CN115023177A - 对个体海马癫痫发作进行成像以及反复癫痫发作的长期影响 - Google Patents

Abstract

本发明证实，腹侧海马点燃导致腹侧海马兴奋性环路发生功能重组。最明显的是与内侧前额叶皮层连通、fMRI上激活量增加以及电生理学上激活幅度增加。有证据表明点燃后焦虑增加。本发明提供了采用同步LFP‑fMRI对单次癫痫发作进行成像的方法。对个体癫痫发作的时空动态进行成像能够表征局灶性和继发性全面性癫痫发作的传播模式，从而提供有针对性的干预。

Description

对个体海马癫痫发作进行成像以及反复癫痫发作的长期影响

相关申请的交叉引用

本专利申请案主张于2019年12月6日提交的编号为62/945,012的美国临时专利申请案的优先权，上述专利全文并入本文以用于所有目的。

背景技术

癫痫发作活动侵入涉及意识或心肺调节的关键环路时，事故或死亡风险均有所增加。目前仍然对此类癫痫发作的演变和传播方式知之甚少，但有证据表明皮层和皮层下环路均受累。记录癫痫发作的标准方法(例如电生理学和光学成像)的空间覆盖范围有限，无法捕捉与某些事件相关的全脑活动的演变。例如，局灶性进展为双侧强直-阵挛性(FBTC)癫痫发作(以前被称为继发性全面性癫痫发作)难以治疗，且显著影响患者的生活质量和安全。fMRI能够提供全脑信息，并已用于可视化人类和动物的局灶性和全面起源的癫痫发作，但由于相关的运动活动会导致运动伪影，因此很难将其用于可视化FBTC癫痫发作。

一直以来都难以理解癫痫发作、点燃与亚阈值活动背后的关系，但是这对于癫痫的诊断和治疗至关重要。本文提供的方法可用于诊断癫痫并做出相应的治疗决策。这是一种新方法，能够首次定义癫痫发作、点燃与亚阈值活动之间的具体关系。

发明内容

本发明提供了用于分析与大脑中癫痫发作相关的事件(例如，模拟癫痫发作的事件)的方法和模型；包括评估功能性和电神经环路变化的影响。所述方法和模型可以包括，例如，单次癫痫发作分析、亚阈值刺激触发、局灶性进展为双侧强直-阵挛性(FBTC)癫痫发作分析、兴奋性腹侧海马(VH)网络分析、游走性癫痫发作核心分析等中的一种或更多种。

在一些实施例中，提供了用于识别和定位个体中游走性癫痫发作核心的方法和模型。在一些实施例中，提供了用于治疗剂设计以治疗癫痫发作(包括但不限于FBTC癫痫发作)的方法和模型。在一些实施例中，所述游走性癫痫发作核心的识别用于识别癫痫发作起始区。分析方法可以包括但不限于确定电生理学，例如，局部场电位(LFP)和功能性磁共振成像(fMRI)。模型可以包括但不限于光遗传学模型，以及使用光遗传学刺激进行点燃和癫痫发作诱导。还可以使用其他刺激方法，例如电、磁、药理等刺激。优选可用于引起海马区等区域单次癫痫发作的刺激方法。刺激方法包括亚阈值活动。

本文提供的数据阐明了可通过同步电生理学和功能性MRI进行分析的点燃和癫痫发作诱导模型的使用情况。为了在动物模型中用同步LFP-fMRI对单次癫痫发作进行成像，可以对所述动物作镇静处理，并给予短效神经肌肉阻滞剂，以避免所述动物在癫痫发作成像期间运动，用于此目的的示例性药剂包括但不限于右美托咪定镇静剂和维库溴铵。通过对与癫痫发作相关的个体癫痫发作事件进行成像，可以对其进行详细分析。例如，据证实，海马中缓慢游走性活动的核心提供了新的癫痫传播和泛化机制。模型包括已点燃的动物大脑，例如活动物，其可以是哺乳动物(例如，啮齿动物如大鼠、小鼠等)、非人灵长类动物等。

在一些实施例中，提供了癫痫发作的光遗传点燃模型，其中在动物模型中通过细胞类型特异性光遗传学刺激诱导电图癫痫发作，然后所述动物在较长时间内提供可靠的FBTC癫痫发作诱导，其中所述较长时间可以至多为2周、至多为3周、至多为4周、至多为2个月、至多为3个月或更长。用于刺激的所述光激活多肽可以是，例如，通道视紫红质，包括但不限于CHR2。所述光激活多肽可以与在兴奋性海马神经元中表达的启动子可操作地连接。刺激模式包括一系列低于所述阈值的短而温和的刺激(例如约10Hz)，以触发癫痫发作，评价潜在的功能性环路变化。长而强烈的刺激(约40Hz)可用于评价癫痫发作环路动态。同步电生理学和fMRI可用于确定点燃所述腹侧海马中的兴奋性神经元以及癫痫发作诱导的影响。对单次诱导性癫痫发作的全脑网络动态进行的成像展示了局灶性和FBTC癫痫发作的传播情况。

本文提供的模型可用于设计和测试治疗性干预措施，例如手术、药理干预措施等，其中可确定治疗性干预措施对癫痫发作诱导和传播的影响。所述模型还可用于设计治疗癫痫共病的药物，例如所述最大的活动变化发生在所述内侧前额叶皮层(mePFC)，表明腹侧海马(vHip)与mePFC之间的兴奋性关系有所增进。设计用于治疗vHip-mePFC环路功能障碍的疗法可减少与癫痫相关的共病，包括焦虑和认知缺陷。在一些实施例中，癫痫发作传播的这些变量用于指导癫痫的手术靶向和治疗开发。本文中的研究结果包括展示伴随癫痫发作的高幅度活动的缓慢游走性核心，并且经常在癫痫发作之前观察到。

在一些实施例中，提供了改进的癫痫手术方法。如本领域所知，此类方法需要可靠地定位癫痫发作起始区(SOZ)。本文内容表明，游走性海马核心提供了癫痫发作传播的基本机制，这可以影响SOZ定位。所述SOZ在整个癫痫发作期间可能并不活跃；癫痫发作活动的区域分布可以快速变化；活跃度最高的区域通常不是SOZ。标准临床SOZ识别方法包括，例如，单光子发射计算机体层摄影(SPECT)、电生理学等。用于检测SOZ的改进方法反映了对所述游走性核心的检测，以改进SOZ定位。

附图说明

图1：光遗传腹侧海马点燃持续数月，海马体积无变化。(A)将腹侧海马中的CamKII细胞作为光遗传点燃的目标，并植入用于刺激和电生理学的光极。将电极植入同侧内侧前额叶皮层进行电生理检查。右图：ChR2-eYFP表达定位于腹侧海马的共聚焦图像。(B)对于光遗传点燃，每隔一天对大鼠进行一轮刺激，一天最多刺激12次，或者直到观察到Racine第5级癫痫发作。持续刺激，直到达到点燃标准：在当日前三次刺激内，观察到第5级癫痫发作。(C)83％(10/12)的大鼠在第7天被点燃，到第11天，所有大鼠均被点燃。(D)每只接受点燃的大鼠在每次刺激时的行为评分表明点燃成功。(E)每只大鼠为实现点燃而接受的刺激总数。(F)未点燃动物和已点燃动物的海马体积前后无显著变化。左图：同侧海马体积变化，t检验(t＝-0.385，p＝0.703)，右图：对侧海马体积变化，t检验(t＝-1.361，p＝0.187)。(G)在实现点燃后3周和12周，对大鼠亚组进行测试，确定动物是否保留有点燃表型。大鼠受到3次刺激。所有已点燃动物均出现Racine第5级癫痫发作，而对照大鼠均未表现出任何癫痫发作相关的Racine行为(每组n＝5)，表明点燃引起持续变化。所有数据均以平均值±s.e.m表示。p<0.05的阈值用于确定统计学意义。

图2：海马点燃会导致全脑海马连通性变化和焦虑加剧。(A)将腹侧海马CamKII细胞作为同侧腹侧海马(iVHip)和同侧内侧前额叶皮层(iMePFC)中用电极刺激以进行LFP记录的目标。fMRI对整个大脑的27张切片进行成像。(B)同步LFP-fMRI用于评估点燃前后和未点燃对照动物(每组n＝12)的10Hz VHip连通性。对于每次扫描，在10Hz下给予5秒刺激，每分钟给予一次，持续6个周期。(C)同笼、年龄匹配的对照动物(左图)和已点燃(右图)动物的统计t图，t阈值对应于p<0.001。观察到对照动物中的活动主要限于iVHip、iDHip、iMePFC、iAmyg和iSept，而已点燃大鼠中的活动包括这些区域并扩展到其他区域。(D)未点燃大鼠和已点燃大鼠的全脑区域激活量。对个体动物的区域激活量进行量化，并表示为占已激活区域的比例。按从已点燃大鼠的最大平均体积到最小平均体积的顺序对体积进行排序。对照动物与已点燃动物之间有七个区域存在显著差异(t检验，具有调整后的p值，使用Bonferroni-Holm校正进行多重比较)。在iMePFC中观察到最大影响，其次是cMePFC、iFrAssC、iTeAssC、iOrFrC、iInsC，最后是iStria。(E)未点燃动物和已点燃动物对10Hz刺激的区域CBV-fMRI峰值幅度响应。选择未点燃动物中的五个最大活跃区域(活跃ROI百分比)来确定点燃对未点燃网络的影响，并反转CBV幅度以便于解释。点燃后，在iMePFC和iAmyg中观察到幅度显著增加。每个灰色圆圈均代表单只动物的数据。(F)在点燃前(左图)和点燃后(右图)从单只大鼠的iVHip和iMePFC中同时获得LFP响应。蓝色柱条表示10Hz光遗传学刺激。观察到点燃后iMePFC LFP响应增加。在8-12Hz下对LFP进行了梯度伪影校正和带通滤波。(G)未点燃大鼠和点燃大鼠中LFP响应的群组分析。左图：在对照动物和已点燃动物中，在前后条件下，iVHip LFP对10Hz刺激的响应并无差异(每组n＝12，F＝0.59，p＝0.81，双向重复测量ANOVA)。右图：与对照动物相比，点燃后iMePFC LFP对10Hz刺激的响应增加(每组n＝11，F＝5.39，p＝0.031，双向重复测量ANOVA)。事后分析表明，点燃后增加了6.4±2.6倍(配对t检验，t＝2.47，p＝0.033)。为了估计LFP功率，计算了刺激期间的LFP功率与刺激前5s的LFP功率之间的比率。对于每只动物的每个时间点，6-18个刺激块的比率中值用于评估时间依赖性群体效应。对于每个刺激块，相对于刺激开始前5s的功率计算所述刺激块的归一化功率。由于电极损坏(1只对照动物)和伪影污染(1只已点燃动物)，两只动物被排除在前额叶皮层分析之外。有关这些动物的数据，请参阅增补部分。(H)fMRI后10周，一部分动物接受了焦虑和抑郁行为测试。(I)蔗糖偏好实验。基线实验结果表明对装有水的两个瓶子中的任何一个均无偏好。用一个装有蔗糖水的瓶子和另一个装有水的瓶子得到的实验测量结果表明，两组都更喜欢蔗糖溶液，且未观察到两组之间存在差异(n＝7、8，t检验，p>0.05)。(J)强迫游泳实验。点燃后，未观察到各组之间存在差异(n＝7、8，t检验，p>0.05)。(K)旷场实验。与未点燃大鼠相比，已点燃大鼠在旷场中心花费的时间明显少于未点燃大鼠，这表明点燃后焦虑表型增加(t检验，p＝0.046)。所有数据均以平均值±s.e.m表示。p<0.05的阈值用于确定统计学意义。

图3：在已点燃和未点燃大鼠中诱导的癫痫发作的不同传播模式。(A)使用同步LFP-fMRI诱导和评估癫痫发作。在未点燃和已点燃动物(分别为n＝2-4每只大鼠和n＝7、5只大鼠)中，在90s基线后诱导癫痫发作。(B)诱导的癫痫发作的发作持续时间。已点燃大鼠的癫痫发作时间明显长于未点燃大鼠(t检验，p<0.001)。(C、D)在未点燃大鼠中诱导的单次癫痫发作，数字表示LFP和BOLD图的等效时间点。(C)LFP响应与腹侧海马BOLD响应重叠。(D)对光遗传学癫痫发作诱导的全脑BOLD响应。左图：对应于Paxinos大鼠脑图谱的脑切片，展示了相对于前囟的坐标。蓝色圆圈表示癫痫发作诱导部位。中图：癫痫发作诱导期间和诱导之后BOLD活动的演变。右图：实验的体素级最大强度投影。观察到活动主要限于同侧半球。(E、F)在已点燃大鼠中诱导的单次癫痫发作，数字表示LFP和BOLD图的等效时间点。(E)LFP响应与腹侧海马BOLD响应重叠。(F)对光遗传学癫痫发作诱导的全脑BOLD响应。左图：对应于Paxinos大鼠脑图谱的脑切片，展示了相对于前囟的坐标。蓝色圆圈表示癫痫发作诱导部位。中图：癫痫发作诱导期间和诱导之后BOLD活动的演变。右图：实验的体素级最大强度投影。观察到活动传播至双侧皮层。依据基线(定义为刺激开始前60s)将BOLD图像归一化。所有图像均以±2％阈值显示，以实现可视化。

图4.已点燃癫痫发作逐渐传播至双侧皮层，而未点燃癫痫发作仍然保持在局部范围内。(A)单次光遗传学诱导癫痫发作的区域BOLD活动示例。使用通用脑图谱将区域自动分割成44个脑区。蓝色柱条表示光遗传学癫痫发作诱导期。(B)未点燃癫痫发作(n＝20，来自7只大鼠)和已点燃癫痫发作(n＝17，来自5只大鼠)中激活的区域数目。已点燃大鼠的癫痫发作比未点燃动物的癫痫发作多激活15.5±2.2个区域(p<0.0001)。灰色圆圈表示个体癫痫发作。(C)未点燃癫痫发作和已点燃癫痫发作中激活区域的分布。依据癫痫发作总数(分别为n＝20和n＝17)将每组的每个区域归一化，以便进行比较。观察到在未点燃癫痫发作中，激活区域主要位于同侧半球，而在已点燃癫痫发作中，双侧激活更为常见。黑色圆圈表示80％阈值，确保实现可靠的发作起始时间估计，以便进行区域传播分析。(D)未点燃癫痫发作和已点燃癫痫发作中活动的区域传播。按从最快到最慢的顺序对区域进行排序，白色柱条表示同侧区域，黑色柱条表示对侧区域，以实现可视化。左图：在未点燃大鼠的癫痫发作中，在同侧半球中最一致地观察到激活区域。右图：与活动传播至两个半球的已点燃大鼠的癫痫发作情况形成对比。值得注意的是，活动从同侧传播至对侧半球。红色标签表示两组均激活的区域。(E)常见激活区域的发作起始时间比较。iMePFC在已点燃癫痫发作中的激活速度明显快于未点燃癫痫发作，快了1.28±0.46s(t＝2.153，p＝0.044，通过Bonferroni程序予以校正以便进行多重比较)。p<0.05的阈值用于确定统计学意义。

