生物分子内容物与其它分区的内容物保持分离，从而允许检测和定量存在于该不同生物样品中的目标生物分子分析物。
可用于本公开的组合物和方法中的裂解剂的实例包括生物活性试剂，如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、唇形蛋白酶、细胞裂解酶、溶细胞酶以及可从例如西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)获得的其它裂解酶以及其它可商购获得的裂解酶。其它裂解剂可以另外或可替代地与生物颗粒共分隔以引起生物样品的内容物释放到分区(例如，孔或液滴)中。例如，在一些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些对于基于乳液的***可能是较不期望的，其中表面活性剂可干扰稳定乳液。在一些实施例中，裂解溶液可以包括非离子表面活性剂，如例如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可以包括离子表面活性剂，例如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。电穿孔、热、声或机械细胞破碎也可用于某些情况，例如基于非乳液基的分隔，如可以补充或代替液滴分隔的生物颗粒的提供或封装，其中封装的任何孔径足够小以在细胞破碎后保留给定大小的核酸片段。
除了裂解剂和/或解固剂与生物样品颗粒共分隔成离散分区(例如，孔或液滴)之外，还经考虑其它测定试剂也可共分隔在分区中。例如，DNase和RNase灭活剂或抑制剂、螯合剂，如EDTA、蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K、沙雷氏菌属肽酶(即，源自沙雷氏菌属物种的肽酶)、ArcticZymes蛋白酶，以及用于去除或以其它方式减少不同细胞裂解物组分对核酸的后续处理的负活性或影响的其它试剂。
在分区(例如，孔或离散液滴)中包含与解固剂组合的蛋白酶组合物极大地促进了使样品的后续测定所需的解固生物样品的过程。因此，在至少一个实施例中，将蛋白酶与解固剂和固定生物样品共分隔成离散分区。用于本公开的方法中的合适类别的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21，其可包括胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样、凝血酶样、弹性蛋白酶样和枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。广泛范围的不同丝氨酸蛋白酶被充分表征并可商购。在可用于本发明方法的丝氨酸蛋白酶中，选择的是：碱性蛋白酶、碱性蛋白酶、ArcticZymes蛋白酶、芽孢杆菌肽酶A、芽孢杆菌肽酶B、bioprase、粘菌酶、esperase、genenase、kazusase、maxatase、沙雷氏菌属肽酶、蛋白酶K、蛋白酶S、savinase、枯草杆菌蛋白酶A、枯草杆菌蛋白酶B、枯草杆菌蛋白酶BL、枯草杆菌蛋白酶E、枯草杆菌蛋白酶J、枯草杆菌蛋白酶S、枯草杆菌蛋白酶S41、不耐热蛋白酶K(新英格兰生物实验室)、thermoase和胰蛋白酶。
在一些实施例中，将来自生物样品的生物颗粒提供或封装在离散分区(例如，孔或液滴)中，将其它试剂暴露于适当的刺激以释放样品颗粒的生物分子内容物和/或共分隔的珠粒的内容物。例如，在一些实施例中，化学刺激可以与生物样品颗粒和珠粒(例如凝胶珠粒)一起共分隔在分区中，以允许珠粒降解并将其内容物释放到分区中。在一些实施例中，可以用固定生物样品颗粒和解固剂生成离散分区，其中解固剂包含在可以通过热刺激降解的珠粒中。在这样的实施例中，分区暴露于热刺激，从而使珠粒降解并释放解固剂。在另一个实施例中，经考虑包含固定生物样品颗粒(例如，固定细胞)和两种不同珠粒(例如，一种珠粒携带解固剂，一种珠粒携带测定试剂)的分区，其中两种不同珠粒的内容物通过非重叠刺激(例如，化学刺激和热刺激)释放。在一个实施例中，该分区是包含或封装固定生物样品颗粒和两种不同珠粒(例如，一种珠粒携带解固剂，并且一种珠粒携带测定试剂)的液滴，其中两种不同珠粒的内容物通过非重叠刺激(例如，化学刺激和热刺激)释放。这样的实施例可以允许不同试剂在不同时间释放到相同的离散分区(例如，孔或液滴)中。例如，由热刺激触发的第一珠粒将解固剂释放到分区中，并且然后在设定时间后，由化学刺激触发的第二珠粒释放检测解固的生物样品颗粒的分析物的测定试剂。
还可以将另外的测定试剂与生物样品一起共分隔成离散分区(例如，孔或液滴)，如用于使生物样品的DNA片段化的核酸内切酶、用于扩增生物样品的核酸片段并将条形码分子标签附着于扩增的片段的DNA聚合酶和dNTP。其它酶可以是共分隔的，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNase、枯草杆菌蛋白酶A、沙雷氏菌属肽酶，ArcticZymes蛋白酶，不耐热蛋白酶K(新英格兰生物实验室)，等。另外的测定试剂还可以包括逆转录酶(RT)酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可以用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。
在一些实施例中，模板转换可用于增加测定中生成的cDNA的长度。在一些实施例中，模板转换可用于将预定的核酸序列附加到cDNA上。在模板转换的实例中，cDNA可以由模板例如细胞mRNA的逆转录生成，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶(RT)可以以模板独立的方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如polyC。
一旦生物样品细胞的内容物释放到离散分区(例如，孔或液滴)中，其中含有的生物分子组分(例如，生物样品的大分子组分，如RNA、DNA或蛋白质)可以在分区内进一步处理。根据本文所述的方法和***，可为单独的生物样品的生物分子内容物提供独特的条形码标识符，并且在表征生物分子组分时(例如在测序测定中)，可将它们归属为源自相同生物样品。通过将核酸条形码序列特异性地分配给单独的生物样品或生物样品组来提供将特征归于单独的生物样品或生物样品组的能力。
在一些方面，以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供独特的标识符条形码，核酸分子包含可以附着于或以其它方式结合于单独的生物样品的核酸内容物或者生物样品的其它组分，并且特别是结合于那些核酸的片段的序列。在一些实施例中，仅一个核酸条形码序列与给定的离散液滴相结合，尽管在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。核酸条形码序列可以在核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内包括约6至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多约6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在单个邻近核苷酸区段中，或者它们可以分隔成两个或更多个由1个或多个核苷酸分隔的单独子序列。在一些情况下，分隔的条形码子序列的长度可以为约4个到约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个核苷酸或更短。
在一些实施例中，核酸条形码分子还可以包含可用于在分区中处理来自生物样品的核酸的其它功能序列。这些功能序列可以包括，例如，用于在将相结合的条形码序列附着的同时扩增来自分区中的单独的生物样品的核酸分子的靶向或随机/通用扩增引物序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如，用于识别序列的存在或用于拉下条形码编码的核酸分子，或者许多其它潜在功能序列中的任一种。
在一些实施例中，大量的核酸条形码分子(例如，寡核苷酸)可释放地附着于珠粒，其中附着于特定珠粒的所有核酸分子将包括相同的核酸条形码序列，但其中大量的不同条形码序列在所使用的珠粒群体中呈现。在一些实施例中，如本文别处所述，凝胶珠粒(例如，包含聚丙烯酰胺聚合物基质)用作固体支持物和将核酸分子递送到分区中的递送载体，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可以被配置成在暴露于特定刺激时释放那些核酸分子。在一些情况下，珠粒群体提供不同的条形码序列文库，所述条形码序列文库包含至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。
在对珠粒施加特定刺激时，核酸条形码分子可以从珠粒释放。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过切割释放核酸分子的光不稳定键。在其它情况下，可以使用热刺激，其中升高珠粒环境的温度将导致键的裂解或者核酸分子从珠粒的其它释放。在仍其它情况下，可以使用切割核酸分子与珠粒的键或以其它方式导致核酸分子从珠粒释放的化学刺激。在一种情况下，此类组合物包括上述的用于提供或封装生物样品的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(如DTT)而降解以释放附着的核酸分子。
E.在基于分区的测定中使用固定生物样品和解固剂
如本文别处所公开的，本公开的组合物和方法允许固定的、稳定化的生物样品(例如，固定细胞，如甲醛固定的活检细胞)以离散分区(例如，孔或液滴)提供，任选地作为单个固定细胞，连同能够逆转固定的解固剂，并且由此允许对样品的细胞分析物进行测定，如同它们从新鲜样品获得一样。在一个实施例中，将固定的、稳定化的生物样品(例如，固定细胞，如甲醛固定的活检细胞)与解固剂一起提供或封装在离散液滴中(任选地，作为单个固定细胞)，解固剂能够逆转固定并且由此允许对样品的细胞分析物进行测定，如同它们从新鲜样品获得一样。这些方法允许新鲜生物样品立即例如用甲醛固定，并且然后在其与解固剂一起提供在分区(例如提供在孔中，或者提供在液滴中，或者封装在液滴中)中之前储存一段时间，并且通常与其它材料(如独特核酸条形码分子)和测定试剂一起提供。因此，经考虑可执行本公开的方法，其中当生物样品被固定时，在生成离散分区之前的时间量为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少1周、至少1个月、至少6个月，或更长。
本公开还提供了一种测定方法，其包含以下步骤：(a)提供包含固定生物样品、解固剂和测定试剂的离散分区(例如，孔或液滴)；和(b)检测来自测定试剂和解固的生物样品的反应的分析物。在一个实施例中，测定方法包含以下步骤：(a)生成包含或封装固定生物样品、解固剂和测定试剂的离散液滴；和(b)检测来自测定试剂和解固的生物样品的反应的分析物。任选地，该方法的步骤可以进一步包含在生成离散分区(例如，离散孔或离散液滴)之前将生物样品固定。
大范围的基于液滴的测定和***是本领域已知的。适用于本发明的测定和***包括但不限于美国专利第9694361号、第10357771号、第10273541号和第10011872号以及美国公开专利申请第20180105808号、第20190367982号和第20190338353号中所述的那些，其中的每一个以全文引用的方式并入本文。经考虑可使用新鲜生物样品(如提供或封装在具有携带条形码的珠粒的液滴中的单细胞)来执行的任何测定也可使用固定生物样品、如本文所公开的解固剂和本公开的方法来执行。也就是说，在任何基于液滴的测定中，可以在运行测定方案之前将新鲜生物样品固定，并使用固定生物样品。在这样的测定中，该方案包含将固定的生物物质与解固剂和测定试剂一起提供或封装在离散液滴中。
示范性测定包括单细胞转录谱分析、单细胞序列分析、个体T和B细胞的免疫谱分析、单细胞染色质可及性分析(例如ATAC seq分析)。这些示范性测定可使用用于将生物样品、凝胶珠粒、条形码和/或其它化合物/材料分隔或封装在液滴中的市售***执行，如Chromium***(10X Genomics公司，美国加利福尼亚州普莱森顿)。
在测定方法的一些实施例中，离散分区(例如，孔或液滴)进一步包含一个或多个珠粒。在一些实施例中，珠粒可以含有测定试剂和/或解固剂。在一些实施例中，条形码由珠粒携带或包含在珠粒中。美国专利第20180216162A1号中提供了用于对来自单细胞的生物分子进行样品制备、扩增和测序的组合物、方法和***，单细胞提供或用条形码封装在液滴中，其以引用的方式并入本文。
测定试剂可以包括用于对在分区中提供的生物样品(例如，在孔中或在液滴中提供，或封装在液滴中)进行一种或多种另外的化学或生物化学操作的那些。因此，可用于该测定方法的测定试剂包括可用于进行反应的任何试剂，如核酸修饰(例如，连接、消化、甲基化、随机诱变、亚硫酸氢盐转化、尿嘧啶水解、核酸修复、加帽或解帽)、核酸扩增(例如，等温扩增或PCR)、核酸***或切割(例如，经由CRISPR/Cas9介导的或转座子介导的***或切割)和/或逆转录。另外，有用的测定试剂可以包括允许以比非靶向序列特异性读段更高的速率制备对目标大分子成分特异性的靶向序列或测序读段的那些。
此外，本发明提供了与固定生物样品的分析相关的组合物和***。在一个实施例中，本发明提供了包含多个分区的组合物，其中所述多个分区的子集包含固定细胞和解固剂。在另一个实施例中，分区的子集进一步包含蛋白酶。在另一个实施例中，多个分区中的分区包含固定细胞和解固剂。在某些实施例中，固定细胞是单个固定细胞。在其它实施例中，本发明提供了包含分区的组合物，其中该分区包含本文所述的固定细胞和解固剂。分区可以是液滴或孔。在另一个实施例中，分区进一步包含蛋白酶。本文描述的一个或多个分区可以进一步包含以下中的一种或多种：逆转录酶(RT)、珠粒和用于核酸延伸反应的试剂。在另外一个实施例中，本发明的组合物具有或在不同于环境温度或非环境温度的温度下提供。在一个实施例中，该温度低于环境温度或高于环境温度。如本文别处所描述，分区方法可生成分区群体或多个分区。在此类情况下，可以生成或以其它方式提供任何合适数量的分区。例如，可以生成或以其它方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多个分区。此外，所述多个分区可以包含未占据的分区(例如，空分区)和占据的分区。例如，根据本发明的占据的分区包含固定细胞和解固剂。
