CN115025288A - 一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法 - Google Patents
一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法。所述外泌体水凝胶混合体系的组分包括间充质干细胞亚群来源的外泌体和甲基丙烯酰化明胶，所述间充质干细胞亚群为带有CD146+和CD271+标记的细胞亚群；所述外泌体表达有人血管生成素样蛋白4。可以达到快速促进血管内皮细胞增殖、成管和迁移，可以很大程度上发挥干细胞治疗所带来的有利作用，同时也避免了干细胞移植所带来的相关不良反应，比如肿瘤形成等。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法。
背景技术
脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的中枢神经***创伤性疾病，中国现有创伤性脊髓损伤患者超过200万，每年新增10-14万。脊髓损伤发生后将脊髓处血管不通，无法进行血液循环，甚至引起死亡。SCI不仅消耗巨大的医疗资源，也给个人、家庭和社会带来沉重的经济负担。然而，对于伴有严重神经功能障碍SCI患者仍无有效的治疗方法。目前，临床上主要采用脊柱固定和髓内减压、激素应用等治疗减少继发损伤；细胞治疗、神经因子、基因治疗等治疗手段多数处于实验阶段。因此，亟待寻求治疗脊髓损伤、促进功能恢复的有效策略。
多项研究表明间充质干细胞移植可以在衰老，脑损伤和神经退行性疾病等条件下可以促进脊髓损伤的功能恢复。目前临床间充质干细胞的主要来源为骨髓、脐带等。但是干细胞治疗在常规临床治疗中，仍有很多问题有待解决，包括移植细胞存活率低，细胞去分化和肿瘤形成等。所以当前迫切需要去寻找一种可以发挥干细胞的积极治疗效果，同时也可以减少相关风险的治疗手段与方法。
外泌体(Exosomes,EXOs)是一种可由多种细胞分泌的纳米级小囊泡，其体内携带着母体细胞核酸和miRNA，蛋白质等多种具有生物活性的成分。外泌体植入也可以避免干细胞直接移植导致的肿瘤等风险和自体的神经干细胞移植涉及的诸多医学伦理问题。干细胞来源外泌体具有与干细胞相似的功能，可以有效促进组织修复及再生，在中枢神经***损伤修复领域表现出了强大的保护能力，开启了无细胞治疗的新途径。
现急需一种可以促进血管再生的材料对脊髓损伤处的血管进行修复和再生。
发明内容
本申请提供了一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法，以解决如何促使血管再生的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种外泌体水凝胶混合体系，所述外泌体水凝胶混合体系的组分包括间充质干细胞亚群来源的外泌体和甲基丙烯酰化明胶，所述间充质干细胞亚群为带有CD146+和CD271+标记的细胞亚群；所述外泌体表达有人血管生成素样蛋白4。
可选的，所述外泌体在所述外泌体水凝胶混合体系中的质量浓度为100-200ug/mL，优选100ug/mL。
可选的，所述间充质干细胞亚群来源于人脐带华通胶；
和/或，所述外泌体水凝胶混合体系具有光敏固化性能；
和/或，外泌体的直径≤150nm。
通过所述外泌体水凝胶混合体系具有光敏固化性能；外泌体的直径≤150nm，通过控制外泌体的直径≤150nm，可以达到去除杂质的积极效果。
可选的，所述外泌体水凝胶混合体系以敷料形式涂覆损伤脊髓局部，所述外泌体水凝胶混合体系的用量为80-100ul/cm2。
可选的，所述损伤脊髓局部中外泌体的数量为1.5×107～2.5×107个/cm2。
可选的，所述外泌体水凝胶混合体系还含有血管内皮生长因子。
所述外泌体水凝胶混合体系还含有血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)，通过添加VEGF，通过激活血管生成相关的PI3K/AKT信号通路，可以达到促进血管再生的积极效果。
第二方面，本申请提供了一种外泌体水凝胶混合体系的制备方法，所述方法包括以下步骤：
得到母体分离后人脐带样本；
将所述人脐带华通胶样本中细胞进行分选，得到标志物为CD146+和CD271+的间充质干细胞亚群；
将间充质干细胞亚群进行培养，收获细胞上清液；
将所述细胞上清液进行过滤、分离和重悬沉淀，得到外泌体；
将外泌体中的蛋白含量进行检测，得到含目标蛋白量的外泌体；
将所述外泌体与甲基丙烯酰化明胶混合，进行共孵育，得到外泌体水凝胶混合体系。
可选的，所述目标蛋白为人血管生成素样蛋白4。
通过人血管生成素样蛋白4，可以达到激活血管再生相关的PI3K/AKT信号通路，促进血管再生的积极效果。
可选的，所述分选的方式为用抗CD146抗体和抗CD271抗体通过流式细胞仪分选间充质干细胞亚群。