图5：缓慢游走性海马癫痫发作核心常见于未点燃大鼠和已点燃大鼠中，并且可作为癫痫发作泛化的主要机制。(A、B)在未点燃大鼠中诱导的单次癫痫发作，数字表示LFP和BOLD图的等效时间点。(A)LFP响应与腹侧海马BOLD响应重叠。(B)同侧海马内BOLD活动的传播。观察到高幅度活动起始于受刺激的VHip，并使海马极点上移至背侧区域，到时间点8时，在VHip电极中无法再检测到活动，但在DHip中BOLD增加持续存在。(C、D)在已点燃大鼠中诱导的单次癫痫发作，数字表示LFP和BOLD图的相应时间点。(C)LFP响应与腹侧海马BOLD响应重叠。(D)同侧海马内BOLD活动的传播。与(A、B)类似，在癫痫发作诱导期间，vHip中的BOLD和LFP增加并且继续增加。高幅度活动从VHip(时间点3、4)上移至DHip极点(时间点5、6)。(E)同侧海马的分割图谱。海马被分割成4个区域，跨越10张切片。(F)从腹侧海马到背侧海马的活动传播时间。从最腹侧到最背侧的分割区域的峰至峰活动用于计算在腹侧到背侧海马中观察到峰值活动的时间。在4/7未点燃大鼠的8/20癫痫发作和5/5已点燃大鼠的15/17癫痫发作中观察到传播性海马活动。(G、H)未点燃动物和已点燃动物中的单独海马体素时程。时间进程来自(A、C)中的同一癫痫发作，并如(E)中一般进行分段。按从最腹侧到最背侧的顺序对体素时程进行排序。

图6：基于体素的组间差异仅在点燃后(而非点燃前)才较为明显。点燃后(右图)和同笼且年龄匹配的对照动物(左图)的统计t图，t阈值对应于p<0.001。

图7：刺激次数或第5级癫痫发作无法解释点燃后激活。点燃后激活与刺激次数(左图)以及与第5级癫痫发作次数(右图)的基于体素的统计t图，t阈值对应于p<0.001。

图8：点燃后内侧前额叶对腹侧海马10Hz刺激的响应幅度增加。腹侧海马环路的区域时间序列数据。

图9：导致排除在分析之外的同步LFP记录。(A-C)上面两张图是通过腹侧海马和同侧内侧前额叶皮层的fMRI同步获得的LFP记录。下面两张图是这些记录的放大图。蓝色柱条表示光遗传学刺激(10Hz，7.5ms脉冲)。(A)刺激抵消后爆发。将相应动物排除在电生理学和BOLD分析之外。(B、C)内侧前额叶皮层电极遭到破坏，导致生成噪声记录。将两只动物排除在内侧前额叶皮层LFP分析之外。

图10：在清醒和右美托咪定镇静大鼠中诱导的癫痫发作中类似的电生理学特征。(A、B)同一只动物的腹侧海马LFP记录以及在清醒和镇静状态下诱导的癫痫发作。红色箭头表示大幅度尖峰活动开始，插图i-iii)是这些癫痫发作组成部分的放大图。蓝色柱条表示光遗传学刺激的时间(40Hz，7.5ms脉冲)。(C)处于清醒和镇静状态的不同动物的另一组电生理记录。(D)清醒和镇静状态下的导致后发放的刺激所占比例无差异。每条线代表一只动物。(E)清醒和镇静状态下的大幅度尖峰活动起始时间无差异。(F)与清醒状态相比，镇静状态下不会出现时间更短的后发放。

图11：未点燃癫痫发作和已点燃癫痫发作的区域传播(使用90％发作起始时间)。按从最快到最慢的顺序对区域进行排序，白色柱条表示同侧区域，黑色柱条表示对侧区域，以实现可视化。左图：在未点燃大鼠的癫痫发作中，在同侧半球中最一致地观察到激活区域。右图：与活动传播至两个半球的已点燃大鼠的癫痫发作情况形成对比。值得注意的是，活动从同侧传播至对侧半球。

图12：未点燃癫痫发作和已点燃癫痫发作中活动的区域传播(使用0％的发作频率)。按从最快到最慢的顺序对区域进行排序，白色柱条表示同侧区域，黑色柱条表示对侧区域，以实现可视化。

图13：未点燃动物和已点燃动物癫痫发作期间不同的区域互相关模式。上图：未点燃动物的平均区域互相关矩阵。下图：已点燃动物的平均区域互相关矩阵。

具体实施方式

定义

在进一步描述本发明的实施例之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施例的实施或测试中。

必须注意的是，如本专利和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一种化合物”的指代对象不仅包括单一化合物，还包括两种或更多种化合物的组合，“取代基”的指代对象包括单一取代基以及两个或更多个取代基，等等。

在描述本发明和主张本发明的权利时，将根据下面列出的定义使用某些术语。应当理解，本文提供的定义并非旨在相互排斥。因此，一些化学部分可能符合一个以上术语的定义。

本文中使用的短语“例如”、“举例而言”、“如”或“包括”旨在引入进一步阐明更普遍的标的物的示例。提供这些示例仅为了帮助理解本发明，并非旨在以任何方式进行限制。

术语“活性剂”、“拮抗剂”、“抑制剂”、“药物”和“药用活性剂”在本文中可互换使用，是指施用于生物体(人或动物)时通过局部和/或全身作用诱发预期药理学和/或生理学效应的化学物质或化合物。

本专利中使用的术语“治疗”等指的是获得期望的药理学和/或生理学作用。预防作用指的是对疾病或其症状的完全或部分预防，治疗作用指的是对疾病和/或疾病导致的不良反应实现部分或完全治愈。本专利中使用的“治疗”涵盖了哺乳动物、特别是人类疾病的任何治疗，包括：(a)防止对象发生疾病或疾病症状，其中对象可能易发生该疾病或症状但尚未确诊(例如，可能与原发性疾病相关或由其引发的疾病；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；和(c)缓解该疾病，即使疾病消退。

“治疗有效量”或“有效量”是指治疗疾病、病状或病症时，施用于哺乳动物或其他受试者且足以治疗所述疾病、病状或病症的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

本文中使用的术语“单位剂型”是指物理上分散的、适用于人和动物受试者的单一剂型，各单位含有预定量的化合物，其以与药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒混合足以产生所需效果的量计算。单位剂型的规格取决于所采用的具体化合物、要达到的效果以及各化合物在宿主中的药物动力学特性。

“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的佐剂”是指可用于制备通常较为安全、无毒且在生物学或其他方面均无不合需求之处的药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂，包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。本说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂”包括一种和多于一种的此类赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。

本文中使用的“药物组合物”意在涵盖适合施用于受试者(例如哺乳动物，尤其是人类)的组合物。通常情况下，“药物组合物”是无菌的，并且优选地，不含能够在受试者体内引起非预期反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是药用级别化合物)。药物组合物可以设计用于通过多种不同的给药途径施用于有相应需求的受试者或患者，所述给药途径包括口服、经颊、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、气管内、肌肉内、皮下给药等。

本文中使用的术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用，是指动物，包括但不限于人类和非人灵长类动物，包括猿类和人类；啮齿动物，包括大鼠和小鼠；牛；马；羊；猫；犬；鸟等。“哺乳动物”是指任何一种或多种哺乳类动物，包括，例如，犬；猫；马；牛；羊；啮齿动物等以及灵长类动物，例如，非人灵长类动物和人类。非人动物模型(例如，哺乳动物，例如非人灵长类动物、鼠、兔等)可用于实验研究。合适的动物模型尤其包括啮齿动物，例如，大鼠和小鼠。

本文中使用的术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，且包括定量和定性测定。

局部场电位(LFP)是通常使用微电极(金属、硅或玻璃微量移液器)在脑组织细胞外空间中记录的电位。深度记录皮层组织(或其他深部脑结构)内的LFP。哺乳动物皮层中的LFP信号反映了数千个神经元的活动，通常用于研究潜在的网络动态，例如感觉处理、运动规划、注意力、记忆和感知。近几十年来，由于高密度硅基微电极(能够在跨越整个大脑区域的数千个位置同时记录LFP)的开发，LFP信号的重要性进一步提升。LFP可用于引导神经假体设备，因为相较于单个神经元尖峰活动，它在慢性环境中能够更容易、更稳定地加以记录。

磁共振成像(MRI)用于分析神经物理事件。特别是，MRI可用于分析大脑中与神经物理事件相关的功能关联区域(解剖神经网络)。关联模式可以表示神经物理事件的时间和/或空间关联。目的MRI技术是功能性MRI(fMRI)。采用fMRI时，图像对比度的时间变化通过合适的MR成像扫描序列显示。功能性MRI(fMRI)测量大脑中因神经活动变化引起的信号变化。在低分辨率下快速(通常每2-3秒一次)扫描大脑。神经活动增加能够通过T*.sub.2变化引起MR信号的变化。这种机制被称为血氧水平依赖(BOLD)效应。神经活动增加导致对氧气的需求增加，而血管***实际上对此进行了过度补偿，从而使得含氧血红蛋白的量相对于脱氧血红蛋白有所增加。由于脱氧血红蛋白会减弱MR信号，因此血管反应会导致与神经活动相关的信号增加。BOLD效应还允许生成神经组织内静脉血管***的高分辨率3D图。

虽然BOLD信号是人类受试者神经科学研究中最常用的方法，但MR成像的灵活性提供了使信号对血液供给的其他方面较为敏感的手段。替代技术采用动脉自旋标记(ASL)或通过脑血流量(CBF)和脑血容量(CBV)对MRI信号进行加权。CBV方法需要注射一类目前正在进行人体临床试验的MRI对比剂。由于经证实，在临床前研究中，该方法比BOLD技术敏感得多，因此它可能会使得fMRI在临床应用中的作用得到扩展。CBF方法能够提供比BOLD信号更多的定量信息，但检测灵敏度显著降低。

癫痫。癫痫是一种大脑疾病，其特征在于随着时间的推移反复发作。癫痫的类型可以包括但不限于全面性癫痫(例如儿童失神癫痫、青少年肌阵挛性癫痫、觉醒时大发作癫痫、韦斯特综合征、伦诺克斯-加斯托综合征)、部分性癫痫(例如，颞叶癫痫、额叶癫痫、儿童良性局灶性癫痫)。

癫痫持续状态(SE)。癫痫持续状态(SE)可包括，例如，惊厥性癫痫持续状态，例如早期癫痫持续状态、确定性癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态；非惊厥性癫痫持续状态，例如全面性癫痫持续状态、复杂部分性癫痫持续状态；全面性周期性癫痫样放电；以及周期性一侧癫痫样放电。惊厥性癫痫持续状态的特征在于存在惊厥性癫痫发作状态，可以包括早期癫痫持续状态、确定性癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态。早期癫痫持续状态采用一线疗法治疗。确定性癫痫持续状态的特征在于，尽管用一线疗法治疗并且施以二线疗法，但癫痫发作状态仍持续存在。难治性癫痫持续状态的特征在于，尽管用一线和二线疗法治疗并且通常施用全身麻醉剂，但癫痫发作状态仍持续存在。超难治性癫痫持续状态的特征在于，尽管用一线疗法、二线疗法和全身麻醉24小时或更长时间进行治疗，但癫痫发作状态仍持续存在。

非惊厥性癫痫持续状态可包括，例如，局灶性非惊厥性癫痫持续状态，例如复杂部分性非惊厥性癫痫持续状态、简单部分性非惊厥性癫痫持续状态、轻微非惊厥性癫痫持续状态；全面性非惊厥性癫痫持续状态，例如，迟发性失神非惊厥性癫痫持续状态、非典型失神非惊厥性癫痫持续状态或典型失神非惊厥性癫痫持续状态。

癫痫发作。癫痫发作是大脑异常电活动事件发生后出现的生理发现或行为变化。术语“癫痫发作”通常与“惊厥”互换使用。惊厥是指一个人的身体快速且不受控制地抖动。在惊厥期间，人的肌肉反复收缩和放松。根据行为类型和大脑活动，癫痫发作分为两大类：全面性和部分性(也称为局部或局灶性)。对癫痫发作类型进行归类有助于医生诊断患者是否患有癫痫。

全面性癫痫发作是由来自整个大脑的电脉冲所致，而部分性癫痫发作是由来自大脑中相对较小部分的电脉冲所致(至少最初是这样)。出现癫痫发作的大脑部分有时被称为病灶。

全面性癫痫发作有多种类型。最常见且最剧烈的(因此也是最广为人知的)是全身性惊厥，也称为癫痫大发作。在这种类型的癫痫发作中，患者会失去意识，且通常会昏倒。意识丧失后，患者全身僵硬(称为癫痫发作的“强直”阶段)30至60秒，然后是肌肉剧烈抽搐(“阵挛”阶段)30至60秒，之后患者进入深度睡眠(“发作后”或癫痫发作后阶段)。在癫痫大发作期间，可能会发生损伤和事故，例如啮舌和尿失禁。

失神发作会导致短暂丧失意识(仅几秒钟)，几乎无或无症状。患者(大多数情况下是儿童)通常会中断活动并且茫然凝视。这些癫痫发作会突然发生和终止，一天当中可能发生数次。患者通常不会意识到他们正发生癫痫发作，只知道“丢失了时间”。

肌阵挛发作表现为肌肉偶尔抽搐，通常发生在身体两侧。患者有时将肌肉抽搐描述为短暂的电击。剧烈时，这些癫痫发作可能导致物体掉落或不由自主地投掷物体。

阵挛发作是同时累及身体两侧的重复性、有节奏的肌肉抽搐。

强直发作的特征在于肌肉僵硬。

失张力发作表现为全身肌张力突然丧失，特别是手臂和腿部肌张力丧失，这通常会导致跌倒。

局灶性进展为双侧强直-阵挛性(FBTC)癫痫发作起源于大脑的一个区域，而后作为强直阵挛发作扩散至大脑两侧。

在评估癫痫发作严重程度时，通常使用量表对癫痫发作相关行为进行分类。Racine量表是最广泛用于描述这些行为的量表。Racine量表包括5级，每级分类如下：第1级：嘴和面部阵挛；第2级：第1级+点头；第3级：第2级+前肢阵挛；第4级：第3级+直立；第5级：第4级+反复直立和跌倒。

本文中使用的术语“点燃”或“点燃模型”是指广泛使用的癫痫发作和癫痫发展模型，其中在反复诱导癫痫发作后，诱导的癫痫发作的持续时间和行为受累增加。在此类模型中，通常用电或化学物质反复刺激实验动物，以诱导癫痫发作。与重复刺激引起的癫痫发作相比，第一次进行此类刺激后发生的癫痫发作持续时间较短，且伴有少量或无任何行为影响。随着进一步的癫痫发作，伴随行为加剧，例如，从早期刺激引起的冻结进展为后期刺激引起的惊厥。在反复刺激后，伴随行为的持续时间延长和行为加剧最终达到稳定期(参见，例如，Bertram,E.，(2007)癫痫，48(增刊2)：65-74)。

可使用多种方法实现点燃，包括但不限于电刺激、光遗传学技术、化学处理等。使用光遗传学技术进行点燃时，光可激活蛋白会在目的靶细胞中表达。可以使用的光可激活蛋白包括但不限于ChR2、VChR1、C1V1等。在一些实施例中，所述光可激活蛋白的表达通过Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子靶向目的神经元。在一些实施例中，将编码所述光可激活蛋白的多核苷酸递送至所述海马。

可以对动物进行刺激，一天最多刺激12次，或者直到出现第5级运动性癫痫发作，并且可以每隔一天对动物进行一轮刺激，最多刺激12天。在一些实施例中，每天刺激动物的次数少于12次，例如，11至9次、9至7次、7至5次、5至3次或少于3次，直到实现点燃。最多可以执行12天的刺激。在一些实施例中，所述动物接受11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天的刺激，以实现点燃。刺激间隔可以是15分钟。如果在当日前三次刺激内，观察到第5级运动性癫痫发作，则可以认为个体被点燃。

癫痫发作起始区。癫痫发作起始区是发生临床癫痫发作的皮层区域，其与致痫区相反，致痫区是发生癫痫发作必不可少的皮层区域。癫痫发作起始区通常通过头皮或侵入性EEG技术定位。癫痫发作起始区的位置还可通过发作期单光子发射计算机体层摄影(SPECT)来确定。通常是刺激区的一部分生成能够产生后发放的尖峰。这些由重复尖峰组成，当侵入雄辩皮层时，这些尖峰有足够的强度来引起临床发作症状。侵入性皮层表面电极记录大脑极其有限区域的活动。通过消除距离和绝缘屏障，每个电极均可记录仅由所述电极覆盖的皮层区域。因此，侵入性电极本质上对于后发放检测非常敏感，但只有当它们直接覆盖癫痫发作起始区时才能准确定义癫痫发作的起源。

