CN115015221A - 快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***及其成像方法 - Google Patents

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朱明尧
迟明波
潘科宇
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Abstract

本发明提供一种快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***及其成像方法，其中的***包括飞秒脉冲激发模块用于输出两束不同频率的且可连续调节光功率的宽带飞秒脉冲激光；快速光谱扫描模块用于实现对两束宽带飞秒脉冲激光同步进行光谱色散并快速同步扫描，输出两束窄带飞秒脉冲光；受激拉曼信号激发模块用于将两束窄带飞秒脉冲光进行空间合束聚焦于样品并激发受激拉曼散射信号；受激拉曼信号探测模块用于将受激拉曼散射信号转换为电信号，并进行数据采集。本发明能够实现高分辨的快速受激拉曼光谱扫描，所需时长远短于传统的光谱扫描技术，所获得的光谱分辨率可根据狭缝宽度自主控制，高于传统的受激拉曼光谱采集***，且本发明不会损失拉曼光谱窗口。

Description

快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***及其成像方法
技术领域
本发明涉及光谱探测分析技术领域，特别涉及一种快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***及其成像方法。
背景技术
在生物、化学以及医药学等领域，光谱技术扮演者越来越重要的作用，不同物质分子及振动模式拥有其独特的光谱，使得光谱分析具有很强的化学特异性从而得到广泛应用。拉曼光谱来源于物质分子的振动跃迁，拥有指纹特性，在复杂的生物***中，能够准确鉴别其化学组成，且拉曼光谱同该振动模式下的分子浓度呈正比，拥有定性及定量能力。相比于其他光谱技术如荧光光谱、红外吸收谱等，更具有无标记、多色、探测范围广等优势。
传统自发拉曼光谱仪可具有小于2cm-1的高分辨能力，常用于生物拉曼光谱分析，然而其灵敏度受到多种因素制约且缓慢的自发过程不利于很多动态生物过程的捕捉监测。基于三阶非线性光学效应的受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering，SRS)效应，它通过两束频率差等于分子振动跃迁能的超短脉冲共同作用在物质分子上激发，其中泵浦激发光的光子能量更高于斯托克斯光。相比于自发拉曼，信号提升三个数量级以上，且其不受非共振背景干扰，拥有同普通拉曼完全一致的光谱线型，因而SRS在生物医学领域有着巨大的应用价值。目前已经实现接近视频帧率的单色SRS成像水平，然而，针对单一物质进行成像无法对生物***进行准确判别，对于连续光谱的采集与分析是至关重要的。
近些年来，基于光谱聚焦和脉冲整形的多色SRS光谱测量技术被研究出来。光谱聚焦技术通过利用高色散材料(如SHOTT SF57玻璃)将宽谱飞秒激发光的不同颜色成分在时间上均匀色散，使得飞秒脉冲得以展宽，并通过精密平移台连续改变两脉冲光的相对时间延迟，可得到一定范围内的连续SRS光谱，具体范围由原始激发光自身光谱带宽决定。然而依赖电动位移台无法实现快速光谱扫描，无法实现动态样本的快速光谱测量以及多色成像，缺失灵活性。脉冲整形技术通过将宽带飞秒激光的不同颜色在傅里叶平面分散开，通过狭缝选择性透过我们感兴趣的光谱信息，可调节狭缝宽度选择性调节激光谱宽，为了实现光谱扫描，将狭缝固定于电动平移台上，该方法可提供较高的光谱分辨力，然而可利用激光功率有限，影响探测信噪比。现有的脉冲整形方法多为皮秒和飞秒脉冲的组合输出，由于皮秒激光窄线宽的特性而不需要额外整形，只将宽带飞秒激光脉冲整形即可，这样无法得到较宽的光谱窗口以及可观的信噪比。
发明内容
本发明的目的是为了克服已有技术的缺陷，提出一种快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***及其成像方法，实现动态样品的捕捉与光谱测量分析。