在另一方面，本发明涉及用于将多个固定细胞分隔成单个分区的方法和组合物。在一些情况下，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10,000、约15,000、约20,000、约25,000、约30,000、约35,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约80,000、约90,000或约100,000个固定细胞可以被分隔成单个分区。在一些情况下，该方法进一步包含用包含接头(其含有条形码序列)的多个支持物中的每一个将约50至约20,000个固定细胞分隔，其中条形码序列在多个支持物中的每一个中是独特的。
图17示意性地绘示了微孔阵列的实例。该阵列可以包含在衬底1700内。衬底1700包含多个孔1702。孔1702可以具有任何尺寸或形状，并且孔之间的间隔、每个衬底的孔的数量以及衬底1700上的孔的密度可以根据具体应用而改变。在一个此类实例应用中，可包含细胞(例如，固定细胞或解固细胞)或细胞组分(例如，核酸分子)的样品分子1706与可包含与其偶联的核酸条形码分子的珠粒1704共分隔。孔1702可以使用重力或其它装载技术(例如，离心、液体处理器、声学装载、光电等)装载。在一些情况下，孔1702中的至少一个包含单个样品分子1706(例如，细胞)和单个珠粒1704。
试剂可以依次或同时装载到孔中。在一些情况下，在特定操作之前或之后将试剂引入装置。在一些情况下，试剂(其在某些情况下可以以液滴或珠粒形式提供)被依次引入，使得不同的反应或操作在不同的步骤发生。试剂(或者液滴或珠粒)也可以在分散有反应或操作步骤的操作中装载。例如，可以将包含用于使多核苷酸的试剂(例如，限制酶)和/或其它酶(例如，转座酶、连接酶、聚合酶等)的液滴或珠粒装载到一个或多个孔中，随后装载包含用于将核酸条形码分子附着于样品核酸分子上的试剂的液滴或珠粒。试剂可以与样品，如细胞(例如固定细胞或解固的细胞)或者细胞组分(例如细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等))同时或依次提供。因此，孔的使用在进行多步操作或反应中可能是有用的。
如本文别处所述，核酸条形码分子和其它试剂可包含在珠粒或液滴内。可以在装载细胞(例如，固定细胞或解固细胞)之前、之后或同时将这些珠粒或液滴装载到分区(例如，微孔)中，使得每个细胞与不同的珠粒或液滴接触。该技术可用于将独特的核酸条形码分子附着于从每个细胞(例如，固定细胞或解固细胞)获得的核酸分子。可替代地或另外，样品核酸分子可附着于支持物。例如，分区(例如，微孔)可包含其上偶联有多个核酸条形码分子的珠粒。样品核酸分子或其衍生物可以偶联或附着于支持物上的核酸条形码分子。然后可以将得到的条形码核酸分子从分区中去除，并且在一些情况下，将其汇集并测序。在此类情况下，核酸条形码序列可用于追踪样品核酸分子的来源。例如，可以确定具有相同条形码的多核苷酸来源于相同的细胞或分区，而可以确定具有不同条形码的多核苷酸来源于不同的细胞或分区。
可以使用各种方法将样品或试剂装载到孔或微孔中。样品(例如细胞或细胞组分)或试剂(如本文所述)可使用外力(例如重力、电力、磁力)或者使用驱动样品或试剂进入孔中的机构(例如经由压力驱动流动、离心、光电、声学装载、电动泵送、真空、毛细流动等)装载到孔或微孔中。在某些情况下，可使用流体处理***将样品或试剂装载到孔中。样品或试剂的装载可以遵循泊松分布或非泊松分布，例如超泊松或亚泊松。微孔的几何形状、孔之间的间距、密度和尺寸可以被修改以适应有用的样品或试剂分布；例如，可以调节微孔的尺寸和间距，使得样品或试剂可以以超泊松方式分布。
在一个特定的非限制性实例中，微孔阵列或板包含微孔对，其中每对微孔被配置成固持液滴(例如，包含单细胞，例如，单个固定细胞或单个解固细胞)和单个珠粒(如本文所述的那些，其在一些情况下也可提供或封装在液滴中)。液滴和珠粒(或含有珠粒的液滴)可以同时或依次装载，并且液滴和珠粒可以合并，例如在液滴和珠粒接触时或者在施加刺激(例如外力、搅动、热、光、磁力或电力等)时。在一些情况下，液滴和珠粒的装载是超泊松的。在微孔对的其它实例中，孔被配置成保持包含不同试剂和/或样品的两个液滴，它们在接触或施加刺激时合并。在此类情况下，该对的一个微孔的液滴可包含可与该对的另一微孔的液滴中的试剂反应的试剂。例如，一个液滴可以包含试剂，其被配置成释放包含在位于邻近微孔中的另一个液滴中的珠粒的核酸条形码分子。在合并液滴时，核酸条形码分子可以从珠粒释放到分区(例如，接触的微孔或微孔对)中，并且可以进行进一步处理(例如，条形码编码、核酸反应等)。在细胞，例如固定细胞或解固细胞装载在微孔中的情况下，液滴中的一个可以包含用于进一步处理的试剂，例如用于在液滴合并时裂解细胞的裂解试剂。
可以将液滴分隔成孔。液滴可以在装载入孔中之前进行选择或进行预处理。例如，液滴可以包含细胞，例如固定细胞或解固细胞，并且可以选择仅某些液滴，如含有单细胞(或至少一个细胞)的那些液滴用于孔的装载。这种预选处理可用于有效装载单细胞，如获得非泊松分布，或者在孔中进一步分隔之前针对所选特征对细胞进行预过滤。另外，该技术可用于在装载微孔之前或期间获得或防止细胞双联体或多重体形成。
在一些情况下，孔可包含附着于其上的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以附着于孔的表面(例如，孔的壁)。一个孔的核酸条形码分子(例如，分区条形码序列)可以不同于另一个孔的核酸条形码分子，这可以允许识别包含在单个分区或孔中的内容物。在一些情况下，核酸条形码分子可以包含空间条形码序列，其可以识别孔的空间坐标，如在孔阵列或孔板内。在一些情况下，核酸条形码分子可包含用于单个分子识别的唯一分子标识符。在一些情况下，核酸条形码分子可以被配置成附着于或捕获分布在孔中的样品或细胞(例如，固定细胞或解固细胞)内的核酸分子。例如，核酸条形码分子可包含捕获序列，其可用于捕获或杂交到样品内的核酸分子(例如，RNA、DNA)。在一些情况下，核酸条形码分子可以从微孔中释放。例如，核酸条形码分子可以包含化学交联剂，其可以在施加刺激(例如，光、磁、化学、生物、刺激)时切割。可以将释放的核酸条形码分子(其可以被杂交或被配置成与样品核酸分子杂交)收集并汇集用于进一步处理，其可以包括核酸处理(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在此类情况下，独特的分区条形码序列可用于识别核酸分子来源的细胞或分区。
可以对孔内样品进行表征。在非限制性实例中，此类表征可以包括样品(例如细胞或细胞组分)或者其衍生物的成像。表征技术(如显微术或成像)可用于测量固定的空间位置中的样品轮廓。例如，当细胞(例如，固定细胞或解固细胞)任选地用珠粒分隔时，每个微孔和其中包含的内容物的成像可以提供关于细胞双联体形成(例如，频率、空间位置等)、细胞－珠粒对效率、细胞活力、细胞大小、细胞形态、生物标志物(例如，表面标志物，其中的荧光标记的分子等)的表达水平、细胞或珠粒装载速率、细胞－珠粒对的数量、细胞－细胞相互作用(当两个或更多个细胞被共分隔时)的有用信息。可选地或另外地，成像可用于表征孔中扩增产物的量。
在操作中，孔可以同时或依次地装载样品和试剂。当装载细胞(例如，固定细胞或解固细胞)时，可以对孔进行洗涤，例如，从孔、微孔阵列或板中去除过量的细胞。类似地，可以进行洗涤以从孔、微孔阵列或板中去除过量的珠粒或其它试剂。另外，细胞可以在各个分区中裂解以释放细胞内组分或细胞分析物。可替代地，可以在各个分区中将细胞固定或透化。细胞内组分或细胞分析物可偶联到支持物，例如在微孔表面上、在固体支持物(例如珠粒)上，或者它们可被收集用于进一步的下游处理。例如，细胞裂解后，可将细胞内组分或细胞分析物转移到单独的液滴或其它分区中进行条形码编码。可替代地或另外，细胞内组分或细胞分析物(例如，核酸分子)可以偶联到包含核酸条形码分子的珠粒；后续可以收集珠粒并进一步处理，例如进行核酸反应，如逆转录、扩增或延伸，并且可以进一步表征其上的核酸分子，例如经由测序。可替代地或另外，可在孔中对细胞内组分或细胞分析物进行条形码编码(例如，使用包含可释放的核酸条形码分子的珠粒或者在包含核酸条形码分子的微孔表面上)。条形码编码的核酸分子或分析物可以在孔中进一步处理，或者条形码编码的核酸分子或分析物可以从各个分区收集并在分区外进行进一步处理。进一步处理可以包括核酸处理(例如，进行扩增、延伸)或表征(例如，扩增分子的荧光监测、测序)。在任何方便或有用的步骤中，可以将孔(或者微孔阵列或板)密封(例如，使用油、膜、蜡等)，这使得能够储存测定或选择性引入另外的试剂。
图18示意性地示出了用于处理样品内的核酸分子的实例工作流程。可以提供包含多个微孔1802的衬底1800。可以包含细胞(例如，固定细胞或解固细胞)、细胞组分或分析物(例如，蛋白质和/或核酸分子)的样品1806可以在多个微孔1802中与包含核酸条形码分子的多个珠粒1804共分隔。在过程1810期间，可在分区中处理样品1806。例如，细胞可经受足以裂解细胞(例如，固定细胞或解固细胞)并释放其中包含的分析物的条件。在过程1820中，可以进一步处理珠粒1804。通过实例，过程1820a和1820b根据珠粒1804的特性示意性地绘示了不同的工作流程。
在1820a中，珠粒包含附着于其上的核酸条形码分子，并且样品核酸分子(例如，RNA、DNA)可以例如经由杂交或连接附着于核酸条形码分子。此类连接可以发生在珠粒上。在过程1830中，可以收集和汇集来自多个孔1802的珠粒1804。可以在过程1840中执行进一步的处理。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，如本文别处所述，将接头序列连接到核酸分子或其衍生物上。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每个末端。在过程1850中，可以进行进一步的表征，如进行测序以生成测序读段。测序读段可产生关于单独的细胞或者细胞群体(例如，固定细胞或解固细胞)的信息，其可例如在图1855中以视觉或图形表示。
在1820b中，珠粒包含可释放地附着于其上的核酸条形码分子，如下所述。该珠粒可以降解或以其它方式将核酸条形码分子释放到孔1802中；核酸条形码分子然后可用于对孔1802内的核酸分子进行条形码编码。可以在分区内部或分区外部进行进一步的处理。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，如本文别处所述，将接头序列连接到核酸分子或其衍生物上。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每个末端。在过程1850中，可以进行进一步的表征，如进行测序以生成测序读段。测序读段可产生关于单独的细胞或者细胞群体(例如，固定细胞或解固细胞)的信息，其可例如在图1855中以视觉或图形表示。
在1820b中，珠粒包含可释放地附着于其上的核酸条形码分子，如下所述。该珠粒可以降解或以其它方式将核酸条形码分子释放到孔1802中；核酸条形码分子然后可用于对孔1802内的核酸分子进行条形码编码。可以在分区内部或分区外部进行进一步的处理。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，如本文别处所述，将接头序列连接到核酸分子或其衍生物上。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每个末端。在过程1850中，可以进行进一步的表征，如进行测序以生成测序读段。测序读段可产生关于单独的细胞或者细胞群体(例如，固定细胞或解固细胞)的信息，其可例如在图1855中以视觉或图形表示。
F.另外的方法
本公开提供了用于多路复用和以其他方式增加用于分析的样品(例如，细胞、固定细胞或解固细胞)的通量的方法和***。例如，单个或集成的过程工作流程可以允许处理、识别和/或分析更多或多种分析物、更多或多种类型的分析物，和/或更多或多种类型的分析物表征。例如，在本文所述的方法和***中，能够与一种或多种细胞(例如细胞、固定细胞或解固细胞)或者细胞特征结合或以其它方式偶联的一种或多种标记剂可用于表征细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙接合、粘附接合或其任何组合。在一些情况下，细胞特征可包括细胞内分析物，如蛋白质、蛋白质修饰(例如磷酸化状态或其它翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或其任何组合。标记剂可包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂性部分(例如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞接合物、T细胞受体接合物、B细胞受体接合物、前体、适体、单体、亲和体、darpin和蛋白质支架及其任何组合。标记剂可以包括(例如，附着于)指示结合基团所结合的细胞表面特征的报道寡核苷酸。例如，报道寡核苷酸可以包含允许识别标记剂的条形码序列(例如，报道序列)。例如，特异于一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)的标记剂可具有偶联到其上的第一报道寡核苷酸，而特异于不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)的标记剂可具有偶联到其上的不同报道寡核苷酸。关于示范性标记剂、报道寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利第10,550,429号；美国专利公开第20190177800号；和美国专利公开第20190367969号，出于所有目的，其中的每一个以全文引用的方式并入本文。
在特定的实例中，可以提供潜在的细胞特征标记剂的文库，其中各个细胞特征标记剂与核酸报道分子结合，使得不同的报道寡核苷酸序列与能够结合特定细胞特征的每个标记剂结合。在其它方面，文库的不同成员的特征在于存在不同的寡核苷酸序列标记。例如，能够结合第一蛋白的抗体可具有与其结合的第一报道寡核苷酸序列，而能够结合第二蛋白的抗体可具有与其结合的不同的报道寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列的存在可指示特定抗体或者可被特定抗体识别或结合的细胞特征的存在。
对于包含使用固定剂和/或解固剂的工作流程，标记剂可用于在不同时间点标记样品(例如，细胞、固定细胞或解固细胞)。在一个实施例中，在用固定剂处理之前和/或用固定剂处理之后标记多个细胞。在另一个实施例中，在用解固剂处理之前和/或用解固剂处理之后标记多个固定细胞。在一个另外的实施例中，在分隔成分区(例如，孔或液滴)用于进一步处理之前标记多个解固细胞。在另一个实施例中，本文所述的方法、组合物、***和试剂盒提供标记的细胞、标记的固定细胞或标记的解固细胞。