本文中使用的“神经活动”可以指神经元的电活动(例如，神经元的膜电位变化)，以及一个或更多个神经元的电活动的间接测量。因此，神经活动可以指场电位的变化、细胞内离子浓度的变化(例如，细胞内钙浓度)以及由神经元的电活动引起的磁共振变化，其通过诸如功能性磁共振成像中的血氧水平依赖(BOLD)信号测得。

癫痫发作模型

本文提供了用于在体内分析涉及癫痫发作的大脑环路和区域关系的方法和模型，特别是通过对单次癫痫发作进行成像以精细区分影响。本发明的方法可以根据需要使用合适的神经元刺激和神经元活动测量方案的任意数量的组合来对癫痫发作的影响进行成像。所述方法和模型可以包括，例如，单次癫痫发作分析、局灶性进展为双侧强直-阵挛性(FBTC)癫痫发作分析、兴奋性腹侧海马(VH)网络分析等中的一种或更多种。

本文提供的模型通常使用已点燃动物模型。点燃是指在特定脑区通过电刺激放电诱导后重复发生的癫痫发作诱发的可塑性现象使得癫痫发作易感性逐渐增强。它最终会导致自发性癫痫发作和永久性癫痫持续状态的确立。点燃可通过光遗传学或电刺激来建立。

为了在动物模型中用同步LFP-fMRI对单次癫痫发作进行成像，可以对所述动物作镇静处理，并给予短效神经肌肉阻滞剂，以避免所述动物在癫痫发作成像期间运动，用于此目的的示例性药剂包括但不限于右美托咪定镇静剂和维库溴铵。通过对个体癫痫发作进行成像，经证实，海马中缓慢游走性活动核心能够提供新的癫痫发作传播和泛化机制；并且可对FBTC癫痫发作的传播进行成像。

可以通过以下各项在已点燃动物中诱导癫痫发作：光遗传学刺激、电刺激，例如全脑电击刺激方案、单一诱发癫痫后发放；化学惊厥药，例如毛果芸香碱、破伤风毒素、PTZ、红藻氨酸、氟替尔等；液压冲击损伤、高强度声刺激。在一些实施例中，优选光遗传学刺激。

在一实施例中，结合组合的电生理学(例如，局部场电位(LFP)和功能性磁共振成像(fMRI)扫描大脑不同区域)，刺激个体大脑的特定区域，以确定癫痫发作传播区与大脑其他区域之间的功能连接，并对癫痫发作的运动进行成像。适合的分析方案包括电生理学；神经活动的光诱导调节；脑电图(EEG)记录；功能成像和行为分析。电生理学可以包括单电极、多电极和/或场电位记录。如本文进一步描述的那样，神经活动的光诱导调节可以包括任何合适的光遗传学方法。功能成像可以包括fMRI，以及任何使用基因编码指示剂(例如钙指示剂、电压指示剂等)的功能成像方案。行为分析可以包括任何合适的行为测定，例如有关唤醒、记忆(例如水迷宫测定)、条件化(例如恐惧条件化)、感觉反应(对诸如视觉、体感、听觉、味觉和/或嗅觉线索的反应)的行为测定。

一些方案(例如fMRI)提供了代表神经活动的非侵入性、全脑测量。一些方案(例如电生理学)提供了细胞分辨率和神经活动的快速测量以及细胞分辨率和神经活动的快速控制。一些方案(例如光遗传学)提供了对定义的神经元组中动作电位发放的空间定位和时间定义控制。

在一些实施例中，提供了用于通过已点燃动物中单次癫痫发作的诱导和传播来特异性识别和定位个体中游走性癫痫发作核心的方法，这可以用于确定癫痫发作起始区。在一些实施例中，提供了通过已点燃动物中单次癫痫发作的诱导和传播来特异性识别和定位个体中FBTC癫痫发作的方法。

在一些实施例中，提供了癫痫发作的光遗传点燃模型，其中在动物模型中通过细胞类型特异性光遗传学刺激诱导电图癫痫发作，然后所述动物在较长时间内提供可靠的FBTC癫痫发作诱导，其中所述较长时间可以至多为2周、至多为3周、至多为4周、至多为2个月、至多为3个月或更长。用于刺激的所述光激活多肽可以是，例如，通道视紫红质，包括但不限于CHR2。所述光激活多肽可以与在兴奋性海马神经元中表达的启动子可操作地连接。刺激模式包括一系列低于所述阈值的短而温和的刺激(例如约10Hz)，以触发癫痫发作，评价潜在的功能性环路变化。长而强烈的刺激(约40Hz)可用于评价癫痫发作环路动态。

在一些实施例中，提供了癫痫发作的光遗传点燃模型，其中在动物模型中通过细胞类型特异性光遗传学刺激诱导电图癫痫发作，然后所述动物在较长时间内提供可靠的FBTC癫痫发作诱导，其中所述较长时间可以至多为2周、至多为3周、至多为4周、至多为2个月、至多为3个月或更长。刺激模式包括一系列低于所述阈值的短而温和的刺激(例如约8-12Hz，例如，约10Hz)，以触发癫痫发作，评价潜在的功能性环路变化。长而强烈的刺激(约35-45Hz，例如，40Hz)可用于评价癫痫发作环路动态。同步电生理学和fMRI可用于确定点燃所述腹侧海马中的兴奋性神经元的影响。对单次诱导性癫痫发作的全脑网络动态进行的成像展示了局灶性和FBTC癫痫发作的传播情况。在一些实施例中，癫痫发作传播的这些变量用于指导癫痫的手术靶向和治疗开发。研究结果包括展示伴随癫痫发作的高幅度活动的缓慢游走性核心，并且经常在癫痫发作之前观察到。所述动物模型可用于设计和测试治疗性干预措施，例如手术、药理学疗法等，其中可确定治疗性干预措施对癫痫发作传播的影响。所述动物模型还可用于设计治疗癫痫共病的药物，例如所述最大的活动变化发生在所述内侧前额叶皮层(mePFC)，表明腹侧海马(vHip)与mePFC之间的兴奋性关系有所增进。设计用于治疗vHip-mePFC环路功能障碍的疗法可减少与癫痫相关的共病，包括焦虑和认知缺陷。

在一些实施例中，所述动物模型是已点燃动物模型。可以使用多种方法实现点燃，包括但不限于电刺激、光遗传学技术、化学处理等。使用光遗传学技术进行点燃时，光可激活蛋白可以在目的靶细胞中表达。可以使用的光可激活蛋白包括但不限于ChR2、VChR1、C1V1等。在一些实施例中，所述光可激活蛋白通过Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子靶向目的神经元。在一些实施例中，将编码所述光可激活蛋白的所述多核苷酸递送至所述海马。

为实现点燃，所述个体可能会受到至少30Hz且脉冲宽度为7.5ms的光的刺激。在一些实施例中，所述个体受到大于30Hz的刺激。例如，30-35Hz、35-40Hz、40-45Hz、45-50Hz或大于50Hz。为实现点燃，可以对所述个体进行刺激，一天最多刺激12次。在一些实施例中，每天可以刺激受试者的次数少于12次，例如，11至9次、9至7次、7至5次、5至3次或少于3次，直到实现点燃。最多可以执行12天的刺激。在一些实施例中，所述个体可以接受11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天的刺激。

为了研究功能性神经环路的变化，可以用至少1Hz的光脉冲来刺激个体。在一些实施例中，可以用超过1Hz的光脉冲(例如1-5、5-10、10-15或15-20Hz)来刺激所述个体。

为了研究癫痫发作神经环路的变化，可以用至少30Hz的光脉冲来刺激个体。在一些实施例中，可以用超过30Hz的光脉冲(例如30-35、35-40、40-45、45-50或大于50Hz)来刺激所述个体。

在一些实施例中，如果癫痫发作的所述持续时间或严重程度降低，则确定药剂可以对癫痫发作进行有效的靶向干预。在一些实施例中，使用所述Racine量表确定癫痫发作的所述严重程度。在一些实施例中，如果依据所述Racine量表，癫痫发作的严重程度降低至少1级，则确定药剂可以进行有效的靶向干预。例如，使癫痫发作的严重程度从Racine第5级降至第4级。在一些实施例中，癫痫发作的严重程度降低2级、3级、4级或癫痫发作症状全都消退。

光遗传学刺激

如上所述，用于检测单次癫痫发作以及由此衍生的电生理学的动物模型可以利用光遗传学刺激来实现诸如点燃和癫痫发作诱导，其中涉及点燃和癫痫发作诱导的所述神经元可操作地表达光激活多肽。

用于激活所述光激活多肽的所述光刺激可以包括通过诸如频率、脉冲宽度、占空比、波长、强度等来表征的光脉冲。在一些情况下，所述光刺激包括两组或更多组不同的光脉冲，其中每组光脉冲的特征在于光脉冲的不同时间模式。所述时间模式可以通过任何合适的参数来表征，包括但不限于频率、周期(即，所述光刺激的总持续时间)、脉冲宽度、占空比等。

所述光脉冲可以具有任何合适的频率。在一些情况下，所述光脉冲组含有在整个光刺激持续时间内持续的单一光脉冲。在一些情况下，所述光脉冲组的频率为0.1Hz或更高，例如，0.5Hz或更高、1Hz或更高、5Hz或更高、10Hz或更高、20Hz或更高、30Hz或更高、40H或更高，包括50Hz或更高、60Hz或更高、70Hz或更高、80Hz或更高、90Hz或更高、100Hz或更高，并且频率为100,000Hz或更低，例如，10,000Hz或更低、1,000Hz或更低、500Hz或更低、400Hz或更低、300Hz或更低、200Hz或更低，包括100Hz或更低。在一些实施例中，所述光脉冲的频率范围为0.1至100,000Hz，例如，1至10,000Hz、1至1,000Hz，包括5至500Hz或10至100Hz。

例如，可以传递一系列低于所述阈值的短而温和的刺激(例如约1Hz至约15Hz、约5Hz至约15Hz)，以触发癫痫发作，而且可施加约10Hz的刺激来评价潜在的功能性环路变化。可以传递长而强烈的刺激(约25至约50Hz、约35至约45Hz)，例如，可使用约40Hz的刺激来评价癫痫发作环路动态。

在一些情况下，所述两组光脉冲表征为具有不同的参数值，例如不同的脉冲宽度，例如，短或长。所述光脉冲可以具有任何合适的脉冲宽度。在一些情况下，所述脉冲宽度为0.1ms或更长，例如0.5ms或更长、1ms或更长、3ms或更长、5ms或更长、7.5ms或更长、10ms或更长，包括15ms或更长、20ms或更长、25ms或更长、30ms或更长、35ms或更长、40ms或更长、45ms或更长、50ms或更长，并且为500ms或更短，例如，100ms或更短、90ms或更短、80ms或更短、70ms或更短、60ms或更短、50ms或更短、45ms或更短、40ms或更短、35ms或更短、30ms或更短、25ms或更短，包括20ms或更短。在一些实施例中，所述脉冲宽度的范围为0.1至500ms，例如0.5至100ms、1至80ms，包括1至60ms、1至50ms或1至30ms。

所述光脉冲的所述平均功率(在将所述光脉冲传递至脑区的光纤尖端处测得)可以是任何合适的功率。在一些情况下，所述功率为0.1mW或更多，例如，0.5mW或更多、1mW或更多、1.5mW或更多，包括2mW或更多、2.5mW或更多、3mW或更多、3.5mW或更多、4mW或更多、4.5mW或更多、5mW或更多，并且可以为1,000mW或更少，例如，500mW或更少、250mW或更少、100mW或更少、50mW或更少、40mW或更少、30mW或更少、20mW或更少、15mW或更少，包括10mW或更少或5mW或更少。在一些实施例中，所述功率的范围为0.1至1,000mW，例如，0.5至100mW、0.5至50mW、1至20mW，包括1至10mW或1至5mW。

所述光脉冲的所述波长和强度可以发生变化，并且可以取决于所述光激活多肽的所述激活波长、所述脑区的光学透明度、待照射的预期脑体积等。

由所述光脉冲照射的所述脑区体积可以是任何合适的体积。在一些情况下，所述照射的体积为0.001mm³或更大，例如，0.005mm³或更大、0.001mm³或更大、0.005mm³或更大、0.01mm³或更大、0.05mm³或更大，包括0.1mm³或更大，并且为100mm³或更小，例如，50mm³或更小、20mm³或更小、10mm³或更小、5mm³或更小、1mm³或更小，包括0.1mm³或更小。在某些情况下，所述照射的体积范围为0.001至100mm³，例如，0.005至20mm³、0.01至10mm³、0.01至5mm³，包括0.05至1mm³。

可使用任何合适的方法进行光遗传学刺激。合适的方法请见，例如，第8,834,546号美国专利，所述专利以引用方式并入本文。可使用适宜的方法修饰所述大脑合适区域内的神经元(其活性将由光调节)，以表达所述光激活多肽。在一些情况下，脑区内的神经元经遗传修饰以表达光激活多肽。在一些情况下，可以使用病毒载体对所述神经元进行遗传修饰，例如，腺相关病毒载体，所述病毒载体含有具有编码所述光激活多肽的核苷酸序列的核酸。所述病毒载体可以包括任何合适的控制元件(例如，启动子、增强子、重组位点等)，以便根据细胞类型、时间安排、诱导物的存在等来控制所述光激活多肽的表达。在一些情况下，所述光激活多肽的细胞类型特异性表达可以通过使用重组***来实现，例如Cre-Lox重组、Flp-FRT重组等。使用重组实现的基因的细胞类型特异性表达请见以下出版物：例如，Fenno等人，自然：方法，2014年7月；11(7)：763；以及Gompf等人，行为神经科学前沿，2015年7月2日；9：152，这些出版物以引用方式并入本文。

合适的神经元特异性控制序列包括但不限于Ca⁺⁺-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKIIa)启动子的α亚基(参见，例如，Mayford等人(1996)，美国国家科学院院刊，93：13250)，以靶向腹侧海马CAMKII神经元。

在一些情况下，使用一根或更多根光纤照射具有含有光激活肽的神经元的所述脑区。所述光纤可以任何合适的方式配置，以将从合适光源(例如，激光器或发光二极管(LED)光源)发射的光引导至所述脑区。所述光纤可以是任何合适的光纤。在一些情况下，所述光纤是多模光纤。所述光纤可以包括限定芯径的纤芯，其中来自所述光源的光穿过所述纤芯。所述光纤可以具有任何合适的芯径。在一些情况下，所述光纤的所述芯径为10μm或更大，例如，20μm或更大、30μm或更大、40μm或更大、50μm或更大、60μm或更大，包括80μm或更大，并且为1,000μm或更小，例如，500μm或更小、200μm或更小、100μm或更小，包括70μm或更小。在一些实施例中，所述光纤的所述芯径范围为10至1,000μm，例如，20至500μm、30至200μm，包括40至100μm。

被植入所述大脑靶区的光纤末端可以具有适合于用通过所述光纤传递的光刺激来照射所述脑区的任何合适的配置。在一些情况下，所述光纤包括位于或靠近所述光纤远端的附接设备，其中所述光纤远端对应于***所述受试者中的所述末端。在一些情况下，所述附接设备被配置成与所述光纤连接，且有助于使所述光纤附接于所述受试者，例如附接于所述受试者的颅骨。可以使用任何合适的附接设备。在一些情况下，所述附接设备包括套圈，例如金属、陶瓷或塑料套圈。所述套圈可以具有任何合适的尺寸，以固定和附接所述光纤。

