CN115025074A - 一种新型溴酚类化合物dbbd的抗肿瘤作用 - Google Patents

一种新型溴酚类化合物dbbd的抗肿瘤作用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型的溴酚类化合物3,4‑二溴‑5‑（（（2‑溴‑3,4二羟基苄基）氧基）甲基）苯‑1,2‑二醇（DBBD）在抗肿瘤方面的应用。本发明经试验证实，DBBD能够抑制白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、***、卵巢癌、食管癌、鼻咽癌细胞的增殖，而且在体外有效抑制K562细胞单克隆的形成。进一步的实验证明，DBBD并不是通过影响K562细胞周期分布而是通过诱导K562细胞发生caspase途径依赖的细胞凋亡抑制细胞增殖。此外，DBBD可以抑制K562细胞的自噬水平，抑制癌蛋白BCR‑ABL的表达并抑制其活化。DBBD制备步骤简单，产率高，制备工艺成熟，是一种非常有应用前景的抗肿瘤药物。

Description

一种新型溴酚类化合物DBBD的抗肿瘤作用
一、技术领域
本发明是涉及一种新型的溴酚类化合物3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇3,4-dibromo-5-(((2-bromo-3,4dihydroxybenzyl)oxy)methyl)benzene-1,2-diol(DBBD)在抗肿瘤方面的应用，属于化学药领域。
二、背景技术
癌症作为一种威胁人类健康的疾病，它的成因复杂，人类目前尚无法完全治愈。现如今，癌症已经成为人类健康的第二大杀手，仅次于心血管疾病。据报道，中国每年发病数和死亡数分别占全球的23.7％和30％，均高于世界平均水平。抗肿瘤药物对于癌症的防治至关重要，但是现有的抗肿瘤药物特异性较差，往往会导致各种各样的副作用。不仅如此，由于越来越严重的耐药性问题使得现有的抗肿瘤药物的治疗效果越来越差，所以目前迫切需要开发新型的抗肿瘤药物。
溴酚类化合物是常见的海洋次级代谢产物，可以从多种海藻中分离。它具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗炎等作用。据报道，目前已经有多种溴酚类化合物被分离或合成出来，它们对人肝癌细胞，人非小细胞肺癌细胞以及人卵巢癌细胞等肿瘤细胞都有显著的抗增殖作用，而且他们的衍生物也具有非常良好的生物活性。本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇我们合成的一种新型的溴酚类化合物，具有新颖的化学结构。我们对其抗肿瘤活性进行测定并阐明了其抗肿瘤作用的机理。
本发明以前并没有3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇在抗肿瘤方面的应用。而且3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的合成路线简单，产率高，能够对多种肿瘤细胞的增殖产生抑制作用，是一种非常有前途的抗肿瘤药物。
3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的化学名为：3,4-dibromo-5-(((2-bromo-3,4dihydroxybenzyl)oxy)methyl)benzene-1,2-diol(DBBD)化学结构式见图1。
三、发明内容
本发明的目的之一是证明了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的抗肿瘤作用。
本发明的目的之二是阐明了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇抗肿瘤作用的机制。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
采用MTT技术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，人慢性粒细胞白血病耐阿霉素细胞(K562/ADR)，人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)，人非小细胞肺癌细胞(A549)增殖的抑制作用。
采用软琼脂克隆技术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇在体外对K562细胞单克隆形成的影响。
采用流式细胞术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞周期分布的影响。
采用流式细胞术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞凋亡的影响。
采用Western Blotting和MTT技术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇诱导K562细胞凋亡的机制。
采用Western Blotting技术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞自噬水平的影响。
采用Western Blotting技术，检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对癌蛋白BCR-ABL及其磷酸化水平表达的影响。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明首次证明了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的抗肿瘤作用，发现其对多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用。同时***性的阐明了其抑制K562细胞增殖的机制。
3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够在体外有效地抑制人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，人慢性粒细胞白血病耐阿霉素细胞(K562/ADR)，人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)，人非小细胞肺癌细胞(A549)的增殖。同时，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇还能够在体外抑制K562细胞单克隆的形成，而且3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞增殖的抑制作用不是通过影响细胞周期分布而是诱导细胞凋亡实现的。我们进一步探究了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇诱导K562细胞凋亡的机制，发现3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇通过激活caspase途径诱导K562细胞凋亡。而且，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够抑制K562细胞的自噬水平并抑制癌蛋白BCR-ABL以及P-BCR-ABL的表达。说明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇具有良好的抗肿瘤作用，具有广泛的应用前景。
四、附图说明
图1表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的化学结构。
图2表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够在体外有效地抑制K562细胞单克隆的形成。
图3表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞的周期分布没有影响。
图4表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够诱导K562细胞凋亡。