能够与一种或多种细胞结合或以其它方式偶联的标记剂可用于将细胞表征为属于特定细胞集。例如，标记剂可用于标记细胞样品或一组细胞。这样，一组细胞可被标记为不同于另一组细胞。在一个实例中，第一组细胞可源自第一样品，并且第二组细胞可源自第二样品。标记剂可允许第一组和第二组具有不同的标记剂(或者与标记剂结合的报道寡核苷酸)。这可以例如促进多路复用，其中第一组的细胞和第二组的细胞可以分别标记，并且然后汇集在一起用于下游分析。标记的下游检测可指示分析物属于特定组。
例如，报道寡核苷酸可以与抗体或其表位结合片段连接，并且标记细胞可以包含使抗体连接的条形码分子或表位结合片段连接的条形码分子经受适合于使抗体与细胞表面上存在的分子结合的条件。抗体或其表位结合片段与表面上存在的分子之间的结合亲和力可以在期望范围内，以确保抗体或其表位结合片段保持与分子结合。例如，结合亲和力可以在期望范围内，以确保抗体或其表位结合片段在各种样品处理步骤(如分隔和/或核酸扩增或延伸)期间保持与分子结合。抗体或其表位结合片段与其结合的分子之间的解离常数(Kd)可以小于约100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。例如，解离常数可以小于约10μM。
在另一个实例中，报道寡核苷酸可以偶联到细胞穿透肽(CPP)，并且标记细胞可以包含将CPP偶联的报道寡核苷酸递送到分析物载体中。标记分析物载体可以包含通过细胞穿透肽将CPP缀合的寡核苷酸递送到细胞和/或细胞珠粒中。可用于本文提供的方法中的CPP可包含至少一个非官能半胱氨酸残基，其可以是游离的或衍生的以与已针对此类连接而修饰的寡核苷酸形成二硫键。可用于本文实施例的CPP的非限制性实例包括穿透素、转运蛋白、plsl、TAT(48－60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的细胞穿透肽可具有诱导细胞群体的细胞的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞穿透的能力。CPP可以是富含精氨酸的肽转运蛋白。CPP可以是Penetratin或Tat肽。在另一个实例中，报道寡核苷酸可以偶联到荧光团或染料，并且标记细胞可包含使荧光团连接的条形码分子经受适合于使荧光团结合至细胞表面的条件。在一些情况下，荧光团可与脂质双层强烈相互作用，并且标记细胞可包含使荧光团连接的条形码分子经受使得荧光团结合到细胞膜或***到细胞膜中的条件。在一些情况下，荧光团是水溶性有机荧光团。在一些情况下，荧光团是Alexa 532马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR马来酰亚胺)、BODIPY-TMR马来酰亚胺、磺基-Cy3马来酰亚胺，Alexa 546羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 550马来酰亚胺、Cy3羧酸/琥珀酰亚胺酯、Cy3B羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 565生物素、磺酰罗丹明B、Alexa 594马来酰亚胺、德克萨斯红马来酰亚胺、Alexa 633马来酰亚胺、Abberior STAR 635P叠氮化物、Atto 647N马来酰亚胺、Atto 647SE或磺基-Cy5马来酰亚胺。参见，例如，Hughes L D等人,《公共科学图书馆：综合(PLoS One.)》2014年2月4日；9(2):e87649描述了有机荧光团，出于所有目的其以全文引用的方式并入本文。
报道寡核苷酸可以偶联到亲脂性分子，并且标记细胞可以包含通过亲脂性分子将核酸条形码分子递送到细胞膜或核膜。亲脂性分子可与脂质膜(如细胞膜和核膜)结合和/或***脂质膜中。在一些情况下，***可以是可逆的。在一些情况下，亲脂性分子与细胞或核膜之间的结合可以使得膜在后续处理(例如分隔、细胞透化、扩增、汇集等)期间保留亲脂性分子(例如，和其结合组分，如核酸条形码分子)。报道核苷酸可以进入细胞内空间和/或细胞核。在一个实施例中，偶联到亲脂性分子的报道寡核苷酸将经由亲脂性分子保持与脂质膜结合和/或***脂质膜中(如本文所述)，直到细胞发生裂解，例如在分区内。
报道寡核苷酸可以是核酸分子的一部分，核酸分子包含如本文别处所述的任何数量的功能序列，如靶向捕获序列、随机引物序列等，并且偶联到另一核酸分子，另一核酸分子是分析物或源自分析物。
在分隔之前，可以将细胞与标记剂的文库一起温育，标记剂可以是针对广泛的一组不同细胞特征(例如受体、蛋白质等)的标记剂，并且包括它们的相关报道寡核苷酸。可以从细胞中洗涤未结合的标记剂，并且然后可以将细胞与本文别处所述的分区特异性条形码寡核苷酸(例如，附着于支持物，如珠粒或凝胶珠粒)一起共分隔(例如，分隔成液滴或孔)。因此，分区可以包括细胞或者一个或多个细胞，以及结合的标记剂和它们已知的相关报道寡核苷酸。
在其它情况下，例如，为了促进样品多路复用，特异于特定细胞特征的标记剂可具有偶联到第一报道寡核苷酸的第一多个标记剂(例如，抗体或亲脂性部分)和偶联到第二报道寡核苷酸的第二多个标记剂。例如，第一多个标记剂和第二多个标记剂可以与不同的细胞、细胞群体或样品相互作用，允许特定的报道寡核苷酸指示特定的细胞群体(或细胞或样品)和细胞特征。以此方式，可以独立地处理不同的样品或组，并且后续将其组合在一起用于汇集分析(例如，如本文别处所述的基于分区的条形码编码)。参见，例如，美国专利公开第20190323088号，出于所有目的其以全文引用的方式并入本文。
如本文别处所述，标记剂的文库可以与特定的细胞特征相结合，以及用于识别源自特定细胞群体或样品的分析物。细胞群体可以与多个文库一起温育，使得细胞或者一个或多个细胞包含多种标记剂。例如，细胞可包含与其偶联的亲脂性标记剂和抗体。亲脂性标记剂可指示细胞是特定细胞样品的成员，而抗体可指示细胞包含特定分析物。以这种方式，报道寡核苷酸和标记剂可以允许进行多分析物、多路复用分析。
在一些情况下，这些报道寡核苷酸可以包含核酸条形码序列，其允许识别偶联到报道寡核苷酸的标记剂。使用寡核苷酸作为报道分子可以提供能够在序列方面生成显著多样性的优点，同时还可以容易地附着于大多数生物分子，例如抗体等，以及可以容易地检测，例如使用测序或阵列技术。
报道寡核苷酸与标记剂的附着(偶联)可以通过多种直接或间接、共价或非共价结合或附着中的任一种来实现。例如，可以使用化学缀合技术(例如，可获自安诺伦生物科技有限公司(Innova Biosciences)的
Figure BDA0003777519330000431
抗体标记试剂盒)以及其它非共价附着机制，例如，使用生物素化的抗体和具有抗生物素蛋白或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括一个或多个生物素化的接头，偶联到寡核苷酸的珠粒)，将寡核苷酸共价附着于标记剂(如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分。抗体和寡核苷酸生物素化技术是可用的。参见，例如，Fang等人,“用于合成寡核苷酸的5'端标记和亲和纯化的可氟化物切割的生物素化亚磷酰胺(Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling and Affinity Purification of Synthetic Oligonucleotides)，”《核酸研究期刊(Nucleic Acids Res.)》2003年1月15日；31(2):708-715，出于所有目的其以全文引用的方式并入本文。同样，已经开发了蛋白质和肽生物素化技术，并且容易获得。参见，例如，美国专利第6,265,552号，出于所有目的其以全文引用的方式并入本文。此外，点击反应化学，如甲基四嗪-PEG5-NHS酯反应、TCO-PEG4-NHS酯反应等可用于将报道寡核苷酸与标记剂偶联。市售的试剂盒，如来自Thunderlink和Abcam的那些，以及本领域常用的技术可用于将报道寡核苷酸适当地与标记剂偶联。在另一个实例中，标记剂间接地(例如，经由杂交)偶联到包含识别标记剂的条形码序列的报道寡核苷酸。例如，标记剂可以直接地偶联(例如共价结合)到杂交寡核苷酸上，杂交寡核苷酸包含与报道寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报道寡核苷酸的杂交将标记剂偶联到报道寡核苷酸。在一些实施例中，报道寡核苷酸是可从标记剂释放的，如在施加刺激时。例如，报道寡核苷酸可以通过不稳定的键(例如，化学不稳定的、光不稳定的、热不稳定的等)附着于标记剂上，如本文别处一般所述的用于从支持物释放分子。在一些情况下，本文所述的报道寡核苷酸可包括一种或多种可用于后续处理的功能序列，如接头序列、唯一分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流动细胞附着序列(如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下，标记剂可包含报道寡核苷酸和标记。标记可以是荧光团、放射性同位素、能够进行比色反应的分子、磁性颗粒或能够检测的任何其它合适的分子或化合物。标记可以直接或间接地缀合至标记剂(或报道寡核苷酸)(例如，标记可以缀合至能够结合标记剂或报道寡核苷酸的分子)。在一些情况下，将标记缀合至与报道寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸，并且可以允许寡核苷酸与报道寡核苷酸杂交。
图19描述了包含其上附着的报道寡核苷酸(1940)的示范性标记剂(1910、1920、1930)。标记剂1910(例如，本文所述的任何标记剂)附着(直接地，例如，共价附着，或者间接地)于报道寡核苷酸1940。报道寡核苷酸1940可以包含识别标记剂1910的条形码序列1942。报道寡核苷酸1940还可包含一个或多个可用于后续处理的功能序列1943，如接头序列、唯一分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流动细胞附着序列(如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列，或者测序引物或引物结合序列(如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
参考图19，在一些情况下，与标记剂(例如1910、1920、1930)缀合的报道寡核苷酸1940包含引物序列1941、识别标记剂(例如1910、1920、1930)的条形码序列1942和功能序列1943。功能序列1943可以被配置成与互补序列杂交，如存在于核酸条形码分子1990(未示出)上的互补序列，如本文别处所述的那些。在一些情况下，核酸条形码分子1990附着于支持物(例如，珠粒，如凝胶珠粒)，如本文别处所述的那些。例如，核酸条形码分子1990可以经由可释放的键(例如，包含不稳定的键)附着于支持物，如本文别处所述的那些。在一些情况下，报道寡核苷酸1940包含一个或多个另外的功能序列，如上述的那些。
在一些情况下，标记剂1910是包含报道寡核苷酸1940的蛋白质或多肽(例如，抗原或预期抗原)。报道寡核苷酸1940包含识别多肽1910的条形码序列1942，并且可用于推断分析物，例如多肽1910的结合配偶体(即多肽1910可结合的分子或化合物)的存在。在一些情况下，标记剂1910是包含报道寡核苷酸1940的亲脂性部分(例如胆固醇)，其中选择亲脂性部分使得标记剂1910整合到细胞膜或核膜中。报道寡核苷酸1940包含识别亲脂性部分1910的条形码序列1942，亲脂性部分1910在一些情况下用于标记细胞(例如细胞组、细胞样品等)并且可用于如本文别处所述的多路复用分析。在一些情况下，标记剂是包含报道寡核苷酸1940的抗体1920(或其表位结合片段)。报道寡核苷酸1940包含识别抗体1920的条形码序列1942，并且可用于推断例如抗体1920的靶标(即抗体1920结合的分子或化合物)的存在。在其它实施例中，标记剂1930包含MHC分子1931，其包含肽1932和识别肽1932的报道寡核苷酸1940。在一些情况下，MHC分子偶联到支持物1933。在一些情况下，支持物1933可以是多肽，如链霉亲和素，或者多糖，如葡聚糖。在一些情况下，报道寡核苷酸1940可以以任何合适的方式直接或间接地偶联到MHC标记剂1930。例如，报道寡核苷酸1940可以偶联到MHC分子1931、支持物1933或肽1932。在一些实施例中，标记剂1930包含多个MHC分子(例如，是MHC多聚体，其可以偶联到支持物(例如，1933))。I类和/或II类MHC多聚体的许多可能的构型可与本文公开的组合物、方法和***一起使用，例如MHC四聚体、MHC五聚体(经由卷曲螺旋结构域组装的MHC，例如
Figure BDA0003777519330000451
MHC I类五聚体(ProImmune有限公司)、MHC八聚体、MHC十二聚体、MHC修饰的葡聚糖分子(例如MHC
Figure BDA0003777519330000452
(Immudex))等。有关示范性标记剂的描述，包括抗体和基于MHC的标记剂、报道寡核苷酸和使用方法，参见例如美国专利第10,550,429号和美国专利公开第20190367969号,出于所有目的其中的每一个以全文引用的方式并入本文。
图20绘示了携带条形码的珠粒的另一个实例。在一些实施例中，多种分析物(例如，使用本文所述的标记剂的RNA和一种或多种分析物)的分析可包含核酸条形码分子，如图20中大体描绘的。在一些实施例中，核酸条形码分子2010和2020经由如本文别处所述的可释放的键2040(例如，包含不稳定的键)附着于支持物2030。核酸条形码分子2010可包含接头序列2011、条形码序列2012和接头序列2013。核酸条形码分子2020可包含接头序列2021、条形码序列2012和接头序列2023，其中接头序列2023包含与接头序列2013不同的序列。在一些情况下，接头2011和接头2021包含相同的序列。在一些情况下，接头2011和接头2021包含不同的序列。虽然支持物2030被示为包含核酸条形码分子2010和2020，但是本文设想了包含共同条形码序列2012的任何合适数量的条形码分子。例如，在一些实施例中，支持物2030进一步包含核酸条形码分子2050。核酸条形码分子2050可包含接头序列2051、条形码序列2012和接头序列2053，其中接头序列2053包含与接头序列2013和2023不同的序列。在一些情况下，核酸条形码分子(例如，2010、2020、2050)包含一个或多个另外的功能序列，如UMI或本文所述的其它序列。核酸条形码分子2010、2020或2050可以与本文别处所述的分析物相互作用，例如，如图21A至C所示。