在某些实施例中，可以使用任何合适的电子组件来实施本发明的方法，以控制和/或协调用于照射所述脑区的各种光学组件。所述光学组件(例如，光源、光纤、透镜、物镜、镜子等)可以由控制器控制，例如，以协调用光脉冲照射所述脑区的光源。所述控制器可以包括所述光源的驱动器，其能够控制与所述光脉冲相关的一个或更多个参数，例如(但不限于)所述光脉冲的所述频率、脉冲宽度、占空比、波长、强度等。所述控制器可以与所述光源的组件(例如，准直器、快门、滤光轮、动镜、透镜等)通信。

许多光激活多肽是本领域中已知的适用于光遗传学用途的多肽，包括，例如，光激活离子通道或光激活离子泵。参见，例如，Repina等人，化学和生物分子工程年度评论，2017年6月7日；8：13-39；WO2014144409A1；US 10,220,092；US 10,371,776；PCT/US2011/028893；WO/2013/093463；WO/2017/210664；WO/2017/015395；WO/2019/092564；WO/2017/100058，所述各文献明确以引用方式并入本文。所述光激活多肽由不同波长的光激活，包括，例如，蓝光；绿光；黄光；橙光；红光。所述光激活多肽可融合至各种序列中，例如信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和/或N端高尔基体输出信号等；包括添加增强所述蛋白向所述细胞质膜转运的运输信号(ts)。

目的光激活多肽包括，例如，阶跃功能视蛋白(SFO)6蛋白或稳定阶跃功能视蛋白(SSFO)蛋白，其可以在所述蛋白的所述视黄醛结合袋中的关键位置处具有特异性氨基酸取代。参见，例如，WO 2010/056970，其内容以引用方式全文并入本文。所述多肽可以是来源于团藻(VChR1)的阳离子通道，任选地包含一个或更多个氨基酸取代，例如，C123A；C123S；D151A等。光激活阳离子通道蛋白可以是来源于团藻的所述VChR1蛋白和莱茵衣藻的所述ChR1蛋白的C1V1嵌合蛋白，其中所述蛋白包含具有被ChR1的所述第一和第二跨膜螺旋替代的至少第一和第二跨膜螺旋的VChR1的所述氨基酸序列，任选地在氨基酸残基E122或E162处具有氨基酸取代。在其他实施例中，所述光激活阳离子通道蛋白是来源于莱茵衣藻的所述ChR1和所述ChR2蛋白的C1C2嵌合蛋白，其中所述蛋白对光有反应，并且用光照射所述细胞时，能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施例中，去极化光激活多肽是来源于莱茵衣藻的去极化光激活多肽的红移变体；称为“ReaChR多肽”或“ReaChR蛋白”或“ReaChR”。在一些实施例中，去极化光激活多肽是来源于Scherffelia dubia的SdChR多肽，其中用光照射所述细胞时，所述SdChR多肽能够跨细胞膜转运阳离子。在一些实施例中，去极化光激活多肽是来源于夜配衣藻的CnChR1，其中用光照射所述细胞时，所述CnChR1多肽能够跨细胞膜转运阳离子。在一些实施例中，所述光激活阳离子通道蛋白是来源于Chloromonassubdivisa的CsChR蛋白和夜配衣藻的CnChR1蛋白的CsChrimson嵌合蛋白，其中所述蛋白的所述N端包含CsChR的残基1-73的氨基酸序列，接着是CnChR1的残基79-350的氨基酸序列；对光有反应；并且用光照射所述细胞时，能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施例中，去极化光激活多肽可以是，例如，来源于淡黄毛枝藻的ShChR1，其中用光照射所述细胞时，所述ShChR1多肽能够跨细胞膜转运阳离子。

在一些实施例中，去极化光激活多肽来源于莱茵衣藻(CHR1，特别是CHR2)，其中用光照射所述细胞时，所述多肽能够跨细胞膜转运阳离子；并且用光照射所述细胞时，能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施例中，与EYFP融合的CaMKIIa驱动的人源化通道视紫红质CHR2 H134R突变体用于光遗传学激活。用于激活来源于莱茵衣藻的光激活阳离子通道蛋白的所述光的波长可以介于约460至约495nm之间，或者波长可为约480nm。所述光激活阳离子通道蛋白可以另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或***，以提高或降低对光的敏感性、提高或降低对特定波长的光的敏感性，和/或提高或降低所述光激活阳离子通道蛋白调节所述细胞质膜的所述极化状态的能力。此外，所述光激活阳离子通道蛋白可包含一个或更多个保守氨基酸取代和/或一个或更多个非保守氨基酸取代。含有引入所述天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或***的所述光激活质子泵蛋白适当地保留了跨细胞膜转运阳离子的能力。所述蛋白可以包含多种氨基酸取代，例如，H134R、T159C、L132C、E123A等中的一种或更多种；所述蛋白还可以包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。

药物设计

本发明提供了用于优化疗法的方法，所述优化方式如下：分析癫痫发作对脑区的影响，并基于所述信息，选择最适合解决癫痫发作诱导和传播的适当候选药物和治疗方式，同时最大限度地减少非预期毒性。通过选择能够最大限度地减少非预期毒性，同时提供有效活性的治疗方案来优化所述治疗。

本文提供的模型可用于设计和测试治疗性干预措施，例如手术、药理学疗法等，其中可确定治疗性干预措施对癫痫发作诱导和传播的影响。所述模型还可用于设计治疗癫痫共病的药物，例如所述最大的活动变化发生在所述内侧前额叶皮层(mePFC)，表明腹侧海马(vHip)与mePFC之间的兴奋性关系有所增进。设计用于治疗vHip-mePFC环路功能障碍的疗法可减少与癫痫相关的共病，包括焦虑和认知缺陷。在一些实施例中，癫痫发作传播的这些变量用于指导癫痫的手术靶向和治疗开发。本文中的研究结果包括展示伴随癫痫发作的高幅度活动的缓慢游走性核心，并且经常在癫痫发作之前观察到。

在一些实施例中，测试治疗性干预措施弱化腹侧海马(vHip)与mePFC之间的兴奋性关系的能力。本文所揭示的方法还可用于分析药剂对神经元和脑区的影响。例如，可以对暴露于一种或更多种受试化合物后兴奋性关系的变化进行分析，以分析所述受试化合物对个体的影响。此类分析可用于多种目的，例如用于开发抗癫痫疗法。

参数是细胞、组织和有机体(特别是可准确测量的组分)的可量化特征。例如，参数可以是电生理放电部位、强度、持续时间、速度等，并且可通过fMRI、LFP等成像。读数可以包括单个确定值，或者可以包括平均值、中值或方差等。典型地，对于参数，将进行多次测量，以获得一系列参数读出值。相应值预计会发生变化，并且采用标准统计方法和用于提供单个值的常用统计方法来获取测试参数组中各参数的值范围。

目的候选药剂是用于药物设计的生物活性药剂，涵盖许多化学物质类别，主要为有机分子(其可以包括有机金属分子)、无机分子、基因序列等。另外受关注的是治疗性干预措施，例如手术、脑深部刺激、光遗传学技术等。本发明的重要方面是评价具有优选生物响应功能的候选疗法。

其包括药理活性药物、遗传活性分子等。目的化合物包括化疗剂、抗炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道修饰剂和神经活性剂。适用于本发明的药物制剂的示例是以下出版物中描述的药物制剂：“治疗学的药理学基础”，Goodman和Gilman，McGraw-Hill，纽约州纽约市，(1996)，第九版，以下章节：作用于突触和神经效应器连接部位的药物；作用于中枢神经***的药物；自体有效物质：炎症的药物治疗；水、盐和离子；等等。

受试化合物包括上述所有类型的分子，并且可以进一步包含未知含量的样本。受人关注的是源自天然来源(例如植物)的天然存在的化合物的复杂混合物。虽然许多样本包含化合物溶液，但也可以测定可溶于合适溶剂中的固体样本。目的样本包括环境样本，例如地下水、海水、采矿废弃物等；生物学样本，例如用作物、组织样本等制备的裂解物；制造样本，例如药品制备过程中的时间进程；以及为分析制备的化合物文库；等等。目的样本包括正在评估潜在治疗价值的化合物，即候选药物。

术语样本还包括已向其中加入额外组分的上述流体，例如影响离子强度、pH、总蛋白浓度等的组分。此外，可对所述样本进行处理，以实现至少部分分级分离或浓缩。如果注意减少所述化合物的降解，则可以将生物学样本储存在氮气下、将其冷冻储存或其组合等。所用样本的体积足以进行可测量的检测，通常约0.1:1至1ml的生物学样本便已足够。

化合物(包括候选药剂)可从各种来源处获得，包括合成或天然化合物文库。例如，许多手段可用于各种有机化合物(包括生物分子)的随机和定向合成，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可获得或轻易产生呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，天然或合成产生的文库和化合物可通过常规化学、物理和生化手段轻易地加以修饰，且可用于产生组合文库。已知药剂可以进行直接或随机的化学修饰(例如，酰化、烷化、酯化、酰胺化等)，以生成结构类似物。

本文中使用的术语“遗传因子”是指多核苷酸及其类似物，其中在本发明的筛选测定中通过向细胞中加入所述遗传因子来测试所述遗传因子。所述遗传因子的引入使得所述细胞的总遗传组成发生改变。如本文中使用的那样，遗传因子可使蛋白表达，并且正在评价其对一种或更多种靶通路的影响。所述遗传因子(例如DNA)使得细胞基因组发生实验引入的变化，通常通过将所述序列整合到染色体中进行。基因变化也可以是瞬时变化，其中所述外源序列未整合，而是作为附加体保持。可以采用包含目的基因，并且被逆转录并***所述宿主细胞基因组中的RNA病毒。还可以在体外合成遗传因子(多肽或多核苷酸)，并通过与促使所述药剂转移至目的细胞中的部分(例如，触角足16-氨基酸“Penetratin-1肽，可从Qbiogene处获得)共轭，从而递送至细胞中。遗传因子的作用是使所述细胞中特定基因产物的表达增加，并且可能使所述细胞中的其他产物增加和/或减少。

在一些情况下，将已知或未知活性的化学药剂施用于动物，并评估对癫痫发作诱导、传播和运动的影响。这些化学药剂可用于激活通路、抑制通路等，其中受关注的是调节目的通路以外的通路，并且相较于使用天然因子，化学药剂可能更为适宜。所述化学药剂以溶液或易溶形式适宜地添加，并且可以多种方式施用于动物，例如本领域已知的口服、皮下给药、插管等。优选的化学药剂配方基本上由生物活性化合物和生理学上可接受的载体(例如，水、生理盐水等)组成。

在一实施例中，结合组合的电生理学(例如，局部场电位(LFP)和功能性磁共振成像(fMRI)扫描大脑不同区域)，刺激个体大脑的特定区域，以确定癫痫发作传播区与大脑其他区域之间的功能连接，并对癫痫发作的运动进行成像。可以诸如用右美托咪定对所述动物作镇静处理；并给予短效神经肌肉阻滞剂，例如维库溴铵，以避免所述动物在用同步LFP-fMRI进行癫痫发作成像期间运动。

适合的分析方案包括电生理学；神经活动的光诱导调节；脑电图(EEG)记录；功能成像和行为分析。电生理学可以包括单电极、多电极和/或场电位记录。如本文进一步描述的那样，神经活动的光诱导调节可以包括任何合适的光遗传学方法。功能成像可以包括fMRI，以及任何使用基因编码指示剂(例如钙指示剂、电压指示剂等)的功能成像方案。行为分析可以包括任何合适的行为测定，例如有关唤醒、记忆(例如水迷宫测定)、条件化(例如恐惧条件化)、感觉反应(对诸如视觉、体感、听觉、味觉和/或嗅觉线索的反应)的行为测定。

本文提供的模型可用于设计和测试治疗性干预措施，例如手术、药理干预措施(药物疗法)等，其中可确定治疗性干预措施对癫痫发作诱导和传播的影响。所述模型还可用于设计治疗癫痫共病的药物，例如所述最大的活动变化发生在所述内侧前额叶皮层(mePFC)，表明腹侧海马(vHip)与mePFC之间的兴奋性关系有所增进。设计用于治疗vHip-mePFC环路功能障碍的疗法可减少与癫痫相关的共病，包括焦虑和认知缺陷。在一些实施例中，癫痫发作传播的这些变量用于指导癫痫的手术靶向和治疗开发。本文中的研究结果包括展示伴随癫痫发作的高幅度活动的缓慢游走性核心，并且经常在癫痫发作之前观察到。

可以评估的具体发现包括，例如，用单光子发射计算机体层摄影(SPECT)、电生理学等实现的癫痫发作起始区(SOZ)定位，其中所述定位能检测游走性癫痫发作核心的位置，以及药剂对所述游走性核心的大小、游走速度、持续时间和/或位置的影响。在受刺激的海马中发现了高幅度活动的缓慢游走性核心，在一些情况下，这是在癫痫发作泛化之前唯一可检测到的活动，表明是新的癫痫发作泛化机制。所述游走性核心的平均传播速度为0.117mm/s(未点燃动物)和0.107mm/s(已点燃动物)。活动从iVHip游走至iDHip，然后传播至同侧皮层、对侧海马，最后传播至对侧皮层。

FBTC癫痫发作的诱导和传播，例如药剂对癫痫发作的大小、速度、持续时间和/或位置的影响。结果发现，已点燃癫痫发作始终是双侧激活，而未点燃癫痫发作优先激活同侧半球。mThal——被认为是癫痫发作泛化的关键节点的区域，其激活时间晚于皮层的许多区域。可以具体分析mThal激活。

可与已知的抗癫痫药物进行比较，例如加巴喷丁、托吡酯、拉莫三嗪、左乙拉西坦、司替戊醇和卢非酰胺、奥卡西平、拉考沙胺、吡仑帕奈等。

从受试药剂和参考药剂中获得的测量结果的比较可通过使用合适的推导方案、AI***、统计比较等来完成。将所述数据与参考结果数据库进行比较。可以汇编参考结果数据库。对于每种参考和测试模式，通常会生成数据矩阵，其中所述数据矩阵中的每个点对应于参数的读数，其中每个参数的数据可以来自于重复测定，例如相同类型的多次个体癫痫发作等。数据点可以是定量的、半定量的或定性的，这取决于所述参数的性质。读数可以是与测量相关的平均值、平均数、中值、方差或其他统计学或数学导出的值。通过直接比较相应的参考读出，可以进一步细化参数读数信息。在相同条件下针对各项参数获得的绝对值将显示出活生物体所固有的变异性，还可以反映出个体细胞变异性以及个体之间固有的变异性。

分类规则是基于从多次重复实验中获得的训练数据集(即数据矩阵)构建的。选择分类规则，以便正确识别重复参考模式并成功区分不同的参考模式。分类规则学习算法可以包括决策树方法、统计方法、朴素贝叶斯算法等。知识数据库将具有足够的复杂性，以便有效识别新的受试药剂并分类。用于生成一组充分涵盖的分类模式的若干种方法以及用于区分它们的足够强大的数学/统计方法可以实现这一点。

非药理学疗法设计

大量患者在用抗癫痫药物治疗后仍然发生癫痫发作，这使得相关人员采用手术和神经调节疗法来治疗癫痫。本文回顾了采用这两种治疗方式治疗耐药性癫痫的现状。可在本文所述的模型中测试手术和手术修饰的效果，以提升功效。

手术方式包括癫痫切除手术，特别是内侧颞叶癫痫(MTLE)。然而，癫痫病灶的常规定位和切除不足以获得良好的转归，并且可从确定游走性癫痫发作核心的部位和路径中受益。切除手术后癫痫发作的转归受以下各项影响：磁共振成像(MRI)病变的存在与否、相关病变的病理基质、癫痫病灶的范围和位置以及接受手术的患者的选择标准。

病变离断是癫痫手术特有的概念。即使致病性病变留在原位，致癫痫皮层与周围皮层和下游中脑完全离断也足以控制癫痫发作。可使用半球切开术、前额叶离断和后部离断。这些离断手术减少了与扩大切除术相关的手术并发症。