为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：
本发明提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，包括：飞秒脉冲激发模块，用于输出两束不同频率的且可连续调节光功率的宽带飞秒脉冲激光；快速光谱扫描模块，用于实现对两束宽带飞秒脉冲激光同步进行光谱色散并快速同步扫描，输出两束窄带飞秒脉冲光；受激拉曼信号激发模块，用于将两束窄带飞秒脉冲光以时间和空间同步的方式聚焦于样品并激发受激拉曼散射信号；受激拉曼信号探测模块，用于将受激拉曼散射信号转换为电信号，并进行数据采集。
优选地，飞秒脉冲激发模块包括：双路同步飞秒激光器，用于发出两束不同频率的线偏振宽带飞秒脉冲激光；其中，将频率高的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为泵浦光，将频率低的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为斯托克斯光；泵浦光路功率连续调节组，包括泵浦光路消色差零级半波片和泵浦光路格兰泰勒棱镜，泵浦光路消色差零级半波片用于对泵浦光进行偏振角旋转，泵浦光路格兰泰勒棱镜用于选择性透过固定偏振方向的光分量，而反射其他方向的光分量；斯托克斯光路功率连续调节组，包括斯托克斯光路消色差零级半波片和斯托克斯光路格兰泰勒棱镜，斯托克斯光路消色差零级半波片用于对斯托克斯光进行偏振角旋转，斯托克斯光路格兰泰勒棱镜用于选择性透过固定偏振方向的光分量，而反射其他方向的光分量。
优选地，快速光谱扫描模块包括：双面镀有反射膜的一维扫描振镜，用于对泵浦光与斯托克斯光的方向进行偏转；斯托克斯光路脉冲光谱整形器，斯托克斯光路脉冲光谱整形器包括斯托克斯光路消色差双胶合透镜组、斯托克斯光路准直透镜组、斯托克斯光路透射衍射光栅和斯托克斯光路夹缝，斯托克斯光路消色差双胶合透镜组与一维扫描振镜组成4f光学***，用于使一维扫描振镜扫描过程中投射到斯托克斯光路透射衍射光栅表面的光斑为不动点；斯托克斯光路透射衍射光栅用于对斯托克斯光进行空间色散，形成空间排布的色光组合；斯托克斯光路夹缝用于选择性透过斯托克斯光空间色散后的部分色光，获得窄带斯托克斯光；斯托克斯光路准直透镜组用于对窄带斯托克斯光进行准直；泵浦光路脉冲光谱整形器，泵浦光路脉冲光谱整形器包括泵浦光路消色差双胶合透镜组、泵浦光路准直透镜组、泵浦光路透射衍射光栅和泵浦光路夹缝，泵浦光路消色差双胶合透镜组与一维扫描振镜组成4f光学***，用于使一维扫描振镜扫描过程中投射到泵浦光路透射衍射光栅表面的光斑为不动点；泵浦光路透射衍射光栅用于将泵浦光进行空间色散，形成空间排布的色光组合；泵浦光路夹缝用于选择性透过泵浦光空间色散后的部分色光，获得窄带泵浦光；泵浦光路准直透镜组用于对窄带泵浦光进行准直。
优选地，受激拉曼信号激发模块包括时间延迟线、斯托克斯光路反射镜、汇聚透镜、声光调制器、声光驱动器、一级衍射光准直透镜、二向色镜、二维扫描振镜、显微物镜和载物台；其中，时间延迟线设置在一维扫描振镜与泵浦光路格兰泰勒棱镜之间，用于改变泵浦光与斯托克斯光之间的相对光程差；斯托克斯光路反射镜用于将窄带斯托克斯光反射至斯托克斯光路汇聚透镜；汇聚透镜用于将窄带斯托克斯光或对窄带泵浦光汇聚至声光调制器；声光调制器用于产生超声调制信号对窄带斯托克斯光进行高频调制产生一级衍射斯托克斯光或对窄带泵浦光进行高频调制产生一级衍射泵浦光；声光驱动器用于驱动声光调制器产生超声调制信号；一级衍射光准直透镜，用于对一级衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光进行准直；二向色镜用于对一级衍射斯托克斯光与窄带泵浦光进行空间合束或对一级衍射泵浦光或窄带斯托克斯光进行空间合束；二维扫描振镜用于对合束后的激光进行二维扫描；载物台用于放置样品；显微物镜用于将合束后的激光聚焦于样品上，激发受激拉曼散射信号。
优选地，受激拉曼信号探测模块包括油浸聚光镜、滤光片、光电探测器、信号发生器和锁相放大器；其中，油浸聚光镜用于收集受激拉曼散射信号；滤光片用于滤除一级衍射斯托克斯光保留窄带泵浦光，或者滤除一级衍射泵浦光保留窄带斯托克斯光；光电探测器用于将窄带斯托克斯光或窄带泵浦光转化为电信号并传输至锁相放大器；信号发生器用于接收声光驱动器发出的声光调制信号并将相同频率的参考信号输入至锁相放大器；锁相放大器用于接收电信号与参考信号，并解调得到受激拉曼散射信号。
