CN115032389A - 一种检测凝血酶及其抑制剂的纸基传感方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析检测领域，涉及一种检测凝血酶及其抑制剂的纸基传感方法。方法基于凝血酶与血浆中纤维蛋白原的凝血过程，将成胶过程释放出的水含量不同转化为纸基上流动距离或者面积的差异。本发明还提供一种筛选凝血酶抑制药物的简易方法。抑制药物通过抑制凝血酶活性，阻碍纤维蛋白原交联过程，减少吸收水分，在纸基上得到不同的流动距离，构建了一种简易、便携、无需设备，具有较高的灵敏度和显著的特异性的可用于即时检测的传感装置。

Description

一种检测凝血酶及其抑制剂的纸基传感方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种对凝血酶及其药物抑制剂的可视化的纸基床旁快检方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
床旁快检是一种易于操作、可以快速响应且低成本的诊断方法。通过简化诊断过程，此方法能在床旁、病房或中心实验室之外的其他地方开展。基于纸张的侧向流动检测是各种即时检测方法中研究最广泛的生物传感方法，已被用于许多生物分子的检测，包括DNA、蛋白质和病毒。其中，特异性检测一般是通过胶体金标记或酶催化比色反应的信号变化实现的。实际血液样品中含有红细胞、黄疸、溶血等，会对实验结果产生颜色干扰，一般需要分离血浆作为样品进行测试。然而，血浆的分离较为耗时且需要专业化的仪器和操作，不能满足即时检测的需要。基于黏度变化的纸基是一种潜在的解决方法，满足便携、快速、简易、无专业操作的要求。
凝血酶是一种参与凝血反应的丝氨酸蛋白酶，可催化可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，活化血小板。凝血酶水平异常可反映出凝血功能障碍，从而出现阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等多种疾病。凝血酶抑制剂的研究对于溶栓药物的发现和凝血疾病临床治疗迫切需要。因此，凝血酶的定量测定和抑制剂的筛选对疾病诊断和药物评价具有重要意义。
目前为止，凝血酶的检测方法有电化学法、荧光法、比色法等。与传统的免疫分析方法相比，这些方法具有良好的灵敏度和稳定性。然而，这些方法大多是耗时费力的，并且结合标记分子、掺杂适体、使用复杂的仪器和复杂的操作程序，在实际应用中存在局限性。凝血酶原时间试验常用于外源性凝血途径的先天性凝血疾病的诊断，该方法对于通过凝血时间测定凝血酶活性，需较严格的实验条件和人员培训。LC-MS技术具有较高的特异性和准确性，一直被用于新型凝血酶抑制剂的筛选，但需大型仪器设备和专业化操作。因此，开发无标记、简单、便携的凝血酶检测和抑制剂筛选方法非常重要。
发明内容
针对现有技术中凝血酶检测过程存在预处理步骤繁杂，人员专业性要求高，处理时间长，工作效率有待提升以及检测物灵敏度不高等不足。本发明提供了一种检测凝血酶及其抑制剂的纸基传感方法。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种检测凝血酶的纸基传感检测方法，包括：
将多组已知活度的凝血酶分别与血浆形成混合溶液，进行孵育后，得到待测溶液；
将试纸条与待测溶液接触，静置，至水溶液不再扩散为止；
建立水溶液的印迹距离或者面积与待测物凝血酶活度的关系；
重复上述步骤，对待测凝血酶进行测试，确定其活度。
发明人发现：基于黏度变化原理的纸基传感用于检测凝血酶的研究应用尚未被开发。通过纤维蛋白原和凝血酶之间的结合关系，本发明建立了一种简易、便携、无需设备，具有较高的灵敏度和显著的特异性的可用于即时检测凝血酶及其抑制药物的方法。
本发明的第二个方面，提供了一种检测凝血酶抑制药物的纸基传感检测方法，包括：
将含抑制药物的待测物用有机溶剂溶解后，用PBS溶液稀释到相应浓度，得到抑制药物溶液；
将血浆溶液与凝血酶溶液混合，加入抑制药物溶液，孵育，得到待测溶液；
将试纸条与待测溶液接触，静置，至水溶液不再扩散为止；
建立水溶液的移动面积或距离占试纸条整体的比例与抑制药物浓度的关系；
重复上述步骤，对待测物中抑制药物浓度进行测试，确定其浓度。
本发明的原理在于凝血过程中血浆中的纤维蛋白原在凝血酶作用下形成的凝血不溶性纤维蛋白。此交联过程可以捕获水分子，水分子被固定在纤维蛋白凝胶中，不能随试纸流动。当凝血酶抑制药物使凝血酶失活，水被释放，沿着试纸流动形成印迹，通过印迹距离或者面积实现对凝血酶及其抑制药物的定量。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明涉及检测原理简单，凝血酶使得纤维蛋白原成胶释放水溶液。纸基成本低廉、操作简单便捷、过程快速且易保存。