通过硬膜下电极和深度电极进行的颅内EEG记录可用于识别游走性癫痫发作核心的位置，以便进行手术。使用无框架立体定向导航***可以同时准确植入两种类型的电极。虽然尖峰和尖波被认为是常规EEG中的致癫痫标志，但发作期直流(DC)漂移和高频振荡(HFO)也被认为是宽带EEG中的致癫痫标志。HFO通常被定义为高于80Hz的振荡活动。虽然癫痫发作传统上表征为超同步神经元活动，但对单个神经元的发作期发放模式的检查表明，癫痫发作开始和扩散期间的神经元尖峰活动是高度异质的，而非超同步的。另外，如本文所示，不存在用于产生癫痫发作的静态核心。

非手术干预措施包括，例如，迷走神经刺激；对多个区域的深部脑刺激(DBS)、闭环反应性刺激和三叉神经刺激。迷走神经刺激(VNS)疗法能够长期、间歇性地刺激左颈迷走神经(VN)，产生稳定大脑皮层并缓解癫痫发作的传入神经冲动。

适用于癫痫治疗的颅内神经刺激包括，例如，适用于DBS的多种靶标，例如丘脑中央中核、海马、底丘脑核、蓝斑、尾状核、***体和小脑。闭环电刺激***有望通过对癫痫发作病灶或其他响应于检测到的癫痫发作开始的位置进行电刺激来消除癫痫发作。

计算机方面

本发明的方法中可以使用计算***(例如计算机)，以通过所述一个或更多个控制器来控制和/或协调刺激，并分析来自所述脑区扫描的数据。计算单元可以包括任何合适的组件来分析所述测量图像。因此，所述计算单元可以包括以下各项中的一项或更多项：处理器；非瞬态计算机可读存储器，例如计算机可读介质；输入设备，例如键盘、鼠标、触摸屏等；输出设备，例如显示器、屏幕、扬声器等；网络接口，例如有线或无线网络接口；等等。

可在基于计算机的***上分析和存储测量所得的原始数据，例如fMRI、LFP等。本文中使用的“基于计算机的***”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。本发明的基于计算机的***的最小硬件包括中央处理单元(CPU)、输入装置、输出装置和数据存储装置。技术人员可轻易理解的是，本发明适用当前可用的任何一种基于计算机的***。数据存储装置可以包括如上所述记录本信息的任何制造商，或者可以访问这种制造商的存储器访问装置。

输入和输出装置的各种结构格式可用于在基于计算机的***中输入和输出信息。这种情况为技术人员提供了相似性排序，并确定了在测试数据中含有的相似性程度。

所述分析可以在硬件或软件中，或者两者的组合中实现。在本发明的一个实施例中，提供了一种机器可读存储介质，该介质包括由机器可读数据编码的数据存储材料，当使用用所述数据的指令编程的机器时，该数据存储材料能够显示任何数据集和本发明的数据对比。这些数据可以用于多种目的，例如药物发现，细胞组分之间相互作用的分析等。在一些实施例中，本发明通过在可编程计算机上执行的计算机程序实现，所述计算机包括处理器、数据存储***(包括易失性和非易失性存储器和/或存储元件)、至少一个输入设备和至少一个输出设备。程序代码应用于输入数据以执行上述功能并生成输出信息。以已知方式将输出信息应用于一个或更多个输出设备。计算机可以是，例如，常规设计的个人计算机、微型计算机或工作站。

每个程序都可以用高级程序或面向对象的编程语言实现，以便与计算机***通信。但是，在需要的情况下，程序可以用汇编或机器语言实现。在任何情况下，该语言都可以是编译或解释型语言。每个这样的计算机程序都可以存储在通用或专用可编程计算机可读的存储介质或设备(例如ROM或磁盘)上，用于在计算机读取存储介质或设备以执行本文所述的程序时配置和操作计算机。所述***也可以被视为以配置有计算机程序的计算机可读存储介质的方式实现，其中配置的存储介质可使计算机以特定和预定义的方式操作以执行本文所述的功能。用于输入和输出装置的各种结构格式可用于在本发明的基于计算机的***中输入和输出信息。

本文进一步提供了通过计算机存储和/或传输采用本文所揭示的方法收集的序列和其他数据的方法。任何计算机或计算机配件(包括但不限于软件和存储设备)可用于实施本发明。序列或其他数据(例如，免疫组库分析结果)可由用户直接或间接输入计算机。另外，可用于DNA测序或分析DNA或分析免疫组库数据的任何设备都可以连接到计算机，以便能够将数据传输至计算机和/或计算机兼容的存储设备。数据可以存储在计算机或合适的存储设备(例如CD)上。数据也可以通过本领域公知的方法(例如，互联网、地面邮件、航空邮件)从计算机发送到另一台计算机或数据收集点。因此，通过本文所述方法收集的数据可以在任何点或地理位置收集并发送到任何其他地理位置。

实验

通过在点燃前后对个体海马癫痫发作进行成像来剖析癫痫发作网络

在这项研究中，我们通过改进癫痫研究和抗癫痫药物开发中使用的FBTC癫痫发作诱导技术，开发并利用了一种新的癫痫发生点燃模型。通过使用细胞类型特异性光遗传学刺激反复诱导电图癫痫发作，我们发现，出现FBTC癫痫发作，并且可以在此后数月内实现可靠诱导。然后，我们使用同步电生理学和fMRI来研究点燃腹侧海马中兴奋性神经元的影响，腹侧海马是人类癫痫中最常受影响的区域。我们研究了点燃改变的潜在海马环路，并对焦虑和抑郁这两种常见的癫痫相关共病进行了测试，以研究点燃、潜在环路与行为之间的关系。我们直接对单次诱发的癫痫发作的全脑网络动态进行成像，以揭示已点燃动物中局灶性和首次FBTC癫痫发作的传播。在此过程中，我们确定了癫痫发作的关键特征，这些特征对我们理解癫痫发作机制、手术靶向和治疗开发具有重要意义。

腹侧海马的光遗传点燃。点燃使用活动来重塑神经元环路。我们开发了一种新的点燃方法，并研究了反复光遗传学刺激腹侧海马(VHip)的影响，这通常是人类和动物模型中自发性癫痫发作起源的区域。我们以大鼠的腹侧海马CAMKII神经元为靶标(图1A、B)。成功点燃表征为在当日前三次刺激内诱发全面性运动性癫痫发作(Racine第5级)。

所有大鼠在刺激11天时达到点燃标准，其中83％(12只大鼠中有10只)在第7天达到点燃标准(图1C)。所需的平均刺激次数为53.6次(范围：29-117，图1D)，惊厥性癫痫发作(Racine第3-5级)的平均次数为6.75次(范围：2-13)，全面性癫痫发作(Racine第5级)的平均次数为2.9次(范围：1-9)。每只动物每次刺激的行为评分的可视化见图1E。

与其他常见的癫痫模型相比，点燃能最大限度地降低细胞损失。为了评估细胞损失，我们基于解剖MRI在点燃前后以及未点燃对照大鼠的相应时间点测量了海马体积。与其他点燃模型一致，我们未在任一半球中检测到明显的海马体积变化(图1F)。在同侧和对侧海马中，已点燃动物与未点燃动物的相应体积变化分别为0.63±0.82％与0.14±0.96％，p＝0.7和1.37±1.22％与-1.03±1.27％，p＝0.19。

点燃模型的关键特征在于，一旦动物被点燃，其影响显然是持久性的，因此很容易引起运动性癫痫发作。为了确认我们的新点燃程序是否导致处于持续点燃状态，我们评价了点燃后3周和12周以及未点燃对照动物(两组n＝5)中的一部分大鼠。仅在已点燃大鼠和两个时间点观察到运动性癫痫发作(Racine第5级)，而未点燃大鼠在任一时间点均未表现出任何明显的癫痫发作行为(Racine第0级)(图1G)。总之，我们的研究结果表明，这种光遗传点燃程序与传统点燃方法具有共同的关键特征，并为我们研究环路重塑和FBTC癫痫发作提供了新的平台。

点燃后广泛的腹侧海马环路重塑和焦虑加剧。点燃诱导局部结构和功能重塑，但尚不清楚哪些下游区域受到影响。我们通过在10Hz下刺激VHip CAMKII神经元来应对这一挑战，并使用同步局部场电位(LFP)和脑血容量(CBV)-fMRI来评价有无点燃的全脑响应。为了使全脑响应可视化，我们使用标准的通用线性模型方法生成fMRI激活图，以识别在刺激期间进行明显调制的体素。在未点燃大鼠中，刺激引起的活动主要局限于同侧半球的以下区域：背侧海马(DHip)、VHip、隔膜(Sept)、杏仁核(Amyg)和内侧前额叶皮层(MePFC)(图2C，左图)。相反，在已点燃大鼠中，相同刺激引起的活动超出这些区域，并且包括对侧半球的区域(图2C，右图，不同时间点的组群比较见图6)。在已点燃大鼠中，我们测试了点燃程序中的个体差异是否会导致区域活动模式存在差异。然而，将实现点燃的刺激次数或第5级运动性癫痫发作的次数作为回归量不会得到噪声电平以外的任何明显的体素关系(图7)。

我们通过将大脑分割成44个单独的区域并量化其激活量来研究未点燃大鼠和已点燃大鼠之间的全脑差异(图2D)。在针对多重比较进行调整后，我们发现，未点燃组与点燃组之间存在七个不同的脑区：同侧MePFC(27.2±9.0％与83.3±9.0％，p＝0.011)、对侧MePFC(1.4±0.7％与.29.2±7.3％，p＝0.033)、同侧额叶联合皮层(iFrAssC)(0.24±0.24％与27.1±5.6％，p＝0.004)、同侧颞叶联合皮层(iTeAssC)(0.34±0.34％与26.7±4.8％，p＝0.0006)、同侧眶额叶皮层(iOrFrC)(1.4±0.7％与23.8±3.9％，p＝0.0005)、同侧岛叶皮层(iInsC)(0.2±0.18％与13.0±2.7％，p＝0.0047)和同侧纹状体(iStria)(2.6±0.9％与14.8±2.7％，p＝0.011)。值得注意的是，在iVHip或iDHip中未观察到显著差异(17.3±3.0％与27.8±3.1％，p＝0.684，10.1±2.9％与24.4±5.9％，p＝0.994)。

我们接下来通过比较两组之间的区域CBV-fMRI幅度来研究点燃如何影响未点燃腹侧海马环路(图2E)。我们在未点燃组中选择了五个激活量最大的ROI进行比较(图2C，左图，ROI时间序列见图8)。在多重比较校正后，我们未在iVHip(2.1±0.3％与3.1±0.4％，p＝0.122)、iSept(1.6±0.3％与2.5±0.3％，p＝0.082)或iDHip(0.8±0.2％与1.2±0.2％，p＝0.178)中检测到CBV-fMRI响应幅度差异。然而，在iMePFC(1.3±0.3％与4.2±0.6％，p＝0.0023)和iAmyg(1.1±0.3％与3.0±0.4％，p＝0.0023)中观察到了明显差异。这些数据表明，点燃使得未点燃腹侧海马环路特定下游区域的响应增强。

上述结果表明，在光遗传学iVHip刺激期间，iVHip中的光遗传点燃使得iMePFC中的活动分布更广(图2D)、活动更强烈(图2E)，这通过fMRI进行测量。我们接下来分析了同步获得的LFP，以确定是否存在相应的LFP信号变化。点燃后，iMePFC中的响应明显增加(图2F)，这通过LFP进行测量。我们通过将5s刺激期间的频带功率除以刺激开始前5s的频带功率来量化这种响应。我们使用这一指标来比较点燃前和点燃后以及未点燃组和已点燃组的情况。我们未在iVHip中检测到任何明显差异(图2G，左图，p＝0.81，每组n＝12，双因素重复测量ANOVA)。然而，在iMePFC中，我们发现组群与时间之间存在显著的相互作用(图2G，右图，p＝0.031，每组n＝11。iMePFC记录的动物数量减少是由于电极故障所致，参见图9)。进一步分析表明，点燃后LFP幅度增加了6.4±2.6倍(p＝0.033，配对t检验)。结合fMRI响应，这表明点燃使得iVHip与iMePFC的连通性增加。

在已点燃动物中，我们发现，iMePFC响应发生了极大变化，并且整体大脑响应增加，但尚不清楚这些变化是否会对行为产生任何长期影响。由于腹侧海马体调节情绪和情感行为，因此我们研究了腹侧海马点燃是否会导致焦虑和抑郁增加：这是两种最常见的癫痫共病，其机制起源存在争议。在杏仁核电点燃后，已经检测到焦虑和抑郁。我们通过在一部分动物中点燃后12周(第二个fMRI时间点后10周)进行行为测试，研究了我们的光遗传点燃对焦虑和抑郁的长期行为影响(图2H)。我们使用强迫游泳和蔗糖偏好实验(分别为图2I和J)来评估抑郁，并使用旷场实验来评估焦虑。两种抑郁实验均未表明未点燃和已点燃动物之间存在明显差异。对于强迫游泳实验，未点燃对照组的平均不动评分为36.3±0.99，已点燃大鼠的相应评分为34.1±1.89(图2I，p＝0.303，t检验)。对于蔗糖偏好实验，无证据表明未点燃大鼠与已点燃大鼠之间存在差异(图2J，组群与***均估计分别为96.2±0.9％和83.9±12.8％)。在实验期间引入蔗糖水时，两组消耗的液体总量都有所增加(未点燃大鼠组增加了32.3±8.0ml，p＝0.005，已点燃大鼠组增加了24.7±6.9ml，p＝0.011，配对t检验)。相比之下，有证据表明已点燃动物的焦虑表型增加。与未点燃大鼠相比，已点燃动物在旷场中心花费的时间更少(图2K，12.5±1.5％与8.0±1.4％的中心花费时间，p＝0.046，未点燃对照大鼠与已点燃大鼠，t检验，n＝8和7)。重要的是，两组动物在5分钟实验期间移动的距离相似(2446±153cm与2203±197cm，p＝0.98)。我们发现，腹侧海马点燃导致焦虑加剧而非抑郁，这能够支持以下假设：即，重复异常活动会导致潜在的环路变化，从而引起焦虑。

上述实验表明，通过旷场实验测量可知，光遗传腹侧海马点燃导致iVHip-iMePFC连通性增加，且焦虑增加。值得注意的是，在之前的研究中，与将正常啮齿动物置于安全区域的情况相比，将这些动物置于致焦虑区域(旷场)时，观察到Vhip与MePFC之间的θ耦合增加。在另一研究中，将Arch注入Vhip并将光纤植入MePFC时，可以通过抑制Vhip输入来消除置于致焦虑环境中的正常动物的焦虑反应。这很有趣，因为焦虑是癫痫最常见的共病之一。我们的研究表明，海马中引发的点燃会引起iVHip-iMePFC连通性变化，这是在癫痫中观察到焦虑的坚实基础。

通过同步LFP-fMRI对未点燃大鼠和已点燃大鼠单次癫痫发作进行全脑成像。fMRI能够提供全脑信息，并已用于可视化人类和动物的局灶性和全面起源的癫痫发作，但由于相关的运动活动会导致运动伪影，因此将其用于可视化FBTC癫痫发作具有挑战性。动物fMRI通常需要镇静或麻醉来限制其运动，但镇静和麻醉的使用会影响癫痫发作活动，进而影响相关的运动活动。我们之前已经证实，在我们用于成像的右美托咪定镇静方案下，我们能够可靠地诱导癫痫发作，并且癫痫发作在清醒和镇静状态下的电生理学特征相似(清醒和镇静状态下未点燃癫痫发作期间的动物体内电生理学特征见图10)。在右美托咪定镇静下在已点燃动物中诱导癫痫发作时，会出现刻板的癫痫发作行为，这让人想起清醒动物中的癫痫发作行为，表明运动性癫痫发作环路在镇静作用下被激活。因此，我们开发了一种基于右美托咪定镇静并结合维库溴铵(一种短效神经肌肉阻滞剂)的方案，以避免动物在用同步LFP-fMRI进行癫痫发作成像期间运动(图3A)。正如预期的那样，在已点燃动物中，通过iVHip LFP估计的癫痫发作持续时间长于未点燃动物(图3B，66.2±6.7s与35.4±5.17s；p＝0.001)。

