CN115023612A - 用于检测水源中污染性重金属的装置、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及使用简单、快速和高选择性的免疫分析***，包括横向和向上流动分析***来检测水样中的重金属(例如，铅)的电子读取器装置、检测组合物和方法。该免疫分析旨在检测非常低水平的污染分析物，诸如低于1ppb的铅，对任何常见水源(例如自来水或饮用水)具有高特异性和选择性。有利地，该分析的实施不需要正式的技术培训或昂贵的设备或试剂，并且配备有可用于50个或更多样品的多用途阅读器。免疫分析样品收集器***是消耗品(一次性)，并且可以任何所需数量购买。分析结果使用SafeSpout设计的应用程序从阅读器无线传输，其根据测试结果提供重要信息。

Description

用于检测水源中污染性重金属的装置、组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月6日提交的美国临时申请序列号62/944,739的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并在此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年12月3日，名为052652-501001WO_SL_ST25.txt，大小为4,073字节。
技术领域
本文描述的主题一般涉及样品收集和制备***、污染物检测方法和新型试剂、样品读取器仪器、相关软件和智能手机应用程序，用于使用横向或向上流动分析技术检测饮用水(例如，饮用水源)中以及环境和工业用水(例如，非饮用水源)中的污染重金属(例如铅)。具体而言，本公开涉及用于简单实施和检测饮用水、自来水和其他易消耗类型的水源以及环境和工业水源中的总铅的免疫传感装置。有利地，本公开提供了用于检测微粒和溶解铅的装置、组合物和方法，它们使用简单、灵敏度高、特异性高，并且无需使用重金属检测通常需要的复杂的装置、多个用户步骤和专门知识，即可提供快速电子读数。
背景技术
铅污染是一个严重的全球健康和环境问题。铅可以在体内进行生物蓄积，并产生严重的长期健康后果，诸如成人肾脏问题和高血压以及儿童身心发育迟缓(Jones,A.2009)。US-EPA制定了国家主要饮用水法规(NPDWR)的目标，即在市政饮用水***中实现零铅，但在所有市政供水***中的行动水平为15ppb。最近的一项研究表明，在自来水中测得的铅总质量中，高达75％来自连接住宅和水管的铅服务管线(AWWA研究基金会，2008年)。据报道，在美国市政饮用水中测得的铅总量中，高达30％是由含铅管道或旧房管道腐蚀产生的颗粒物(>45μm)(Deshommes,E.et al.,2010)。此外，饮用水中的铅通常以胶体形式存在(尺寸<45μm)(Deshommes,E.et al.,2010)，这增加了饮用水中不处于溶解离子状态的总铅的比例。目前使用分析测试条的可用技术仅提供溶解的离子铅的定性测量，因此低估了饮用水样中的总铅含量。随着公民越来越意识到与摄入和吸入铅相关的危险，越来越需要提供简单的手持装置，该装置可以快速、准确和定量地测量市政和其他常用水源中的总铅(颗粒和溶解)量。理想情况下，该***应该是用户友好的，并且具有最少数量的程序步骤，同时产生可靠和可重复的结果，即使是由未经培训的个人执行。
US 5,019,516描述了一种从饮用水样中提取铅，然后定量测定样品中总铅的方法。US 5,019,516中描述的方法已发展为LeadTrakTM***(Hach)，并涉及水样中铅的提取、复合、中和和比色测定。该***已适用于手持式袖珍色度计，但样品制备和结果的准确性需要熟练的用户、昂贵的试剂且耗时。
US 5,089,663描述了新的刚性螯合结构，和制备它们的方法以及在制备放射性金属标记的免疫缀合物中使用它们的方法。新的螯合物包括环己基EDTA、环己基DTPA和TTHA的反式形式及其衍生物。
US 8,859,265描述了一种横向流动免疫分析装置，用于以改进的准确度对全血中的分析物进行定性和定量分析。
US 8,614,101公开了横向流动分析装置和方法，其结合用于即时检验装置的裂解剂。将含有可疑目标分析物(例如药物、病毒、核酸、RNA等)的细胞样品(例如红细胞、白细胞)加载到包含纸条的样品应用区域并流动，直到它们遇到预加载的裂解剂，在那里它们迁移到结合区和检测区。描述了用于在细胞裂解后检测分析物的免疫分析法。
US 6,699,722公开了用于定性和定量检测样品中分析物的方法和装置。该方法描述了阳性检测分析***，即更强的信号对应于存在更多的分析物。所公开主题的装置可以包括样品施加区、包括移动分析物类似物的移动区、主要和次要捕获区，每个区都包括固定的结合配偶体，该结合配偶体对被测试的分析物具有结合亲和力，用于检测分析物类似物。在移动区使用示踪剂缀合物，该缀合物略微迁移到分析物样品后面，因此任何样品在缀合物之前接触结合配偶体。基于结合在次级捕获区中的缀合物提供的可检测信号的存在和/或强度来可视化结果。
US 7,109,942公开了用于测定液体样品中分析物的测试装置，包括:(a)硝酸纤维素载体，(b)结合试剂，当分析物存在时，在硝酸纤维素的限定检测区域中有效捕获分析物载体；(c)标记试剂，其在存在液体样品的情况下可在硝酸纤维素载体中自由移动，选择所述标记试剂使得当分析物存在于液体样品中时它被捕获在检测区中；(d)样品接收构件；和(e)控制区，其设置在硝酸纤维素载体上或硝酸纤维素载体中，位于检测区远离样品接收构件的一侧。对照区包含对照结合试剂，无论样品中是否存在分析物，该对照结合试剂都会结合标记试剂。施加到样品接收构件的液体样品被输送到然后沿着硝酸纤维素载体的长度通过检测区，检测区中标记试剂的检测表明液体样品中存在分析物。
US 6,020,147公开了用于检测疑似含有分析物的载液中分析物的存在的装置。该装置包括液体可渗透的固体介质，其限定了能够支持毛细流动的流体流动路径，沿该路径是i)施加载液的位点，ii)对分析物或化学部分特异的扩散结合的标记反应物，该化学部分本身是分析物与另一种化学部分的反应产物，所述标记的反应物能够沿流动路径流动，其中所述扩散结合的标记反应物和所述分析物或化学部分具有特定的配体-受体(抗原-抗体)对，以及iii)一个或多个沿流动路径间隔开的区域，每个区域具有与其结合的预定量的反应物，该反应物对分析物或化学部分是特异性的，该化学部分本身是分析物与另一化学部分的反应产物。可以通过使载液与施加位点接触以允许液体通过毛细流动沿着流动路径通过使得分析物或分析物与另一化学部分的反应产物结合到标记的反应物和结合到固体介质的反应物的方式来使用该装置。标记的反应物与结合到固体介质的反应物夹在分析物或化学部分之间，该化学部分本身是分析物与另一个化学部分的反应产物。
US 6,352,862公开了适用于家庭、诊所或医生手术的分析装置，旨在快速给出分析结果，并且需要用户的技能和参与程度最低。在家中使用测试装置来测试怀孕和生育期(***)现在很普遍。
US 6,001,658描述了测试条装置，该装置可以单独使用，也可以与具有与分析物结合的可扩散标记结合配偶体、固定分析物和包含固定抗体的检测区域的相关外壳组件一起使用。该测试条分析提供分析物浓度的半定量读数。
美国专利号5,622,871公开了可用于例如妊娠测试的分析测试装置，包括由防潮固体材料(诸如塑料材料)构成的中空外壳，该外壳包含干燥的多孔载体，该载体通过吸水的样品接收部件与外壳的外部间接连通，该样品接收部件从外壳突出，使得液体测试样品可以施加到接收构件并从那里渗透到多孔载体，在第一区中含有标记的特异性结合试剂的载体在潮湿状态下可在多孔载体内自由移动，并且在空间上与第一区不同的第二区中，未标记的特异性结合试剂用于相同的分析物，未标记的试剂永久固定在载体材料上，因此在潮湿状态下不可移动，这两个区域的布置使得施加到多孔载体上的液体样品可以通过第一区渗透到第二区中，并且该装置在外壳中装有孔，能够观察标记试剂在第二区域中的结合程度(如果有的话)。该装置可以包括用于突出吸水构件的可拆卸帽。
US 5,451,507描述了双区、不连贯的免疫成像方法，其中第一区具有非扩散结合的试剂，该试剂与组分结合，例如分析物复合物或缀合物，结合到或能够结合到信号产生***的构件。当待测分析物存在时，它会在进入第二区时结合。分析物的浓度直接取决于组分迁移到第二区的距离。
Marzo et al.(2013),Anal.Chem.85:3532-3538描述了一种集成的横向流动纸基免疫检测装置，用于检测饮用水中的镉(Cd2+)。该检测***基于沉积在结合垫上的Cd-EDTA-BSA-金纳米颗粒缀合物与分析样品中形成的Cd-EDTA复合物之间的竞争反应，用于对Cd-EDTA特异但不是游离Cd2+的单克隆抗体的相同结合位点，其固定在检测测试线上。Cd2+检测水平低至0.1ng/ml，定量水平低至0.4ng/ml。
Kuang et al.(2013),Readers 13:4214-4224描述了一种用于免疫检测饮用水中铅的快速且灵敏的横向流动检测条。该***基于对分析物的检测，该分析物通过毛细管流动迁移通过条上的一系列区域，在这些区域中，分析物首先与螯合剂或缀合物结合，然后与识别复合物或缀合物的分析物-螯合剂的特异性抗体结合。
Khosraviani et al.(2000),Bioconjugate Chem.11:267-277公开了识别Pb(II)-环己基二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)复合物的单克隆抗体(2C12)的产生和表征。当CHXDTPA用作复合物或与BSA的缀合物中的螯合剂时，添加Pb(II)可将抗体对复合物的亲和力提高200倍以上。使用Pb(II)的原型免疫分析的灵敏度可以通过改变测试溶液中用于复合Pb(II)的固定金属螯合物和/或可溶性螯合剂的结构来调节。
D.Rahmi et al.(2007),Talanta 72:600-606；Y.Zhu et al.(2005),Bull ChemSoc Japan 78:107-115；and Y.Zhu et al.(2004),Bull Chem Soc Japan 77:1834-1842描述了一种去除海水样中溶解盐和Ca2+的方法，该方法适用于处理自来水所需的样品制备方法。
因此，本领域仍然需要一种快速、高灵敏度和用户友好的分析装置，以检测市政和家庭饮用水/自来水***和其他水源中极低水平的颗粒、胶体和溶解铅，即总铅。理想的分析应该包括最少数量的程序步骤，产生可靠和可重复的结果，并且对于未经培训的个人来说简便，可以在家中、现场和工作环境中使用。
发明内容
本公开提供了用于识别并量化饮用水中ng/ml(ppb)水平的分析物的读取器装置、检测组合物和检测方法。本公开的实施方案提供了分析装置，例如横向流动或色谱分析，其可靠地检测并准确测量饮用水中低浓度(<1ppb)的溶解铅(Pb(II))和颗粒铅，即使在存在潜在的干扰分析物的情况下也是如此。在一些实施方案中，样品预处理***防止分析受到来自饮用水中通常存在的钙和其他金属和化学物质的干扰。在一些实施方案中，样品预处理***溶解由于市政管道和管道***的腐蚀而可能存在于饮用水中的颗粒铅和胶体铅。来自本文公开的方法和装置的结果可以使用诸如扫描仪的光电读取器来定量读取。