具体地，可以通过分步利用抗CD31、抗CD45、抗CD235a、抗CD73、抗CD90、抗CD146和抗CD271对人脐带华通胶间充质干细胞进行分选，得到CD146+和CD271+细胞亚群及其外泌体。
可选的，所述将间充质干细胞亚群进行培养，后收集细胞上清液，具体包括：将间充质干细胞亚群进行培养，当所述间充质干细胞亚群的汇合度为60％-％70％时，加入无外泌体培养基，48h-72h后收获上清液。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的外泌体水凝胶混合体系，其组分包括间充质干细胞亚群来源的外泌体和甲基丙烯酰化明胶，由于所述间充质干细胞亚群为带有CD146+和CD271+标记的细胞亚群，其从中提取的外泌体中，外泌体表达的促进血管再生的蛋白种类多，外泌体活性高，并且具有人血管生成素样蛋白4，通过激活血管再生相关的PI3K/AKT信号通路，可以达到快速促进血管细胞增殖、成管和迁移，可以很大程度上发挥干细胞治疗所带来的治疗作用，同时也避免了干细胞移植所带来的相关不良反应，比如肿瘤形成等；使用时，添加光引发剂，达到固化的效果。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的人脐带华通胶间充质干细胞亚群(CD146+CD271+HUCWJMSCs)的分选图；
图2为本申请实施例提供的人脐带华通胶间充质干细胞亚群外泌体的提取和鉴定；
图3为本申请实施例提供的CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs促脊髓损伤小鼠的功能恢复作用；
图4为本申请实施例提供的CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs对血管内皮细胞生物学行为的影响；
图5为本申请实施例提供的CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs-水凝胶混合体系脊髓损伤小鼠的功能恢复作用。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例所用的脐带样本在分娩后健康母亲那里获得，本研究经中南大学湘雅医院伦理评审委员会批准，并在采集样本前获得所有参与者的知情同意；DMEM/F-12培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素、II型胶原酶、0.25％胰蛋白酶购自Gibco公司；CD31抗体，CD45抗体，CD235a抗体，CD90抗体，CD73抗体，CD146抗体和CD271抗体购自Biolegend公司。
实施例1
人脐带华通胶间充质干细胞CD146+CD271+亚群(CD146+CD271+HUCWJMSC)的制备。
(1)本研究经中南大学湘雅医院伦理评审委员会批准，并在采集样本前获得所有参与者的知情同意。在分娩后从健康母亲那里获得人脐带样本，并在收集后6小时内进行处理。首先用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤脐带两次以除去期待上残留的血液。在培养皿中将冲洗过的脐带切成3-4厘米长的片段，并将羊膜和脐静脉和脐动脉分离获取华通胶。然后，将华通胶切成1mm3碎块并加入1g/LⅡ型胶原酶中，37℃恒温振荡仪持续消化30min后，随即用0.25％胰酶37℃恒温振荡仪持续消化30min。以70um细胞筛过滤消化液，滤液400G离心5min，弃上清液以PBS洗2次。
(2)以流式细胞仪分离CD146+CD271+HUCWJMSC，首先利用通用技术分离一些杂质细胞，然后利用CD73抗体、CD90抗体，实施流式细胞仪法分选人脐带华通胶间充质干细胞。CD146+CD271+HUCWJMSC代表了高度富集CD146和CD271人脐带华通胶间充质干的细胞亚群，其中HUCWJMSC代表了人脐带华通胶间充质干细胞。
(3)根据需要利用抗CD146抗体、抗CD271抗体，实施流式细胞仪法分选人脐带华通胶间充质干细胞亚群。人脐带华通胶间充质干细胞亚群标志物为CD146+和CD271+。
(4)将人脐带华通胶间充质干细胞亚群并转移至DMEM/F-12培养基中，并补充10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