在已点燃动物和未点燃动物中，iVHip BOLD信号增加对应于癫痫发作相关的iVHip LFP幅度增加，表明BOLD成功捕捉到了局部癫痫发作活动(图3C、E)。图3展示了具有选定时间点的单次癫痫发作示例，在这些时间点捕捉到了未点燃动物和已点燃动物的活动传播。扫描期间的体素级最大强度投影(MIP)提供了癫痫发作期间激活区域的汇总情况(图3D、F)。这些MIP活动模式与使用2-脱氧葡萄糖等终点法报告的局灶性和全面性癫痫发作的相应模式具有惊人的相似之处。

在未点燃动物的癫痫发作示例中(图3C、D)，腹侧海马环路中最初出现活动爆发，让人想起10Hz iVHip阈下刺激网络(图2)，而后活动传播至同侧背侧海马，随后出现与发作后效应相关的负面BOLD响应。

在已点燃动物的单次癫痫发作示例中(图3E、F)，在整个扫描过程中，出现BOLD活动的区域大幅增加，现在在皮层中也可检测到活动(图3F)。重要的是，观察到BOLD活动从海马传播至同侧皮层，然后传播至对侧皮层(图3E时间点5-7)，这首次清楚地展示了整个大脑中局灶性进展为继发性全面性癫痫发作的癫痫发作传播动态。

对于未点燃和已点燃癫痫发作，一旦活动从iVHip传播开来，BOLD活动便会持续下去，直到在iVHip LFP上检测到癫痫发作活动结束(图3C、D时间点9-10和E、F时间点8-12)，这清楚地展示了局部电记录如何低估癫痫发作的持续时间。

未点燃动物和已点燃动物中不同的全脑传播动态。接下来，我们通过计算区域发作起始时间比较了未点燃和已点燃癫痫发作的区域BOLD传播模式(n＝20，来自7只未点燃大鼠；n＝17，来自5只已点燃大鼠。一只未点燃大鼠和两只已点燃大鼠失去了头盖，无法成像)。使用脑图谱，针对每次癫痫发作对44个ROI的平均区域响应进行分割和计算(图4A单次癫痫发作的区域动态)。发作起始时间被定义为BOLD活动首次超过60s刺激前基线四个标准差的时间，额外限制条件是，在此时间之后的后续10s内，活动必须保持在阈值以上至少5s。我们比较了激活的ROI的数量，发现已点燃组的癫痫发作所累及的区域多于未点燃大鼠(图4B，23.4±2.0个区域与38.8±1.0个区域，n＝20与17，对照与已点燃，p<0.0001)。

接下来，我们使用改进后的雷达图研究了未点燃和已点燃癫痫发作中区域激活的频率(图4C)。数据集的这种可视化显示，已点燃癫痫发作始终是双侧激活，而未点燃癫痫发作优先激活同侧半球。

为了计算用以研究活动传播的平均区域发作起始时间，仅使用在至少80％的癫痫发作中活跃的区域(图4C，n＝16-20(未点燃癫痫发作)和n＝14-17(已点燃癫痫发作)，80％阈值用于获得可靠的发作起始时间估计。90％和0％阈值分别见图11、12)。在未点燃癫痫发作中，至少80％的癫痫发作中有八个区域处于活跃状态，这些区域均来自同侧半球(图4D，左图，按从最快到最慢的顺序对区域进行排序)：iPiriC、iMePFC、iOrFrC、iVHip、iSept、iInsulC、同侧内嗅皮层(iEntC)、iTeAssC。对于已点燃癫痫发作，来自两个半球的38个区域在至少80％的癫痫发作中处于活跃状态(图4D，右图)。此外，从同侧半球到对侧半球有清晰的传播模式：在发作起始时间最快的前20个区域中，18个区域位于同侧半球。在其余18个区域中，14个位于对侧半球(每组的互相关区域分析见图13)。值得注意的是，mThal——被认为是癫痫发作泛化的关键节点的区域，其激活时间晚于皮层的许多区域，这表明mThal激活是癫痫发作泛化的下游活动。

然后，我们比较了未点燃组和已点燃组之间八个常见活跃区域的区域发作起始时间(图4E)。我们检测到，在iMePFC中，已点燃癫痫发作的发作起始时间(2.8±0.26s)快于未点燃癫痫发作(4.1±0.34s，Holm's调整后的p＝0.044)，而在其他区域未观察到一致差异(对于所有其他区域，p>0.3，未点燃与点燃)：iVHip(4.2±0.43s与4.4±0.76s)、iOrFrC(4.2±0.51s与3.0±0.21s)、iSept(4.6±0.62s与7.1±1.34s)、iInsC(7.1±3.94s与6.9±2.33s)、同侧梨状皮层(iPiriC)(3.4±0.32s与3.4±0.33s)、iEntC(9.8±3.06s与9.7±5.7s)和iTeAssC(10.8±2.14s与8.6±3.46s)。

海马中高幅度活动的游走性核心及其在癫痫发作泛化中的作用。在癫痫发作期间，我们经常在受刺激的海马中观察到高幅度活动的缓慢游走性核心，在一些情况下，这是在癫痫发作泛化之前唯一可检测到的活动，表明是新的癫痫发作泛化机制。在未点燃和已点燃组动物的同侧海马中均观察到游走性核心，这表明核心可以在有无点燃诱导的环路重组的情况下形成，在75％(9/12)大鼠的62％(23/37)癫痫发作中观察到该核心。这些数字分析表明，与未点燃对照大鼠(4/7未点燃大鼠的8/20癫痫发作)相比，在已点燃大鼠(5/5已点燃大鼠的15/17癫痫发作)中更频繁地观察到该核心。图5A、B展示了未点燃动物的游走性核心示例，图5C、D展示了已点燃动物的相应示例。

鉴于核心的游走性，我们接下来通过从腹侧到背侧将海马分为四个区域并计算峰至峰时间，估计其在两组中的传播速度(图5E、G、H)。未点燃组和已点燃组中游走性核心的传播速度相似(图5F)，未点燃大鼠的相应平均速度为0.117mm/s，已点燃大鼠的相应平均速度为0.107mm/s。

虽然未点燃和已点燃大鼠癫痫发作中的游走性海马活动有相似之处，但仅在已点燃大鼠中观察到游走至对侧海马。在出现游走性核心的癫痫发作中，在0％(0/8)未点燃癫痫发作和53％(8/15)(来自4/5大鼠)中观察到从iDHip传播至cDHip的活动。

尽管大多数快速泛化的癫痫发作会导致活动分布广泛(图3F)，但我们发现在一些癫痫发作(来自两只已点燃大鼠的三次癫痫发作)中，游走性海马活动是皮层激活前大脑中唯一明显的响应，这表明核心可能在癫痫发作泛化中起关键作用(图5I、J)。活动从iVHip游走至iDHip(时间点2-5)，然后传播至同侧皮层(6)、对侧海马(7-8)，最后传播至对侧皮层(9)。

我们已经展示了局灶性和FBTC癫痫发作动态的全脑成像，以及这些癫痫发作出现的潜在功能障碍网络。首先，我们开发了新的海马点燃光遗传学模型，以便可靠地引起FBTC癫痫发作。然后，我们使用两种刺激模式对腹侧海马环路动态进行了全脑研究：短而温和的10Hz刺激以评价潜在的功能环路变化，以及长而强烈的40Hz刺激以评价癫痫发作环路动态。我们发现，点燃导致受刺激的腹侧海马环路出现慢性、广泛重组，其中mePFC中的活动变化最大。点燃后，焦虑行为加剧。接下来，我们对个体局灶性和FBTC癫痫发作的全脑动态进行成像，以揭示其不同的传播模式，并且我们确定了经常伴随癫痫发作出现的高幅度活动的缓慢游走性核心。重要的是，在三次已点燃FBTC癫痫发作中，该核心是癫痫发作泛化前大脑中的唯一活动，表明该核心是癫痫发作的基本传播机制，且在癫痫发作泛化中起重要作用。

我们观察到的持久、广泛的点燃诱导的腹侧海马环路变化展示了特异性环路是如何在重复异常活动后进行功能重组的。因此，它是一种有用的动物模型，可用于研究反复癫痫样或癫痫发作活动对基础环路的影响。此外，重组后的环路与焦虑加剧有关，这表明出现了针对焦虑的敏感环路，焦虑是最常见的癫痫共病之一。我们发现，大脑中最大的活动变化发生在mePFC中，这表明vHip与mePFC之间的兴奋性关系有所增进。值得注意的是，这些区域是焦虑环路的三个节点中的两个，在动物进入抗焦虑环境时，其显示θ耦合增加，当θ耦合遭到破坏时，相关的焦虑行为消退。在癫痫患者和其他海马点燃模型中观察到vHip-mePFC环路功能障碍，并且环路功能障碍与认知缺陷有关，而认知缺陷是另一种常见的癫痫共病。总之，这些数据表明，开发针对vHip-mePFC环路功能障碍的疗法可能会减少与癫痫相关的一些最常见共病的发生，并且能够对可能对生活质量产生比癫痫发作本身更大的影响的病症进行有效治疗。

游走性海马核心作为癫痫发作传播的基本机制，对癫痫手术而言具有重要意义，这需要可靠地定位癫痫发作起始区(SOZ)。我们的单次癫痫发作数据对应的SOZ已知，即腹侧海马，并且这些数据展示了游走性核心如何影响SOZ定位(图3D、F和5J)。通过这些数据，我们发现，SOZ在整个癫痫发作期间可能并不活跃，癫痫发作活动的区域分布可以快速变化，活跃度最高的区域通常不是SOZ。这对标准临床SOZ识别方法(例如，单光子发射计算机体层摄影(SPECT)和电生理学)有直接影响。SPECT使用在癫痫发作时手动注射的短寿命放射性血流示踪剂，因此任何注射延迟都可能导致无法检测到SOZ中的任何活动。电生理学使用电极在癫痫发作期间绘制电活动图，虽然有出色的时间分辨率，但会出现可能导致SOZ错误分类的位置和方向偏差。位置偏差的示例示于单次癫痫发作数据中，其中癫痫发作活动远离植入SOZ的电极传播，虽然癫痫发作活动在大脑中的其他地方进行，但不会再在该电极上检测到癫痫发作(图3D、F和5J)。同样地，如果将电极放置在游走性癫痫发作核心的路径中，则癫痫发作活动的开始将反映为传播而非发作。因此，开发能够检测游走性核心的方法可能有助于改善癫痫手术的SOZ定位。

游走性海马核心的机制尚不清楚，我们不知道这种现象是否在海马之外发生。但是，固有的海马环路足以支持该核心，因为在未点燃和已点燃大鼠中均观察到了该核心。以约0.1mm/s的速度移动时，在人类和动物中报告了以相似速度传播的癫痫发作活动，并指出离子扩散和抑制性约束是潜在的关键机制。有趣的是，近期的证据表明，缓慢传播活动是癫痫相关猝死(SUDEP)的主要机制，需要进一步的研究来确定这种活动是否与游走性海马核心的潜在机制相同。

癫痫发作从海马传播出来时，活动遵循已知的轴突通路，因此涉及突触机制。图5J是通过突触传导传播的示例，其中癫痫发作活动从同侧海马传播至对侧海马。在局灶性皮层癫痫发作的小鼠模型中观察到突触癫痫发作传播机制，其中活动传播至特异性区域，而不是非选择性地传播至毗连区域。开发针对这些机制的疗法可以提高疗效。

缩写。‘i’同侧，‘c’对侧，‘ChR2’通道视紫红质2，‘Amyg’杏仁核，‘AudC’听觉皮层，‘CingC’扣带皮层，‘DHip’背侧海马，‘DLThal’背外侧丘脑，‘EntC’内嗅皮层，‘FrAssC’额叶联合皮层，‘Hypo’下丘脑，‘InsulC’岛叶皮层，‘MDThal’背内侧丘脑，‘mePFC’内侧前额叶皮层，‘MotorC’运动皮层，‘OrFrC’眶额叶皮层，‘ParieC’顶叶皮层，‘PiriC’梨状皮层，‘ReplC’压后皮层，‘Sept’隔膜，‘SomC’体感皮层，‘Stria’纹状体，‘TeAssC’颞叶联合皮层，‘VHip’腹侧海马，‘VisC’视觉皮层。

材料和方法

实验设计。将AAV-5-CAMKIIa-hChR2(H134R)-eYFP注入25只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories)的右腹侧海马中，并植入MRI兼容性光极，以实现同步刺激和电生理记录，同时向同侧内侧前额叶皮层植入MRI兼容性电极，用于电生理记录(REF Ben电极纸和海马纸)。手术后至少六周，使用同步LFP光遗传学fMRI(ofMRI)对大鼠进行成像，以研究点燃后海马环路的变化。将动物随机分成两组：实验点燃组和对照组(n＝12，n＝13)。在MRI扫描后至少1周，对点燃组进行点燃，1-2周后使用LFP-ofMRI再次对所有大鼠进行成像。在LFP-ofMRI后约一个月，再次对一部分大鼠(每组n＝5)进行复验，以评价点燃效应的持久性。然后，在LFP-ofMRI后10周，使用蔗糖偏好实验、旷场实验和强迫游泳实验测试其余动物(n＝7，n＝8)的抑郁和焦虑证据，以最大限度地减少急性癫痫发作的影响，评价点燃的长期后果。隔一周进行一项行为测试。在行为测试结束后至少一周，使用LFP-ofMRI对癫痫发作进行成像，以研究癫痫发作环路的性质。

病毒注射以及光极和电极植入的外科手术。畜牧和实验方案严格按照美国国立卫生研究院(NIH)和斯坦福大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南执行。动物饲养在环境受控的条件下，安排12小时光照-黑暗循环，可随意进食和饮水。

简而言之，使用含有5％异氟醚的纯氧麻醉大鼠，然后在整个手术过程中异氟醚维持2-3％异氟醚供给。使用连接Hamilton注射器的33号针头将2μlAAV-5-CAMKIIa-hChR2(H134R)-eYFP注入右腹侧海马(AP：-5.6mm，LR：5.7mm，DV：6mm，以硬脑膜为基点)。使用注射泵(Micro 4，World Precision Instruments，FL)确保以恒定速率(150nl/min)给药。***如前所述(Duffy等人，2015)的MRI兼容性碳纤维光极(采用0.22数值孔径、直径105μm的阶跃型多模光纤(ThorLabs，Newton，NJ)构建)，以使电极尖端和纤维位于注射部位的正上方。植入前，检查光极，确保光传输百分比大于80％，并且假设对大脑的光传输约为该值。将单颗黄铜螺钉***小脑上方，以固定牙科水门汀，并用作接地电极和参比电极。将碳纤维电极植入右侧内侧前额叶皮层(AP：+3.24mm，LR：+1.25mm，DV：-3.4mm，以硬脑膜为基点，10°角)。最后，将电极线焊接到DF13连接器(Hirose，日本)上，并使用光固化牙科水门汀将所有组件固定到颅骨上。术前给予丁丙诺啡缓释剂(1mg/kg，s.c.)，以减轻手术引起的疼痛和不适。术前和术后也局部给予利多卡因(4％)和布比卡因(0.25％)。为了给病毒诱导的蛋白表达留出时间，在术后至少6周进行了实验。

光遗传点燃。使用以下程序点燃12只大鼠，并在其居住笼中使用同步视频LFP记录进行全程监控。动物通过光纤和电气旋转接头(Doric Lenses)连接到473nm(蓝光)二极管泵浦固态激光器(Laserglow Technologies，加拿大多伦多)和16通道BrainAmp ExG MR放大器(Brain Products，德国)。使用Logitech C920 HD Pro网络摄像头录制视频。