本文提供检测并定量样品中的分析物的方法，其包括以下步骤:a)获得潜在地含有目标分析物的样品；b)将所述样品转移至样品收集器，预处理所述样品以制备用于检测并定量分析物的样品；c)使所述经预处理的样品与测试条接触；d)使用所述测试条分析所述经预处理的样品以确定所述经预处理的样品中分析物的浓度；以及e)定量所述分析物的浓度，其中使用所述测试条定性且定量地测量分析物的浓度。
本文进一步提供包括免疫分析测试条的检测并定量样品中的分析物的方法，其中样品施加区和检测区在色谱免疫分析测试条上，并且所述测试条进一步包括样品垫，其中将所述经预处理的样品施加到所述测试条或首先与所述测试条和结合区或结合垫接触，其中所述结合垫包括至少一种能够随样品介质迁移的标记的结合配偶体，和捕获区或捕获垫，其中所述捕获垫包括含有螯合剂-缀合物的测试线和含有抗物种抗体的对照线，和吸收垫，其中样品流终止。
本文公开的方法和装置可用于检测液体样品中各种类型水源中的分析物(例如铅)，该液体样品选自下组：自来水、井水、未过滤的饮用水、经过滤的饮用水、包含在管道内的家用管道水、瓶装水、城市用水、含水层水、包括工业废水源的废水、流出水和河水。
使用本公开的装置、组合物和方法可以容易地检测可能含有目标分析物(例如铅)的任何已知来源的饮用水或消耗水或非饮用水或工业用水。在一些实施方案中，公开了该方法，其中所述样品是选自下组的液体样品:自来水、井水、未过滤的饮用水、经过滤的饮用水、包含在管道内的家用管道水、瓶装水、城市用水、含水层水、包括工业废水源的废水、流出水和河水。
在一些实施方案中，所述分析物包括重金属。在一些实施方案中，所述重金属选自铅Pb(II)、铬Cr(II)、砷Ar(II)、镉Cd(II)和汞Hg(II)。在一些实施方案中，所述重金属是铅Pb(II)。
在一些实施方案中，该测定包括多用途读取器装置、一次性样品收集和制备***、检测组合物和检测方法，其提供对水样中分析物(例如铅)存在的定量评估，例如，通过比色或荧光分析。在一些实施方案中，提供读取器装置、样品收集和制备***、检测组合物和检测方法用于定量测定水样中总铅的存在。在一些实施方案中，提供测定***，该测定***由一个或多个横向或向上流动的免疫分析条组成，该条被封装在具有内部设计以管理流体的塑料外壳内，该塑料外壳包括顶部外壳和底部外壳；样品处理组件(例如，收集和预处理***)；用于传感、检测分析，供电和电子通信的光电组件；以及用于驱动***构件的机械组件。在本公开的一个方面，分析物读取器装置适于与软件应用程序通信以允许快速、定量地解释水样中的分析物浓度。在一些实施方案中，可以将分析结合到一次性分析盒中，然后将其与样品收集和制备***集成，统称为一次性耗材。多用途读取器可包括照明、电机驱动、蓝牙传输(BLE)功能、集成电路和微控制器、可编程固件和电池。在一些实施方案中，提供由智能手机应用程序(“app”)和后端软件平台组成的软件，用于将分析物浓度结果从读取器装置传送给用户。
本公开的一些实施方案的分析***还可以提供由螯合剂(例如，CHXADTPA)、螯合剂-缀合物(CHXADTPA-缀合物)、重组抗体、试剂、信号纳米颗粒、样品施加垫、捕获垫、和吸收垫组成的免疫分析条。在一些实施方案中，免疫分析条可以由不同部分组成，包括样品应用区域或垫、缀合物垫、捕获垫，其包括测试线和对照线以及吸收垫。缀合物垫可以包括结合样品中的铅的不同试剂。例如，缀合物垫可包含螯合剂(诸如CHXADTPA)，其结合铅以形成Pb(II)-CHXADTPA复合物。缀合物垫还可以包含螯合剂缀合物，例如与牛血清白蛋白(BSA)缀合的CHXADTPA，其在Pb(II)、Pb(II)-CHXADTPA-BSA缀合物的存在下形成。捕获垫测试线包括特异性针对Pb(II)-CHXADTPA复合物或Pb(II)-CHXADTPA缀合物中所含结合铅的单克隆抗体。单克隆抗体与金纳米颗粒(AuNP)共价连接以进行比色检测，并且单克隆抗体-AuNP复合物嵌入测试线。在一些实施方案中，特别是如果采用横向流动分析，则样品接收垫、缀合物垫、捕获垫、测试和对照线以及吸收垫彼此连续流体接触。在不需要样品垫或样品接收区域的替代实施方案中，例如，当采用色谱分析并且样品向上流动时，结合垫、捕获垫、测试和对照线以及吸收垫彼此之间保持连续的流体接触。
在一些实施方案中，测试线中的重组抗体对Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的亲和力可能高于对Pb(II)-CHXADTPA复合物的亲和力，使得Pb(II)-缀合物可以结合在测试线处并且Pb(II)-CHXADTPA复合物可以通过对照线。在一些实施方案中，测试线中的单克隆抗体对Pb(II)-CHXADTPA复合物和Pb(II)-CHXADTPA-缀合物两者具有相同的亲和力。在一些实施方案中，嵌入测试线的单克隆抗体可以对Pb(II)-CHXADTPA复合物具有更高的亲和力，并且Pb(II)-CHXADTPA复合物可以在测试线处结合。
本公开的分析的实施方案可以包括将疑似含有铅的液态水样引入到样品收集制备装置的出口或分配室处的条上进行检测，并允许样品通过毛细作用从结合垫底部通过捕获垫测试和对照线向上或沿条迁移，最后到达吸收垫。报告基团或检测分子可以存在于样品接收垫、缀合垫中，在迁移路径中但在测试和对照线之前，或单独施加于条。在一些实施方案中，检测分子与单克隆抗体共价连接。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXADTPA-缀合物Pb(II)-CHXADTPA复合物后面迁移，使得Pb(II)-CHXADTPA复合物在Pb(II)-CHXADTPA缀合物之前到达测试线，从而减少测试线处的信号并通过与抗BSA抗体的间接抗体结合而与对照线结合。
在一些实施方案中，所述经预处理的样品中重金属检测水平的浓度约为<1ppb至约20ppb。在一些实施方案中，所述经预处理的样品中金属的浓度为<1ppb至约15ppb，<1ppb至约8ppb，<1ppb至5ppb，<1ppb至2ppb。在一些实施方案中，所述经预处理的样品中铅Pb(II)的浓度<1ppb。
本公开进一步提供用于检测并定量样品中的分析物的***，其包括以下步骤:a)获得潜在地含有目标分析物的样品；b)将所述样品转移至样品收集器进行预处理以制备用于检测并定量分析物的样品；c)使所述经预处理的样品与测试条接触；d)使用所述测试条分析所述经预处理的样品以确定样品中分析物的浓度，其中使用所述测试条定性且定量地测量分析物的浓度；e)定性地测定在步骤d)中检测的金属的浓度水平，其中在60分钟内，45分钟内，30分钟内，20分钟内或15分钟内测定结果；以及f)定量地测定在步骤d)中检测的金属的浓度水平，其中所述金属浓度水平被记录在多用途读取器装置中。在一些实施方案中，使用后端软件平台将浓度数据无线传输到智能手机应用程序。在一些实施方案中，步骤b)中的所述样品收集器和步骤f)中的所述多用途读取器装置的部分是一次性的或可再回收的。
本公开还提供用于检测并定量液体样品中的分析物的装置，其包括:分析物检测读取器100；样品收集器110；和分析盒130，其中所述分析物检测读取器被设计成保持样品收集器和用于读取样品的分析盒。在一些实施方案中，所述样品收集器进一步包括样品预处理***112。在一些实施方案中，所述样品预处理***112包括:水收集室114；含有酸的泡罩安瓿116；分配棒118；离子交换树脂120；排出管121；废物收集室122；分离室123；样品分离室124；含有中和试剂和螯合剂的泡罩或等同物125；样品分配室126；和免疫分析条128a和128b，其中所述免疫分析条检测不同浓度范围的分析物。
在一些实施方案中，所述免疫分析条用于检测并定量分析物，其包括:底板202；样品接收垫204a和干燥样品处理垫204b；第一结合垫区206a和第二结合垫区206b，其中所述第一结合垫区和所述第二结合垫区浸渍有与检测试剂结合的第一结合配偶体；并且其中与所述检测试剂结合的第一结合配偶体能够沿着所述免疫分析条流动到细长的分析物检测捕获垫208；第一捕获区，其包括固定有分析物螯合剂-缀合物的测试线210，其中与所述检测试剂结合的第一结合配偶体竞争测试线处的结合位点；第二捕获区，其包括固定有第二结合配偶体的对照线212；以及吸收垫214a和吸收储存垫214b，其中所述吸收垫用作芯吸机构以调节从样品接收垫到吸收储存垫的毛细流动。
在一些实施方案中，所述结合配偶体包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链(scFv)抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是命名为2C12的单克隆抗体，其中2C12包括轻链和重链可变区。在一些实施方案中，所述轻链和重链可变区分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；其中2C12的轻链可变区中的互补性决定区(CDR)由残基24-39(SEQ ID NO:3)、残基55-61(SEQ ID NO:4)和残基95-103(SEQ ID NO:5)组成；并且其中2C12的重链可变区中的互补性决定区(CDR)由残基26-35(SEQ ID NO:6)、残基50-65(SEQ ID NO:7)和残基98-105(SEQ ID NO:8)组成。
在一些实施方案中，所述装置进一步包括螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂选自下组:CHXDTPA、CHXEDTA、EDTA、EGTA、柠檬酸盐和ITCBE或任何前述的游离酸。在一些实施方案中，所述螯合剂是CHXDTPA。
在一些实施方案中，所述装置进一步包括检测或标记试剂。在一些实施方案中，所述检测或标记试剂选自下组:金纳米颗粒(AuNP)；胶乳微粒；包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的报告基团；包括银、硒和碳的金属溶胶标签。在一些实施方案中，所述检测或标记试剂是金纳米颗粒(AuNP)。
附图说明
本领域技术人员将理解，下文描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本公开的范围。
图1A-1C描绘了本公开的代表性分析装置的三维示意图，其示出了组成部件。(A)示出了根据本公开的实施方案的代表性读取器装置。(B)示出了根据本公开的实施方案的具有分析盒的代表性样品收集器。(C)示出了根据本公开的实施方案的代表性样品收集器，其包括横截面。