如图1所示，图1中的6幅图按箭头标号依次为：①去除碎片得到细胞过程图(横坐标为前向散射光-曲线下面积信号相对强度，反映细胞的体积，纵坐标为侧向散射光信号相对强度，反映细胞的颗粒度)、②获得单个细胞图(框内得到单个细胞比率较高，横坐标为前向散射光-曲线下面积信号相对强度，纵坐标为前向散射光-宽度信号相对强度)、③获得活细胞图(框内为活细胞，框外为死细胞；DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，横坐标为DAPI荧光信号相对强度，纵坐标为侧向散射光信号相对强度，反映细胞的颗粒度)、④获得CD45/235a/31-细胞图(横坐标为CD45/235a/31的荧光信号相对强度，纵坐标为侧向散射光信号相对强度，反映细胞的颗粒度，此过程去掉了内皮细胞，免疫细胞和血细胞)、⑤获HUCWJMSC细胞图(框内的为人脐带华通胶间充质干细胞，横坐标为CD90+荧光信号相对强度，纵坐标为CD73+荧光信号相对强度，CD90+和CD73+为HUCWJMSC的标志物)、⑥获得CD146+CD271+HUCWJMSC的图(框内为带有CD146+CD271+标记的细胞亚群，横坐标为CD146+荧光信号相对强度，纵坐标为CD271+荧光信号相对强度)，其中，通过图中圈出来的部分为目标细胞，6个图为目标亚细胞群的获得过程；分选后细胞的干细胞的标志物CD73、CD90的阳性率为5.96％(是从图中可直接测得阳性率)；分选后细胞的CD146、CD271阳性率为14.7％，通过两个阳性率说明了得到了CD146+和CD271+HUCWJMSC亚群。
而现有技术中，往往只得到了未分选的人脐带华通胶间充质干细胞，没有得到具有特定标记物的人脐带华通胶间充质干细胞亚群，而本申请的带有CD146+和CD271+标记的细胞亚群，其从中提取的外泌体，相比其他未分选的人脐带华通胶间充质干细胞，经研究，具有明显更强的促进血管细胞增殖、成管和迁移的能力。
实施例2
人脐带华通胶间充质干细胞中CD146+和CD271+细胞亚群外泌体制备
待CD146+CD271+细胞亚群生长至60-％70％汇合度时，收集培养上清液经0.22μm滤膜过滤后，依次经4℃，500G离心10min；4℃，2000g离心30min；4℃，10000g离心60min；110000g离心90min后，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再次110000g离心90min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到外泌体后保存于-80℃，图2中，A.光镜下CD146+和CD271+标记的细胞亚群培养7天的图片，显微镜放大倍率为100×，通过图，说明了分选后的CD146+和CD271+标记的细胞亚群具有典型间充质干细胞长梭形形态特点。B.为透射电镜观察CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs的形态。C.使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)获得CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs的粒径分布和图像，横坐标为外泌体的粒径，纵坐标为相对浓度。D对外泌体的特异性标记物进行蛋白质印迹(WB)分析，结果显示CD63和TSG101明显存在。
实施例3
亚群外泌体促进小鼠脊髓损伤模型功能修复能力
所有动物操作由中南大学动物伦理委员会授权。常规麻醉、备皮、消毒、铺单。以T10棘突为中心依次切开皮肤、皮下、肌肉和椎板，显露脊髓。采用改良Allen’s打击法，撞击力度＝10g×25mm建立脊髓打击模型。冲洗伤口，逐层关闭切口，敷料覆盖伤口并固定。所有小鼠均饲养于动物实验室内，环境温度22～24℃，相对湿度60％～80％。术后分笼饲养，标准饲料和饮水让其自行摄食。术后3d常规予以青霉素2WU/Bid肌内注射抗感染。每天挤压膀胱2～4次帮助排尿，直到排尿反射恢复。
在脊髓损伤后1、3、7、14、21、28、42和56天分别使用BMS(Basso Mouse Scale)主评分和副评分***评估脊髓损伤后小鼠后肢的运动功能和运动协调及稳定功能，BMS主评分一共9分，从0分到9分，评分越高运动功能恢复越好；BMS副评分一共11分，评分越高运动稳定性和协调性越好。由两名熟悉BMS评分的研究者在实验设计中双盲观察每只小鼠5分钟。然后记录每只小鼠的平均得分。
图3中A图横坐标为Pre-sur(脊髓损伤前的时间点)、SCI 1D、SCI 3D、SCI 7D、SCI14D、SCI 21D、SCI28D、SCI42D和56D(依次为脊髓损伤后第1，3，7，14，21，28,42及56天的时间点)，纵坐标代表了BMS主评分，从0-9分，评分越高，说明了小鼠后肢运动功能恢复越好；B图横坐标为Pre-sur(脊髓损伤前的时间点)、SCI 1D、SCI 3D、SCI 7D、SCI 14D、SCI 21D、SCI28D、SCI42D和56D(依次为脊髓损伤后第1，3，7，14，21，28，42及56天的时间点)，纵坐标代表了BMS主副评分，从0-11分，评分越高，说明了小鼠后肢运动稳定性和协调性恢复越好；图中0/50/100/150/200分别代表了外泌体的不同浓度(单位是ug/mL)。