图5表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够调控与K562细胞凋亡有关的蛋白。
图6表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇与泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk联合作用后会降低对K562细胞增殖的抑制作用。
图7表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够降低K562细胞的自噬水平。
图8表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够以浓度依赖的方式抑制BCR-ABL与P-BCR-ABL的表达。
图9表明本发明中3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够以时间依赖的方式抑制BCR-ABL与P-BCR-ABL的表达。
五、具体实施方式
下面结合附图和试验例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
试验例1
探究了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)；人慢性粒细胞白血病耐阿霉素细胞(K562/ADR)；人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)；人非小细胞肺癌细胞(A549)。以上细胞购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；MTT(上海索莱宝生物科技有限公司)；阿霉素；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；酶标仪(Bio-Tek公司，美国)；超净工作台(Heraeus公司，德国)。
实验方法MTT法(悬浮细胞)：取处在对数生长期的肿瘤细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇，对照组加入等比例稀释的DMSO，设置阿霉素为阳性对照(浓度为1μM)，同时加入培养基对照。将96孔板置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养72h。培养结束后在每个孔中加入20μL的MTT溶液，继续置于培养箱中孵育4h。取出后每孔加入100μL三联液，置于37℃的烘箱中过夜孵育以溶解Formazan结晶。次日取出，使用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(OD)值。同时，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC50。
实验方法MTT法(贴壁细胞)：取处在对数生长期的肿瘤细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇，对照组加入等比例稀释的DMSO，设置阿霉素为阳性对照(浓度为1μM)，同时加入培养基对照。置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养72h。培养结束后在每个孔中加入20μL的MTT溶液，继续置于培养箱中孵育4h。孵育结束后弃掉上清，每孔加入150μLDMSO，置于37℃的烘箱中孵育10min后使用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(OD)值。同时，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC50。
试验结果表明，经SPSS软件统计，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用72h后能够显著抑制K562、K562/ADR、MCF-7/ADR、A549细胞增殖，IC50值见表1。说明了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，而且对K562细胞的抑制作用最强。证明了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇具有良好的抗肿瘤作用。
表1 3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用于多种肿瘤细胞72h的IC50
Figure BDA0002963153990000041
试验例2
探究了不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞单克隆形成的影响。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)；结晶紫；低熔点琼脂糖；2×DMEM(GIBCO公司，美国)。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(Heraeus公司，德国)。
实验方法软琼脂克隆法：首先用PBS配置1.6％的下层琼脂和0.8％的上层琼脂，高压蒸汽灭菌后备用。将2×DMEM培养基和1.6％的下层琼脂按1:1的比例等比例混合后取2mL注入六孔板中作为下层琼脂。随后取对数生长期的细胞进行计数，按2000/孔的数量将细胞进行稀释，体积为900μL/孔。在EP管中加入1mL 0.8％的下层琼脂和细胞后加入100μL稀释好的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇，混匀后注入6孔板中形成双层琼脂。待琼脂凝固后置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养10-14天。当肉眼可见克隆形成时取出用结晶紫进行染色4-6h，拍照。
根据图2实验结果发现，在加入3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇后，K562细胞单克隆形成的数量明显减少，并且随着3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇浓度的升高，K562细胞的单克隆形成数量逐渐减少，说明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇抑制K562细胞单克隆的形成具有浓度依赖性。进而说明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇可以在体外有效地抑制K562细胞单克隆的形成。
试验例3
探究了不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞周期分布的影响。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；阿霉素；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)；PBS；MuseTM细胞周期试剂盒。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(Heraeus公司，德国)；流式细胞仪；高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)。
实验方法流式细胞术：取对数生长期的细胞进行计数，按30万/孔的数量接种到6孔板中。实验组中加入不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇，对照组加入等倍稀释的DMSO，设置阿霉素为阳性对照(浓度为0.5μM)。置于CO2培养箱中培养24h后收集细胞样品,在4℃冷冻离心机1200rpm离心5min之后，弃掉培养基，加入预冷的PBS，洗两遍。将细胞沉淀重悬于1mL预冷的PBS中，在涡旋状态下缓慢加入2mL，-20℃预冷的无水乙醇，放在-20℃过夜固定后取出处理后的细胞，在4℃冷冻离心机1200rpm离心5min离心后去掉乙醇，之后用预冷的PBS洗两遍。室温加入PI染液200μL并在黑暗中染色30min。最后放到流式细胞仪上进行检测。