图2A-2B示出了根据本公开实施方案的免疫分析条的实施方案。(A)具体示出了根据本公开的实施方案的显示不同功能区域的免疫分析条的侧视图。(B)示出了根据本公开的实施方案的免疫分析条的俯视图，其显示了沿着条的不同功能区域。
图3示出了免疫分析条配置的替代实施方案，其中流动是通过分析盒内的向上毛细迁移来实现的。
图4描绘了根据本公开的实施方案的描述本公开的用于测定水样中的分析物浓度的方法的分析的流程图和工艺概述，从样品制备到定量测定以及通过远程装置通过电子读数进行结果传输。
图5A-5B示出了单克隆抗体2C12轻链可变区(A)和重链可变区(B)的氨基酸序列。互补决定区(CDR)由覆盖各个氨基酸序列的边界区域表示。
图6A-6B示出了根据本公开的实施方案的使用硝酸纤维素条的免疫分析的铅检测范围测试(以ppb为单位)的结果。(A)示出了根据本公开的实施方案的条1，其包含2.5μg/ml与金纳米颗粒结合的重组抗体和40nM螯合剂复合物。泳道分别对应于:1)未添加螯合剂；2)0ppb；3)0.2ppb；4)0.5ppb；5)1.0ppb；6)1.9ppb；7)3.9ppb；和8)7.8ppb。(B)示出了根据本公开的实施方案的条2，其含有20μg/ml与金纳米颗粒结合的重组抗体和120nM螯合剂复合物。泳道分别对应于:1)未添加螯合剂；2)0ppb；3)1.0ppb；4)1.9ppb；5)3.9ppb；6)7.8ppb；7)15.5ppb；和8)20.7ppb。
图7示出了根据本公开的实施方案的免疫分析检测***的示意图，其显示了标记的单克隆抗体与测试线或对照线结合，取决于水样是否含有低浓度或高浓度的分析物(例如铅)。
具体实施方式
本公开总体涉及用于检测饮用水或疑似含有重金属污染物(包括铅)的其他水源中的分析物(例如铅)的快速、易于使用的分析装置、组合物和使用方法。该分析可以定量检测饮用水和其他饮用水源中非常低水平的分析物(例如浓度<1ppb的总铅)，同时使用最少的程序步骤。该分析***旨在供未经培训的个人使用。本公开涵盖可含有诊断特异性结合分析的诊断试剂盒，并且在一些实施方案中，含有免疫诊断特异性结合测定***。此外，读取器装置由于其简单的方法步骤和准确性，使其适用于现场使用，诸如在家庭、诊所和护理点(POC)中。测试结果通过有限的用户界面自动读取，并通过与智能手机应用程序的电子(例如无线)通信提供定量评估。
除非另有说明，否则本公开中的术语应由相关领域的普通技术人员根据常规用法来理解。
如本文所用，术语“样品”涵盖从饮用水源获得的样品。样品可以是任何饮用水源。此类样品包括但不限于自来水或饮用水、管道内所含的家用管道水、瓶装水、井水和过滤水。待分析的样品可以通过简单的收集获得，并且可以来自单一来源，即，不是来自不同来源的混合物。在一些实施方案中，样品是自来水或饮用水样，但决不限于自来水或饮用水样。
横向或色谱流动测定基于竞争性免疫分析，其包含抗体、螯合剂复合物、由螯合剂和蛋白质组成的螯合剂缀合物以及检测分子。在竞争性测定中，分析物和标记的检测分子或报告基团同时被引入结合剂，使得这些分子竞争结合位点。对于竞争性免疫分析，标记典型地是标记的分析物缀合物或复合物，它与样品中存在的任何未标记的分析物竞争结合抗体。在该竞争性测定中，分析物和标记的报道分子同时被引入结合剂，使得这些分子竞争结合位点。
本文提供了检测并定量样品中的分析物的方法，其包括以下步骤:a)获得潜在地含有目标分析物的样品；b)将所述样品转移至样品收集器，预处理所述样品以制备用于检测并定量分析物的样品；c)使所述经预处理的样品与测试条接触；d)使用所述测试条分析所述经预处理的样品以确定所述经预处理的样品中分析物的浓度；以及e)定量所述分析物的浓度，其中使用所述测试条定性且定量地测量分析物的浓度。
在一些实施方案中，所述经预处理的样品中重金属检测水平的浓度约为<1ppb至约20ppb。在一些实施方案中，所述经预处理的样品中金属的浓度为<1ppb至约15ppb，<1ppb至约8ppb，<1ppb至5ppb，<1ppb至2ppb。在一些实施方案中，所述经预处理的样品中铅Pb(II)的浓度<1ppb。
在一些实施方案中，检测并定量的方法进一步包括以下步骤:f)在步骤b)中转移样品的60分钟内测定步骤d)中检测到的金属的浓度水平。在实施方案中，在步骤b)中转移样品的45分钟内测定浓度水平。在实施方案中，在步骤b)中转移样品的30分钟内测定浓度水平。在实施方案中，在步骤b)中转移样品的15分钟内测定浓度水平。
在另一种竞争性分析形式中，报告基团或检测分子(例如AuNP)与抗体共价连接，抗体结合位点的竞争发生在与配体复合的分析物(例如Pb(II))和与缀合物复合的分析物之间，即CHXADTPAvs.CHXADTPA-BSA。
样品收集器是多室***，其使用户能够从家用水龙头或其他消耗性水源收集水样，以便在引入侧流分析之前进行准备。该***由多个腔室组成，其中精确量的样品水被(i)酸化，例如用硝酸，以溶解颗粒中的铅，(ii)中和，(iii)允许流过离子交换树脂捕集金属，(iv)用醋酸铵溶液洗涤以去除饮用水中常见的可能干扰下游铅免疫分析的金属(例如钙、镁)，(v)用更高浓度的醋酸铵溶液洗涤以将铅从树脂洗脱以捕获到浓缩溶液中，和(vi)与金属螯合剂和缓冲液结合，然后精确计量到横向或色谱流动分析中。流动测定盒与样本收集装置集成在一起，并且可能需要或可能不需要用户步骤来***样本收集器。流式分析盒和样品收集装置这两个项目统称为“耗材”，在进行单个分析物测试的过程中一起使用一次。
光电读取器由光学读取头、PCBA和蓝牙(BLE)发射器组成，可解释定量检测信息并将其传送到消费者智能手机上的专有用户应用程序。此外，读取器含有电机驱动器，该电机驱动器驱动耗材的各个步骤，从样品制备到测试结果准备好时横向流动分析的自动移动，以允许读取头扫描结果。在一些实施方案中，读取器由可更换电池供电并被设计为使用大约20至100次，每次在最终用户进行新测试时使用新耗材。在一些实施方案中，读取器被设计为使用约30至90次、约40至80次、约50至70次或约60至65次。
本发明进一步提供检测并定量样品中的分析物的方法，包括免疫分析测试条，其中样品施加区和检测区在色谱免疫分析测试条上，并且所述测试条进一步包括样品垫，其中将所述经预处理的样品施加到所述测试条或首先与所述测试条和结合区或结合垫接触，其中所述结合垫包括至少一种能够随样品介质迁移的标记的结合配偶体，和捕获区或捕获垫，其中所述捕获垫包括含有螯合剂-缀合物的测试线和含有抗物种抗体的对照线，和吸收垫，其中样品流终止。
为了帮助理解本公开，图1示出了根据本公开实施方案的分析检测***的代表性设计和内部工作组件。该***由读取装置、样品收集器和分析盒组成。图1A示出了分析物检测***读取器装置100的代表性设计，其与含有***的分析盒130的消耗性样品收集器110一起描绘。图1B示出了样品收集器110的实施方案，其显示了代表性样品预处理***112和样品预处理***112的实施方案的横截面细节(右)和分析盒130。图1C示出了包含在样品收集器内的样品预处理***112的实施方案。如在112的横截面细节中可以看出，预处理***包括代表性的水收集室114，其收集含有用于测试的分析物(例如，铅)的水样。含有硝酸的泡罩或安瓿116用于将样品的pH值降低到所需的范围(例如，<1)以溶解可能呈颗粒或胶体形式的任何分析物。然后，通过从泡罩包装(未显示)中释放乙酸盐缓冲液和溶解的氢氧化物盐(钠或钾)将酸化样品的pH调节至～3.5，然后通过分配棒118推进到离子交换树脂柱120中，它可能会或可能不会悬浮在缓冲区中。样品然后进入排出管121，在那里它流入废物收集室122。然后，由分配棒118驱动含有醋酸铵溶液的第二泡罩包装或等同物，其可能位于或可能不位于腔室114中，然后由分配棒118驱动并允许流过树脂柱120，从而将输出物收集在与122相邻的另一废物室中。可以位于水收集室114中的第三安瓿或泡罩包装的较高浓度乙酸铵然后由分配棒118驱动并允许流过树脂柱120，由此将输出物收集在分离室123中，随后是样品分离室124并用缓冲液和两种不同浓度的螯合剂中和，这些螯合剂包含在泡罩或等同物125中。在样品收集盒的底部定位有两个样品分配室126，每个样品分配室126与它们匹配的两个免疫分析条128中的每一个直接接触。样品通过沿每个免疫分析条128a和128b向上方向的毛细迁移从那里移动。在一些实施方案中，多用途读取器装置100由塑料外壳组成，该塑料外壳具有内部电机驱动机械设计以驱动样本收集器110和含有一个、两个或三个免疫分析条的测定盒130的流体，以及用于传感、分析、供电和通信的光电组件，以及由智能手机“应用程序”和后端企业软件***组成的软件平台。在一些实施方案中，一旦在单次使用后由读取器测定分析物浓度，消耗性样品收集器可被丢弃或回收。
多用途读取器装置允许未经培训的用户连续或在不同时间执行多个分析。在一些实施方案中，多用途读取器装置与例如1-3种一次性耗材一起包装，每种耗材由分析盒以及样品收集和制备***组成。在读取器分析结果并通过蓝牙通信将结果传输到智能手机应用程序后，一次性耗材可以立即处理或回收。在一些实施方案中，多用途读取器装置提供对任何饮用水样或消耗水样的高灵敏度、高特异性和宽动态检测范围(例如<1至25ppb)的分析物(例如总铅)的定量评估。在一些实施方案中，多用途读取器装置配备有蓝牙连接能力，用于与智能手机进行无线通信，并集成到SafeSpout应用程序中。在一些实施方案中，多用途读取器装置配备简单的读取器操作和应用程序驱动的用户界面以容易地指导未经培训的用户完成分析物检测过程并轻松报告测试结果。在一些实施方案中，多用途读取器装置配备有具有存储能力和适合家庭、办公室或现场使用的操作条件的强大读取器设计。
在一些实施方案中，多用途读取器装置具有50mm x 140mm x 30mm(WxHxD)的尺寸并且是防水的。在一些实施方案中，多用途读取器装置由可更换的双AA电池供电。
通过额外的设计考虑，诸如通过增加采样功能、增加用于测试的分析物种类的数量，例如通过改变测试线中包含的单克隆抗体或抗体片段的特异性等，增加蓝牙功能和电子功能，以及其他设计修改，以增加***的多功能性和功能性。在一些实施方案中，多用途读取器装置具有结合到设计中的样品收集元件，以在开始测定之前促进样品操作和处理。在一些实施方案中，多用途读取器装置具有并入设计中的样品预处理元件，以在开始测定之前充分制备水样。在一些实施方案中，多用途读取器装置被设计为结合用于不同分析物的多种测定。例如，读取器装置可以分析重金属污染物，包括但不限于Pb(II)、Cr(II)、Ar(II)、Cd(II)和Hg(II)。在一些实施方案中，多用途读取器装置被设计为将日益复杂的蓝牙微处理器与随附的嵌入式软件结合起来，以传输更多数据并与SafeSpout的智能手机应用程序进行更有效的通信。在一些实施方案中，多用途读取器装置被设计为结合电源管理***以在使用时装置的电源。在一些实施方案中，耗材以及所有试剂和化学成分被设计为具有12至24个月或更长的保质期。在一些实施方案中，多用途读取器装置被设计为用于20-100次测试，每次使用新的耗材。在一些实施方案中，多用途读取器装置被设计用于约30-90次测试、约40-80次测试、约50-70次测试或约60-65次测试。在一些实施方案中，多用途读取器装置和消耗品由可回收的材料组成。