通过图3可知，100-200μg/ml CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs治疗可显著改善小鼠脊髓损伤后的双下肢运动功能和运动的稳定性和协调性。
实施例4
亚群外泌体改善血管内皮细胞生物学行为能力
(1)亚群外泌体促进血管内皮细胞增殖。将血管内皮细胞接种至96孔板中，分别用实施例2制得的亚群外泌体(浓度100-200μg/ml，优选的为100μg/ml)，未分选HUCWJMSC-EXOs(浓度100-200μg/ml)以及PBS(对照组)处理血管内皮细胞。将10μl CCK-8试剂加入各孔的培养基中。在37℃下孵育4小时后，用酶标仪在450nm处检测吸光度。通过图5可知，表达了CD146+和CD271+的细胞亚群后提取的外泌体，相比于未分选的细胞来源的外泌体具有更强的促进血管内皮细胞增殖的效果，是由于高表达人血管生成素样蛋白4造成的。
(2)亚群外泌体促进血管内皮细胞横向迁移。将脊髓微血管内皮细胞接种至6孔板中，待细胞汇合度至90％，分别用实施例2制得的亚群外泌体(浓度100-200μg/ml)，未分选HUCWJMSC-EXOs(浓度100-200μg/ml)以及PBS(对照组)处理血管内皮细胞，使用200ul tip头尖端做十字形划痕。分别在0小时和12小时用显微镜观察测量划痕两侧的距离。通过图5可知，本申请的亚群外泌体具有更强的促进血管内皮细胞横向迁移的能力。
(3)亚群外泌体促进血管内皮细胞增殖纵向迁移。将脊髓微血管内皮细胞以1-2×104个细胞/ml的密度培养在24孔transwell小室上室，上室细胞培养基中不含血清。在下室加入500μl含10％FBS的培养基，然后分别将CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs(浓度100-200μg/ml)，HUCWJMSC-EXOs(浓度100-200μg/ml)以及PBS(对照组)，加入下室进行干预，培养12h后，擦去上室未迁移的细胞，将迁移至下室的细胞用4％多聚甲醛固定20min，然后用0.1％结晶紫染色15min，计数。通过图5可知，本申请的亚群外泌体具有更强的促进血管内皮细胞纵向迁移的能力。
(4)亚群外泌体促进血管内皮细胞成管。将脊髓微血管内皮细胞以8-10×103个细胞/孔的密度接种转移至预先铺好120μl Matrigel(Corning)的48孔板中，并分别将实施例2制得的亚群外泌体(浓度100-200μg/ml)，未分选HUCWJMSC-EXOs(浓度100-200μg/ml)以及PBS(对照组)，加入进行干预。培养在具有5％CO2的37℃培养箱中12h，显微镜下观察，计算并比较各组细胞形成分支节点数目和节段长度。通过图5可知，本申请的亚群外泌体具有更强的促进血管内皮细胞成管的能力。
通过图4可知，A为血管内皮细胞增殖实验，吸光值越高代表了血管内皮细胞增殖能力越强，与未分选HUCWJMSC-EXOs相比，CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs在4h促进血管内皮细胞效应更强。B为血管内皮细胞横向迁移实验，通过图中的血管内皮细胞向中间迁移的现象可知，与未分选HUCWJMSC-EXOs相比，CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs在12h促进血管内皮细胞横向迁移效应更强。C为血管内皮细胞纵向迁移实验，通过图中的细胞数目可知，与未分选HUCWJMSC-EXOs相比，CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs在12h促进血管内皮细胞纵向迁移效应更强；D为血管内皮细胞管形成实验，通过图中的血管内皮细胞成管特性可知，与未分选HUCWJMSC-EXOs相比，CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs在12h促进血管内皮细胞管形成效应更强。
实施例5
亚群外泌体水凝胶混合体系构建及应用
构建小鼠脊髓打击模型，将CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs、VEGF与GelMA光固化水凝胶(即甲基丙烯酰化明胶)混合，水凝胶中CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs的浓度为100-200μg/ml，VEGF的浓度为20ng/mL，避光条件下进行共孵育至少1h，形成外泌体水凝胶混合体系，于-20℃避光保存。将亚群外泌体水凝胶混合体系加热到37-40℃，使其处于水相，在损伤脊髓局部以敷料形式按照100ul/cm2覆盖亚群外泌体-凝胶缓释制剂，此外，分别覆盖PBS-凝胶制剂、HUCWJMSC-EXOs-凝胶制剂和VEGF-凝胶制剂作为对照。于365-405nm60mW/cm2条件下光照至少30s，使水凝胶从水相转变为固相，缝合伤口。CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs代表了CD146+CD271+人脐带华通胶间充质干细胞外泌体。