(2)本发明检测装置简易，仅需捕捉数据的智能手机或测量标尺可完成检测。与传统方法相比，避免大型仪器的繁杂和检测人员的专业培训，可实现即时检测的功能，有应用推广的潜在价值。
(3)本发明提供了一种检测凝血酶和抑制药物的高通量检测方法，该方法具有可避免非特异性且背景信号因素干扰少等优点。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为检测凝血酶及其抑制剂的纸基传感器原理图；
图2(A)为检测凝血酶检测数据及(B)线性关系(C)表示优化孵育时间的纸基照片且通过(D)数据直观看出60min为最优化时间；
图3凝血酶活性的标准曲线；
图4(A)和(B)为阿加曲班检测数据。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明的第一个方面，提供了一种凝血酶的检测方法，包括步骤：将待测物与血浆混合形成混合溶液。在适宜的条件下孵育后将试纸条放入反应孔中，等待水溶液扩散，试纸条上形成不同的扩散面积。不同量的凝血酶引起纤维蛋白成胶程度不同，从而释放出水的含量不同，引起在pH试纸条上产生不同的移动效果。结合智能手机等便携设备对凝血酶的含量进行测量。
本发明的第二个方面，提供一种检测凝血酶抑制药物的检测方法，包括将待测物与凝血酶、纤维蛋白原混合成溶液。在适宜的条件下孵育后将试纸条放入反应孔中，等待水溶液扩散。目标分子抑制凝血酶的酶活性，不同程度减少纤维蛋白凝胶的生成。混合溶液同样在pH试纸条上产生不同的移动效果，可结合智能手机等便携设备对凝血酶的含量进行测量。
本发明的原理在于凝血过程中纤维蛋白原在凝血酶作用下形成的纤维蛋白交联过程可以捕获水分子。因为水分子被固定在纤维蛋白凝胶中，不能随试纸流动。当凝血酶抑制药物使凝血酶失活后，水被释放，沿着试纸流动形成印迹，通过印迹距离或者面积实现对凝血酶及其抑制药物的定量。
图1为检测凝血酶及其抑制剂的纸基传感器原理图
本发明的第一个方面，提供一种凝血酶的检测方法，本发明的技术方案如下：
a.试纸条处理:本实验使用的指示性试纸条为pH试纸条，将试纸条切割为5.75mm×60mm。
b.凝血酶的检测：
S1：冻干的兔血浆溶解在PBS缓冲液中。
S2：将S1的10μL纤维蛋白原溶液与20μL待测物溶液混合，得到总体积为30μL的检测溶液。
S3：将溶液在37℃条件下孵育，将a.的试纸条放入反应孔中静置3min，直至水完全溶液扩散。
c.数据处理：
S1:将试纸条放在疏水性基板上进行观测。
S2：观察加入待测酶的试纸条移动距离，使用智能手机等拍照工具记录，从而实现对目标物的检测。
S2：可利用Photoshop和Origin等工具统计移动面积或距离占试纸条整体的比例进行定量计算。
需要说明的是，待测物测试之前，需要先做标准工作曲线，再将实际样本的信号带入工作曲线。
本发明中，凝血酶作用底物选择含纤维蛋白原的血浆溶液，包括但不限于冻干兔血浆、人全血以及经过分离的血浆等。
根据本发明优选的，PBS缓冲液的pH范围是7.2～7.4。
根据本发明优选的，S3反应的孵育时间为60min。
本发明中，所述疏水性基板材料包括聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板、PVC板等。
根据本发明优选的，疏水性基板为PVC板。
本发明中，实验过程将试纸放在疏水基板上进行或在孔板内反应，后放到疏水基板上测量。
本发明中，分析数据过程的定量依据可以选择测量面积、距离、像素点等。
根据本发明优选的，本方法的定量依据为测量像素点前后差值，即：测量水流动痕迹的总像素值。
图2(A)为检测凝血酶检测数据及(B)线性关系(C)表示优化孵育时间的纸基照片且通过(D)数据直观看出60min为最优化时间。
本发明的第二个方面，提供一种检测凝血酶抑制药物的检测方法，技术方案如下：
(1)试纸条处理:本实验使用的指示性试纸条为pH试纸条，将试纸条切割为5.75mm×60mm。
(2)抑制药物的检测：
S1：冻干的兔血浆溶解在PBS缓冲液中。
S2：将含抑制药物的待测物用极少量有机溶剂溶解，后用PBS溶液稀释到相应浓度。
S3：将S1上述10μL血浆溶液与20μL凝血酶溶液混合，得到总体积为30μL的检测溶液。加入S2中的抑制药物溶液。
S4：同样将溶液在37℃条件下孵育，将试纸条放入反应孔中静置3min，直至水完全溶液扩散。
(3)数据处理：
S1:将试纸条放在疏水性基板上进行观测。
S2：观察加入试纸条移动距离，使用智能手机等拍照工具记录，从而实现对目标物的检测。
S3：使用Photoshop和Origin等工具统计移动面积或距离占试纸条整体的比例进行定量计算。
本发明中，凝血酶作用底物选择含纤维蛋白原的血浆溶液，包括但不限于冻干兔血浆、人全血以及经过分离的血浆等。
根据本发明优选的，PBS缓冲液的pH范围是7.2～7.4。