抗体、肽和多肽
在一些实施方案中，该方法提供结合配偶体，其包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链(scFv)抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段或抗原结合片段。在一些实施方案中，用于本文所述测定方法的抗体是单克隆抗体(mAb)或重组单克隆抗体(recmAb)、抗体片段、肽或多肽，其与Pb(II)-CHXADTPA复合物和具有不同或相似亲和力的Pb(II)-CHXADTPA缀合物结合，使得在单克隆抗体与Pb(II)结合后，它们与其他抗原的结合能力进一步被阻断或大大降低。
在一些实施方案中，用于检测分析物(诸如Pb(II))的分析中使用的单克隆抗体或重组合成的单克隆抗体被称为“2C12”，并且下文将描述该单克隆抗体或合成重组单克隆抗体的产生。在一些实施方案中，单克隆抗体是命名为2C12的单克隆抗体，其中2C12包含轻链和重链可变区。
在一些实施方案中，单克隆抗体2C12的轻链和重链可变区分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；其中2C12的轻链可变区中的互补决定区(CDR)由残基24-39(SEQ ID NO:3)、残基55-61(SEQ ID NO:4)和残基95-103(SEQ ID NO:5)组成；并且其中2C12的重链可变区中的互补决定区(CDR)由残基26-35(SEQ ID NO:6)、残基50-65(SEQ IDNO:7)和残基98-105组成(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，免疫分析是竞争性免疫分析并且分析条具有固定在测试线上的Pb(II)-CHXADTPA-BSA缀合物和固定在对照线上的抗物种(例如小鼠)抗体。在一些实施方案中，将疑似含有污染分析物(诸如铅)的水样添加到样品垫用于横向流动或添加到样品制备***用于向上流动，其中Pb(II)和螯合剂CHXADTPA形成复合物，Pb(II)-CHXADTPA。Pb(II)-CHXADTPA复合物通过毛细管迁移沿条流动，并与结合垫上的抗体混合。抗Pb(II)-CHXADTPA抗体，即2C12，与水样中所含的可溶性Pb(II)-CHXADTPA结合。在一些实施方案中，当铅浓度低时，大部分抗-Pb(II)-CHXADTPA抗体与测试线结合，提供强信号。在一些实施方案中，当样品中的铅浓度高，因此Pb(II)-CHXADTPA复合物的浓度高时，Pb(II)-CHXADTPA复合物与固定在测试线处的Pb(II)-CHXADTPA缀合物竞争，并且信号强度与样品中Pb(II)的浓度成正比降低。
在一些实施方案中，本公开的免疫分析包括至少一个分析条，其被设计用于检测<1ppb(μg/l)至约25ppb或更多范围内的污染分析物(例如，铅)。在一些实施方案中，本公开的免疫分析包含至少两个、至少三个或更多个条以检测<1ppb至约25ppb或更多范围内的污染分析物(例如，铅)。
在一些实施方案中，本公开的免疫分析包括两个单独的分析条，其中该条之一检测0至8ppb(低范围)范围内的铅并且抗Pb(II)-CHXADTPA抗体与金(Au)纳米颗粒结合并且Pb(II)-CHXADTPA螯合剂以40nM(相当于220μg/ml)存在，并且其中第二条检测1至20ppb(高范围)范围内的铅并且抗-Pb(II)-CHXADTPA抗体(例如2C12)与金(Au)纳米颗粒结合，并且Pb(II)-CHXADTPA螯合剂的浓度为120nM(相当于660μg/ml)。
在一些实施方案中，本公开的免疫分析包含三个或更多个分析条，其中每个条在不同但重叠的范围内检测污染分析物，从而提高分析的特异性或灵敏度或两者。例如，一个免疫分析条可以检测0至8ppb的分析物，第二个免疫分析条可以检测5至15ppb的分析物，并且第三个免疫分析条可以检测10至25ppb的分析物。
在替代实施方案中，本公开的抗体、肽或多肽可以与Pb(II)-CHXADTPA复合物或Pb(II)-CHXADTPA-缀合物结合，或两者相等并取决于Pb(II)-CHXADTPA复合物形成的时间，将因此竞争测试线处的单克隆或重组单克隆抗体结合结构域的相互作用。在一些实施方案中，将Pb(II)-CHXADTPA复合物置于样品垫中并在将水样施加到样品端口后立即形成。在一些实施方案中，将游离螯合剂CHXADTPA在施加于免疫分析条之前作为样品制备过程的一部分直接与水样混合。在一些实施方案中，将报道缀合物嵌入样品端口和样品垫下游的免疫分析条的结合垫中，使得所有或绝大多数的Pb(II)与螯合剂复合物结合，除了在样品中Pb(II)的浓度超过螯合剂复合物结合水样中所有Pb(II)的能力的那些情况下。在一些实施方案中，金纳米颗粒被被动吸收到单克隆抗体上，但不与缀合物共价结合，以允许在免疫分析条上的测试线和对照线处进行颜色检测。在一些实施方案中，金纳米颗粒与单克隆抗体共价结合，但不与缀合物共价结合，以允许在免疫分析条上的测试线和对照线上进行颜色检测。
用于本文所述方法的抗体是单克隆抗体，其在一些实施方案中包括从蛋白质表达载体合成的抗体。或者，用于本文所述方法的抗体可以是单克隆抗体，其在一些实施方案中包括小鼠抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段或任何前述的抗原结合片段。抗原结合片段是含有Pb(II)-螯合剂结合位点的免疫球蛋白分子片段。Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段缺乏完整抗体的重链恒定片段(Fc)，可能优于完整抗体。使用本领域熟知的方法，例如通过用酶(诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段))进行蛋白水解切割，从完整抗体产生此类片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是重链二聚体、单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段或F(ab')片段。此类片段还可以融合至另一个免疫球蛋白结构域，包括但不限于Fc区或其片段。本领域技术人员将理解可以产生其他融合产物，包括但不限于scFv-Fc融合体、可变区(例如，VL和VH)-Fc融合体和scFv-scFv-Fc融合体。免疫球蛋白分子可以是任何类型，包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY，和任何类别，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或任何亚类。在一些实施方案中，本公开的方法中使用的抗体是IgG。在一些实施方案中，使用的抗体是IgG1。
如上所述，用于本文所述方法的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体衍生自对特定抗原具有特异性的基本上同质的抗体群体，该群体含有基本上相似的表位结合位点。该抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgY及其任何亚类。从蛋白质表达载体生产重组单克隆抗体的方法是本领域熟知的。从常规杂交瘤技术生产抗体的方法也是本领域熟知的。用于本公开的方法和组合物的单克隆抗体可以使用重组技术产生并且在下文的实施方案中进行了描述。在另一个实施方案中，单克隆抗体是通过本领域相关技术人员熟知的常规杂交瘤技术产生的抗体。
图2进一步有助于说明在免疫分析中使用单克隆抗体的本公开的实施方案。图2示出了分析的侧视图并且通常用200表示。参考图2A，免疫分析条由垫或区域组成，在这些垫或区域中，当水样沿条横向或向上流过不同垫时，会发生不同的活动。免疫分析条位于分析盒的每一端的薄层压板202的顶部，但在207处板的中间部分变厚。在一些实施方案中，水样被施加到样品接收垫204a，在那里它迁移到可含有螯合剂的干燥样品处理垫区域204b。水样中的分析物(例如，Pb(II))在样品处理垫204b处与嵌入的螯合剂(例如，CHXADTPA)迅速复合。在一些实施方案中，在被施加到样品接收垫之前首先在预处理步骤中用螯合剂处理水样，从而消除了对样品处理垫204b的需要。在一些实施方案中，当样品中的Pb(II)浓度疑似很高时，可以首先用螯合剂(例如CHXADTPA)处理水样，该螯合剂被施加到样品接收垫204a上并允许迁移到样品处理垫204b，其中过量的Pb(II)复合以形成Pb(II)-CHXADTPA。从204b开始，样品横向或向上流动到相邻的结合垫206a，该结合垫206a紧邻样品处理垫204b的下方，与之前没有与游离螯合剂CHXADTPA复合或通过随机碰撞复合的任何过量Pb(II)从CHXADTPA解离并结合至Pb(II)-缀合物。在一些实施方案中，CHXADTPA-缀合物在第一缀合物垫表面206a处和然后在第二缀合物垫表面206b处复合任何过量的Pb(II)或解离的Pb(II)，其中形成Pb(II)-CHXADTPA-缀合物(例如，Pb(II)-CHXADTPA-BSA)。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为100:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为90:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为80:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为70:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为60:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为50:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为40:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为30:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为20:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为10:1。在一些实施方案中，与Pb(II)-CHXDTPA结合的标记的抗体缀合物从结合垫206b迁移，使得游离的CHXADTPA螯合剂和未结合的Pb(II)通过毛细管迁移比Pb(II)-缀合物更快地横向或向上流动到细长的分析物检测捕获垫208中，在那里它首先到达测试线210，在那里免疫分析条中嵌入的标记单克隆抗体-AuNP与Pb(II)-CHXADTPA缀合物结合。