实施例6
亚群外泌体水凝胶混合体系应用后对脊髓损伤功能恢复的影响
在实施例3基础上在脊髓损伤后1、3、7、14、21、28、42和56天使用BMS(Basso MouseScale)主评分及副评分***评估外泌体水凝胶混合体系对脊髓损伤后小鼠后肢的运动功能的治疗作用。
通过图5可知，其横坐标和纵坐标含义与图3相同，图中，A.CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs水凝胶混合体系治疗可显著改善小鼠脊髓损伤后的双下肢运动功能。B.CD146+CD271+HUCWJMSC-EXOs水凝胶混合体系治疗可显著改善小鼠脊髓损伤后的双下肢运动稳定性和协调性。
通过BMS主评分和副评分***实验证实，所述外泌体在质量浓度为100-200ug/mL时，相比其他浓度，促进脊髓损伤功能恢复效果更好，原因在于改善运动功能和运动稳定性和协调性。通过血管内皮细胞增殖、成管和迁移实验证实，所述亚群外泌体，相比未分选细胞外泌体，促进脊髓损伤功能恢复效果更好，原因在于促进血管再生能力更强。
通过BMS主评分和副评分***实验证实，所述外泌体水凝胶混合体系以敷料形式涂覆损伤脊髓局部，所述外泌体水凝胶混合体系的用量为80-100ul/cm2。此时所述损伤脊髓局部中具有活性的外泌体的数量约为1.5×107～2.5×107个/cm2，可以通过促进血管增殖至损伤前80％左右，达到促进脊髓损伤功能恢复的效果。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种外泌体水凝胶混合体系，其特征在于，所述外泌体水凝胶混合体系的组分包括间充质干细胞亚群来源的外泌体和甲基丙烯酰化明胶，所述间充质干细胞亚群为带有CD146+和CD271+标记的细胞亚群；所述外泌体表达有人血管生成素样蛋白4。
2.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶混合体系，其特征在于，所述外泌体在所述外泌体水凝胶混合体系中的质量浓度为100-200ug/mL，优选100ug/mL。
3.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶混合体系，其特征在于，所述间充质干细胞亚群来源于人脐带华通胶；
和/或，所述外泌体水凝胶混合体系具有光敏固化性能；
和/或，外泌体的直径≤150nm。
4.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶混合体系，其特征在于，所述外泌体水凝胶混合体系以敷料形式涂覆损伤脊髓局部，所述外泌体水凝胶混合体系的用量为80-100ul/cm2。
5.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶混合体系，其特征在于，所述损伤脊髓局部中外泌体的数量为1.5×107～2.5×107个/cm2。
6.根据权利要求1所述的外泌体水凝胶混合体系，其特征在于，所述外泌体水凝胶混合体系还含有血管内皮生长因子。
7.一种外泌体水凝胶混合体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
得到母体分离后人脐带样本；
将所述人脐带华通胶样本中细胞进行分选，得到标志物为CD146+和CD271+的间充质干细胞亚群；
将间充质干细胞亚群进行培养，收获细胞上清液；
将所述细胞上清液进行过滤、分离和重悬沉淀，得到外泌体；
将外泌体中的蛋白含量进行检测，得到含目标蛋白量的外泌体；
将所述外泌体与甲基丙烯酰化明胶混合，进行共孵育，得到外泌体水凝胶混合体系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为人血管生成素样蛋白4。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分选的方式为用抗CD146抗体和抗CD271抗体通过流式细胞仪分选间充质干细胞亚群。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述将间充质干细胞亚群进行培养，后收获上清液，具体包括：将间充质干细胞亚群进行培养，当所述间充质干细胞亚群的汇合度为60％-％70％时，加入无外泌体培养基，48h-72h后收获上清液。
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