参考图21A，在用标记剂标记细胞的情况下，序列2123可以与报道寡核苷酸的接头序列互补。细胞可以与一个或多个报道寡核苷酸2210缀合的标记剂2110(例如，多肽、抗体或本文别处所述的其它)接触。在一些情况下，可在条形码编码之前进一步处理细胞。例如，此类处理步骤可以包括一个或多个洗涤和/或细胞分选步骤。在一些情况下，将结合至标记剂2110(其缀合至寡核苷酸2210和包含核酸条形码分子2190的支持物2130(例如，珠粒，如凝胶珠粒))的细胞分隔成多个分区(例如，液滴乳液的液滴或微孔阵列的孔)中的分区。在一些情况下，分区至多包含结合至标记剂2110的单细胞。在一些情况下，缀合至标记剂2110(例如多肽、抗体、pMHC分子，如MHC多聚体等)的报道寡核苷酸2210包含第一接头序列2111(例如引物序列)、识别标记剂2110(例如pMHC分子或复合物的多肽、抗体或肽)的条形码序列2112和接头序列2113。接头序列2113可以被配置成与互补序列杂交，如存在于核酸条形码分子2190上的序列2123。在一些情况下，寡核苷酸2210包含一个或多个另外的功能序列，如本文别处所述的那些。
条形码编码的核酸可以从图21A至C中描述的构建体生成(例如，经由核酸反应，如核酸延伸或连接)。例如，序列2113然后可以与互补序列2123杂交以生成(例如，经由核酸反应，如核酸延伸或连接)包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补序列)和报道序列2112(或其反向互补序列)的条形码核酸分子。然后可以任选地如本文别处所述处理条形码编码的核酸分子，例如扩增分子和/或将测序平台特异性序列附加到片段上。参见，例如，美国专利公开第2018/0105808号，出于所有目的其以全文引用的方式并入本文。然后可以在合适的测序平台上对条形码编码的核酸分子或由其生成的衍生物进行测序。
在一些情况下，可以进行多种分析物(例如，使用本文所述的标记剂的核酸和一种或多种分析物)的分析。例如，工作流程可包含如图21A至C的任一个大体所示的工作流程，或者如本文别处所述的用于单独的分析物的工作流程的组合。例如，通过使用图21A至C大体所示的工作流程的组合，可以分析多种分析物。
在一些情况下，分析物(例如核酸、多肽、碳水化合物、脂质等)的分析包含如图21A大体描绘的工作流程。核酸条形码分子2190可以与一种或多种分析物共分隔。在一些情况下，核酸条形码分子2190附着于支持物2130(例如，珠粒，如凝胶珠粒)，如本文别处所述的那些。例如，核酸条形码分子2190可以经由可释放的键2140(例如，包含不稳定的键)附着于支持物2130，如本文别处所述的那些。核酸条形码分子2190可包含条形码序列2121，并且任选地包含其它另外的序列，例如UMI序列2122(或者本文别处所述的其它功能序列)。核酸条形码分子2190可包含可与另一核酸序列互补的序列2123，使得其可与特定序列杂交。
例如，序列2123可包含poly-T序列并可用于与mRNA杂交。参考图21C，在一些实施例中，核酸条形码分子2190包含与来自细胞的RNA分子2160的序列互补的序列2123。在一些情况下，序列2123包含特异于RNA分子的序列。序列2123可以包含已知或靶向序列或者随机序列。在一些情况下，可进行核酸延伸反应，从而生成包含序列2123、条形码序列2121、UMI序列2122、任何其它功能序列和对应于RNA分子2160的序列的条形码编码的核酸产物。
在另一个实例中，序列2123可以与已经附加到分析物的突出端序列或接头序列互补。例如，参考图21B，在一些实施例中，引物2150包含与来自分析物载体的核酸分子2160的序列(如编码BCR序列的RNA)互补的序列。在一些情况下，引物2150包含与RNA分子2160不互补的一个或多个序列2151。序列2151可以是如本文别处所述的功能序列，例如接头序列、测序引物序列或促进偶联到测序仪的流动细胞的序列。在一些情况下，引物2150包含poly-T序列。在一些情况下，引物2150包含与RNA分子中的靶向序列互补的序列。在一些情况下，引物2150包含与免疫分子的区域(如TCR或BCR序列的恒定区域)互补的序列。引物2150与核酸分子2160杂交，并且生成互补分子2170。例如，互补分子2170可以是逆转录反应中生成的cDNA。在一些情况下，另外的序列附加到互补分子2170上。例如，可以选择逆转录酶使得几个非模板化碱基2180(例如，poly-C序列)附加到cDNA上。在另一个实例中，末端转移酶也可用于附加另外的序列。核酸条形码分子2190包含与非模板化碱基互补的序列2124，并且逆转录酶在核酸条形码分子2190上进行模板转换反应以生成包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补序列)和互补分子2170的序列(或其部分)的条形码编码的核酸分子。在一些情况下，序列2123包含与免疫分子的区域(如TCR或BCR序列的恒定区域)互补的序列。序列2123与核酸分子2160杂交，并且生成互补分子2170。例如，互补分子2170可以在逆转录反应中生成，逆转录反应生成包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补序列)和互补分子2170的序列(或其部分)的条形码编码的核酸分子。适用于对由mRNA转录物(包括编码免疫细胞受体的V(D)J区域的那些)生成的cDNA进行条形码编码和/或条形码编码方法和组合物(包括模板转换寡核苷酸)描述于2015年6月26日提交的国际专利申请WO2018/075693、美国专利公开第2018/0105808号、美国专利公开第2015/0376609号和美国专利公开第2019/0367969号中，出于所有目的其中的每一个以全文引用的方式并入本文。
实例
本公开的各种特征和实施例在以下代表性实例中说明，所述代表性实例意图是说明性的而并非限制性的。所属领域的技术人员将容易地了解，这些具体实例仅是对本发明的说明，如在随后的权利要求中更充分地描述。本申请中所描述的每个实施例和特征应理解为可与其内所含有的每个实施例互换和组合的。
实例1：使用解固剂的固定PBMC的RNA表达测定
该实例说明了制备PBMC的固定生物样品，以及使用该固定生物样品与四种不同的催化性解固剂和RNA序列测定试剂以确定细胞表达谱。
材料和方法
A.解固剂
对应于化合物(1)(目录号419443；西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)和化合物(4)(目录号218766；西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)的解固剂购自西格玛奥德里奇并且不经进一步纯化即使用。
化合物(8)的解固剂使用以下的2步骤合成程序制备。
步骤1：(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯。在步骤1中，化合物(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯根据Guilard,R.等人,《合成》，2008，10，1575-1579中所述的程序制备。简言之，向3-溴吡啶-4-胺(2.5g，14.5mmol，1当量)(CAS：13534-98-0，西格玛奥德里奇)于乙醇(58mL)中的溶液中加入亚磷酸二乙酯(2.2mL，17.3mmol，1.2当量)、三乙胺(3mL，1.5当量)、PPh3(1.1g，4.3mmol，30mol％)和Pd(OAc)2(0.39g，1.73mmol，12mol％)。将反应混合物用氩气吹扫5分钟。加热回流24小时后，将反应混合物冷却至室温并在真空中浓缩。通过硅胶色谱(MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(0.35g，11％产量)。1H NMR(80MHz,CDCl3):δ＝1.15(t,6H,CH3),4.18-3.69(m,4H,CH2),5.99(br-s,2H,NH2),6.49(d,1H),8.03-7.93(m,1H),8.22(d,1H)。
步骤2：(4-氨基吡啶-3-基)膦酸(化合物(8)。在步骤2中，通过步骤1的前体化合物的酸水解制备目标化合物(4-氨基吡啶-3-基)膦酸(化合物(8))。将(4-氨基吡啶-3-基)膦酸二乙酯(0.35g，1.52mmol，1当量)悬浮于6N HCl(水溶液)(8mL)中。回流12小时后，将反应混合物在真空中浓缩。将残余物用DCM、***洗涤并在真空中浓缩，得到目标化合物(8)(247mg，93％产量)。1H NMR(80MHz,D2O):δ＝6.85-6.55(m,1H),8.05-7.94(m,1H),8.40-8.26(m,1H)。
化合物(11)的解固剂使用以下的4步骤合成程序制备。
步骤1. 4-氨基-3-(二乙氧基磷酰基)苯甲酸甲酯。向4-氨基-3-碘苯甲酸甲酯(2g，7.2mmol，1当量)(CAS：19718-49-1，西格玛奥德里奇)于乙腈(20mL)中的溶液中加入亚磷酸三乙酯(1.9mL，10.8mmol，1.5当量)和Pd(OAc)2(0.16g，0.72mmol，10mol％)。将反应混合物用氩气吹扫5分钟。加热回流18小时后，将反应混合物冷却至室温并在真空中浓缩。残余物在乙酸乙酯和水之间分隔，并且有机层用MgSO4干燥并在真空中浓缩。通过硅胶色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化粗混合物，得到标题化合物(1.4g，70％产量)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝1.27(t,6H,CH3),3.80(s,3H,OMe),3.97-4.11(m,4H,OCH2),6.76(br-s,2H,NH2),6.80-6.83(m,1H),7.82(dd,1H),7.98(dd,1H)。
步骤2. 4-氨基-3-(二乙氧基磷酰基)苯甲酸。向4-氨基-3-(二乙氧基磷酰基)苯甲酸甲酯(0.96g，3.15mmol，1当量)于THF：甲醇：水(10mL:2.5mL，比例：4:1:1)中的溶液中加入固体LiOH(0.45g，18.9mmol，6当量)。在60℃下加热6小时后，将反应混合物在真空中浓缩，酸化至pH 2，并沉淀出固体。将固体过滤并用1N HCl洗涤两次，得到标题化合物(0.49mg，57％产量)。1H NMR(80MHz,CDCl3):δ＝1.34(t,6H,CH3),3.85-4.38(m,4H,OCH2),5.74(br-s,2H,NH2),6.50-6.76(m,1H),7.86-8.36(m,2H)。
步骤3.PEG-酰胺乙基膦酸酯。在氩气下向4-氨基-3-(二乙氧基磷酰基)苯甲酸(0.25g，0.92mmol，1当量)和PEG-胺(0.75g，1.01mmol，1.1当量)于MeOH(4.6mL)中的溶液中加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)。在室温下搅拌18小时后，将反应混合物在真空中浓缩，并将残余物在DCM和盐水之间分隔。将有机层用1N HCl、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用MgSO4干燥、过滤并在真空中浓缩，得到标题化合物(0.35g，36％产量)，其不经纯化即用于下一步骤。1H NMR(80MHz,CD3OD):δ＝1.34(t,6H,CH3),3.44(s,3H,OCH3),3.56-3.91(m,PEG),4.02-4.22(m,4H,OCH2),6.62-6.93(m,1H),7.74-8.45(m,2H)。
步骤4.PEG-酰胺膦酸(化合物(11))。将PEG-酰胺乙基膦酸酯(0.35g，0.36mmol，1当量)悬浮于6N HCl(水溶液)(8mL)中。回流12小时后，将反应混合物在真空中浓缩。将残余物用MeOH、DCM洗涤并在真空中浓缩，得到标题化合物(目录号9，0.31g，94％产量)。1H NMR(80MHz,D2O):δ＝3.02-4.06(m,PEG),7.36-7.52(m,1H),7.99-8.09(m,1H)。
解固剂溶液：将化合物(1)、(4)、(8)和(11)的解固剂各自配制在pH 6.8的30mmolTris缓冲液中至80mM的目标浓度，并使用2M NaOH将pH调节至pH 6.5。将最终制剂通过0.2μm尼龙注射器过滤器过滤，然后加入到最终组合物中，最终组合物含有50mM解固剂化合物、0.2％SDS、10mU/mL蛋白酶K和pH 6.8的30mM Tris中的0.2U/mL RNAse抑制剂。
批量解固：将PBMC用4％PFA在4℃下固定24小时并用PBS中的10％胎牛血清(“FBS”)淬灭。将PFA固定的PBMC用如上所述配制的化合物(1)、(4)、(8)或(11)的解固剂溶液在40℃下处理2小时。在不添加解固剂的情况下制备三种不同的对照样品：(1)新鲜PBMC(“新鲜沉淀”对照)；(2)用4％PFA固定PBMC 24小时，然后用0.2％SDS、10mU/mL蛋白酶K和pH6.8的30mM Tris中的0.2U/mL RNAse抑制剂在40℃下处理2小时(“固定+PK，无解固剂”对照)；和(3)用4％PFA固定PBMC 24小时(“固定无解固剂”对照)。
批量RNA分离：在PFA固定的PBMC的批量解固处理后，将所得的处理的(和对照)样品以450g离心5分钟，并收集沉淀和上清液。分别使用RNeasy Plus微型试剂盒(Qiagen，目录号74134)和RNeasy MinElute Cleanup试剂盒(Qiagen，目录号74204)从收集的沉淀和上清液中分离RNA。使用QubitTM RNA HS测定试剂盒(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，目录号Q32855)和安捷伦RNA ScreenTape***(安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies))定量分离的RNA。