本发明中，S2中使用有机溶液根据相应抑制药物选择，例如二甲基亚砜等溶剂。
根据本发明优选的，S3反应的孵育时间为60min。
本发明中，所述疏水性基板材料包括聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板、PVC板等。
根据本发明优选的，疏水性基板为PVC板。
本发明中，实验过程将试纸放在疏水基板上进行或在孔板内反应，后放到疏水基板上测量。
本发明中，分析数据过程的定量依据可以选择测量面积、距离、像素点等。
根据本发明优选的，本方法的定量依据为测量像素点前后差值。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实例中，若无特殊说明，所用产品均为普通市售产品。
实施例以阿加曲班为例，对本发明做进一步说明。
以下实施例中，凝血酶ELISA试剂盒由南京药源生物技术有限公司提供，OD值由Tecan Spark Multimode Microplate Reader获得。磷酸盐缓冲液(PBS 10mM,pH＝7.4)购自生工生物技术公司。所有实验均使用超纯水，电阻率为18.25MΩ/cm。
采用ELISA试剂盒测定凝血酶活性
采用凝血酶联免疫吸附测定试剂盒准确测定凝血酶活性。通过改变凝血酶浓度(0、25、50、100、200mU/mL)得到校准曲线。通过酶标仪在450nm波长下测定最终TMB显色溶液的吸光强度。得到的标准曲线如图3所示。根据标准曲线测定凝血酶活性为321U/mg。
实施例1：本实例提供一种筛选抑制药物阿加曲班的方法，实现对阿加曲班的高通量筛选，其分子式为：
Figure BDA0003538734760000081
A.试纸条处理:本实验使用的指示性试纸条为pH试纸条，将试纸条切割为5.75mm×60mm。
B.抑制药物的检测：
S1：冻干的兔血浆溶解在PBS缓冲液中。
S2：将含阿加曲班的待测物用二甲基亚砜溶剂溶解，后用PBS溶液稀释到相应浓度。
S3：将S1上述血浆溶液10μL与凝血酶溶液20μL混合，得到总体积为30uL的检测溶液，加入S2得到的阿加曲班溶液。
S4：同样将溶液在37℃条件下孵育，将试纸条放入反应孔中静置3min，直至水完全溶液扩散。
(3)数据处理：
S1：观察试纸条移动距离，使用智能手机等拍照工具记录，从而实现对目标物的检测。
S2：使用Photoshop和Origin等工具统计移动面积或距离占试纸条整体的比例进行定量计算。
图4(A)(B)为待测物阿加曲班检测数据。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测凝血酶的纸基传感检测方法，其特征在于，包括：
将多组已知活度的凝血酶分别与血浆形成混合溶液，进行孵育后，得到待测溶液；
将试纸条与待测溶液接触，静置，至水溶液不再扩散为止；
建立水溶液的印迹距离或者面积与待测物凝血酶活度的关系；
重复上述步骤，对待测凝血酶进行测试，确定其活度。
2.如权利要求1所述的检测凝血酶的纸基传感检测方法，其特征在于，所述血浆为含纤维蛋白原的血浆溶液，优选地，所述血浆为冻干兔血浆、人全血以及经过分离的血浆。
3.如权利要求1所述的检测凝血酶的纸基传感检测方法，其特征在于，所述血浆溶解在PBS缓冲液中，优选地，所述PBS缓冲液的pH范围是7.2～7.4。
4.如权利要求1所述的检测凝血酶的纸基传感检测方法，其特征在于，所述孵育的条件为37～37.5℃下，孵育60～80min。
5.如权利要求1所述的检测凝血酶的纸基传感检测方法，其特征在于，所述试纸条放在疏水性基板上进行观测，优选地，所述疏水性基板为聚碳酸酯板、聚苯乙烯板、聚甲基丙烯酸甲酯板或PVC板。
6.一种检测凝血酶抑制药物的纸基传感检测方法，其特征在于，包括：
将含抑制药物的待测物用有机溶剂溶解后，用PBS溶液稀释到相应浓度，得到抑制药物溶液；
将血浆溶液与凝血酶溶液混合，加入抑制药物溶液，孵育，得到待测溶液；
将试纸条与待测溶液接触，静置，至水溶液不再扩散为止；
建立水溶液的移动面积或距离占试纸条整体的比例与抑制药物浓度的关系；
重复上述步骤，对待测物中抑制药物浓度进行测试，确定其浓度。
7.如权利要求6所述的检测凝血酶抑制药物的纸基传感检测方法，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
8.如权利要求6所述的检测凝血酶抑制药物的纸基传感检测方法，其特征在于，将试纸放在疏水基板上进行或在孔板内反应，后放到疏水基板上测量。
9.如权利要求6所述的检测凝血酶抑制药物的纸基传感检测方法，其特征在于，分析数据过程的定量依据为面积、距离或像素点。
10.如权利要求9所述的检测凝血酶抑制药物的纸基传感检测方法，其特征在于，定量依据为测量像素点前后差值。
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