CN115025235A - 一种治疗面神经损伤疾病的复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种四面体框架核酸与miR‑22的复合物，通过独特的粘性末端链接复合，取得了比现有技术报道的四面体框架核酸与miR‑22的复合物更加优异的稳定性和治疗有效性，可促进细胞对miR‑22的摄取，有效地改善面神经损伤后的微环境，为轴突再生提供条件，对面神经损伤具有很好的治疗效果。

Description

一种治疗面神经损伤疾病的复合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗面神经损伤疾病的复合物及其制备方法和用途。

背景技术

面神经是人体居于骨管中最长的周围神经，其从脑干到面肌组织的走形复杂，功能强大，支配着颌面部肌肉的运动、腺体的分泌、味觉和听觉等。而大多数颌面部手术，都以面神经为中心，这使其十分容易受到医源性的损伤。据报道，口腔和颌面外科手术占损伤原因的40％，其中，颞下颌关节置换术是颌面外科相关医源性面神经损伤的最常见原因。其余头颈部病变切除术占25％，耳鼻喉科手术占17％，医疗美容科手术占11％，其他手术操作占7％。而损伤若未得到及时修复，亦或因修复效果不佳时，则会引起其支配的效应肌群不同程度的功能减退、面部表情缺失、泪腺/涎腺分泌异常等，严重影响患者的身心健康。

面神经损伤后，患者的康复程度与创伤或症状的严重程度密切相关。如果机械性轴突破坏过度，患者有可能需要较长的恢复时间，并伴有严重的功能障碍和后遗症(如麻木、刺痛、烧灼感或剧烈疼痛)。目前临床上根据损伤的程度已开发了多种治疗手段，例如,表情肌训练、电刺激、神经减压术、神经吻合术、神经移植等。尽管显微外科技术取得了进步，但面神经损伤后获得良好的修复效果仍然是一个临床难题，目前神经修复的主要缺点是无法保证神经功能的完全恢复。此外，在现有的周围神经再生研究中，相对较少有人关注面神经，这使得能有效治疗面神经再生的药物匮乏。

MicroRNAs(miRNAs)是一组短的、非编码的微小RNA序列，通过与信使RNA(mRNA)的3个非翻译区(3-UTR)结合，在转录水平上调节基因表达以及细胞对细胞外刺激的反应，在神经***中广泛表达，其中， miRNA-22-3p(miR-22，Gene ID：407004)已被证实是一种在突触中表达的神经元特异性miRNAs，因其具有促进初级感觉神经元再生的能力，被认为在神经修复治疗中具有潜在的价值。然而，由于其固有的不稳定性，导致其临床应用受到极大的限制。

DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)，又称四面体骨架核酸或四面体框架核酸(tetrahedral framework nucleic acids,tFNAs)是一种由4条高度特异的单链DNA通过一个简单的退火过程基于碱基互补配对原则构成的一种四面体结构。因具有良好的生物相容性、组织细胞渗透性和可编程性等诸多优点，使其成为将miRNAs递送至细胞内，提高miRNAs生物应用率的一种合适的治疗载体。

专利申请CN20211029324.0公开了一种四面体框架核酸和miR-22的复合物，用于治疗视神经损伤。但其miR-22是通过脱氧核糖核苷酸序列-TTTTT- 单链连接在构成四面体框架核酸的1～4条单链上，从而连接在了四面体框架核酸的顶点。然而，该复合物的稳定性仍有待进一步提高。特别是相比于可以直接采取玻璃体注射给药的视神经损伤疾病，面神经损伤给药的难度在于药物进入损伤处后需与体液相融合，而体液中的血清及酶可直接影响药物的稳定性，这对药物的稳定性要求更高，因而现有的四面体框架核酸和miR-22 的载药体系难以实现对面神经损伤的有效治疗。因此需要建立更加稳定有效的miRNA给药体系，治疗面神经损伤疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗面神经损伤疾病的复合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种治疗面神经损伤疾病的复合物，它由四面体框架核酸和miR-22通过粘性末端连接构成，所述四面体框架核酸和miR-22的摩尔比为1:(1～4)。

进一步地，上述四面体框架核酸和miR-22的摩尔比为1:1。

进一步地，上述四面体框架核酸由4条单链DNA经碱基互补配对形成，所述四条单链DNA中至少一条的3’端或5’端连接有粘性末端序列a；所述miR-22是3’端或5’段连接有粘性末端序列b的miR-22；所述粘性末端序列a与粘性末端序列b互补或反向互补。