优选地，飞秒脉冲激发模块还包括泵浦光路光挡和斯托克斯光路光挡，泵浦光路光挡用于对泵浦光路格兰泰勒棱镜反射的光分量进行遮挡；斯托克斯光路光挡用于对斯托克斯光路格兰泰勒棱镜反射的光分量进行遮挡；受激拉曼信号激发模块还包括衍射光光挡，衍射光光挡用于遮挡零级衍射光或一级衍射光，一级衍射光为衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光。
优选地，斯托克斯光路消色差双胶合透镜组与泵浦光路消色差双胶合透镜组分别由两个相同焦距的消色差双胶合透镜组成。
优选地，二维扫描振镜由一对互相垂直的表面镀银膜的反射镜组成。
优选地，若声光调制器对窄带泵浦光进行调制，则滤光片采用长波通滤光片，以滤除一级衍射泵浦光保留窄带斯托克斯光，探测受激拉曼增益信号；若声光调制器对窄带斯托克斯光进行调制，则滤光片采用短波通滤光片，以滤除一级衍射斯托克斯光保留窄带泵浦光，探测受激拉曼损耗信号。
本发明提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像方法，利用上述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***实现，包括如下步骤：
S1、通过双路同步飞秒激光器发出两束不同频率的的线偏振宽带飞秒脉冲激光，频率高的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为泵浦光经泵浦光路功率连续调节组入射至一维扫描振镜的一个反射面，频率低的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为斯托克斯光经斯托克斯光路功率连续调节组入射至一维扫描振镜的另一个反射面；
S2、泵浦光经泵浦光路脉冲光谱整形器进行整形获得窄带泵浦光；斯托克斯光经斯托克斯光路脉冲光谱整形器进行整形获得窄带斯托克斯光；
S3、对窄带斯托克斯光或窄带泵浦光进行高频调制获得一级衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光，并利用时间延迟线对一级衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光进行延迟处理，使一级衍射斯托克斯光与窄带窄带泵浦光完成空间合束或使一级衍射泵浦光与窄带斯托克斯光完成空间合束。
S4、将合束后的激光通过二维扫描振镜共同导入显微物镜并作用于样品上，经油浸聚光镜进行光信号收集与光电探测器的光电转换后获得受激拉曼散射信号；
S5、连续快速转动一维扫描振镜的角度，同时扫描输出斯托克斯光和泵浦光的光谱成分并作用于样品上，获得一段受激拉曼散射光谱。
本发明能够取得如下技术效果：
1、本发明仅通过一个一维扫描振镜将两路宽带飞秒激光进行同步快速脉冲整形，获得两束窄带飞秒脉冲激光，且其输出波长随振镜电压精确控制，实现高分辨的快速受激拉曼光谱扫描，所需时长远短于传统的使用基于线性位移平台的时间延迟线的光谱扫描技术，所获得的光谱分辨率可根据狭缝宽度自主控制，高于传统的光谱聚焦受激拉曼光谱采集***，且本发明不会损失拉曼光谱窗口。
2、对于生物***来说，长时间的单点照射采集光谱，大概率会灼伤生物样品，产生不可逆的后果，本发明能够在毫秒级的时间采集一段受激拉曼光谱，可完全避免激光灼烧现象的发生。
3、采用一维扫描振镜同步控制两路光谱整形器，成本更低，且相比于申请号为201610968248.6中公开的基于快速光程扫描的受激拉曼光谱成像***，其稳定性更好，光路更简易。
附图说明
图1是根据本发明实施例提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***的逻辑结构示意图；
图2是根据本发明实施例提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***的光路示意图；
图3是根据本发明实施例提供的4f光学***的光路示意图；