根据图3实验结果发现，在不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用后，处于G0/G1期的K562细胞比例在46.1％-51.1％之间，处于S期的K562细胞的比例在34.7％-45.5％之间，处于G2/M期的K562细胞比例在2.9％-8.1％之间。与对照组相比，在加入3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇后，K562细胞各个周期的比例没有明显的变化。但是在3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的浓度为10μM和20μM时出现了明显的sub-G0/G1峰，说明在3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用可能会诱导K562细胞凋亡。同时，在加入阳性对照阿霉素后，G0/G1期的K562细胞比例由48.8％下降为3.6％，S期的细胞比例由44.2％上升为79.6％，说明在加入阿霉素后会对K562细胞产生S期的细胞周期阻滞。以上结果表明，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞的周期分布没有影响，也进一步证明了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇并不是通过影响K562细胞的周期分布抑制细胞增殖。
试验例4
探究了不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞凋亡的影响。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)；PBS；
Figure BDA0002963153990000061
AnnexinV&Dead Cell试剂盒(Millipore，Billerica，MA，美国)。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(Heraeus公司，德国)；流式细胞仪；高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)。
实验方法流式细胞术：取对数生长期的细胞进行计数，按30万/孔的数量接种到6孔板中。实验组中加入不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇，对照组加入等倍稀释的DMSO，置于CO2培养箱中培养24h后收集细胞样品,在4℃冷冻离心机1200rpm离心5min之后，弃掉培养基，加入预冷的PBS，洗两遍。最后加入凋亡试剂盒中的染液在室温黑暗条件下染色20min并在流式细胞仪上进行检测。
根据图4实验结果发现，在加入3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇后，随着其浓度的升高，处于晚期凋亡的K562细胞比例由2.34％上升为18.94％，坏死的K562细胞比例由1.34％上升为13.38％，而处于早期凋亡的K562细胞比例在1.84％-2.08％之间，没有明显变化。说明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇诱导的K562细胞凋亡以晚期凋亡为主。以上结果表明，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够诱导K562细胞凋亡，并且以晚期凋亡为主。
试验例5
探究了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇诱导K562细胞凋亡的机制。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)；蛋白电泳液；转膜液；MTT(上海索莱宝生物科技有限公司)；1×Loading Buffer；4×上层浓缩胶缓冲液；4×下层分离胶缓冲液。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(Heraeus公司，德国)；蛋白电泳仪(Bio-Rad公司，美国)；摇床(江苏Kylin Bell实验器材公司)；ST-Ⅱ型转移电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司)；FluorChemE多功能成像分析***(Protein Simple公司，美国)；高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)。
实验方法Western Blotting法：将处在对数生长期的K562细胞接种在六孔板中(每孔3×105个细胞)，并用不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇处理24h。然后收集细胞，并在4℃以1000rpm离心5min。用PBS洗涤后，将细胞用1×Loading Buffer在4℃裂解45min。裂解完成后，煮沸15min，并保存在-20℃下。在6-12％SDS-PAGE胶上通过电泳分离蛋白质样品，并转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。切割目标条带后，将NC膜用5％脱脂牛奶密封1h，并在4℃下与目的条带的一抗孵育过夜。然后将NC膜与二抗在室温下孵育1h，并通过显影仪进行化学发光检测。
实验方法MTT法：检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇与泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk联合用药作用于K562细胞的细胞毒。取处在对数生长期的K562细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇与Z-VAD-fmk(50μM)。对照组加入等比例稀释的DMSO，同时加入培养基对照。置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养48h。培养结束后在每个孔中加入20μLMTT溶液，继续置于培养箱中孵育4h。取出后每孔加入100μL三联液，置于37℃的烘箱中过夜孵育以溶解Formazan结晶。次日取出，使用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(OD)值。同时，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率。
根据图5与图6实验结果发现，在3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇处理24h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，而促凋亡蛋白Bax的表达升高。此外，凋亡相关蛋白caspase 3、caspase 9和下游蛋白PARP均被剪切，C-Cas3、C-Cas9、C-RARP的表达升高。说明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够在K562细胞中激活caspase途径(图5)。为了验证caspase途径的激活与K562细胞凋亡的关系，加入泛caspasse抑制剂Z-VAD-fmk以检测3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞的细胞毒性。发现在加入泛caspasse抑制剂Z-VAD-fmk后，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞增殖的抑制作用明显降低(图6)。以上结果表明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇通过caspase依赖性方式诱导K562细胞凋亡。