样品中分析物的存在和/或量可以通过在测试线210处形成的线的可见性或缺失来确定，其对于标记抗体与Pb(II)-CHXADTPA和Pb(II)-CHXADTPA缀合物(例如蛋白质)之间的竞争具有特异性。在一些实施方案中，嵌入的抗体被被动地吸收到金纳米颗粒(AuNP)上。在一些实施方案中，嵌入的抗体与金纳米颗粒(AuNP)共价连接。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXADTPA复合物先于Pb(II)-缀合物到达测试线210，并限制或显著降低测试线处的检测信号(例如，颜色或荧光)。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXADTPA到达测试线210并限制或显著降低测试线处的检测信号(例如，颜色或荧光)。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXADTPA-缀合物已经固定在测试线处。在一些实施方案中，测试线处的低信号与水样中的Pb(II)浓度成反比。在一些实施方案中，测试线处的高信号与水样中的Pb(II)浓度成反比。在一些实施方案中，在测试线处检测到的任何信号总是与水样中的Pb(II)浓度成反比。样品从那里流向对照线212，其用于验证试剂是否正常工作。在一些实施方案中，对照线212嵌入与金纳米颗粒(AuNP)共价连接的抗物种特异性或抗蛋白质(例如，BSA)抗体，其仅靶向并结合Pb(II)-CHXADTPA-缀合物或缺乏Pb(II)的缀合物。样品和任何水、缓冲液、未结合的螯合剂和缀合物通过对照线的毛细迁移从那里流动并进入吸收垫214a，其充当芯吸机构以调节从样品接收垫到吸收剂储存垫214b的毛细流动。
图2B示出了本公开的免疫分析条的一个实施方案，并且总体上以200描绘。免疫分析条200以放大的顶视图显示以示出分析元件的单独组件配置。免疫分析条200可以配置为进行至少四种类型的分析，包括:用于测量样品抗体的二抗夹心；用于以竞争或非竞争模式测量抗原的抗体-抗原-抗体夹心；用于测量抗体的抗原-抗体-抗原夹心；和竞争性抑制分析，涉及结合到缀合物纳米颗粒的抗原、具有可检测的分析物抑制抗抗原反应的条上的抗抗原。在一些实施方案中，分析配置是竞争性抑制分析，涉及结合至缀合物纳米颗粒的抗原、具有可检测的分析物抑制抗抗原反应的条上的抗抗原。在一些实施方案中，样品接收垫204a可以含有干燥的或冻干的螯合剂(例如，CHXADTPA)。在本公开的免疫分析装置的一个实施方案中，可以添加螯合剂作为样品制备过程的一个步骤。干燥或冻干的结合垫206a和206b可以含有由螯合剂(金属溶胶)、蛋白质(例如BSA)、酶基团(例如HRP)、荧光、胶乳微粒、比色颗粒等组成的缀合物，包括在一些实施方案中的金胶体颗粒。如图2A中所述，含有样品接收垫204、结合垫206、捕获垫208和吸收垫214的免疫分析条附接或放置在层压板202或半刚性材料的顶部上。在一些实施方案中，盒130和样品制备***中的免疫分析条与样品收集器110集成。在分析开始之前，进行酸化水样以完全溶解任何颗粒分析物(例如，Pb(II))的预处理步骤。在一些实施方案中，水样用酸处理，酸包括但不限于硝酸、甲酸、盐酸、乙酸、硫酸或柠檬酸。水样203在样品端口201被直接施加到样品接收垫204a，在该处它通过毛细迁移流动并且在样品接收处理垫204b处与螯合剂复合物(例如CHXADTPA)混合。样品Pb(II)-螯合剂复合物通过毛细管迁移流向相邻的结合垫206a和206b，其中任何残留的Pb(II)与CHXADTPA-缀合物结合形成例如Pb(II)-CHXADTPA-缀合物(例如，Pb(II)-CHXADTPA-BSA)。在一些实施方案中，样品体积足够大以允许连续流过捕获垫。在一些实施方案中，样品接收垫、结合垫、捕获垫、测试和对照线区以及吸收垫彼此连续流体接触。在一些实施方案中，初始水样体积可以是10ml或更多。在一些实施方案中，初始水样体积大于10ml并且至多25ml。在一些实施方案中，初始水样为10-25ml。在一些实施方案中，初始水样为10ml。在一些实施方案中，样品制备中使用的试剂被包括并集成在免疫测定***中，并且包括例如储存在样品收集***中的泡罩或玻璃安瓿瓶中的缓冲液、酸化剂(例如硝酸)、离子交换树脂、乙酸铵、螯合剂和其他干燥或冻干的试剂。
接下来，作为Pb(II)-CHXADTPA复合物的样品203和作为Pb(II)-CHXADTPA-BSA的移动缀合物通过毛细管迁移进入细长的捕获垫208。基于Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-BSA缀合物的比例和分子量的差异，Pb(II)-CHXADTPA在沿吸收垫214的方向通过捕获垫208迁移期间在Pb(II)缀合物之前横向流动205。一旦进入捕获垫，Pb(II)-CHXADTPA复合物单独或与Pb(II)-缀合物一起流向测试线210，在那里它们结合固定的捕获剂(例如抗体)。在一些实施方案中，只有Pb(II)-CHXADTPA复合物沿捕获垫流向测试线210。在一些实施方案中，固定的捕获剂是针对Pb(II)-CHXDTPA或Pb(II)-CHXDTPA-缀合物的Pb(II)-CHXDTPA部分的单克隆抗体。在一些实施方案中，嵌入在测试线210处的固定化单克隆抗体命名为2C12。在一些实施方案中，固定的单克隆抗体是缺少完整抗体的重链恒定片段(Fc)的抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，并且在某些情况下可能优于嵌入测试线210的完整抗体。本领域技术人员将理解可以产生其他融合产物，包括但不限于scFv-Fc融合体、可变区(例如，VL和VH)-Fc融合体和scFv-scFv-Fc融合体。免疫球蛋白分子可以是任何类型，包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY，和任何类别，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或任何亚类。Pb(II)-CHXADTPA可以在Pb(II)-缀合物之前在测试线上与单克隆抗体结合，并在结合位点的竞争中胜过缀合物。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为100:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为90:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为80:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为70:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为60:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为50:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为40:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为30:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为20:1，Pb(II)-CHXADTPA与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物的比例约为10:1。在一些实施方案中，Pb(II)-CHXDTPA在Pb(II)-缀合物之前到达测试线210并限制或显著降低测试线处的检测信号(例如，颜色或荧光)。在一些实施方案中，测试线处的低信号与水样中的Pb(II)浓度成反比。在一些实施方案中，测试线处的高信号与水样中的Pb(II)浓度成反比。在一些实施方案中，在测试线处检测到的任何信号总是与水样中的Pb(II)浓度成反比。
还有一条对照线212，用于验证试剂是否按照它们应有的方式反应。在一些实施方案中，对照线212可以含有干燥的或冻干的、包埋的抗物种特异性抗体，其仅结合单克隆或重组报告标记的缀合物。干燥或冻干的缀合物可由胶乳微粒、酶促、荧光或视觉上可观察的标签组成，诸如银、硒、碳、其他金属溶胶标签，其在一些实施方案中包括胶体金标签以允许在结合抗物种特异性抗体时进行检测。然后，样品和任何水、缓冲液、未结合的螯合剂和缀合物通过毛细管迁移流过对照线区并进入吸收垫214a，其充当芯吸机构以调节从样品接收垫到吸收剂储存垫214b的毛细流动。
免疫分析条可由一系列多孔材料组成，诸如纸、棉、聚酯、玻璃、尼龙、混合纤维素酯、纺丝聚乙烯、聚砜等。在一些实施方案中，免疫分析条由硝酸纤维素、尼龙或混合纤维素酯组成，用于免疫分析条200中的分析物捕获垫，而纸、棉、聚酯、玻璃纤维或聚乙烯可优选用于结合垫206、样品接收垫204和吸收垫214。
图3示出了免疫分析条的一个实施方案，其中色谱元件被组装成分析平台300，指示示例性组件垫尺寸，其包括每个元件的长度、宽度和厚度。还显示了测试线和对照线相对于色谱元素的示例性位置和距离。有利地，如图1C所示，当样品通过重力移动到两个样品分配室时，该分析的实施方案不需要样品垫或样品端口。一旦样品到达分配室，它就会接触两个免疫分析条并通过毛细管沿条向上移动而向上移动。样品首先接触结合垫302，其可具有约20-30mm或约25mm的长度。样品流过结合垫，其与捕获垫304重叠约2-4mm、约2-3mm或约2mm。捕获垫306可具有约20-30mm或约25mm的长度并含有测试线308，其中有色标记的抗体与Pb(II)-CHXADTPA-缀合物结合，或在Pb存在下几乎没有结合；和对照线310，其中抗物种、抗蛋白质抗体结合有色标记的抗体或有色标记的Pb(II)-CHXADTPA-缀合物。吸收垫312充当芯，将样品向上吸并且可以与捕获垫314重叠约5-9mm、约6-8mm或约6mm。整个分析条由长度在约50-80mm、约60-70mm或约60-65mm的背卡316支撑。在一些实施方案中，背卡的长度为60mm。