更进一步地，上述粘性末端序列a的序列如SEQ ID NO.6所示，所述粘性末端序列b的序列如SEQ ID NO.7所示；

优选地，所述粘性末端序列a通过连接序列与所述单链DNA连接；更优选地，所述连接序列为TT。

更进一步地，上述4条单链中的一条5’端连接有粘性末端序列a，所述 miR-22是5’段连接有粘性末端序列b的miR-22。

更进一步地，上述4条单链DNA的序列分别独立一对一地选自SEQ ID NO.1～4所示序列；所述miR-22的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了上述复合物的制备方法，包括如下步骤：

将具有四面体框架核酸与miR-22在20～30℃共孵育20～40min；所述四面体框架核酸顶点连接有粘性末端序列a，所述miR-22连接有粘性末端序列 b，粘性末端序列a与粘性末端序列b的互补或反向互补。

进一步地，它是将四面体框架核酸的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上；所述四条单链DNA中至少一条的3’端或5’段连接有粘性末端序列a。

本发明还提供了上述复合物在治疗面神经损伤疾病的药物中的用途；优选地，所述面神经损伤疾病包括面部表情缺失、泪腺/涎腺分泌异常。

进一步地，上述药物是促进面神经修复的药物。

实验结果表明，本发明四面体框架核酸与miR-22的复合物，通过独特的粘性末端链接复合，取得了比现有技术报道的四面体框架核酸与miR-22 的复合物更加优异的稳定性和更优异的治疗有效性，可促进细胞对miR-22 的摄取，改善面神经损伤后的微环境，为轴突再生提供条件，对面神经损伤具有很好的治疗效果。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是(a)携带不同荧光基团的核酸PAGE胶图(绿色：FAM，红色：Cy5，合并：橙色)；(b)核酸染料Gelred复色后核酸的PAGE胶图；(c)携带FAM绿色荧光基团的核酸PAGE胶图；(d)携带Cy5红色荧光基团的核酸PAGE胶图；泳道(1：miR-22-FAM，2：cS3，3：cS3-miR22-FAM，4： tFNAs-Cy5，5：ctFNAs-Cy5，6：ctFNAs-miR22-FAM，7： Cy5-ctFNAs-miR22-FAM，8：Marker)

图2是(a)tFNAs的TEM及AFM图像；(b)ctFNAs-miR22的TEM 及AFM图像。

图3是(a)tFNAs的粒径及Zeta电位；(b)ctFNAs-miR22的粒径及Zeta 电位；(c)tFNAs及ctFNAs-miR22粒径及电位的统计表。

图4是RAW264.7对ctFNAS-miR22的摄取情况。(a)流式细胞术检测 3小时内RAW264.7对miR-22、ctFNAS-miR22的快速摄取；(b)细胞免疫荧光检测3小时内RAW264.7对miR-22、ctFNAS-miR22的高效摄取(红色：Cy5荧光基团；绿色：鬼笔环肽；蓝色:DAPI)，标尺：5μm

图5是SCs对ctFNAS-miR22的摄取情况。(a)流式细胞术检测12小时内SCs对miR-22、ctFNAS-miR22的快速摄取；(b)细胞免疫荧光检测12 小时内SCs对miR-22、ctFNAS-miR22的高效摄取；红色：Cy5荧光基团；绿色：细胞骨架；蓝色:细胞核，标尺：5μm。

图6是ctFNAs-miR22促进SCs增殖、迁移。(a)EdU法检测处于增殖期的SCs图像；(b)EdU的统计学分析；(c)24小时侵袭实验图像；(d)SCs 垂直迁移统计分析；(e)24小时划痕实验图像；(f)SCs水平迁移统计分析。统计数据均为平均数±标准差(n＝3)，经单因素方差分析，*P＜0.05，**P ＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001表示有统计学差异。

图7是ctFNAs-miR22促进施旺细胞对巨噬细胞的迁移。(a)24小时内不同培养环境下巨噬细胞划痕实验图像；(b)共培养划痕实验示意图；(c) RAW264.7水平迁移统计分析，数据均为平均数±标准差(n＝3)，经单因素方差分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001表示有统计学差异。(d)24小时RAW264.7垂直迁移图像；(e)共培养侵袭实验示意图。