图4是根据本发明实施例提供的声光调制器输出的零级衍射光与一级衍射光的强度调制示意图；
图5是根据本发明实施例提供的快速光谱扫描数字编码组合光谱探测过程示意图；
图6是根据本发明实施例提供的功率连续调节实验的测量结果示意图。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
图1示出了根据本发明实施例提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***的逻辑结构。
如图1所示，本发明实施例提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，包括飞秒脉冲激发模块1、快速光谱扫描模块2、受激拉曼信号激发模块3以及受激拉曼信号探测模块4，飞秒脉冲激发模块1用于输出两束不同频率的且可连续调节光功率的宽带飞秒脉冲激光；快速光谱扫描模块2用于实现对两束宽带飞秒脉冲激光同步进行光谱色散并快速同步扫描，输出两束窄带飞秒脉冲光；受激拉曼信号激发模块3用于将两束窄带飞秒脉冲光以时间和空间同步的方式聚焦于样品并激发受激拉曼散射信号；受激拉曼信号探测模块4用于将受激拉曼散射信号转换为电信号，并通过Labview软件进行数据采集。
时间延迟线放置于泵浦光路或斯托克斯光路均可，时间延迟线的作用仅仅在于改变泵浦光与斯托克斯光的相对光程差，而声光调制器放置于泵浦光路或斯托克斯光路将决定探测的受激拉曼散射信号是泵浦光损耗量(受激拉曼损耗信号)或斯托克斯增益量(受激拉曼增益信号)，二者探测光路中所采用的的滤光片也将有所不同，声光调制器在泵浦光路，采用长波通滤光片，探测受激拉曼增益信号；反之，采用短波通滤光片探测受激拉曼损耗信号。
下面以时间延迟线安置于泵浦光路以及声光调制器安置于斯托克斯光路为例具体说明，其他几种装置可同理组合。
图2示出了根据本发明实施例提供的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***的光路。
如图2所示，飞秒脉冲激发模块1包括双路同步飞秒激光器100、泵浦光路功率连续调节组以及斯托克斯光路功率连续调节组。双路同步飞秒激光器100用于输出两束不同频率的线偏振宽带飞秒脉冲激光，将频率高的飞秒脉冲激光作为泵浦光，频率低的飞秒脉冲激光作为斯托克斯光。泵浦光路功率连续调节组和斯托克斯光路功率连续调节组的结构相一致，仅适用波长因不同频率的激发光而有所不同。泵浦光路功率连续调节组包括消色差零级半波片101和格兰泰勒棱镜102，斯托克斯光路功率连续调节组包括消色差零级半波片104和格兰泰勒棱镜105。消色差零级半波片101与104分别对泵浦光和斯托克斯光进行偏振角旋转，格兰泰勒棱镜102与105用于选择性透过水平偏振方向的光分量而反射竖直方向的光分量，连续旋转消色差零级半波片101与104实现泵浦光与斯托克斯光的功率连续调节，光挡103与光挡106负责遮挡竖直方向的光分量避免其对光学***造成影响。
快速光谱扫描模块2包括双面镀银膜的一维扫描振镜21和两个完全相同的脉冲光谱整形器，一个设置在泵浦光路中，另一个设置在斯托克斯光路中。
斯托克斯光路的脉冲光谱整形器包括第一透镜组、第二透镜组、透射衍射光栅223和狭缝225；泵浦光路的脉冲光谱整形器包括第一透镜组、第二透镜组、透射衍射光栅233和狭缝235。本实例中斯托克斯光路的第一透镜组由两个相同焦距的消色差双胶合透镜221和222组成，其作用在于与振镜21、透射衍射光栅223组成一套4f光学***，该4f光学***的原理如图3所示，可使振镜扫描过程中投射到光栅表面的光斑为不动点而仅入射角度发生微小改变；透射衍射光栅223用于将宽带飞秒斯托克斯光的不同颜色组分在空间色散排布，形成空间排布的色光组合，第二透镜组包括第一透镜224与第二透镜226，该透镜组用于实现激光准直；狭缝225用于选择性透过不同色光而阻挡其它色光通过。泵浦光路中所采用的第一透镜组、第二透镜组、透射衍射光栅233和狭缝235的作用与斯托克斯光路相同。由于该***扫描过程中，所需要的泵浦光与斯托克斯光的脉冲时间始终重叠作用于样品，故该实例中的快速光谱扫描模块的泵浦光路中第一透镜组为同斯托克斯光路第一透镜组相同焦距的消色差双胶合透镜231和232，且第二透镜组也由焦距同斯托克斯光路第二透镜组的第一透镜234和第二透镜236组成。