批量RNA测序：RNA不能从“固定无解固剂”对照样品中分离。因此，没有经由批量RNA测序测试该组。“新鲜沉淀”对照数据是在不进行下述10X Genomics单细胞3'V3方案的情况下使用Qiagen试剂盒在批量RNA分离后通过测序获得的。对于上述四种解固剂处理的样品和剩余的对照样品，使用等量的10ng RNA进行cDNA扩增。cDNA扩增后，根据10XGenomics单细胞3'V3方案(10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)进行文库制备。将新鲜PBMC的3000-细胞装载用作单细胞参照(“新鲜SC3P”)，并使用单细胞3'V3方案(10XGenomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)进行文库制备。最后的文库在NovaSeq 6000测序仪(因美纳公司，美国加利福尼亚州圣迭戈)上测序至25至1亿个读数。使用软件包Preseq估计批量文库复杂性，如Daley和Smith所述(参见例如，Daley和Smith，“预测测序文库的分子复杂性(Predicting the molecular complexity of sequencing libraries)，”《自然方法(Nature Methods)》10:325-327，2013)。本文所用的文库复杂性是指作为所有测序的读段的函数的与转录组正确比对的独特RNA分子的估计数量(即，被认为是信息性的并用于基因表达计数的读段)。对文库的基因表达计数进行下采样以匹配最低测序深度，并将成对的基因表达相关性计算为样品之间基因表达计数的皮尔逊相关性(R2)。当比较来自对照、解固的PBMC的基因表达数据时，如在商业基因表达分析软件(例如，10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)中惯用的，将跨细胞的基因表达计数求和以产生伪本体基因表达计数。
结果：相对于仅用蛋白酶K和SDS处理的固定的PBMC，用化合物(1)或化合物(4)的解固剂处理的固定的PBMC显示测序的每读段RNA回收率增加。此外，如图7中描绘的图所示，相对于用蛋白酶K处理但不用解固剂处理的固定的PBMC样品(在图中标记为“固定+PK，无解固剂”)，用化合物(1)(在图中标为“Cmpd 1”)或化合物(4)(在图中标为“Cmpd 4”)的解固剂处理也增加了转录组映射。相反，相对于未用解固剂处理的固定样品，用化合物(8)(在图中的条上标记为“Cmpd 8”)或化合物(11)(在图中的条上标记为“Cmpd 11”)的解固剂处理降低了转录组映射。
如图8所示，相对于未处理固定的PBMC，用化合物(1)、(4)和(8)的解固剂处理导致转录组文库的复杂性更高。用化合物(8)的解固剂处理导致文库复杂性最高。这种增加的文库复杂性增加了从固定生物样品中检测稀有转录物的能力。
如由图9中所绘制的结果所示，用化合物(8)的解固剂处理固定的PBMC产生表现出与新鲜细胞相关性高的基因表达谱(R2＝0.882)。如图10所示，未用解固剂处理的固定PBMC表现出与新鲜细胞的基因表达谱的相关性显著较低(R2＝0.658)。
总之，使用化合物(1)的解固剂处理制备用于RNA基因表达谱测定的PFA固定的PBMC样品提供了来自固定生物样品中的RNA的最高回收率。然而，用化合物(8)的解固剂处理提供了来自固定细胞的基因表达谱，其表现出与从解固的新鲜细胞获得的基因表达谱的相关性较高。
实例2：使用化合物(1)的解固剂和低温枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶处理的固定细胞的RNA表达测定
本实例说明组合使用化合物(1)的催化性解固剂与低温枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶处理以解固PFA固定的Jurkats细胞。
材料和方法：来自地衣芽孢杆菌的100mg/ml枯草杆菌蛋白酶A的蛋白酶原液(西格玛奥德里奇，目录号P5380)在H2O中制备并储存在-20℃。制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(1)的解固剂的原液，并在室温下储存。通过400g离心5分钟使解离的单细胞(Jurkats)沉淀并除去上清液。含有0.2U/μL Qiagen RNAse抑制剂的PBS中的4％PFA的固定试剂溶液(Qiagen，目录号129916)加入到沉淀的细胞并且混合物在4℃下温育过夜。将得到的固定细胞用PBS中的10％FBS淬灭，并以500g在4℃下离心5分钟。150,000个固定细胞在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于pH 6.8的100μL，30mM Tris-HCL，1mM EDTA中。将RNAse抑制剂与以下中的一个一起加入到固定细胞溶液中：(a)5mg/mL枯草杆菌蛋白酶A；或者(b)5mg/mL枯草杆菌蛋白酶A和50mM化合物(1)。使具有枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶并且具有或不具有化合物(1)的解固剂的固定细胞溶液在8℃下温育2小时，随后在70℃下在Eppendorf Thermomixer上以300rpm连续振荡15分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。使用Qiagen 96试剂盒来执行收集部分的RNA提取(Qiagen，目录号74181)、批量RNA测序，和/或单细胞3'测序。还制备新鲜细胞、具有解固条件的新鲜细胞和未经解固处理的固定细胞的对照样品，并提取RNA。通过Qubit HS测定(Q32855)来评估RNA产量，并通过安捷伦4200高灵敏度ScreenTape(5067-5579)来评估产量和DV200质量度量。
结果：结果总结在表2中。相对于从新鲜细胞回收RNA，在8℃下使用枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶处理2小时允许从4％PFA固定的Jurkats细胞回收约7％RNA。然而，将50mM化合物(1)的解固剂与枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶在8℃下组合处理2小时使RNA的产量加倍至新鲜RNA的约15％，并且改善回收的RNA的质量，如DV200所指示。在对组合处理进行2小时，8℃处理后，在70℃下进一步添加15分钟的加热步骤导致具有>95％DV200的RNA回收率(相对于新鲜的)显著提高71％。
表2
Figure BDA0003777519330000521
实例3：含有固定生物样品和解固剂的离散液滴的制备
本实例说明了制备含有PBMC的固定生物样品和化合物(8)的解固剂的离散液滴(GEM)，然后使用液滴中的解固的样品进行单细胞RNA序列表达谱实验。
固定生物样品的制备：
如上文实例1中所述制备固定PBMC的固定生物样品。可以将固定生物样品在4℃或-20℃下储存几天或更长，然后在基于液滴的测定(例如，单细胞测定)中处理。
解固剂的制备：
如实例1中所述制备化合物(8)的解固剂的80mM原液。
具有固定细胞、解固剂和条形码编码的凝胶珠粒的液滴的生成
将包含固定的PBMC的固定生物样品转化成与Chromium***(10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)一起使用的标准主混合物，用于将样品与称为GEM的离散液滴形式的条形码编码的凝胶珠粒(“乳液中的凝胶珠粒”)一起分隔。制备Chromium***，在生成含有样品PBMC和条形码凝胶珠粒的GEM时，加入解固剂溶液作为单独的试剂。可替代地，将解固剂溶液加入到含有条形码编码的凝胶珠粒的悬浮液的储器中，并通过与凝胶珠粒相同的入口通道引入到GEM中。一旦生成，收集GEM，并执行热温育步骤。加热步骤促进细胞内容物、条形码寡核苷酸和逆转录酶(RT)催化的反应的裂解和释放，逆转录酶催化的反应导致将条形码结合到3'合成子中的cDNA合成反应。在将解固剂与GEM结合时，可以根据需要延长热温育步骤以允许由化合物(8)催化的解固反应，解固反应从GEM中的PBMC样品释放的生物分子中去除交联。
实例4：组合使用化合物(1)和/或(8)与枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶处理对固定细胞进行批量解固
本实例说明了在各种温度下组合使用化合物(1)和/或(8)的催化性解固剂与蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A来使PFA固定的Jurkat细胞解固并测定从处理的细胞进入沉淀和/或上清液的RNA的量和质量的研究。
材料和方法：
A.蛋白酶制备：来自地衣芽孢杆菌的100mg/ml枯草杆菌蛋白酶A的蛋白酶原液(西格玛奥德里奇，目录号P5380)在H2O中制备并储存在-20℃。
B.解固剂原液：制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(1)的解固剂的原液，并在室温下储存。制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(8)的解固剂的原液，并在室温下储存。
C.固定细胞制备：通过400g离心5分钟使解离的单细胞(Jurkats)沉淀并除去上清液。含有0.2U/μL Qiagen RNAse抑制剂的PBS中的4％PFA的固定试剂溶液(Qiagen，目录号129916)加入沉淀的细胞并将混合物在4℃下温育过夜。将得到的固定细胞用PBS中的10％FBS淬灭，并以500g在4℃下离心5分钟。150,000个固定细胞在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于pH 6.8的100μL，30mM Tris-HCL，1mM EDTA中。
D.细胞解固/蛋白酶处理：将RNAse抑制剂与以下中的一个一起加入到固定细胞溶液中：(a)5mg/mL枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶；(b)5mg/mL枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶和50mM化合物(1)；(c)5mg/mL枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶和50mM化合物(8)；(d)5mg/mL枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶与25mM化合物(8)和25mM化合物(1)。
将用枯草杆菌蛋白酶A蛋白酶和用或不用化合物(1)和/或(8)的解固剂处理的固定细胞溶液在以下条件中的一个下温育：(1)8℃，持续2小时；(2)8℃，持续2小时，随后在70℃下在Eppendorf Thermomixer上以300rpm连续振荡15分钟；(3)53℃，持续45分钟；或者(4)53℃，持续45分钟，随后在70℃下在Eppendorf Thermomixer上以300rpm连续振荡15分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。
E.RNA定量：使用Qiagen 96试剂盒来执行收集部分的RNA提取(Qiagen，目录号74181)、批量RNA测序，和/或单细胞3'测序。还制备新鲜细胞、具有解固条件的新鲜细胞和未经解固处理的固定细胞的对照样品，并提取RNA。通过Qubit HS测定(Q32855)来评估RNA产量，并通过安捷伦4200高灵敏度ScreenTape(5067-5579)来评估产量和DV200质量度量。
结果：结果总结在表3中。相对于从新鲜细胞回收RNA，组合使用50mM化合物(8)与枯草杆菌蛋白酶A在8℃下温育2小时，然后在70℃下温育15分钟在沉淀中产生100％的RNA(相对于新鲜的)。沉淀中回收的RNA的质量如DV200所示。组合使用50mM化合物(8)与枯草杆菌蛋白酶A在53℃下温育45分钟也导致几乎所有的RNA回收在沉淀中，尽管相对于新鲜的总产量显著较低。单独使用化合物(1)或与化合物(8)组合使用以及在低温或高温下与枯草杆菌蛋白酶A一起温育导致上清液中大部分(例如40％至80％)，但不是全部RNA的回收。
表3
Figure BDA0003777519330000551
实例5：组合使用化合物(1)和/或(8)与蛋白酶K蛋白酶处理对固定细胞进行批量解固
本实例说明了在各种温度下组合使用化合物(1)和/或(8)的催化性解固剂与蛋白酶，蛋白酶K(“PK”)来使PFA固定的Jurkat细胞解固并测定从处理的细胞进入沉淀和/或上清液的RNA的量和质量的研究。
材料和方法：
A.蛋白酶制备：20mg/mL蛋白酶K的原液(西格玛奥德里奇，目录号AM258)储存在-20℃下。
B.解固剂原液：制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(1)的解固剂的原液，并在室温下储存。制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(8)的解固剂的原液，并在室温下储存。
C.固定细胞制备：通过400g离心5分钟使解离的单细胞(Jurkats)沉淀并除去上清液。含有0.2U/μL Qiagen RNAse抑制剂的PBS中的4％PFA的固定试剂溶液(Qiagen，目录号129916)加入沉淀的细胞并将混合物在4℃下温育过夜。将得到的固定细胞用PBS中的10％FBS淬灭，并以500g在4℃下离心5分钟。150,000个固定细胞在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于pH 6.8的100μL，30mM Tris-HCL，1mM EDTA中。
D.细胞解固/蛋白酶处理：将RNAse抑制剂与以下中的一个一起加入到固定细胞溶液中：(a)0.1mg/mL蛋白酶K蛋白酶；(b)0.2mg/mL蛋白酶K蛋白酶；(c)0.4mg/mL蛋白酶K蛋白酶；(d)0.2mg/mL蛋白酶K蛋白酶和50mM化合物(1)；(e)0.4mg/mL蛋白酶K蛋白酶和50mM化合物(1)；(f)0.2mg/mL蛋白酶K蛋白酶和50mM化合物(8)；(g)0.4mg/mL蛋白酶K蛋白酶和50mM化合物(8)；(h)0.2mg/mL蛋白酶K蛋白酶与25mM化合物(8)和25mM化合物(1)；或者(i)0.4mg/mL蛋白酶K蛋白酶与25mM化合物(8)和25mM化合物(1)。将用蛋白酶K蛋白酶和用或不用化合物(1)和/或(8)的解固剂处理的固定细胞溶液在53℃下温育45分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。
E.RNA定量：使用Qiagen 96试剂盒来执行收集部分的RNA提取(Qiagen，目录号74181)、批量RNA测序，和/或单细胞3'测序。还制备新鲜细胞、具有解固条件的新鲜细胞和未经解固处理的固定细胞的对照样品，并提取RNA。通过Qubit HS测定(Q32855)来评估RNA产量，并通过安捷伦4200高灵敏度ScreenTape(5067-5579)来评估产量和DV200质量度量。