图8是ctFNAs-miR22促进损伤后巨噬细胞及施旺细胞构建的微环境中抗炎因子的表达。(a)ctFNAs-miR22对损伤后微环境中炎症因子的影响示意图；(b)ELISA检测RAW264.7释放的TNF-α统计分析；(c)ELISA检测 RAW264.7释放的IL-10统计分析。统计数据均为平均数±标准差(n＝3)，经单因素方差分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001表示有统计学差异。

图9是ctFNAs-miR22促进损伤后巨噬细胞及施旺细胞构建的微环境中 FGF-9的表达。(d)ctFNAs-miR22对损伤后微环境中细胞因子的影响示意图； (e)ELISA检测共培养环境中经不同处理后，由RSCs释放的FGF-9。统计数据均平均数±标准差(n＝3)，经单因素方差分析，Tukey检验校正：*P＜ 0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001表示有统计学差异。

图10是不同处理后大鼠在不同时间触须运动的变化。(a)大鼠触须运动的视频记录。记录手术侧(左)和对照侧(右)的触须伸展(1)和触须收缩(2) 运动，观察从矢状线(Fr-Occ)开始的触须运动幅度和频率。(b)基于视频的触须运动评分统计。根据Vibrissa评分标准进行统计，数据均为平均数±标准差(n＝5),经单因素方差分析，Tukey检验校正：*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001，****P＜0.0001，表示有统计学差异。

图11是不同处理后面神经在不同时间的面神经组织HE染色结果，标尺： 20μm。

图12是不同处理后面神经在不同时间的面神经组织甲苯胺蓝染色结果，标尺：50μm。

图13是面神经组织在透射电镜下的图像。(a)正常面神经组织(1)及钳夹后面神经组织(2)的电镜组织图；(b)不同处理后面神经在不同时间的电镜组织图，标尺：5μm。

图14是(a)免疫荧光检测β-III Tubulin的表达；红色：β-III Tubulin，蓝：细胞核，标尺：20μm；(b)组织化学染色检测MBP的表达，标尺：20 μm。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、四面体框架核酸(tFNA)与miR-22的复合物(ctFNAs-miR22) 的合成

1.合成

将四条DNA单链(S1、S2、cS3、S4，序列见表1)溶解于TM Buffer (10mM Tris-HCl,50mM MgCl₂,pH＝8.0)中，四条DNA单链的终浓度为 1000nM，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到ctFNA；与cmiR-22(序列见表1)按1:1的比例在室温下孵育30分钟，通过基于碱基互补配对的粘性末端合成一种新型 DNA纳米复合物ctFNAs-miR22。

2.鉴定

使用PAGE电泳检测ctFNA-miR22；使用透射电镜检测ctFNA-miR22 的外形；使用纳米粒径电位仪检测ctFNA-miR22的zeta电位及粒径。

3.鉴定结果

电泳结果显示，ctFNA-miR22的条带分子量显著高于miR-22、单链DNA 以及DNA四面体(tFNAs，ctFNAs)，表明单链DNA组装在一起(图1)。

透射电镜检测发现了四面体结构的颗粒(图2)，纳米粒径电位仪检测到的zeta电位和粒径(图3)。

表1本发明涉及的核苷酸序列

*其中Cy5及FAM荧光标记基团用于示踪

以下将以实验例的方式对本发明的有益效果进一步介绍，实验例中涉及的ctFNA-miR22均以实施例1的方法制备得到，部分实验为了示踪，采用将 S1替换为5’段修饰Cy5荧光基团的单链制备ctFNA-miR22，和/或采用将 cmiR-22替换为3’段修饰FAM荧光基团的单链制备ctFNA-miR22。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、SCs细胞及RAW264.7细胞对ctFNAs-miR22的摄取

1.方法

为检测将SCs细胞及RAW264.7细胞摄取ctFNAs-miR22的能力，使用流式细胞术及细胞免疫荧光染色法观察ctFNAs-miR22孵育一定时间后SCs 中该药物的含量及定位。分组设置：对照组(未经任何处理的SCs)、250nM Cy5-miR-22、250nM Cy5-ctFNAs-miR22。

2.结果

如图4-5，3h，RAW264.7细胞对ctFNAs-miR22的摄取高达99.30％，而此时被摄取的miR-22约只有4.28％。12h，约66.20％的SCs细胞能摄取 ctFNAs-miR22，而摄取miR22的细胞约只有5.94％。激光共聚焦显微镜下观察示，红色荧光为修饰了Cy5荧光基团的miR22/ctFNAS-miR22，绿色荧光为细胞骨架，被大量摄取后的ctFNAS-miR22呈散点状均匀分布在细胞质中，而此时仅有少量miR22被SCs/RAW264.7摄取。以上结果说明ctFNAS-miR22 传递***能帮助miR-22快速、高效的被细胞摄取。