首先通过逐步增加刺激强度来评价每只动物的后发放阈值，以在无行为性癫痫发作的情况下促使发生电图癫痫发作(使用Racine量表进行评估)。从1mW下10s 40Hz刺激序列(脉冲宽度为7.5ms)开始，功率每次增加1mW，刺激间隔(ISI)为1分钟，功率最高为20mW。如果未观察到后发放，则持续时间增加2.5s，并将功率重置为1mW。

确定后发放阈值后，开始点燃。对动物进行刺激，一天最多刺激12次，或者直到出现第5级运动性癫痫发作，并且可以每隔一天对动物进行一轮刺激，最多刺激12天。刺激间隔为15分钟。如果在当日前三次刺激内，观察到第5级运动性癫痫发作，则认为动物被点燃。

使用相同的点燃标准，在通过三次刺激(ISI为15分钟)点燃后3周和12周，在一部分动物(五只年龄匹配的平行对照动物和5只已点燃大鼠)中评估点燃的持久性。

同步LFP-ofMRI数据采集以评估腹侧海马连通性。为了评估腹侧海马连通性，使用光遗传学刺激在10Hz下刺激腹侧海马中的CAMKIIα细胞，并使用同步LFP-fMRI进行评估。使用斯坦福体内成像创新中心(SCi3)的7T水平钻孔***(Bruker BioSpec 70/30)进行数据采集。使用直径为86mm的2通道体积线圈进行RF激励，使用20mm单环表面线圈作为RF接收器。通过推注(0.1mg/kg，s.c.)右美托咪定对大鼠作镇静处理，然后通过***侧尾静脉的插管连续输注(0.05mg/kg，i.v.)。单次推注Feraheme(15mg/kg，i.v.)进行脑血容量(CBV)加权成像，以提高对比度噪声比(Mandeville等人，1998)和微血管敏感性(Zhao等人，2006)，与BOLD fMRI相比，该技术具有此优势。在对比剂注射后约15分钟，使用具有以下采集参数的4次分段螺旋读出进行fMRI采集：TR＝0.75ms，TE＝9ms，翻转角＝30，视野＝32x 32mm，矩阵＝70x 70，切片厚度＝0.6mm，切片数＝30，重复次数＝130，虚拟扫描次数＝4。对于光遗传学刺激，使用块设计，其包含5s开启和55s关闭，并在10Hz、7.5ms脉冲宽度下进行刺激。在每次治疗结束时，给予Atipamazole(0.5mg/kg，s.c.)，以逆转右美托咪定的作用。除fMRI外，还采集了解剖学(快速自旋回波)扫描信息，以便用以下参数评估海马体积：TR＝4755ms，TEeff＝29.9ms，RARE因子＝8，视野＝30x 30mm，矩阵＝256x 256，切片厚度＝0.6mm。为了评估海马体积，在每只动物的同侧和对侧半球上手动绘制海马体积。在未点燃和已点燃动物中进行基线和点燃后测量，并通过基于其基线将每个海马体积归一化来评估动物体积。对于各半球，使用单独的t检验来评估两组之间的差异，以确定明显的海马体积减少是否与点燃有关。

同步LFP-ofMRI数据采集以对癫痫发作环路动态进行成像。为了评估未点燃动物(n＝7)和已点燃动物(n＝5)的全脑癫痫发作环路动态，我们使用同步LFP-fMRI和腹侧海马CAMKIIα细胞的光遗传学刺激。由于植入物丢失，无法对三只动物进行成像(未点燃组n＝1，已点燃组n＝2)。如上所述，在预定的后发放阈值下使用40Hz脉冲序列(脉冲宽度为7.5ms)诱导癫痫发作。由于右美托咪定镇静方案下的运动性癫痫发作导致发生明显运动，因此麻痹动物并通气，以进行癫痫发作LFP-ofMRI。使用5％异氟醚进行麻醉诱导，并使用2-3％异氟醚维持麻醉状态，然后给大鼠插管，以用于药物输注。之后，给动物插管并推注右美托咪定(0.1mg/kg，s.c.)。在该程序的其余部分，缓慢撤除异氟醚，并连续输注右美托咪定(0.05mg/kg，i.v)和维库溴铵(7.5mg/kg)来维持镇静和麻痹。使用如上所述的MRI***进行数据采集。对于fMRI，使用具有以下参数的1次EPI读出采集数据：TR＝1s，TE＝16ms，翻转角＝30，视野＝32x 32mm，矩阵＝70x 70，切片厚度＝0.6mm，重复次数＝480，虚拟扫描次数＝4。在开始成像后90s开始进行癫痫发作诱导。在每次治疗结束时，给予Atipamazole(0.5mg/kg，s.c.)，以逆转右美托咪定的作用。

同步LFP记录和处理。使用16通道BrainAmp ExG MR放大器(Brain Products，德国)进行与fMRI数据采集同时进行的LFP记录，该放大器配有1000Hz的低通滤波器，采样频率为5000Hz。通过主成分分析，使用Liu等人实施的方法去除了梯度伪影(Liu等人，2012)。

fMRI预处理和分析。使用SPM12对所有fMRI数据进行预处理，并使用SPM12分析10Hz腹侧海马活动数据。对于预处理，首先使用0.5mm的高斯核在半峰全宽下对数据进行平滑处理，并使用6参数刚性配准对运动进行校正。对图像进行手动脑掩蔽，然后使用SPM中实施的12参数仿射配准与公共空间对齐。使用双伽马基组函数实现刺激块的信号卷积。使用通用线性模型(GLM)生成统计激活图。对于区域分析，使用通用脑图谱自动分割大脑，产生44个区域，然后计算个体动物的激活体积和平均时程。

fMRI癫痫发作传播分析。对于各癫痫发作fMRI，在感兴趣区域层面确定癫痫发作传播。将扫描记录到脑图谱中，以0.1Hz进行低通滤波，并使用上述脑图谱分割成单个区域。利用给定区域内的所有体素计算平均时程。通过确定信号达到与基线(刺激开始前60s)相差四个标准差的时间来计算每个区域的发作起始时间，额外限制条件是，此后10s内，该信号必须维持在该基线以上至少5s。

海马连通性与癫痫发作诱导之间的关系。为了研究海马连通性与该网络中诱导的癫痫发作之间的关系，我们计算了某区域在癫痫发作诱导期间处于活跃状态的条件概率，前提是它在10Hz非癫痫发作刺激期间处于活跃状态。

对于10Hz海马连通性数据，使用上述程序生成单一受试者体素级别图，并在P<0.001下进行阈值化处理。

为了确定与每只动物的光遗传学癫痫发作诱导相关的网络，我们计算了在诱导期的前10s内激活体素的百分比。首先，在体素层面上确定最大BOLD变化百分比。接下来，首先应用能够最大限度降低类内方差的阈值，使用Otsu方法对每次诱导的图像进行二值化处理，然后计算动物内癫痫发作时激活的体素百分比，以生成能够评价与光遗传学癫痫发作诱导相关的网络变化的图。对于组分析，对这些图进行组内平均，以提供与光遗传学癫痫发作诱导相关的网络图。

利用单一受试者10Hz海马连通图和单一受试者癫痫发作诱导网络图，我们继续评价某区域在癫痫发作诱导期间处于活跃状态的条件概率，前提是它在10Hz刺激期间处于活跃状态。首先，使用44区域脑图谱将所有数据自动分割成44个区域的相应数据。接下来，针对两组数据，我们使用5％激活体积阈值来确定脑区是否处于活跃状态。之后，我们计算了未点燃组和已点燃组在区域层面的条件概率。

蔗糖偏好实验。将两只装有淡水的瓶子放置在单独饲养的大鼠(8只对照大鼠和7只已点燃大鼠)的居住笼中四天，每天交换瓶子位置，使大鼠适应瓶子并减少对位置的偏好。每天(上午9点至10点)对水瓶进行称重。在适应期后，将两只装有淡水的瓶子——一只装满水，另一只装满5％w/v蔗糖水——放入笼中。每天(上午9点至10点)对水瓶进行称重并交换水瓶位置，持续四天。在研究期间，对水瓶的身份进行设盲。通过每天饮用的水量和水与蔗糖水的比例评估兴趣缺失。

旷场实验。针对该程度，对动物的身份(8只对照大鼠和7只已点燃大鼠)进行设盲，仅在数据处理完成后方才揭盲。将大鼠单独放置在定制腔室(1m x 1m x 0.3m)中，并使用Logitech C920 HD Pro网络摄像头进行记录。使用Viewer3软件(Biobserve GmbH，德国)在记录的前五分钟离线进行自动跟踪。使用移动距离和远离活动场所边缘的时间来评估焦虑。

强迫游泳实验。针对该程度，对动物的身份(8只对照大鼠和7只已点燃大鼠)进行设盲，仅在数据处理完成后方才揭盲。将大鼠单独放置在定制的圆柱形容器(直径30cm，高90cm)中，容器内装有23-25℃、约60cm高的水。实验前一天进行了10分钟的预实验。使用Logitech C920 HD Pro网络摄像头在实验期间(5分钟)记录动物情况。将动物用毛巾擦干并送回其居住笼中。所有数据均进行离线分析。使用改进的FST评分***对动物的不动、游泳和攀爬进行评分，评估每5s时期的主要行为(Slattery和Cryan，2012)。使用不动评分评估行为绝望。

统计分析。值以平均值±sem的形式表示。如有指示，使用Holm的Bonferroni方法调整p值，以进行多重比较。使用SPSS 21或自定义MATLAB脚本进行统计分析。P<0.05时具有统计学意义。

示例2

了解功能障碍的大脑网络如何导致癫痫发作并影响其传播和终止是癫痫研究的核心目标，并且可以为癫痫发作和癫痫相关共病的靶向治疗的开发提供信息。在本项研究中，我们在反复海马癫痫发作(点燃)(一种导致慢性网络变化的程序)之前和一周后研究了兴奋性腹侧海马(VH)网络，同时对大鼠进行同步电生理学和功能性MRI与光遗传学刺激。我们还直接对单次癫痫发作的全脑网络动态进行成像，以揭示局灶性和首次局灶性进展为双侧强直-阵挛性癫痫发作。我们还对焦虑和抑郁这两种常见的癫痫相关共病进行了测试。最后，我们根据受试者内部数据报告了海马网络与由此产生的癫痫发作动态之间的关系。点燃后，检测到兴奋性VH网络活动广泛增加。在mPFC中检测到最大变化(点燃后，LFP带宽增加了6.4倍，激活体积增加了56％)。由于VH前额叶皮层环路与焦虑和抑郁有关，因此我们测试并发现已点燃大鼠更加焦虑(n＝7、8，p＝0.046)。对于癫痫发作成像，已点燃大鼠的癫痫发作持续时间比未点燃大鼠长30.7±8.4s(p＝0.001)，激活的ROI多15.5±2.2个(p<0.001)。传播网络分析表明，对照动物的活动保持在同侧，而已点燃大鼠的活动逐渐传播至双侧皮层。mPFC激活速度更快。背内侧丘脑是与癫痫发作泛化4有关的区域，仅在已点燃大鼠中处于活跃状态。接下来，我们研究了VH网络与癫痫发作网络之间的线性关系，发现对照动物中95％的变异性得到了解释，而已点燃大鼠中77％的变异性得到了解释(p<0.001，p＝0.05，n＝7、5)。最后，我们研究了VH网络活动对癫痫发作受累的阳性预测值，发现在始终激活的ROI方面，对照动物为0.86±0.08个(3个ROI，n＝7)，已点燃大鼠为0.89±0.07个(14个ROI，n＝5)，这表明评估VH活动能够可靠地知晓癫痫发作通路。总之，这些结果揭示了海马癫痫发作传播的全脑兴奋性VH网络以及反复癫痫发作对这些网络的长期影响。

在本项研究中，我们在反复海马癫痫发作(点燃)(一种导致慢性网络变化的程序)之前和一周后研究了兴奋性腹侧海马(VH)网络，同时对大鼠进行同步电生理学和功能性MRI与光遗传学刺激。我们还直接对单次癫痫发作的全脑网络动态进行成像，以揭示局灶性和首次局灶性进展为双侧强直-阵挛性癫痫发作。我们还对焦虑和抑郁这两种常见的癫痫相关共病进行了测试。最后，我们根据受试者内部数据报告了海马网络与由此产生的癫痫发作动态之间的关系。

光遗传点燃。12只大鼠中有10只(83％)在刺激的第7天达到点燃标准，所有大鼠在第11天点燃。点燃所需的平均刺激次数为53.6次(范围：29-117)，惊厥性癫痫发作(Racine第3-5级)的平均次数为6.75次(范围：2-13)，全面性癫痫发作(Racine第5级)的平均次数为2.9次(范围：1-9)。用荧光显微镜证实了能用ChR2-eYFP成功靶向腹侧海马。

点燃能最大限度地降低细胞损失，因此我们测试能否通过在点燃前后和平行对照未点燃大鼠中测量扫描过程中获得的解剖MR扫描中的海马体积，从而检测任何明显的海马体积损失。与未点燃动物相比，点燃时，在同侧和对侧海马中均未检测到显著的海马体积差异(图1F，0.63±0.82％与0.14±0.96％，p＝0.7和1.37±1.22％与-1.03±1.27％，p＝0.19，点燃与未点燃，分别在同侧和对侧海马中，平均值±sem)，这能够支持以下假设：即，点燃不会导致大量细胞损失。

为了确认点燃的慢性效应，在点燃后3周和12周重新测试了一部分大鼠(点燃和未点燃，n＝5)。所有这5只已点燃大鼠在两个时间点均出现Racine第5级癫痫发作，表明点燃持续存在，而未点燃大鼠在任一时间点均未表现出任何明显的癫痫发作行为。

局部和全脑对10Hz腹侧海马光遗传学刺激的响应(有无点燃)以及点燃对焦虑和抑郁的影响。在未点燃大鼠中，10Hz光遗传学刺激导致CBV活动主要位于同侧半球、背侧和腹侧海马、隔膜、杏仁核和内侧前额叶皮层。相比之下，在已点燃大鼠中，相同的刺激导致活动超出这些区域并包括对侧半球的区域。在比较大脑各个区域的活动体积时，我们发现，在使用Bonferroni-Holm方法进行多重比较校正后，两组大鼠在七个区域中表现出一致的体积差异：同侧额叶联合皮层(0.24±0.24％与27.1±5.6％，p＝0.004)、颞叶联合皮层(0.34±0.34％与26.7±4.8％，p＝0.0006)、眶额叶皮层(1.4±0.7％与23.8±3.9％，p＝0.0005)、岛叶皮层(0.2±0.18％与13.0±2.7％，p＝0.0047)，最后是纹状体(2.6±0.9％与14.8±2.7％，p＝0.011)。两组之间同侧腹侧或背侧海马的活跃ROI百分比均无明显差异(17.3±3.0％与27.8±3.1％，p＝0.684，10.1±2.9％与24.4±5.9％，p＝0.994)。

接下来，我们通过研究fMRI对光遗传学刺激的响应幅度来询问未点燃大鼠中活跃的区域在已点燃大鼠中是如何变化的。我们未在腹侧或背侧海马中检测到响应幅度差异(未点燃与已点燃，平均值±sem，使用Bonferroni-Holm方法调整p值，以进行多重比较)；VHip(2.1±0.3％与3.1±0.4％，p＝0.122)，dHip(0.8±0.2％与1.2±0.2％，p＝0.178)。然而，在mePFC(1.3±0.3％，4.2±0.6％，p＝0.0023)、隔膜(1.6±0.3％，2.5±0.3％，p＝0.082)和杏仁核(1.1±0.3％，3.0±0.4％，p＝0.0023)中观察到了明显差异。