包括本文公开的免疫分析的样品制备的一般工艺步骤在图4和流程图400中描述。步骤402至414构成预处理步骤并且被设计为溶解任何微粒重金属分析物(例如铅)，将铅与树脂结合并去除结合的钙，以提高分析的特异性。疑似含有铅的水样在样品收集器402中被捕获。样品被酸化(例如，硝酸)404以溶解任何微粒分析物(例如，铅)。在一个替代实施方案中，在将水样施加到样品收集器之前，首先在样品预处理步骤中将水样与游离螯合剂混合以形成Pb(II)-螯合剂复合物。然后，将样品的pH值升高406以允许铅与树脂结合。在一些实施方案中，树脂是螯合离子交换树脂(例如，Chelex 100；BioRad，Hercules，CA)。铅与树脂408结合，然后用乙酸铵洗涤树脂以除去钙410。在乙酸铵洗涤之后，用乙酸铵或硝酸洗脱铅412并中和414，然后将样品递送至免疫分析416。预处理的样品然后流到样品收集器模块底部的样品分配室，因此样品首先接触免疫分析条并且免疫分析开始416。然后，含金属样品通过毛细迁移沿免疫分析条向上流动，并与其中分析物-螯合剂复合物结合抗体的结合垫418中的标记抗体混合。从那里，标记的抗体-Pb(II)-CHXADTPA复合物沿着捕获垫流动，直到它们到达测试线420，在那里，如果分析物浓度低，它们结合Pb(II)-CHXADTPA缀合物，如果分析物浓度高，它们通过测试线。在一个替代实施方案中，在样品通过从结合垫到捕获垫的毛细管迁移流动之后，将金纳米颗粒作为单独的试剂(例如，在缓冲液中)添加到分析中。然后，作为抗体-Pb(II)-CHXADTPA复合物的样品通过毛细管迁移流向捕获垫，直到它到达测试线420，在那里Pb(II)-螯合剂和Pb(II)-缀合物与配偶体抗体结合。在一些实施方案中，Pb(II)-螯合剂在Pb(II)-缀合物结合单克隆抗体之前更快地移动通过捕获垫区以结合单克隆抗体。在一些实施方案中，嵌入测试线的单克隆抗体命名为2C12。在一些实施方案中，嵌入测试线的重组单克隆抗体或非重组单克隆抗体是2C12或其衍生物、变体或片段。在一些实施方案中，单克隆抗体是嵌入测试线的全长重组2C12单克隆抗体。选择含有检测试剂的捕获垫以具有足够的孔径，使得缀合物试剂可以由乳胶、金、银、硒、碳组成，但不限于这些元素。在测试线处未结合的Pb(II)-CHXADTPA复合物和Pb(II)-CHXDTPA-缀合物通过测试线流过捕获垫，直到它们到达嵌入抗物种特异性或抗蛋白质抗体的对照线422。样品大小由吸收垫424的容量决定，可以在50μl至150μl、60μl至100μl或70μl至80μl的范围内。过量的未结合的Pb(II)-CHXADTPA复合物和Pb(II)-CHXDTPA-缀合物然后向吸收垫424迁移。一旦样品液体已经从对照线流到吸收垫，分析就完成了，并且可以首先对测试线和对照线颜色发展进行定性评估426。分析物浓度的定量测定428由扫描测试线的光电读取头进行，解释颜色强度和检测到的校准分析物浓度之间的关系，并通过蓝牙功能将结果传输到专有的智能手机应用程序。
化学品和试剂
本公开描述了根据分析中使用的样品需要或可能是可选的化学品和试剂，以实现对目标分析物的稳定检测以及高特异性。
在一些实施方案中，本公开提供螯合剂、缓冲剂、酸、缀合物蛋白、检测颗粒和报道基团。在一些实施方案中，可用于本公开中描述的方法的螯合剂选自下组:CHXADTPA、CHXEDTA、EDTA、EGTA、柠檬酸盐和ITCBE或任何前述的游离酸。在一些实施方案中，螯合剂是CHXADTPA或CHXEDTA。在一些实施方案中，螯合剂是CHXADTPA。
在一些实施方案中，可用于本公开中描述的方法中的缓冲液是维持螯合剂-缀合物复合物的稳定性以允许免疫分析法检测低ppb范围内(<1ppb)的分析物(例如铅)所需的任何合适的缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液选自下组:HEPES、HEPES缓冲盐水(HBS)、CHAPS和磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是HEPES缓冲盐水(HBS)。
在一些实施方案中，可用于本公开中描述的方法的缀合物蛋白选自下组:牛血清白蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)。在一些实施方案中，缀合物蛋白是BSA。
在一些实施方案中，可用于本公开中描述的方法中的报告基团和检测颗粒选自下组:金纳米颗粒(AuNP)、胶乳微粒、酶报告基团(诸如辣根过氧化物酶(HRP))和碱性磷酸酶、金属溶胶标签(诸如银、硒和碳标签)。在一些实施方案中，报告基团或检测颗粒是金纳米颗粒(AuNP)。
在一些实施方案中，可用于本公开所述方法中的酸选自下组:硝酸、乙酸、盐酸、甲酸、柠檬酸和硫酸。在一些实施方案中，酸是硝酸。
本公开进一步提供用于检测并定量样品中的分析物的***，其包括以下步骤:a)获得潜在地含有目标分析物的样品；b)将所述样品转移至样品收集器进行预处理以制备用于检测并定量分析物的样品；c)使所述经预处理的样品与测试条接触；d)使用所述测试条分析所述经预处理的样品以确定样品中分析物的浓度，其中使用所述测试条定性且定量地测量分析物的浓度；e)定性地测定在步骤d)中检测的金属的浓度水平，其中在60分钟内，45分钟内，30分钟内，20分钟内或15分钟内测定结果；以及f)定量地测定在步骤d)中检测的金属的浓度水平，其中所述金属浓度水平被记录在多用途读取器装置中。在一些实施方案中，使用后端软件平台将浓度数据无线传输到智能手机应用程序。在一些实施方案中，步骤b)中的所述样品收集器和步骤f)中的所述多用途读取器装置的部分是一次性的或可再回收的。
本发明进一步提供用于检测并定量样品中的分析物的装置，其包括:分析物检测读取器100；样品收集器110；和分析盒130，其中所述分析物检测读取器被设计成保持样品收集器和用于读取样品的分析盒。在一些实施方案中，所述样品收集器进一步包括样品预处理***112。在一些实施方案中，所述样品预处理***112包括:水收集室114；含有酸的泡罩安瓿116；分配棒118；离子交换树脂120；排出管121；废物收集室122；分离室123；样品分离室124；含有中和试剂和螯合剂的泡罩或等同物125；样品分配室126；和免疫分析条128a和128b，其中所述免疫分析条检测不同浓度范围的分析物。
在一些实施方案中，该装置包括用于检测并定量分析物的免疫分析条，其包括:底板202；样品接收垫204a和干燥样品处理垫204b；第一结合垫区206a和第二结合垫区206b，其中所述第一结合垫区和所述第二结合垫区浸渍有与检测试剂结合的第一结合配偶体；并且其中与所述检测试剂结合的第一结合配偶体能够沿着所述免疫分析条流动到细长的分析物检测捕获垫208；第一捕获区，其包括固定有分析物螯合剂-缀合物的测试线210，其中与所述检测试剂结合的第一结合配偶体竞争测试线处的结合位点；第二捕获区，其包括固定有第二结合配偶体的对照线212；以及吸收垫214a和吸收储存垫214b，其中所述吸收垫用作芯吸机构以调节从样品接收垫到吸收储存垫的毛细流动。
在一些实施方案中，该装置包含结合配偶体，该结合配偶体包含单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链(scFv)抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段或抗原结合片段。在一些实施方案中，单克隆抗体是命名为2C12的单克隆抗体，其中2C12包含轻链和重链可变区。在一些实施方案中，轻链和重链可变区分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；其中2C12的轻链可变区中的互补决定区(CDR)由残基24-39(SEQ IDNO:3)、残基55-61(SEQ ID NO:4)和残基95-103(SEQ ID NO:5)组成；并且其中2C12的重链可变区中的互补决定区(CDR)由残基26-35(SEQ ID NO:6)、残基50-65(SEQ ID NO:7)和残基98-105组成(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，该装置进一步包括螯合剂。在一些实施方案中，螯合剂选自下组：CHXDTPA、CHXEDTA、EDTA、EGTA、柠檬酸盐和ITCBE或任何前述物质的游离酸。在一些实施方案中，螯合剂是CHXDTPA。
在一些实施方案中，该装置进一步包括检测或标记试剂。在一些实施方案中，检测或标记试剂选自下组：金纳米颗粒(AuNP)；胶乳微粒；包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的报告基团；包括银、硒和碳的金属溶胶标签。在一些实施方案中，检测或标记试剂是金纳米颗粒(AuNP)。
提供以下实施例来说明本公开的一些实施方案。这些实施例不应以任何方式解释为将本公开内容限制于所描述的特定装置、组合物和方法。
实施例
实施例1：Pb(II)-缀合物的制备。
蛋白质-螯合剂缀合物是通过对Breshbiel et al.(1986)Inorg.Chem.25:2772-2781先前描述的方法的改进而制备的，最终体积为500μL，其包含5mg蛋白质(BSA或KLH)、2.6mM CHX-A、2.9mM Pb(NO3)2、和50mM Hepes缓冲液中的46mM三乙胺，pH 9.0。通过添加KOH将反应混合物的pH保持在9.0。通过从反应混合物中去除Pb(NO3)2来制备不含金属的BSA缀合物。将反应在25℃下搅拌3小时，并使用Centricon-30过滤器通过缓冲液交换去除任何未反应的低分子量组分。如Chakrabarti et al.(1994),Anal.Biochem.217:70-75先前描述的那样表征蛋白质缀合物。KLH缀合物的游离赖氨酸基团取代程度为17.1％，并且BSA缀合物的游离赖氨酸基团取代程度为5.5％。
实施例2：产生对Pb(II)-CHXADTPA复合物和缀合物特异的重组单克隆抗体。
使用AbAb重组平台(Absolute Antibody NA,Boston,MA)从Khosraviani et al.(2000),Bioconjugate 11:267-277所述的抗原性Pb(II)-CHXDTPA-缀合物mAB 2C12确定的序列生成重组单克隆抗体，命名为2C12。简而言之，在重组抗体基因克隆和表达的第一阶段，在放大合成之前，使用HEK293细胞系对2C12抗体基因进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在HEK293细胞中确定优化后的表达后，将序列亚克隆到Absolute Antibody提供的适当克隆载体中。第二阶段包括扩大中试表达和纯化。HEK293细胞在瞬时转染的最佳生长阶段传代。将细胞瞬时转染到合适的表达载体中并再培养6-14天。转染适当体积的细胞，目的是在纯化后获得特定量(以毫克计)的蛋白质。使用亲和层析在一步纯化过程中收获培养物。纯化后，将纯化后的抗体换入缓冲液中长期保存。通过SDS-PAGE分析纯化的2C12抗体的纯度，并通过紫外光谱测定浓度。抗体同种型是IgG1，分子量为144.7kDa。消光系数测定为222,110M-1cm-1。
Khosraviani et al.(1994)已经阐明了单克隆抗体2C12的特异性Pb(II)-CHXDTPA复合物结合区。图5A-B显示2C12的轻链可变区(A)(SEQ ID NO:1)和重链可变区(B)(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。互补决定区(CDR)表示为两个可变区的每一个中包含的三个CDR的边界氨基酸序列。轻链和重链可变区中包含的六个总CDR如表1所示。