结果：结果总结在表4中。相对于从新鲜细胞回收RNA，组合使用50mM化合物(8)与0.2或0.4mg/mL蛋白酶K在53℃下持续45分钟仅在沉淀中而不是在上清液中产生高质量RNA。单独使用50mM化合物(1)或与化合物(8)组合使用导致显著部分(从20％至80％)但不是全部的RNA释放到上清液中。
表4
Figure BDA0003777519330000571
Figure BDA0003777519330000581
实例6：使用具有化合物(1)和/或(8)和蛋白酶K的处理对来自解固细胞的RNA进行批量测序
本实例说明了相对于新鲜细胞的RNA测序，对来自用化合物(1)和/或(8)的解固剂和蛋白酶K(“PK”)处理的PFA固定细胞的RNA进行批量测序的研究。
材料和方法：
A.蛋白酶制备：20mg/mL蛋白酶K的原液(西格玛奥德里奇，目录号AM258)在H2O中制备并储存在-20℃。
B.解固剂原液：制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(1)的解固剂的原液，并在室温下储存。制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(8)的解固剂的原液，并在室温下储存。
C.固定细胞制备：通过400g离心5分钟使解离的单细胞(Jurkats)沉淀并除去上清液。含有0.2U/μL Qiagen RNAse抑制剂的PBS中的4％PFA的固定试剂溶液(Qiagen，目录号129916)加入沉淀的细胞并将混合物在4℃下温育过夜。将得到的固定细胞用PBS中的10％FBS淬灭，并以500g在4℃下离心5分钟。150,000个固定细胞在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于pH 6.8的100μL，30mM Tris-HCL，1mM EDTA中。
D.细胞解固/蛋白酶处理：将RNAse抑制剂与以下中的一个一起加入到固定细胞溶液中：(a)0.1mg/mL蛋白酶K蛋白酶；(b)0.1mg/mL蛋白酶K蛋白酶和50mM化合物(1)；(c)0.1mg/mL蛋白酶K蛋白酶和50mM化合物(8)；(d)0.1mg/mL蛋白酶K蛋白酶与25mM化合物(1)和25mM化合物(8)。
将用蛋白酶K蛋白酶和用或不用化合物(1)和/或(8)的解固剂处理的固定细胞溶液在以下条件中的一个下温育：(1)8℃，持续2小时；(2)8℃，持续2小时，随后在70℃下在Eppendorf Thermomixer上以300rpm连续振荡15分钟；(3)53℃，持续45分钟；或者(4)53℃，持续45分钟，随后在70℃下在Eppendorf Thermomixer上以300rpm连续振荡15分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。
E.RNA分离：使用Qiagen 96试剂盒来执行收集部分的RNA提取(Qiagen，目录号74181)。还制备新鲜细胞、具有解固条件的新鲜细胞和未经解固处理的固定细胞的对照样品，并提取RNA。通过Qubit HS测定(Q32855)来评估RNA产量，并通过安捷伦4200高灵敏度ScreenTape(5067-5579)来评估产量和DV200质量度量。
F.批量RNA测序：使用当量的10ng RNA进行解固剂处理的样品和对照样品的cDNA扩增。将批量RNA装载到主混合物中以替代单细胞悬浮液，然后根据10X Genomics单细胞3'V3方案(10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)进行GEM-RT、cDNA后扩增和文库制备。将新鲜细胞的3000个细胞装载用作单细胞参照(新鲜SC3P)，并使用单细胞3'V3方案(10xGenomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)进行文库制备。最后的文库在NovaSeq6000测序仪(因美纳公司，美国加利福尼亚州圣迭戈)上测序至25至1亿个读数。使用软件包Preseq估计批量文库复杂性，如Daley和Smith所述(参见例如，Daley和Smith，“预测测序文库的分子复杂性(Predicting the molecular complexity of sequencing libraries)，”《自然方法(Nature Methods)》10:325-327，2013)。本文所用的文库复杂性是指作为所有测序的读段的函数的与转录组正确比对的独特RNA分子的估计数量(即，被认为是信息性的并用于基因表达计数的读段)。对文库的基因表达计数进行下采样以匹配最低测序深度，并将成对的基因表达相关性计算为样品之间基因表达计数的皮尔逊相关性(R2)。当比较来自对照、解固细胞的基因表达数据时，如在商业基因表达分析软件(例如，10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)中惯用的，将跨细胞的基因表达计数求和以产生伪本体基因表达计数。
结果：RNA定量和质量结果总结于表5中。
表5
Figure BDA0003777519330000601
实例7：用化合物(8)和蛋白酶批量解固，随后进行单细胞分区条形码编码和cDNA合成
本实例说明了使用化合物(8)和蛋白酶K(“PK”)对PFA固定细胞进行批量解固，随后通过条形码编码和逆转录解固RNA分隔到GEM中以提供cDNA的研究。
材料和方法：
A.蛋白酶制备：20mg/mL蛋白酶K的原液(西格玛奥德里奇，目录号AM258)储存在-20℃下。
B.化合物(8)的解固剂原液：制备在pH 6.8的30mM Tris-HCl、1mM EDTA中的100mM化合物(8)的解固剂的原液，并在室温下储存。
C.固定细胞制备：通过400g离心5分钟使解离的单细胞(Jurkats)沉淀并除去上清液。含有0.2U/μL Qiagen RNAse抑制剂的PBS中的4％PFA的固定试剂溶液(Qiagen，目录号129916)加入沉淀的细胞并将混合物在4℃下温育过夜。将得到的固定细胞用PBS中的10％FBS淬灭，并以500g在4℃下离心5分钟。150,000个固定细胞在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于pH 6.8的100μL，30mM Tris-HCL，1mM EDTA中。
D.细胞解固/蛋白酶处理：将RNAse抑制剂与0.1mg/mL蛋白酶K和50mM化合物(8)一起加入到固定细胞溶液中。允许将用蛋白酶和化合物(8)处理的固定细胞溶液在53℃下温育45分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。显微成像显示，通过这种处理解固的细胞保持完整，尽管相对于新鲜或PFA固定细胞有些肿胀。
E.将沉淀部分分隔到GEM中和3'-RT：将从解固/蛋白酶处理收集的沉淀沉淀部分以300g离心5分钟，并用PBS 0.1％BSA洗涤两次，然后装载到单细胞3'V3方案标准主混合物中，该标准主混合物与Chromium***(10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)一起使用，用于将样品与条形码编码的凝胶珠粒一起分隔成称为GEM(“乳液中的凝胶珠粒”)的离散液滴。一旦生成，收集GEM，并执行热温育步骤。加热步骤促进细胞内容物和RNA的释放，条形码寡核苷酸捕获RNA，以及导致cDNA合成的逆转录(RT)反应，cDNA合成将条形码结合到3'合成子中。
使用Agilent 2100生物分析仪5067-4626进行cDNA电泳图谱分析以评估来自每种样品的DNA大小和产量。
结果：
使用0.1mg/mL蛋白酶K和化合物(8)的解固剂处理的批量解固已显示在沉淀的细胞部分中生成接近100％的RNA含量。另外，如上所述，这种解固处理导致细胞看起来是完整的，尽管相对于新鲜或PFA固定细胞有些肿胀。在用于单细胞3'-RT反应的条件下，将该解固处理后的洗涤的沉淀部分与逆转录(RT)主混合物测定试剂一起分隔到GEM中。新鲜细胞分隔的RT测定试剂混合物的cDNA电泳图谱图如图11A所示。用RT测定试剂混合物和蛋白酶PK分隔的新鲜细胞的cDNA电泳图谱图如图11B所示。图11A的图示出了峰在1000和2500之间的独特的丘图谱，表明分区中的RT能够催化全长cDNA合成子的合成。相反，图11B的图没有示出表明RT不能合成cDNA的丘图谱。这种RT功能的缺乏归因于RT被存在于分区中的蛋白酶PK蛋白水解失活。然而，图11C(其中固定细胞已经使用化合物(8)和PK批量解固，然后沉淀和洗涤)确实示出了表明分区中的RT保持活性的独特丘图谱。在分隔前将细胞批量解固然后沉淀并洗涤它们的能力有效地去除了蛋白酶并允许从PFA固定细胞开始的单细胞3'-RT反应。
实例8：用化合物(8)和冷活性蛋白酶对PFA固定的PBMC进行批量解固，随后进行单细胞分区条形码编码和cDNA合成
本实例说明了在25℃或14℃下使用化合物(8)的解固剂和冷活性蛋白酶(例如，ArcticZymes蛋白酶)对PFA固定细胞进行批量低温解固，随后进行蛋白酶失活，用条形码编码将解固细胞分隔到GEM中，以及将解固RNA逆转录以提供cDNA的研究。
材料和方法：
A.蛋白酶制备：将10U/mL冷活性蛋白酶，ArcticZymes蛋白酶(ArcticZymesTechnologies ASA，挪威特罗姆瑟)的原液储存在-20℃下。
B.化合物(8)的解固剂原液：制备在pH 8.3的50mM Tris-HCl、1mM EDTA中的300mM化合物(8)的解固剂的原液，使用5μm注射器过滤器过滤，并在室温下储存。
C.固定细胞制备：通过400g离心5分钟使分离的单细胞(PBMC)沉淀并去除上清液。含有0.2U/μL Qiagen RNAse抑制剂的PBS中的4％PFA的固定试剂溶液(Qiagen，目录号129916)加入沉淀的细胞并将混合物在4℃下温育过夜。将得到的固定细胞用PBS中的无RNAse的10％FBS(Seradigm 97069-085)淬灭并以500g在4℃下离心5分钟。将150,000个固定细胞在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于含有20U/mL RNase抑制剂的PBS中的0.4％RNase无BSA中。
D.细胞解固/蛋白酶处理：将RNAse抑制剂与10U/mL冷活性蛋白酶、ArcticZymes蛋白酶、50至200mM解固剂、化合物(8)和1mM蛋白酶抑制剂PMSF一起加入到固定细胞溶液中。允许将用蛋白酶和化合物(8)处理的固定细胞溶液在14至25℃下温育45至90分钟，然后在70至85℃下温育15分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。显微成像显示，通过这种处理解固的细胞保持完整，尽管相对于新鲜或PFA固定细胞有些肿胀。
E.将沉淀部分分隔到GEM中和3'-RT：将从解固/蛋白酶处理收集的沉淀部分以300g离心5分钟，并用PBS 0.04％BSA洗涤两次，然后装载到单细胞3'V3方案标准主混合物中，该标准主混合物与Chromium***(10X Genomics，美国加利福尼亚州普莱森顿)一起使用，用于将样品与条形码编码的凝胶珠粒一起分隔成称为GEM(“乳液中的凝胶珠粒”)的离散液滴。一旦生成，收集GEM，并执行热温育步骤。加热步骤促进细胞内容物和RNA的释放，条形码寡核苷酸捕获RNA，以及导致cDNA合成的逆转录(RT)反应，cDNA合成将条形码结合到3'合成子中。
使用Agilent 2100生物分析仪5067-4626进行cDNA电泳图谱分析以评估来自每种样品的DNA大小和产量。
如下执行样品中存在的PBMC细胞类型的确定和映射：通过使用差异表达的标记基因表达识别的细胞簇的自动元分析进行PBMC细胞类型确定。通过自动化脚本识别PBMC细胞类型组合物，脚本通过基于每种细胞类型的差异表达的已知标记基因与未分类细胞的组合对细胞进行分类来定量PBMC样品中已知待检测的细胞类型的数量和分率，未分类细胞进入未确定的类别。
结果：
如上面在实例5至7中指出的，使用蛋白酶和化合物(8)的解固剂的组合处理的批量解固已显示导致剩余在沉淀的部分中的处理的细胞的接近100％的RNA含量。另外，如上所述，这种解固处理导致细胞相对于新鲜或PFA固定细胞看起来是完整的。在该解固处理后，用逆转录(RT)主混合物测定试剂将洗涤的沉淀部分分隔到GEM中，允许执行单细胞3'-RT反应，其产生与新鲜细胞产生的cDNA非常相似的cDNA。
如图12A、12B和12C中描绘的图所示，使用化合物(8)和ArcticZymes蛋白酶的解固处理在14至25℃温育45至90分钟生成的cDNA合成子，显示出cDNA电泳图谱(图12C)，其比来自没有化合物(8)的处理的图谱(图12B)更接近地类似新鲜细胞的图谱(图12A)，这表明从样品获得的cDNA很少或没有。另外，新鲜和固定+解固处理的基因表达值的相关性(R2)显著高于没有任何解固处理的新鲜和固定。
另外，如图13中描绘的图所示，执行细胞计数以确定新鲜细胞中发现的不同PBMC细胞类型与经受解固处理的固定细胞相比的比例。观察到新鲜细胞样品中发现的B细胞、单核细胞、T细胞和树突状细胞的比例与经受解固处理的固定细胞样品中发现的比例类似。这些比较的PBMC细胞计数结果表明，使用本公开的蛋白酶和解固剂的解固处理可用于从固定样品中回收相对罕见的细胞类型并在基于液滴的测定中分析这些细胞类型。
实例9：来自肾组织的PFA固定细胞的批量解固，随后进行单细胞分区条形码编码和cDNA合成
本实例说明了使用实例7中描述的低温解固处理对来自肾组织的PFA固定细胞进行批量解固的研究。
材料和方法：
A.从肾组织制备PFA固定细胞。用PBS冲洗新鲜的肾脏，用刀片将其切碎成精细的组织浆液，然后通过与10mg/mL胰酶(西格玛，P1625)和2.5mg/mL胶原酶A(罗氏(Roche)，11088 793 001)的酶混合物在37℃下以500rpm摇动30分钟温育而分离。将解离的浆液用1ml全自动磁性细胞分选器(autoMACS)分离缓冲液以500rcf洗涤两次，持续5分钟，然后通过40um flowmi过滤，并在4℃下沉淀，用4％PFA固定细胞过夜。第二天，将固定细胞以500g沉淀5分钟，然后用PBS中的3％无RNase的BSA中和，然后再次沉淀以用蛋白酶处理解固。
B.细胞解固/蛋白酶处理：将RNAse抑制剂与10U冷活性蛋白酶、ArcticZymes蛋白酶、100mM解固剂、化合物(8)和1mM蛋白酶抑制剂PMSF一起加入到固定细胞溶液中。允许将用蛋白酶和化合物(8)处理的固定细胞溶液在14或25℃下温育90分钟，随后在70℃的较高温度下温育15分钟。将所得细胞溶液以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。