受激拉曼信号激发模块3包括第一反射镜31、时间延迟线32、二向色镜33、第二反射镜34、二维扫描振镜35、显微物镜36、载物台37、透镜组、声光调制器43、声光驱动器44和光挡423。第一反射镜31用于将泵浦光反射至时间延迟线32；时间延迟线32由一个搭载一对互相垂直的平面反射镜的电动位移平台构成，电动位移平台可沿箭头方向前后平移并改变泵浦光与斯托克斯光之间的相对光程差；第一透镜组包括两块平凸透镜，分别为第一平凸透镜421和第二平凸透镜422，斯托克斯光选择输出成分经第一反射镜411反射并被第一平凸透镜421会聚至声光调制器43，出射零级光与一级光，声光调制器对脉冲激光的调制存在一定的调制深度，其表现为调制周期的消光比，如图4所示，以正弦调制为例，声光调制器出射零级光与一级光，二者相位相差180度，其中一级光调制深度更高于零级光，图2所示的实施例选择调制深度更高的一级衍射光，光挡423用于阻止零级光传播以影响光路，当然，如果***空间不足或为了满足其他目的，也可采用零级光输出而阻挡一级光的方案；第二平凸透镜422用于将一级光准直；声光驱动器44用于驱动声光调制器43产生超声调制信号；二向色镜33用于将泵浦光与经调制的斯托克斯光进行空间合束；第二反射镜34用于将合束后的激光反射至二维扫描振镜35；二维扫描振镜35由一对互相垂直的镀银反射镜组成，用于激光快速扫描样本；显微物镜36正对放置样品的载物台37，用于将激光会聚至样品之上；本实例中受激拉曼信号激发模块设置两块反射镜用于改变光路传播方向满足光路空间布置，可以根据实际需求，选择不同数量的平面反射镜以满足不同***的空间布置要求；另外，本实例中，所用到的二向色镜为短波通二向色镜，若泵浦光与斯托克斯光交换，则二向色镜需对应长波通二向色镜以满足实际要求。
受激拉曼信号探测模块包括第一反射镜411、第二反射镜412、油浸聚光镜451、短波通滤光片452、光电探测器453、信号发生器46、锁相放大器47、数字采集卡48和计算机软件49。在本实例中，第一反射镜411与第二反射镜412用于改变光传播方向以满足***空间布置，同样的，可选择不同数量的平面反射镜以满足不同的实际需求。油浸聚光镜451提供一个高数值孔径的聚光能力，能够将大部分激光能量收集；短波通滤光片452用于过滤复合光中的斯托克斯光而仅通过泵浦光，探测受激拉曼损耗信号。当然，如果声光调制器对泵浦光进行调制，则需替换为长波通滤光片，以过滤泵浦光而仅通过斯托克斯光，探测受激拉曼增益信号；信号发生器46用于输入声光调制信号以及把相同频率的参考信号输入锁相放大器47，锁相放大器47接收光电探测器453转换的电信号与信号发生器46发出的参考信号，以解调出受激拉曼散射信号，并将该信号输入至数字采集卡48中，数字采集卡48对接计算机软件49并将数字信号转换为光谱及图像信息并可视化。
本发明是通过快速改变双面镀银膜的一维扫描振镜21的不同输入电压值，快速改变泵浦光与斯托克斯光在光栅处的入射角，从而将二者不同光谱成分从狭缝快速选择输出。为了保证脉冲时间同步，消色差双胶合透镜221、222、231和232需具有相同的焦距。最后通过数字编码对泵浦光路与斯托克斯光路输出的光谱成分进行排列，如图5所示，宽带飞秒激光经光栅分光与狭缝选择后，分成若干组分的色光并数字编码，相同的数字编码为同时输出并共同作用于样本上的泵浦光与斯托克斯光，图中字母M和N代表未知的数字，根据***所要分成的组分多少决定，它由一维扫描振镜21的单次扫描步长与狭缝宽度共同决定，拉曼波数由公式
Figure BDA0003749281390000101
计算，其中Ω代表拉曼波数，λp代表泵浦光波长，λs代表斯托克斯光波长。一维扫描振镜21可实现连续或离散点扫描，若需要几种拉曼波数快速扫描，可通过软件控制一维扫描振镜21设置对应的离散电压值进行快速切换，若需要采集连续受激拉曼光谱则直接快速连续改变电压值即可。
根据图2所示的实施例进行可行性分析如下：