表1.单克隆抗体2C12轻链和重链可变区的氨基酸序列。
ID NO: 2C12^ 序列<sup>*</sup>
SEQ ID NO:3 轻CDR-1/24-39 RSSQSLVHSNGDTYLH
SEQ ID NO:4 轻CDR-2/55-61 KVSDRFS
SEQ ID NO:5 轻CDR-3/95-103 SQSTHVPYT
SEQ ID NO:6 重CDR-1/26-35 GFSLTNYGVH
SEQ ID NO:7 重CDR-2/50-65 VIWAGGITNYNSALMS
SEQ ID NO:8 重CDR-3/98-105 GNYGGFAY
*经D.Blake许可；^表示Khosraviani et al.2000的2C12中的氨基酸残基数。
实施例3：水样制备。
加标或疑似含有铅的水样经过预处理步骤以溶解任何颗粒铅，然后再递送到免疫分析检测***。通过添加1.5％硝酸酸化10毫升样品，并在室温下放置3.5分钟以溶解颗粒。用醋酸盐缓冲液和氢氧化钠调节样品的pH值，使树脂结合步骤的pH值达到3.5。将样品添加到螯合树脂柱中以结合铅，并基于树脂柱的填充密度将流速(重力)调节至约0.5-1ml/min。接下来，用25ml 0.1M乙酸铵缓冲液(pH 3.5)洗涤树脂以除去钙。用15mL的1或2M醋酸铵缓冲液(pH 4.5)从螯合树脂中选择性洗脱铅。最后，在螯合剂(CHXADTPA)存在下，用1M碳酸钾或5M KOH或KOH中和含铅样品，为免疫分析检测和铅浓度测定做准备。
实施例4：通过酸化确定颗粒铅溶解所需的时间。
已知含有颗粒铅(～30ppb)的水样用10μm针头式过滤器过滤以去除大颗粒(样品1)，或未经过滤(样品2)，然后将两个样品分成两份(样品1a、1b和2a、2b)并用1.5％硝酸酸化以将颗粒铅溶解成铅2+离子。在3、10、30、60、90、120、270和960分钟时取出等分试样，并使用连接到PFA-ST雾化器的NexION 350D质谱仪和设置在4℃的珀尔帖控制石英旋流雾化室通过电感耦合等离子体质谱仪测量溶解铅的浓度。与1.5％硝酸一起孵育3分钟后，未观察到离子铅浓度的显著差异，这表明在室温下孵育3分钟足以将水样中存在的铅颗粒溶解为可重复的铅2+离子的浓度(表2)。
表2.ICP-MS测量被铅颗粒污染的过滤和未过滤水样中的铅浓度。样品在1.5％硝酸中孵育3至960分钟。
Figure BDA0003754005730000311
实施例5：使用全条形式的金纳米颗粒确定Pb(II)检测范围。
范围测试使用2.5μg/ml(条1)和20μg/ml(条2)金缀合物标记的带盖带的重组抗体条以全条形式进行。重复测试包括在CN95膜上与1.5mg/ml Pb(II)-CHXADTPA-BSA配对的2.5μg/ml和20μg/ml重组单克隆2C12抗体-金纳米颗粒的干燥条。使用25mm结合垫、25mm硝酸纤维素膜、18mm吸收垫和8mm盖带以干燥形式对条进行评估。结合垫在硝酸纤维素上重叠2mm，盖带在硝酸纤维素上重叠3mm，并且吸收垫在硝酸纤维素上重叠6mm。在测试该分析法时，试剂和材料由4.8mM Pb标准品(1000ppm)、HBS中的10μM CHXADTPA、0.01N和0.1N HCL溶液、含和不含5％Tween20的Hepes缓冲盐水溶液、浸渍有1.5mg/ml的Pb(II)-CHXADTPA-BSA和0.5mg/ml的山羊抗MS抗体组成。将2.5和20μg/ml的重组抗体-金纳米颗粒在OD 10处干燥到25mm的玻璃纤维材料上，然后置于试纸条上。简而言之，该方法包括通过将5.5mgCHXADTPA螯合剂添加到10ml HEPES缓冲盐水(HBS)中来制备1mM CHXADTPA溶液。首先在HCL中制备1mM铅溶液，如Pb(II)，以完全溶解任何颗粒铅，然后进一步稀释至0-2000nM的工作浓度。对于测试程序，40nM和120nM螯合剂缀合物(CHXADTPA-BSA)分别与2.5μg/ml和20μg/ml含或不含铅的重组2C12-金纳米颗粒配对。图6显示了使用2.5μg/ml rec-Ab-Au纳米颗粒的40nM螯合剂-缀合物的条1(图6A)和使用20μg/ml rec-Ab-Au纳米颗粒的120nM螯合剂-缀合物的条2(图6B)的结果。在使用完整条1的干燥***中，灵敏度略微降低，检测到0.5ppb的Pb(II)，而在半条带格式中检测到0.25ppb的铅。在条2中观察到线形态，其显示略高的CV。在盖带-硝化纤维素界面处的条1中观察到聚集，一旦去除，就会通过膜清除。条1的整体功能检测范围在0-8ppb，而条2的整体功能检测范围在1-20ppb，因此覆盖了所需检测的全部范围，没有任何重叠。
图7显示了Pb(II)-CHXADTPA复合物和Pb(II)-CHXADTPA缀合物在高和低分析物浓度下沿分析条与抗体-AuNP结合的示意图。
实施例6：用于检测并定量水样中分析物的试剂盒。
根据本公开的实施方案的分析***可以测试试剂盒的形式提供。该测试试剂盒可包括一种或多种一次性耗材(可用于相同或不同的分析物)，以及与多用途读取器和Spout应用程序一起使用耗材的说明书。该说明书将指导如何收集水样、将分析盒与样品收集器集成、将集成耗材放入读取器、将分析物浓度的定量结果链接以传输到用户的智能手机应用程序，并解释相对于不同基准的结果。该说明书还可以包括标准，诸如用于比较测试结果的标准表格、图表或图片。预期分析物检测试剂盒含有组件，其包括读取器和一个一次性耗材***，该***由样品收集器和制备材料(例如试剂等)和盒内的免疫分析条组成。还可以预期，根据消费者的选择，每6个月或多或少将额外的一次性耗材***以单个包装形式送到消费者家中。消费者将根据自己的喜好订阅从1到任意数量的消耗品补充装数量。读取器将设计用于处理大约50个或更多的单独分析物检测测试。
等同物
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述主题的特定实施方案的许多等同物。这些等同物旨在被以下权利要求所涵盖。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地和单独地指示为出于所有目的以引用的方式整体并入。
本主题不受本文描述的特定实施方案的范围限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了本文描述的那些之外，本文公开的主题的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
Figure IDA0003754005780000011
Figure IDA0003754005780000021
Figure IDA0003754005780000031
Figure IDA0003754005780000041
Figure IDA0003754005780000051

Claims (39)

1.检测并定量样品中的分析物的方法，其包括以下步骤:
a)获得潜在地含有目标分析物的样品；
b)将所述样品转移至样品收集器，预处理所述样品以制备用于检测并定量分析物的样品；
c)使所述经预处理的样品与测试条接触；
d)使用所述测试条分析所述经预处理的样品以测定所述经预处理的样品中分析物的浓度；以及
e)定量所述分析物的浓度，其中使用所述测试条定性且定量地测量分析物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测并定量样品中的分析物包括免疫分析测试条，其中样品施加区和检测区在色谱免疫分析测试条上，并且所述测试条进一步包括样品垫，其中将所述经预处理的样品施加到所述测试条和结合区或结合垫或首先与所述测试条和结合区或结合垫接触，其中所述结合垫包括至少一种能够随样品介质迁移的标记的结合配偶体，和捕获区或捕获垫，其中所述捕获垫包括含有螯合剂-缀合物的测试线和含有抗物种抗体的对照线，和吸收垫，其中样品流终止。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是选自下组的液体样品:自来水、井水、未过滤的饮用水、经过滤的饮用水、包含在管道内的家用管道水、瓶装水、城市用水、含水层水、包括工业废水源的废水、流出水和河水。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括重金属。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述重金属选自铅Pb(II)、铬Cr(II)、砷Ar(II)、镉Cd(II)和汞Hg(II)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述重金属是铅Pb(II)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述经预处理的样品中重金属检测水平的浓度约为<1ppb至约20ppb。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述经预处理的样品中金属的浓度为<1ppb至约15ppb，<1ppb至约8ppb，<1ppb至5ppb，<1ppb至2ppb。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述经预处理的样品中铅Pb(II)的浓度为<1ppb。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤:f)在步骤b)中转移样品的60分钟内测定步骤d)中检测到的金属的浓度水平。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤b)中转移样品的45分钟内测定浓度水平。
12.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤b)中转移样品的30分钟内测定浓度水平。
13.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤b)中转移样品的15分钟内测定浓度水平。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种结合配偶体包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链(scFv)抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段或抗原结合片段。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体是命名为2C12的单克隆抗体，其中2C12包括轻链和重链可变区。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述轻链和重链可变区分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；其中2C12的轻链可变区中的互补性决定区(CDR)由残基24-39(SEQ ID NO:3)、残基55-61(SEQ ID NO:4)和残基95-103(SEQ ID NO:5)组成；并且其中2C12的重链可变区中的互补性决定区(CDR)由残基26-35(SEQ ID NO:6)、残基50-65(SEQID NO:7)和残基98-105(SEQ ID NO:8)组成。