实验例2、ctFNAs-miR22调控SCs与巨噬细胞间交互作用改善损伤后微环境

1.方法

将SCs与巨噬细胞共培养；分组设置：对照组(未经任何处理的 RAW264.7/SCs)、LPS(1μg/mL)损伤组、LPS+miR-22(250nM)治疗组、 LPS+tFNAs(250nM)治疗组、LPS+ctFNAs-miR22(250nM)治疗组，进行如下检测：

(1)显微镜下观察ctFNAs-miR22对SCs增殖迁移的影响；

(2)显微镜下观察ctFNAs-miR22介导SCs促进巨噬细胞迁移的影响

(3)酶标仪检测共培养环境内细胞因子的分泌；

(4)使用免疫荧光及Western blot检测Bax、caspase-3、BCL-2的表达；

2.结果

图6所示，ctFNAs-miR22促进SCs增殖、迁移。ctFNA-miR22较ctFNA、单链miR22更能抑制NMDA引起的细胞凋亡。

图7所示，ctFNAs-miR22促进施旺细胞对巨噬细胞的迁移。

图8所示，ctFNAs-miR22促进损伤后巨噬细胞及施旺细胞构建的微环境中抗炎因子的表达。

图9所示，ctFNAs-miR22促进损伤后巨噬细胞及施旺细胞构建的微环境中FGF-9的表达。

本实验例的结果表明，ctFNAs-miR22可增强SCs与巨噬细胞间的交互作用，促进SCs介导的M2巨噬细胞极化，改善损伤后微环境，为轴突再生提供条件。

实验例3、ctFNAs-miR22促进大鼠面神经损伤的修复

1.方法：

大鼠面神经钳夹损伤模型建立1)称取每只大鼠体重，按比例稀释水合氯醛，进行腹腔注射麻醉。

2)取做面神经为手术侧，刮去左耳后周围毛发，用碘伏及75％酒精消毒。

3)在左耳后缘0.5-1mm切口，分离肌筋膜，暴露茎乳突孔，找到面神经后，用直头止血钳垂直于面神经钳夹面神经干60秒。然后用3-0丝线缝合钳夹处临近肌肉标记损伤部位。周围皮肤用3-0尼龙线缝合，在皮肤再次表面标记损伤部位。术后在大鼠饮水中加入抗生素，防止术后感染感染。

4)模型建立24小时后,将他们随机分配为4组(每组6只大鼠)：损伤组(生理盐水60μL),miR-22治疗组(250nM 60μL)、tFNAs治疗组(250nM 60μL)、ctFNAs-miR22治疗组(250nM60μL)。建模24小时后进行第一次注射，采取隔日注射，连续注射3周。对照组为正常小鼠(3只)以及其余各组中每只大鼠未行手术操作的右侧面神经。

2.体内检测：

A)大鼠触须震颤实验

B)面神经HE染色

C)甲苯胺蓝染色

D)透射电镜

E)免疫组化

F)免疫荧光

2.结果

大鼠触须震颤实验(图10)：面神经钳夹损伤后24小时观察到触须运动障碍，手术侧的触须完全停止运动，部分大鼠还伴有眼睑运动障碍等面瘫的表现，健康侧触须则可以高频率、大幅度的运动。而经ctFNAs-miR22治疗两周后即可观察到手术侧触须运动的幅度几乎完全恢复，直至第三周手术侧触须的运动频率及幅度均恢复正常。

面神经HE染色(图11)：正常对照组，神经纤维组织排列规则，结构致密，细胞核形态和分布均匀。而钳夹损伤后，神经纤维结构被破坏，出现断裂、间隙以及水肿空泡变性等。经ctFNAs-miRNA22治疗两周后，与其他处理组相比，纤维的密度明显增加，纤维排列更加紧密而规则。持续三周治疗后，ctFNAs-miRNA22组纤维再生更为明显，其纤维形态更趋近对照组。