一：飞秒脉冲激发模块中的功率连续调节组采用一可旋转的消色差零级半波片与一格兰泰勒棱镜的组合进行功率调节。例如飞秒激光器输出水平偏振的宽带飞秒脉冲激光，经消色差半波片，其偏振方向将发生旋转，格兰泰勒棱镜利用光线以布儒斯特角入射时P偏振光透过而S偏振光反射的特性，可实现功率连续旋转调节，如图6所示为该功率连续调节组的功率调节实验数据，横坐标代表入射激光同消色差零级半波片的光轴夹角，纵坐标为归一化的功率值，以每90°为一个调节周期进行功率调节。
二：快速光谱扫描模块，确保经脉冲整形后输出的泵浦光与斯托克斯光在时间与空间保持同步性，在一维扫描振镜21归零时，调整使泵浦与斯托克斯入射光均以45°角入射一维扫描振镜21，且两条光路中所使用的均为相同尺寸及焦距的消色差双胶合透镜221、222、231和232。当然，透射衍射光栅之后的第一透镜224与第一透镜234同样采用相同的焦距。为了进一步证明本发明的实施例中提供的方法的可行性，现结合具体实例详述如下：
受激拉曼散射需满足两种必要条件：首先，两束输入光的频率差对应拉曼活性分子的振动频率；其次，两束输入的脉冲光需满足时间空间完全同步作用于样本分子上。由于受激拉曼散射属于三阶非线性光学效应，需较强的瞬时光功率密度激发才能够激发，故采用飞秒脉冲激光以大大提高该效应的发生效率，然而双路飞秒激发光需要精确的脉冲重叠，故可灵活改变光程差的时间延迟线是必要的，一维振镜扫描时，泵浦光与斯托克斯光传播方向随振镜角度而变化，变化量相同，根据几何学原理，由振镜投影到光栅上的光程不发生改变，从而不破坏两束脉冲光的时间重叠程度。以激光波长801nm&1045nm，脉宽120fs和200fs的飞秒脉冲激光以及1000刻线/毫米的透射衍射光栅为例，该透射衍射光栅最佳入射角31.3°入射能实现最大衍射效率。根据光栅衍射方程d(sinθ±sinα)＝mλ，其中，d表示光栅常数，θ代表衍射角，α代表入射角，m为衍射级次，代入泵浦光及斯托克斯光中心波长以及入射角31.3°，可得泵浦光中心波长衍射角为16.4°，斯托克斯光中心波长衍射角为31.7°。宽带飞秒脉冲光拥有10nm的光谱半高宽，根据光栅衍射方程演变公式：
Figure BDA0003749281390000111
其中Δθ表示光栅分光夹角，Δλ表示波长差，m代表衍射级次，d代表光栅常数，θ表示中心波长衍射角，根据计算得，光谱半高宽10nm的泵浦光和斯托克斯光被光栅衍射分光的夹角分别为0.6°和0.85°，在本发明的一个实施例中，选用的透镜224与234焦距均为10cm，那么根据以上计算结果可计算该***的光谱分辨率指标所需要满足的狭缝225和235的宽度，计算结果为当狭缝225宽50μm且狭缝235宽75μm时，可满足该***拉曼光谱分辨率在0.5nm左右，根据拉曼位移公式
Figure BDA0003749281390000121
本实施例中所满足光谱宽度约为250cm-1(采用宽带泵浦光与斯托克斯光强度值在半高全宽以上的光谱组分而舍弃其他光谱成分以免影响信噪比)，扫描步数为20，采用1KHz线性扫描振镜扫描一段受激拉曼光谱仅需20ms，若需继续提高分辨率可适当缩小狭缝宽度。
本发明还提供一种快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像方法，利用上述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***实现，包括如下步骤：
S1、通过双路同步飞秒激光器发出两束不同频率的的线偏振宽带飞秒脉冲激光，频率高的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为泵浦光经泵浦光路功率连续调节组入射至一维扫描振镜的一个反射面，频率低的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为斯托克斯光经斯托克斯光路功率连续调节组入射至一维扫描振镜的另一个反射面。
S2、泵浦光经泵浦光路脉冲光谱整形器进行整形获得窄带泵浦光；斯托克斯光经斯托克斯光路脉冲光谱整形器进行整形获得窄带斯托克斯光。
S3、对窄带斯托克斯光或窄带泵浦光进行高频调制获得一级衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光，并利用时间延迟线对一级衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光进行延迟处理，使一级衍射斯托克斯光与窄带窄带泵浦光完成空间合束或使一级衍射泵浦光与窄带斯托克斯光完成空间合束。