由于我们用fMRI同步测量了iMePFC和iVHip中的局部场电位(LFP)，因此我们研究了这些区域是否存在互补的LFP响应。点燃后，iMePFC在视觉上出现明显增加。我们通过计算5s刺激期间的带宽响应(依据刺激开始前5s的带宽进行归一化)来量化这种变化，并将点燃前后的响应与未点燃大鼠的相应响应进行比较。我们未在腹侧海马中检测到任何明显差异(F＝0.59，p＝0.81，未点燃大鼠和已点燃大鼠分别为n＝13和12，用双因素重复测量ANOVA进行分析)。然而，在内侧前额叶皮层中，我们发现组群与时间之间存在显著的相互作用(F＝5.39，p＝0.031，每组n＝11)。事后分析表明，点燃后增加了6.4±2.6倍(平均值±s.e.m.)(配对t检验，t＝2.47，p＝0.033)。这结合fMRI响应表明点燃使得腹侧海马与内侧前额叶皮层的连通性增加。

由于腹侧海马到内侧前额叶皮层环路与焦虑的表达有关，因此我们研究了点燃程序是否导致部分动物出现长期行为障碍。我们进行焦虑和抑郁测试，这是两种最常见的癫痫相关情感共病。针对抑郁，对动物进行了强迫游泳和蔗糖偏好实验。两种实验均未表明未点燃和已点燃动物之间存在明显差异。对于强迫游泳实验，未点燃对照动物与已点燃大鼠的不动评分分别为36.3±0.99与34.1±1.89(平均值±s.e.m)，通过t检验计算得到的p值为0.303。对于蔗糖偏好实验，我们未找到证据表明未点燃大鼠与已点燃大鼠之间存在差异(F＝0.48，p＝0.499，双因素重复测量ANOVA，未点燃动物和已点燃动物的平均估计分别为96.2±0.9％和83.9±12.8％)。在实验期间引入蔗糖水时，两组消耗的液体总量都有所增加(未点燃大鼠组增加了32.3±8.0ml，p＝0.005，已点燃大鼠组增加了24.7±6.9ml，p＝0.011，配对t检验)。我们发现，与未点燃大鼠相比，已点燃动物在旷场中心花费的时间更少，这表明海马点燃导致焦虑增加(12.5±1.5％与8.0±1.4％的中心花费时间，p＝0.046，mean±s.e.m.，未点燃对照大鼠与已点燃大鼠，t检验，n＝8和7)。重要的是，两组动物在5分钟测试期间移动的距离相似(2446±153cm与2203±197cm，p＝0.98)。

通过同步LFP-fMRI对未点燃大鼠和已点燃大鼠单次癫痫发作进行成像。在已点燃动物中诱导的癫痫发作与在右美托咪定镇静下MRI上刻板行为造成的明显运动伪影有关，这让人想起在清醒已点燃动物中观察到的行为。因此，我们开发了一种基于右美托咪定镇静并结合维库溴铵(一种短效神经肌肉阻滞剂)的方案，以避免动物在癫痫发作成像期间运动。

在已点燃和未点燃动物中，我们使用LFP验证了在同侧腹侧海马中停止光遗传学刺激后癫痫发作的出现情况(用fMRI同步采集)。重要的是，同侧腹侧海马BOLD信号遵循与LFP相似的轨迹，表明BOLD捕捉到了癫痫发作响应。未点燃动物和已点燃动物的单次癫痫发作(使用LFP实现)示例以及归一化BOLD变化对应于LFP上时间点的单一1s帧。在未点燃动物的癫痫发作中，腹侧海马环路中最初出现活动爆发，让人想起10Hz网络，而后活动传播至同侧背侧海马，随后出现负面BOLD响应。扫描期间的体素级最大强度投影(MIP)揭示了高幅度活动网络。

在已点燃动物的单次癫痫发作中，在整个扫描过程中，出现BOLD活动的区域大幅增加，现在在皮层中也可检测到活动，这表明癫痫发作从最初的癫痫发作病灶开始泛化。重要的是，BOLD活动从初始海马网络传播至同侧皮层，然后传播至对侧皮层，这首次展示了整个大脑中局灶性进展为继发性全面性癫痫发作的癫痫发作传播动态。癫痫发作的MIP汇总了该实验的高幅度活动。值得注意的是，对于未点燃和已点燃癫痫发作，BOLD活动一直持续到在LFP上检测到癫痫发作活动结束。

未点燃动物和已点燃动物的癫痫发作传播。接下来，我们量化了在未点燃大鼠和已点燃大鼠中诱导的癫痫发作中的BOLD活动传播(n＝20，来自7只大鼠，n＝17，来自5只大鼠。未点燃组和已点燃组中分别有1只和2只大鼠失去了头盖，无法用于本实验中)。为了捕捉传播，我们使用自动分割图谱进行区域分析，得到44个ROI。区域层面的时间序列示例见图4A。为了确定传播，我们将区域发作起始时间定义为活动首次达到超过60s刺激开始前基线四个标准差的时间，并且在此时间之后的后续10s内，活动必须保持在阈值以上5s。为了验证该程序能够区分未点燃组和已点燃组，我们比较了两组之间检测到的ROI数量，并证实已点燃组的癫痫发作中始终激活的区域多于未点燃组(23.4±2.0个区域与38.8±1.0个区域，n＝20与17，对照与已点燃，平均值±sem，p<0.0001)。

接下来，我们研究了所有未点燃和已点燃癫痫发作中44个区域的活动分布情况。将雷达图沿中轴排列成两个半球的镜像后显示，已点燃大鼠的癫痫发作本质上始终位于双侧，而未点燃大鼠也有一些激活区域，这些ROI优先位于同侧半球。为了可靠地估计发作起始时间，我们仅使用在每个癫痫发作组中至少80％被激活的区域(在未点燃和已点燃癫痫发作中，n＝16-20，n＝14-17，通过90％和0％阈值计算得到的发作起始时间见增补图)。

按从最快到最慢的顺序对每组的ROI发作起始时间进行排序，并为同侧和对侧半球进行颜色编码。在未点燃动物中，估计有8个ROI(iPiriC、IMePFC、iOrFrC、iVHip、iSept、iInsulC、iEntC、iTeAssC)。值得注意的是，所有区域都来自同侧半球。对于已点燃癫痫发作，在38个区域中检测到活动，其中明显的是，同侧半球首先被激活，然后在对侧半球中检测到激活。这些ROI包括在未点燃大鼠中发现的8个ROI。在发作起始时间最快的前20个区域中，18个区域位于同侧半球。在其余18个区域中，14个位于对侧半球。接下来，我们比较了两组之间在未点燃大脑中始终激活的八个区域的发作起始时间，发现同侧mPFC在点燃大脑中比在对照组中更快激活(4.1±0.34s与2.8±0.26s，未点燃对照与已点燃，Holm调整后的p＝0.044)，其他区域未见差异(Holm调整后的p值>0.3)：同侧腹侧海马(4.2±0.43s与4.4±0.76s)、眶额叶皮层(4.2±0.51s与3.0±0.21s)、隔膜(4.6±0.62s与7.1±1.34s)、岛叶皮层(7.1±3.94s与6.9±2.33s)、梨状皮层(3.4±0.32s与3.4±0.33s)、内嗅皮层(9.8±3.06s与9.7±5.7s)和颞叶联合皮层(10.8±2.14s与8.6±3.46s)。

10Hz腹侧海马刺激的功能网络与光遗传学癫痫发作诱导期间的关系。我们假设光遗传学癫痫发作诱导期间的初始环路激活的区域与10Hz腹侧海马刺激激活的区域类似，因为癫痫发作和非癫痫发作诱导刺激都激活了腹侧海马环路。为了评价两个网络之间的关系，我们计算了ROI在癫痫发作诱导网络中处于活跃状态的条件概率，前提是它在10Hz刺激中处于活跃状态。

为了估计每次癫痫发作的癫痫发作诱导网络，我们在最初的10s癫痫发作诱导期间发现了体素级最大强度值。为了确定体素是否处于活跃状态，使用Otsu方法对图像进行二值化处理，这能够最大限度地降低类内方差(未点燃组的平均阈值为2.49±0.17％，已点燃组的平均阈值为3.0±0.19％，平均值±s.e.m，t检验，p＝0.32)。由于每只动物出现2-4次癫痫发作，因此我们计算了各体素的激活频率，然后将其归一化为癫痫发作次数以进行组群比较。最后，我们计算了组群层面各体素的平均激活次数，以生成癫痫发作诱导网络进行比较。在视觉上，癫痫发作诱导网络与组群层面阈下刺激网络之间存在明显且惊人的相似之处。我们使用分割图谱量化了两组中的ROI激活量，并按从大到小的顺序对已点燃组的体积进行排序。在多重比较校正后，我们未发现任何ROI的任何显著差异，但这可能是由于我们拥有的动物数量少以及所涉及的多重比较数量所致。我们研究了两组之间的活跃体素数量，发现点燃大鼠的诱导网络中的活跃体素多于未点燃大鼠，这能够支持以下假设：点燃后，癫痫发作诱导网络更大(在已点燃大鼠和未点燃大鼠中分别为3562±636个体素和1784±347个体素，t＝2.64，p＝0.025)。

对成像程序和刺激模式的不同血管敏感性使得难以在体素层面上比较网络，因此我们采用ROI方法来计算条件概率。对于10Hz刺激网络和癫痫发作诱导网络，我们使用5％激活体积阈值来确定ROI是否处于活跃状态。为了检查该模型的稳健性，我们比较了两个实验组之间在10Hz网络和光遗传学癫痫发作诱导网络中激活的ROI数量，结果发现，我们可以检测到组间存在显著差异(对于10Hz网络，未点燃组＝5.6±1.4个ROI与已点燃组＝16.8±2.6个ROI，t＝4.10，p＝0.002；对于癫痫发作诱导网络，未点燃组＝20.6±2.1个ROI与已点燃组＝30.8±3.4个ROI，t＝2.69，p＝0.023)。

我们计算了ROI在癫痫发作诱导网络中处于活跃状态的概率，前提是它在个体动物的相应10Hz网络中处于活跃状态，以便研究两个网络之间的关系。按从大到小的顺序对条件概率分布进行排序，并且还根据它们在10Hz网络中激活的一致性，按从最一致到最不一致的顺序对其进行排序。在未点燃组中，iVHip和iSept在10Hz网络中处于活跃状态的一致性最高，在癫痫发作诱导网络中也是如此。iMePFC和iAmyg是在10Hz网络中处于活跃状态的一致性次高的区域(在4/7只动物中观察到)，这些ROI在随后的癫痫发作诱导中也处于活跃状态。在已点燃大鼠中，iVHip、iMePFC、iOrbFrC、iFrAssC、iSept、iStria、iTeAssC和iAmyg在10Hz网络中处于活跃状态，并且在随后的癫痫发作诱导中也处于活跃状态。

总体而言，未点燃动物的平均条件概率为0.76±0.11，已点燃动物的平均条件概率为0.89±0.05，这表明10Hz网络中的区域激活与早期扫描后12周癫痫发作诱导期间激活的网络中的区域激活情况类似。此外，这能够支持以下假设：即，早期活动与癫痫发作诱导相关，后续活动因该网络的激活引起。

同侧海马活动传播诱导癫痫发作后，我们在动物亚群的同侧海马中观察到一个明显的现象，其中高幅度活动簇在几秒钟内从iVHip游走至iDHip。我们试图在显示该现象的癫痫发作中描述这一点(未点燃大鼠中4只动物的8次癫痫发作，5只已点燃大鼠的15次癫痫发作)。

iVHip LFP响应与来自iVHip的BOLD信号重叠，时间点通过相应的fMRI突出显示。对于fMRI，我们只突出显示来自iVHip和iDHip的两张切片，以便实现可视化。在未点燃动物中，活动从iVHip开始，并逐步上移至iDHip。活动一直持续到电图癫痫发作结束。在已点燃大鼠中，随着活动上移至极点，也会出现类似模式。在这种情况下，在达到iDHip后，活动似乎会越过同侧区域到达对侧DHip。观察到这些癫痫发作来自不同的动物，其中海马内传播也较为明显。

为了进一步表征海马内传播，从最腹侧到最背侧将同侧海马分成四个区域。我们量化了最背侧和最腹侧区域的峰至峰响应以估计传播时间，发现未点燃大鼠的平均差异为42.9s(范围：0-66s)，已点燃大鼠的平均差异为46.9s(范围：0-118s)。这转化为0.07mm/s-0.117ms/s的传播速度。

材料和方法如示例1所述。

Claims (35)

1.一种用于分析与大脑癫痫发作相关的事件的模型，所述模型包含：

已点燃的动物大脑，其在受到刺激时，会提供反映功能性和神经环路变化的神经事件；并且允许分析由单次癫痫发作引起的所述神经事件。

2.根据权利要求1所述的模型，其中对所述神经事件的所述分析包含电生理学和磁共振成像(MRI)中的其中一种或两种。

3.根据权利要求1或2所述的模型，其中对所述神经事件的所述分析通过同步测量电生理学和功能性磁共振成像(fMRI)来进行。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的模型，其中所述刺激为电刺激，并且针对感兴趣区域。

5.根据权利要求5所述的模型，其中所述感兴趣区域为海马。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述反映功能性和神经环路变化的神经事件包含以下各项中的一项或更多项：局灶性进展为双侧强直-阵挛性(FBTC)癫痫发作、兴奋性腹侧海马(VH)网络变化、亚阈值刺激触发变化以及游走性癫痫发作核心诱导。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述提供反映功能性和神经环路变化的神经事件的刺激为电刺激。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述电刺激通过光遗传学技术来传递。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述动物大脑包含经基因工程改造以包含光可激活多肽的神经元。

10.根据权利要求9所述的模型，其中所述光可激活多肽为通道视紫红质。

11.根据权利要求10所述的模型，其中所述通道视紫红质与在兴奋性海马神经元中表达的启动子可操作地连接。

12.根据权利要求11所述的模型，其中所述启动子为钙调蛋白依赖性激酶IIα(CaMKIIα)启动子。

13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述提供神经事件的刺激低于触发癫痫发作的阈值。

14.根据权利要求13所述的模型，其中所述刺激为约5Hz至约15Hz。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述刺激被应用于评价潜在的功能性环路变化。

16.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述刺激足以触发癫痫发作。

17.根据权利要求16所述的模型，其中所述刺激为约35Hz至约45Hz。

18.根据权利要求16所述的模型，其中所述刺激被应用于评价癫痫发作环路动态。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的模型，其中识别了游走性癫痫发作核心。

20.根据权利要求19所述的模型，其中所述游走性癫痫发作核心用于定位癫痫发作***区。

21.根据权利要求20所述的模型，其中所述SOZ通过单光子发射计算机体层摄影(SPECT)进行成像。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的模型，其中使用电刺激、光遗传学技术或化学处理来实现点燃。

23.根据权利要求22所述的模型，其中光遗传点燃通过以下方式进行：

a.将编码光可激活蛋白的多核苷酸递送至所述大脑的第一区域内的靶神经元，

b.用足以诱发点燃的频率和脉冲宽度反复照射所述大脑的所述第一区域；以及

c.在几天的时间里重复步骤b。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的模型，其中对所述动物作镇静处理，并给予短效神经肌肉阻滞剂，以避免所述动物在癫痫发作成像期间运动。

25.根据权利要求24所述的模型，其中所述动物用右美托咪定镇静，并用维库溴铵阻滞。

26.一种用于开发癫痫的治疗性干预措施的方法，所述方法包含：

用治疗性干预措施处理根据权利要求1-25中任一项所述的模型，并确定对反映功能性和神经环路变化的神经事件的影响。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述治疗性干预措施为外科干预措施。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述治疗性干预措施为电气干预措施。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗性干预措施包含深部脑刺激。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗性干预措施为药理干预措施。

31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述神经事件包含癫痫发作。

32.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述神经事件包含游走性癫痫发作核心。

33.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述神经事件包含癫痫共病。

34.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述神经事件包含局灶性进展为双侧强直-阵挛性(FBTC)癫痫发作。

35.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述神经事件包含兴奋性腹侧海马(VH)网络改变。

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