17.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括螯合剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述螯合剂选自下组:CHXDTPA、CHXEDTA、EDTA、EGTA、柠檬酸盐和ITCBE或任何前述的游离酸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述螯合剂是CHXDTPA。
20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测或标记试剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述检测或标记试剂选自下组:金纳米颗粒(AuNP)；胶乳微粒；包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的报告基团；包括银、硒和碳的金属溶胶标签。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测或标记试剂是金纳米颗粒(AuNP)。
23.用于检测并定量样品中的分析物的***，其包括以下步骤:
a)获得潜在地含有目标分析物的样品；
b)将所述样品转移至样品收集器进行预处理以制备用于检测并定量分析物的样品；
c)使所述经预处理的样品与测试条接触；
d)使用所述测试条分析所述经预处理的样品以确定样品中分析物的浓度，其中使用所述测试条定性且定量地测量分析物的浓度；
e)定性地测定在步骤d)中检测的金属的浓度水平，其中在60分钟内，45分钟内，30分钟内，20分钟内或15分钟内测定结果；以及
f)定量地测定在步骤d)中检测的金属的浓度水平，其中将所述金属浓度水平记录在多用途读取器装置中。
24.根据权利要求23所述的***，其中使用后端软件平台将浓度数据无线传输到智能手机应用程序。
25.根据权利要求23所述的***，其中步骤b)中的所述样品收集器和步骤f)中的所述多用途读取器装置的部分是一次性的或可再回收的。
26.用于检测并定量液体样品中的分析物的装置，其包括:
-分析物检测读取器100；
-样品收集器110；和
-分析盒130，其中所述分析物检测读取器被设计成保持样品收集器和用于读取样品的分析盒。
27.根据权利要求26所述的装置，其中所述样品收集器进一步包括样品预处理***112。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述样品预处理***112包括:
水收集室114，
含有酸的泡罩安瓿116，
分配棒118，
离子交换树脂120，
排出管121，
废物收集室122，
分离室123，
样品分离室124，
含有中和试剂和螯合剂的泡罩或等同物125，
样品分配室126，和
免疫分析条128a和128b，其中所述免疫分析条检测不同浓度范围的分析物。
29.根据权利要求28所述的装置，其中所述免疫分析条用于检测并定量分析物，其包括:
-底板202；
-样品接收垫204a和干燥样品处理垫204b；
-第一结合垫区206a和第二结合垫区206b，其中所述第一结合垫区和所述第二结合垫区用与检测试剂结合的第一结合配偶体浸渍；并且其中与所述检测试剂结合的第一结合配偶体能够沿着所述免疫分析条流动到细长的分析物检测捕获垫208；
-包括固定有分析物螯合剂-缀合物的测试线210的第一捕获区，其中与所述检测试剂结合的第一结合配偶体竞争测试线处的结合位点；
-第二捕获区，其包括固定有第二结合配偶体的对照线212；以及
-吸收垫214a和吸收储存垫214b，其中所述吸收垫用作芯吸机构以调节从样品接收垫到吸收储存垫的毛细流动。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述第一结合配偶体包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链(scFv)抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段或抗原结合片段。
31.根据权利要求30所述的装置，其中所述单克隆抗体是命名为2C12的单克隆抗体，其中2C12包括轻链和重链可变区。
32.根据权利要求31所述的装置，其中所述轻链和重链可变区分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；其中2C12的轻链可变区中的互补性决定区(CDR)由残基24-39(SEQ ID NO:3)、残基55-61(SEQ ID NO:4)和残基95-103(SEQ ID NO:5)组成；并且其中2C12的重链可变区中的互补性决定区(CDR)由残基26-35(SEQ ID NO:6)、残基50-65(SEQID NO:7)和残基98-105(SEQ ID NO:8)组成。
33.根据权利要求29所述的装置，其中所述第二结合配偶体包括抗物种抗体。
34.根据权利要求26或28所述的装置，其进一步包括螯合剂。
35.根据权利要求34所述的装置，其中所述螯合剂选自下组:CHXDTPA、CHXEDTA、EDTA、EGTA、柠檬酸盐和ITCBE或任何前述的游离酸。
36.根据权利要求35所述的装置，其中所述螯合剂是CHXDTPA。
37.根据权利要求26或28所述的装置，其进一步包括检测或标记试剂。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述检测或标记试剂选自下组:金纳米颗粒(AuNP)；胶乳微粒；包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的报告基团；包括银、硒和碳的金属溶胶标签。
39.根据权利要求38所述的装置，其中所述检测或标记试剂是金纳米颗粒(AuNP)。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230035149A (ko) 2015-06-19 2023-03-10 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 단일 또는 다중 용기를 위한 병합 장치
JP7360455B2 (ja) 2018-10-03 2023-10-12 武田薬品工業株式会社 複数の容器のためのパッケージング
USD893046S1 (en) * 2018-10-03 2020-08-11 Baxalta GmbH Container unit
USD986436S1 (en) * 2020-05-05 2023-05-16 Roche Diabetes Care, Inc. Container assembly

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622871A (en) 1987-04-27 1997-04-22 Unilever Patent Holdings B.V. Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents
US5073484A (en) 1982-03-09 1991-12-17 Bio-Metric Systems, Inc. Quantitative analysis apparatus and method
US5334513A (en) 1988-05-17 1994-08-02 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for immunochromatographic analysis
US6352862B1 (en) 1989-02-17 2002-03-05 Unilever Patent Holdings B.V. Analytical test device for imuno assays and methods of using same
US5019516A (en) 1989-06-09 1991-05-28 Hach Company Lead extraction and analysis
US5089663A (en) 1989-06-29 1992-02-18 Associated Universities, Inc. Cyclohexyl-triethylenetetraamine hexacetic acid
US6001658A (en) 1996-09-13 1999-12-14 Diagnostic Chemicals Limited Test strip apparatus and method for determining presence of analyte in a fluid sample
US6699722B2 (en) 2000-04-14 2004-03-02 A-Fem Medical Corporation Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
US7109942B2 (en) 2004-10-21 2006-09-19 The Boeing Company Structurally integrated phased array antenna aperture design and fabrication method
US8614101B2 (en) 2008-05-20 2013-12-24 Rapid Pathogen Screening, Inc. In situ lysis of cells in lateral flow immunoassays
JP4689521B2 (ja) * 2006-04-07 2011-05-25 財団法人電力中央研究所 抗鉛モノクローナル抗体
KR100946566B1 (ko) 2009-11-18 2010-03-11 주식회사 인포피아 측방 유동 면역 분석 디바이스
CN103487577B (zh) * 2013-09-27 2015-09-16 河南科技学院 一种铅离子快速检测金标试纸条或卡

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