C.如实例8所述将沉淀部分分隔到GEM和3'-RT中。
D.如实例8所述进行细胞计数以确定cDNA合成后肾组织样品中存在的细胞类型的比例。
结果：如图14中描绘的结果的图所示，在经受解固处理的PFA固定的肾组织样品中发现的几种不同细胞类型(包括B细胞、树突状细胞、CD14、CD16、NK、血小板、各种T细胞，间质祖细胞、近端小管和远端肾单位，)的比例与在新鲜样品中发现的这些细胞类型的比例非常类似。这些比较的细胞比例结果表明，使用本公开的蛋白酶和解固剂的解固处理可用于从固定组织样品中回收相对罕见的细胞类型，如分化的肾单位和足细胞。
实例10：使用化合物(12)、(13)、(14)、(15)的脯氨酸类似物解固剂和冷活性蛋白酶用于PFA固定的Jurkats的批量解固
本实例说明了Jurkats的固定生物样品的制备，以及组合使用化合物(12)、(13)、(14)和(15)的脯氨酸类似物解固剂与蛋白酶对该固定生物样品进行解固。脯氨酸是独特的氨基酸，其在5元环中含有仲胺，导致高亲核性。化合物(12)、(13)、(14)和(15)的脯氨酸类似物结构中的高亲核性连同近端胺或酸部分表明这些化合物(如本公开的化合物(1)至(11))可用作PFA固定的交联生物分子的催化性解固剂。
材料和方法
A.脯氨酸类似物解固剂制备
对应于化合物(12)((2S,4R)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸)的脯氨酸类似物解固剂购自西格玛奥德里奇公司并且不经进一步纯化即使用(目录号51-35-4；西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)。
化合物(13)((2S,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸)的脯氨酸类似物解固剂使用以下1-步骤程序由Boc保护的试剂制备。
Figure BDA0003777519330000651
向(2S,4R)-4-氨基-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-羧酸(150mg，0.7mmol，1当量)的固体(目录号：132622-69-6，组合块)中加入4mL 4M HCl并在室温下搅拌。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物在真空中浓缩，得到定量产量的标题化合物。1H NMR(80MHz,CD3OD):d＝2.53-2.13(m,2H),3.12-2.91(m,1H),3.66-3.12(m,2H),4.13-3.67(m,1H)。
对应于化合物(14)二盐酸盐((2S,4S)-4-[(吡啶-4-基)氧基]吡咯烷-2-羧酸二盐酸盐)的脯氨酸类似物解固剂购自Enamine且不经进一步纯化即使用(目录号EN300-7353434；Enamine，美国新泽西州)。
化合物(15)((2S,4S)-4-(吡啶-3-基氧基)吡咯烷-2-羧酸)的脯氨酸类似物解固剂使用以下1-步骤程序由Boc保护的试剂制备。
Figure BDA0003777519330000652
向(2S,4S)-1-(叔丁氧基羰基)-4-(吡啶-3-基氧基)吡咯烷-2-羧酸(100mg，0.3mmol，1当量)的固体(目录号：PH014404，西格玛奥德里奇)中加入2mL 4M HCl并在室温下搅拌。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物在真空中浓缩，得到定量产量的标题化合物。1HNMR(80MHz,CD3OD):d＝2.75-2.05(m,2H),3.51(br-s,2H),4.63-4.25(m,1H),5.61-5.13(m,1H),8.67-7.49(m,4H)。
B.解固剂原液：将化合物(12)、(13)、(14)和(15)的脯氨酸类似物解固剂各自配制在50mmol Tris缓冲液(pH 8.3)中至300mM的目标浓度，并使用2M NaOH将pH调节至pH 8.3。将最终制剂通过0.2μm尼龙注射器过滤器过滤，然后加入到最终组合物中，最终组合物含有100mM解固剂化合物、10U/mL ArcticZymes蛋白酶和pH 8.3的50mM Tris中的0.2U/mLRNAse抑制剂。
C.蛋白酶原液：将10U/mL冷活性蛋白酶、ArcticZymes蛋白酶(ArcticZymesTechnologies ASA，挪威特罗姆瑟)的原液储存在-20℃下。
D.固定细胞的批量解固/蛋白酶处理：将Jurkats用4％PFA在4℃下固定24小时并用PBS中的10％胎牛血清(“FBS”)淬灭。将RNAse抑制剂与10U/mL冷活性蛋白酶、ArcticZymes蛋白酶、1mM蛋白酶抑制剂和100mM每种测试的解固剂中的一种一起加入到固定细胞溶液中：化合物(8)、(12)、(13)、(14)或(15)。允许将经处理的固定细胞溶液在14至25℃下温育90分钟，随后在80℃下更高温度温育15分钟。
E.批量RNA分离：在批量解固处理PFA固定的Jurkats之后，将所得样品以500g在4℃下离心5分钟，并分别收集上清液和沉淀部分。使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen，目录号_74181)从收集的沉淀和上清液中分离RNA。使用QubitTM RNA HS测定试剂盒(Invitrogen，目录号Q32855)定量分离的RNA。
结果：如下表6中的结果所示，用ArcticZymes蛋白酶和化合物(12)、(13)、(14)或(15)的脯氨酸类似物解固剂的组合处理的固定的Jurkat显示RNA在细胞沉淀中的保留与用ArcticZymes蛋白酶和化合物(8)处理所显示的保留相当或更好。
表6
Figure BDA0003777519330000661
实例11：用化合物(8)和冷活性蛋白酶对抗体标记的PFA固定的PBMC进行批量解固，然后进行单细胞分区条形码编码
本实例说明了使用化合物(8)的解固剂和冷活性蛋白酶(例如，ArcticZymes蛋白酶)在25℃下对染色的PFA固定细胞进行批量低温解固，随后是蛋白酶失活，用条形码将解固细胞分隔到GEM中，以及使用特征条形码编码技术方案(10x Genomics公司)处理解固细胞的研究。
材料和方法：
试剂的制备：根据实例8制备蛋白酶和化合物(8)的解固剂原液。
标记剂：免疫图谱(Biolegend)抗体组(T细胞、B细胞、单核细胞和NK细胞识别抗体)用于标记PBMC。
固定细胞制备：如实例8所述制备分离的单细胞(PBMC)，除了在用4％PFA过夜固定之前或之后用TotalSeq C抗体染色。
细胞解固/蛋白酶处理：如实例8所述用化合物(8)的解固剂和冷活性蛋白酶处理细胞。
将沉淀部分分隔到GEM中和5'特征条形码编码工作流程：将从解固/蛋白酶处理收集的沉淀部分以500g离心5分钟，并用PBS 0.04％BSA洗涤两次，然后装载到提供用于单细胞V(D)J试剂盒的主混合物中，该试剂盒具有用于细胞表面蛋白的特征条形码编码技术，用于与Chromium***(10X Genomics公司，美国加利福尼亚州普莱森顿)一起用于将样品与条形码编码的凝胶珠粒一起分隔成称为GEM(“乳液中的凝胶珠粒”)的离散液滴。一旦生成，收集GEM，并执行热温育步骤。加热步骤促进细胞内容物和RNA的释放，条形码寡核苷酸捕获RNA和TotalSeq C寡核苷酸，以及导致cDNA合成的逆转录(RT)反应，cDNA合成将条形码结合到5'合成子中，以及源自TotalSeq C寡核苷酸的条形码编码的延伸产物的生成。
结果：用化合物(8)和冷活性蛋白酶、ArcticZymes蛋白酶(新鲜+Ab+固定)进行PFA固定和解固处理的抗体染色的PBMC显示出与新鲜PBMC对照类似的密度图谱，表明解固处理方法与抗体染色工作流程相容。PFA固定后抗体染色(固定+Ab)显示每个细胞的抗体计数较低。然而，即使在固定和解固处理后也保持了单独的细胞类型的群体图谱(图23)，与新鲜对照相比具有高的基因表达相关性(图22)。图22示出了以样品间基因表达计数的皮尔逊相关性(R2)计算的基因表达相关性。新鲜染色和新鲜染色然后固定的样品显示R2＝0.743，而新鲜染色和固定然后染色的PBMC显示R2＝0.813。图23显示通过基因表达谱测定的PBMC细胞类型计数在新鲜染色的(3)，新鲜染色和固定的(2)和固定和染色的(1)样品之间相对类似，除了在新鲜染色和固定条件下高的未确定的细胞种类。
尽管有前述描述或所附权利要求，但本文阐述的公开内容也由以下编号的条款定义，其单独或与一个或多个其它条款或实施例组合可能是有益的。这些单独编号的条款中的每一个可以使用或与前面或后面条款中的任一个一起组合。因此，这些条款旨在为所有此类组合提供支持，而不必限于下文明确提供的特定组合：
1.一种组合物，其包含固定生物样品和封装在离散液滴中的解固剂。
2.根据条款1所述的组合物，其中所述固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。
3.根据条款1至2所述的组合物，其中所述固定生物样品是单细胞。
4.根据条款1至3所述的组合物，其中所述固定生物样品已经用选自多聚甲醛的固定试剂固定。
5.根据条款1至4所述的组合物，其中所述离散液滴进一步包含珠粒。
6.根据条款5所述的组合物，其中所述解固剂包含在珠粒中。
7.根据条款6所述的组合物，其中所述离散液滴进一步包含测定试剂；任选地，其中所述测定试剂包含在凝胶珠粒中。
8.根据条款6所述的组合物，其中所述离散液滴进一步任选地包含条形码，其中所述条形码包含在凝胶珠粒中。
9.根据条款1至8所述的组合物，其中所述解固剂能够通过用醛(例如多聚甲醛、戊二醛)，NHS酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而去除在生物分子中形成的交联。
10.根据条款1至9所述的组合物，其中所述解固剂能够通过用多聚甲醛固定而去除在生物分子中形成的交联；任选地，用浓度为1％至4％PFA的PF溶液固定。
11.根据条款1至10所述的组合物，其中所述解固剂包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。
Figure BDA0003777519330000691
12.一种制备生物样品的方法，其包含：生成封装固定生物样品和解固剂的离散液滴。
13.根据条款12所述的方法，其中所述方法进一步包含在生成所述离散液滴之前固定所述生物样品。
14.根据条款12至13中任一项所述的方法，其中所述固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。
15.根据条款12至14中任一项所述的方法，其中所述固定生物样品是单细胞。
16.根据条款12至15中任一项所述的方法，其中当所述生物样品被固定时，在生成所述离散液滴之前的时间量为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少1周、至少1个月、至少6个月，或更长。
17.根据条款12至16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含加热所述离散液滴。
18.根据条款12至17中任一项所述的方法，其中所述固定生物样品已经用固定试剂固定，所述固定试剂选自醛(例如多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合。
19.根据条款18所述的方法，其中所述固定试剂是多聚甲醛(“PFA”)；任选地，所述固定试剂是浓度为1％至4％PFA的PFA溶液。
20.根据条款12至19中任一项所述的方法，其中所述离散液滴进一步包含珠粒。
21.根据条款20所述的方法，其中所述解固剂包含在所述珠粒中。
22.根据条款12至21中任一项所述的方法，其中所述离散液滴进一步包含测定试剂；任选地，其中所述测定试剂包含在珠粒中。
23.根据条款12至22中任一项所述的方法，其中所述离散液滴进一步包含条形码；任选地，其中所述条形码包含在珠粒中。
24.根据条款12至23中任一项所述的方法，其中所述解固剂能够通过用醛(例如多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而去除在生物分子中形成的交联。
25.根据条款12至24中任一项所述的方法，其中所述解固剂能够通过用多聚甲醛固定而去除在生物分子中形成的交联；任选地，用浓度为1％至4％PFA的PFA溶液固定。
26.根据条款12至25任一项所述的方法，其中所述解固剂包含选自化合物(8)，化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。
27.一种测定方法，其包含：(a)生成封装固定生物样品、解固剂和测定试剂的离散液滴；和(b)检测来自所述测定试剂和所述解固生物样品的反应的分析物。
28.根据条款27所述的方法，其中所述方法进一步包含在生成所述离散液滴之前固定所述生物样品。
29.根据条款27至28中任一项所述的方法，其中所述固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。
30.根据条款27至30中任一项所述的方法，其中所述固定生物样品是单细胞。
31.根据条款27至30中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含加热所述离散液滴。
32.根据条款27至31中任一项所述的方法，其中所述测定试剂包含在珠粒中。
33.根据条款27至32中任一项所述的方法，其中所述测定试剂包含条形码。
34.根据条款27至33中任一项所述的方法，其中检测来自所述测定试剂的反应的分析物包含确定包含确定核酸序列的群体，核酸序列的群体包含从所述离散液滴获得的条形码。
35.一种组合物，其包含选自化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)及其组合的化合物：
Figure BDA0003777519330000711
36.根据条款35所述的组合物，其进一步包含固定生物样品；任选地，其中所述固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。
37.根据条款35所述的组合物，其进一步包含蛋白酶；任选地，其中所述蛋白酶是不耐热蛋白酶或冷活性蛋白酶；任选地，其中所述蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K、ArcticZymes蛋白酶及其组合。
38.根据条款35至37中任一项所述的组合物，其中所述组合物在分区内；任选地，其中所述分区是离散液滴。