甲苯胺蓝染色(图12)：正常神经被完整神经束膜包围，致密的髓鞘包裹着轴突，形态完整，大小均匀。而损伤后直至第三周依然可见大量坏死的轴突、脱髓鞘改变以及细胞碎片。经一周治疗后，治疗组中均能观察到具有丰富胞质的修复型SCs以及新生的轴突，尤其在ctFNAs-miRNA22治疗组中最为明显。在第二周，ctFNAs-miRNA22相较于其他各处理组，可见大量逐渐成熟的轴突与髓鞘；在第三周，ctFNAs-miRNA22组中轴突逐渐丰盈，包裹轴突的髓鞘更加致密，大小和形态更加规则

透射电镜(图13)：ctFNAs-miRNA22组的神经组织较其他组相比，从第一周开始即可出现含有大量胞质的修复型SCs和新生的轴突，在第二周 SCs的再髓鞘化及新生轴突逐渐成熟，直至第三周神经组织结构更趋近对照组。

免疫组化和免疫荧光(图14)：对神经元标记蛋白β-III Tubulin进行检测，损伤后第一周各组中β-III Tubulin(红色)均较对照组明显减少。第二周，在ctFNAs-miRNA22组中β-III Tubulin的表达较其他组相比明显增加，这种变化在第三周最为明显，且始终优于tFNAs、miR-22治疗组。对髓鞘标记蛋白MBP进行检测后观察到相似的变化。

综上，本发明提供了一种四面体框架核酸与miR-22的复合物，通过独特的粘性末端链接复合，取得了比现有技术报道的四面体框架核酸与miR-22 的复合物更加优异的稳定性和更优异的治疗有效性，可有效地促进细胞对 miR-22的摄取，改善面神经损伤后的微环境，为轴突再生提供条件，对面神经损伤具有很好的治疗效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种治疗面神经损伤疾病的复合物及其制备方法和用途

<130> GYKH1118-2022P0114940CC

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> S1

<400> 1

atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60

gaa 63

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> S2

<400> 2

acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60

tcg 63

<210> 3

<211> 77

<212> DNA

<213> cS3

<400> 3

ttgacctgtg aattactact atggcgggtg ataaaacgtg tagcaagctg taatcgacgg 60

gaagagcatg cccatcc 77

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> S4

<400> 4

acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60

ccg 63

<210> 5

<211> 34

<212> RNA

<213> cmiR-22

<400> 5

uucacagguc aaaagcugcc aguugaagaa cugu 34

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 粘性末端序列a

<400> 6

ttgacctgtg aa 12

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 粘性末端序列b

<400> 7

uucacagguc aa 12

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> S3

<400> 8

actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60

tcc 63

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-22

<400> 9

aagcugccag uugaagaacu gu 22

Claims (10)

1.一种治疗面神经损伤疾病的复合物，其特征在于，它由四面体框架核酸和miR-22通过粘性末端连接构成，所述四面体框架核酸和miR-22的摩尔比为1:(1～4)。

2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述四面体框架核酸和miR-22的摩尔比为1:1。

3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述四面体框架核酸由4条单链DNA经碱基互补配对形成，所述四条单链DNA中至少一条的3’端或5’端连接有粘性末端序列a；所述miR-22是3’端或5’段连接有粘性末端序列b的miR-22；所述粘性末端序列a与粘性末端序列b互补或反向互补。

4.如权利要求3所述的复合物，其特征在于，所述粘性末端序列a的序列如SEQ ID NO.6所示，所述粘性末端序列b的序列如SEQ ID NO.7所示；

优选地，所述粘性末端序列a通过连接序列与所述单链DNA连接；更优选地，所述连接序列为TT。

5.如权利要求3所述的复合物，其特征在于，所述4条单链中的一条5’端连接有粘性末端序列a，所述miR-22是5’段连接有粘性末端序列b的miR-22。

6.如权利要求3～5任一项所述的复合物，其特征在于，所述4条单链DNA的序列分别独立一对一地选自SEQ ID NO.1～4所示序列；所述miR-22的序列如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求1～6任一项所述复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将具有四面体框架核酸与miR-22在20～30℃共孵育20～40min；所述四面体框架核酸顶点连接有粘性末端序列a，所述miR-22连接有粘性末端序列b，粘性末端序列a与粘性末端序列b的互补或反向互补。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，它是将四面体框架核酸的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上；所述四条单链DNA中至少一条的3’端或5’段连接有粘性末端序列a。

9.权利要求1～6任一项所述复合物在治疗面神经损伤疾病的药物中的用途；优选地，所述面神经损伤疾病包括面部表情缺失、泪腺/涎腺分泌异常。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药物是促进面神经修复的药物。

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