试验例6
探究了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞自噬水平的影响。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)；蛋白电泳液；转膜液；1×Loading Buffer；4×上层浓缩胶缓冲液；4×下层分离胶缓冲液。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(Heraeus公司，德国)；蛋白电泳仪(Bio-Rad公司，美国)；摇床(江苏Kylin Bell实验器材公司)；ST-Ⅱ型转移电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司)；FluorChem E多功能成像分析***(Protein Simple公司，美国)；高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)。
实验方法Western Blotting法：将处在对数生长期的K562细胞接种在六孔板中(每孔3×105个细胞)，并用不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇处理24h。然后收集细胞，并在4℃以1000rpm离心5min。用PBS洗涤后，将细胞用1×Loading Buffer在4℃裂解45min。裂解完成后，煮沸15min，并保存在-20℃下。在6-12％SDS-PAGE胶上通过电泳分离蛋白质样品，并转移到NC膜上。切割目标条带后，将NC膜用5％脱脂牛奶密封1h，并在4℃下与目标条带的一抗孵育过夜。然后将NC膜与二抗在室温下孵育1h，并通过显影仪进行化学发光检测。
根据图7实验结果发现，在加入3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用24h后，随着其浓度的升高，K562细胞中LC3-II与LC3-I蛋白水平的比率逐渐升高。LC3-II水平升高可能是由于自噬体形成增加或损害了自噬体成熟。因此，我们检测到P62蛋白的表达，该蛋白通过自噬途径降解并在自噬受损时积累。我们发现在3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用后，K562细胞中P62的表达增加，这表明LC3-II水平的增加是3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇抑制自噬小体成熟的结果。随后我们检测了另一种与自噬有关的蛋白Beclin-1，它是自噬终止的一种关键蛋白，我们发现Beclin-1的表达是逐渐降低的。这些结果表明3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇能够降低K562细胞的自噬水平。
试验例7
探究了3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇对K562细胞中BCR-ABL和P-BCR-ABL表达的影响。
细胞：人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，购自中国科学院上海细胞库。
试剂：3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇；IMDM干粉培养基(GIBCO公司，美国)；蛋白电泳液；转膜液；1×Loading Buffer；4×上层浓缩胶缓冲液；4×下层分离胶缓冲液。
仪器：CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(Heraeus公司，德国)；蛋白电泳仪(Bio-Rad公司，美国)；摇床(江苏Kylin Bell实验器材公司)；ST-Ⅱ型转移电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司)；FluorChem E多功能成像分析***(Protein Simple公司，美国)；高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)。
实验方法Western Blotting法：将处在对数生长期的K562细胞接种在六孔板中(每孔3×105个细胞)，并用不同浓度的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇处理不同的时间。然后收集细胞，并在4℃以1000rpm离心5min。用PBS洗涤后，将细胞用Loading Buffer在4℃裂解45min。裂解完成后，煮沸15min，并保存在-20℃下。在6-12％SDS-PAGE胶上通过电泳分离蛋白质样品，并转移到NC膜上。切割目标条带后，将NC膜用5％脱脂牛奶密封1h，并在4℃下与所示的一抗孵育过夜。然后将NC膜与二抗在室温下孵育1h，并通过显影仪进行化学发光检测。
根据图8与图9实验结果发现，在加入3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇作用24h后，随着其浓度的升高，K562细胞中BCR-ABL和P-BCR-ABL的表达逐渐降低(图8)。同时，当3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇的浓度为10μM时，随着其作用时间的延长，BCR-ABL和P-BCR-ABL的表达逐渐降低(图9)。以上结果表明，3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇在K562细胞中以浓度依赖性和时间依赖性显著抑制癌蛋白BCR-ABL的表达并抑制其活化。

Claims (7)

1.一种新型溴酚类化合物3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇在抗肿瘤领域的应用。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤作用，其特征在于所说的肿瘤细胞为：人白血病细胞系、人恶性淋巴瘤细胞系、人乳腺癌细胞系、人非小细胞肺癌细胞系、人结肠癌细胞系、人胃癌细胞系、人***细胞系、人卵巢癌细胞系、人食管癌细胞系、人鼻咽癌细胞系。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤方面的应用，其特征在于：所述的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇可以制作白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、***、卵巢癌、食管癌、鼻咽癌的药物。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤方面的应用，其特征在于：所述的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇可以在体外有效地抑制K562细胞的增殖。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤方面的应用，其特征在于：所述的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇可以诱导K562细胞发生caspase依赖的细胞凋亡。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤方面的应用，其特征在于：所述的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇可以抑制K562细胞的自噬水平。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤方面的应用，其特征在于：所述的3,4-二溴-5-(((2-溴-3,4二羟基苄基)氧基)甲基)苯-1,2-二醇可以促进K562细胞中BCR-ABL的降解并降低其磷酸化水平。
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