39.一种试剂盒，其包含：测定试剂；和解固剂组合物，其包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。
40.根据条款39所述的试剂盒，其进一步包含蛋白酶；任选地，其中所述蛋白酶是不耐热蛋白酶或冷活性蛋白酶；任选地，其中所述蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K、ArcticZymes蛋白酶及其组合。
41.根据条款39所述的试剂盒，其中所述解固剂组合物包含在珠粒中。
42.根据条款39至41中任一项所述的试剂盒，其中所述测定试剂包含在珠粒中。
43.根据条款39至42中任一项所述的试剂盒，其中所述测定试剂包含条形码。
44.根据条款39至43中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含固定试剂；任选地，其中所述固定试剂选自醛(例如多聚甲醛、戊二醛)、NHS酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合；任选地，其中所述固定试剂是浓度为1％至4％PFA的PFA溶液。
45.一种测定方法，包含：(a)将固定细胞与包含解固剂和蛋白酶的解固溶液一起温育，从而生成解固细胞；(b)从所述解固溶液中分离所述解固细胞；(c)将所述解固细胞与测定试剂组合；和(d)检测来自所述测定试剂的反应的分析物。
46.根据条款45所述的测定方法，其中所述固定细胞已经用多聚甲醛(“PFA”)固定；任选地，用浓度为1％至4％的PFA固定。
47.根据条款45所述的测定方法，其中所述解固剂是包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物的组合物。
48.根据条款45所述的测定方法，其中所述解固剂是组合物，其包含浓度为约1mM至约500mM、约50mM至约300mM，或约25mM至约200mM的化合物(8)的组合物；任选地，其中所述浓度为约50mM至约200mM。
49.根据条款45所述的测定方法，其中所述蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K、ArcticZymes蛋白酶及其组合。
50.根据条款45所述的测定方法，其中将所述固定细胞与所述解固溶液在约15℃至60℃的温度下温育30至120分钟；任选地，其中在25℃下温育至少90分钟。
51.根据条款45所述的测定方法，其中所述方法进一步包含与蛋白酶抑制剂在约60℃至约70℃的温度下温育约10至约20分钟；任选地，其中所述蛋白酶抑制剂是浓度为约1mM的PMSF。
52.根据条款45所述的测定方法，其中将所述固定细胞与所述解固溶液在约50℃至60℃的温度下温育30至60分钟；任选地，其中在53℃下温育至少45分钟。
53.根据条款45所述的测定方法，其中从所述解固溶液中分离所述解固细胞包含使所述溶液离心以提供解固细胞的沉淀。
54.根据条款50所述的测定方法，其中所述分离进一步包含将解固细胞的沉淀再悬浮于溶液中。
55.根据条款45所述的方法，其中所述测定试剂包含逆转录酶；任选地，其中所述测定试剂进一步包含用于cDNA合成的试剂。
56.根据条款45所述的测定方法，其中将所述解固细胞与测定试剂组合进一步包含生成封装所述解固细胞和测定试剂的离散液滴。
57.根据条款52所述的方法，其中所述离散液滴进一步包含条形码，由此所述解固细胞的RNA被所述条形码标记。
58.一种用于分析固定细胞的方法，其包含
(a)提供多个固定细胞，其中所述多个固定细胞中的固定细胞包含多个交联的核酸分子；
(b)用解固剂使所述固定细胞解固，以提供包含来自所述多个交联的核酸分子的多个未交联的核酸分子的解固细胞；
(c)从所述多个未交联的核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个条形码编码的核酸分子，其中所述多个条形码编码的核酸分子中的条形码编码的核酸分子包含i)对应于所述多个所述未交联的核酸分子中的未交联的核酸分子的序列或其互补序列，和ii)条形码序列或其互补序列。
59.根据条款58所述的方法，其中(c)在多个分区中进行。
60.根据条款59所述的方法，其中所述多个分区是多个液滴。
61.根据条款59所述的方法，其中所述多个分区是多个孔。
62.根据条款59或60所述的方法，其中所述多个分区中的分区包含所述解固细胞和包含所述多个核酸条形码分子的支持物。
63.根据条款62所述的方法，其中所述支持物是珠粒。
64.根据条款58所述的方法，其中所述条形码序列是分区特异性条形码序列。
65.根据条款58所述的方法，其中所述多个固定细胞是多个多聚甲醛固定细胞。
66.根据条款58所述的方法，其中所述解固剂能够通过用醛、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而去除在生物分子中形成的交联。
67.根据条款58所述的方法，其中所述解固剂能够通过用多聚甲醛固定而去除在生物分子中形成的交联。
68.根据条款58所述的方法，其中所述解固剂包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。
69.根据条款68所述的方法，其中所述解固剂进一步包含蛋白酶。
70.根据条款69所述的方法，其中所述蛋白酶是不耐热蛋白酶。
71.根据条款69所述的方法，其中所述蛋白酶是冷活性蛋白酶。
72.根据条款58所述的方法，其中所述多个交联的核酸分子包含交联的核糖核酸(RNA)分子。
73.根据条款58所述的方法，其中所述多个非交联的核酸分子包含非交联的核糖核酸(RNA)分子。
74.根据条款58所述的方法，其中所述对应于未交联的核酸分子的序列是对应于未交联的RNA分子的序列。
75.根据条款58所述的方法，其中所述固定细胞包含标记剂。
76.根据条款75所述的方法，其中所述标记剂选自由以下组成的组：蛋白质、肽、抗体、亲脂性部分、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞接合物、T细胞受体接合物、B细胞受体接合物、前体、适体、单体、亲和体、darpin、蛋白质支架及其任何组合。
77.根据条款75所述的方法，其中所述标记剂包含报道寡核苷酸。
78.根据条款77所述的方法，其中所述报道寡核苷酸包含识别所述标记剂的报道序列。
79.根据条款78所述的方法，其进一步包含由所述报道寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子生成另外的条形码编码的核酸分子，其中所述多个条形码编码的核酸分子的所述另外的条形码编码的核酸分子包含i)所述报道序列或其互补序列，和ii)所述条形码序列或其互补序列。
尽管出于清楚和理解的目的通过实例和说明的方式对本发明的前述公开进行了详细描述，但是包括本文所描述的实例、说明和实施例的本公开仅出于说明性目的，意图为示例性的并且不应将其解释为限制本公开。对于所属领域技术人员将显而易见的是，可以对本文所描述的实例、说明和实施例进行各种修改或改变，并且将其包括在本公开和随附权利要求书的精神和范围内。此外，本领域技术人员将认识到与本文所述的那些方法和程序相当的许多方法和程序。所有这些等同物应理解所有此类等效物应被理解为在本公开的范围内并且由随附权利要求书覆盖。
在随附权利要求书中阐述了本发明的另外的实施例。
出于所有目的，本文所提及的所有公开案、专利申请、专利或其它文献的公开内容均明确地通过全文引用的方式并入本文中，其程度如同每个此类单独的公开案、专利、专利申请或其它文献被单独地具体地指示为出于所有目的以全文引用的方式并入本文中并且在本文中全文阐述。如果冲突，将以本说明书(包括指定术语)为准。

Claims (33)

1.一种用于分析固定细胞的方法，其包含
(a)提供多个固定细胞，其中所述多个固定细胞中的固定细胞包含多个交联的核酸分子；
(b)用解固剂使所述固定细胞解固，以提供包含来自所述多个交联的核酸分子的多个未交联的核酸分子的解固细胞；
(c)从所述多个未交联的核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个条形码编码的核酸分子，其中所述多个条形码编码的核酸分子中的条形码编码的核酸分子包含i)对应于所述多个所述未交联的核酸分子中的未交联的核酸分子的序列或其互补序列，和ii)条形码序列或其互补序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(c)在多个分区中进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个分区是多个液滴。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个分区是多个孔。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述多个分区中的分区包含所述解固细胞和包含所述多个核酸条形码分子的支持物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述支持物是珠粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述条形码序列是分区特异性条形码序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个固定细胞是多个多聚甲醛固定细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述解固剂能够通过用醛、NHS酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)、亚氨酸酯或其组合固定而去除在生物分子中形成的交联。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述解固剂能够通过用多聚甲醛固定而去除在生物分子中形成的交联。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述解固剂包含化合物(8)
Figure FDA0003777519320000011
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述解固剂包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。
Figure FDA0003777519320000021
Figure FDA0003777519320000031
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述解固剂进一步包含蛋白酶。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白酶是不耐热蛋白酶。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白酶是冷活性蛋白酶。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个交联的核酸分子包含交联的核糖核酸(RNA)分子。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个未交联的核酸分子包含未交联的核糖核酸(RNA)分子。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述对应于未交联的核酸分子的序列是对应于未交联的RNA分子的序列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定细胞包含标记剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述标记剂选自由以下组成的组：蛋白质、肽、抗体、亲脂性部分、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞接合物、T细胞受体接合物、B细胞受体接合物、前体、适体、单体、亲和体、darpin、蛋白质支架及其任何组合。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述标记剂包含报道寡核苷酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述报道寡核苷酸包含识别标记剂的报道序列。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包含由所述报道寡核苷酸和所述多个核酸条形码分子生成另外的条形码编码的核酸分子，其中所述多个条形码编码的核酸分子中的所述另外的条形码编码的核酸分子包含i)所述报道序列或其互补序列，和ii)所述条形码序列或其互补序列。
24.一种组合物，其包含选自化合物(8)、化合物(9)、化合物(10)及其组合的化合物：
Figure FDA0003777519320000032
25.根据权利要求24所述的组合物，其进一步包含固定生物样品；任选地，其中所述固定生物样品源自组织样品、活检样品或血液样品。
26.根据权利要求24所述的组合物，其进一步包含蛋白酶。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述蛋白酶是不耐热蛋白酶。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述蛋白酶是冷活性蛋白酶。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的组合物，其中所述组合物在分区内。
30.一种试剂盒，其包含：测定试剂；和解固剂组合物，其包含选自化合物(8)、化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)、化合物(4)、化合物(5)、化合物(6)、化合物(7)、化合物(9)、化合物(10)、化合物(11)、化合物(12)、化合物(13)、化合物(14)、化合物(15)及其组合的化合物。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其进一步包含蛋白酶。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述蛋白酶是不耐热蛋白酶。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述蛋白酶是冷活性蛋白酶。
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