S4、将合束后的激光通过二维扫描振镜共同导入显微物镜并作用于样品上，经油浸聚光镜进行光信号收集与光电探测器的光电转换后获得受激拉曼散射信号；
S5、连续快速转动一维扫描振镜的角度，同时扫描输出斯托克斯光和泵浦光的光谱成分并作用于样品上，获得一段受激拉曼散射光谱。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，包括：
飞秒脉冲激发模块，用于输出两束不同频率的且可连续调节光功率的宽带飞秒脉冲激光；
快速光谱扫描模块，用于实现对两束宽带飞秒脉冲激光同步进行光谱色散并快速同步扫描，输出两束窄带飞秒脉冲光；
受激拉曼信号激发模块，用于将两束窄带飞秒脉冲光以时间和空间同步的方式聚焦于样品并激发受激拉曼散射信号；
受激拉曼信号探测模块，用于将所述受激拉曼散射信号转换为电信号，并进行数据采集。
2.如权利要求1所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述飞秒脉冲激发模块包括：
双路同步飞秒激光器，用于发出两束不同频率的线偏振宽带飞秒脉冲激光；其中，将频率高的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为泵浦光，将频率低的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为斯托克斯光；
泵浦光路功率连续调节组，包括泵浦光路消色差零级半波片和泵浦光路格兰泰勒棱镜，所述泵浦光路消色差零级半波片用于对所述泵浦光进行偏振角旋转，所述泵浦光路格兰泰勒棱镜用于选择性透过固定偏振方向的光分量，而反射其他方向的光分量；
斯托克斯光路功率连续调节组，包括斯托克斯光路消色差零级半波片和斯托克斯光路格兰泰勒棱镜，所述斯托克斯光路消色差零级半波片用于对所述斯托克斯光进行偏振角旋转，所述斯托克斯光路格兰泰勒棱镜用于选择性透过固定偏振方向的光分量，而反射其他方向的光分量。
3.如权利要求2所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述快速光谱扫描模块包括：
双面镀有反射膜的一维扫描振镜，用于对所述泵浦光与所述斯托克斯光的方向进行偏转；
斯托克斯光路脉冲光谱整形器，所述斯托克斯光路脉冲光谱整形器包括斯托克斯光路消色差双胶合透镜组、斯托克斯光路准直透镜组、斯托克斯光路透射衍射光栅和斯托克斯光路夹缝，所述斯托克斯光路消色差双胶合透镜组与所述一维扫描振镜组成4f光学***，用于使所述一维扫描振镜扫描过程中投射到所述斯托克斯光路透射衍射光栅表面的光斑为不动点；所述斯托克斯光路透射衍射光栅用于对所述斯托克斯光进行空间色散，形成空间排布的色光组合；所述斯托克斯光路夹缝用于选择性透过所述斯托克斯光空间色散后的部分色光，获得窄带斯托克斯光；所述斯托克斯光路准直透镜组用于对所述窄带斯托克斯光进行准直；
泵浦光路脉冲光谱整形器，所述泵浦光路脉冲光谱整形器包括泵浦光路消色差双胶合透镜组、泵浦光路准直透镜组、泵浦光路透射衍射光栅和泵浦光路夹缝，所述泵浦光路消色差双胶合透镜组与所述一维扫描振镜组成4f光学***，用于使所述一维扫描振镜扫描过程中投射到所述泵浦光路透射衍射光栅表面的光斑为不动点；所述泵浦光路透射衍射光栅用于将所述泵浦光进行空间色散，形成空间排布的色光组合；所述泵浦光路夹缝用于选择性透过所述泵浦光空间色散后的部分色光，获得窄带泵浦光；所述泵浦光路准直透镜组用于对所述窄带泵浦光进行准直。
4.如权利要求3所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述受激拉曼信号激发模块包括时间延迟线、斯托克斯光路反射镜、汇聚透镜、声光调制器、声光驱动器、一级衍射光准直透镜、二向色镜、二维扫描振镜、显微物镜和载物台；其中，
所述时间延迟线设置在所述一维扫描振镜与所述泵浦光路格兰泰勒棱镜之间，用于改变所述泵浦光与所述斯托克斯光之间的相对光程差；
所述斯托克斯光路反射镜用于将所述窄带斯托克斯光反射至所述斯托克斯光路汇聚透镜；
所述汇聚透镜用于将所述窄带斯托克斯光或对所述窄带泵浦光汇聚至所述声光调制器；
所述声光调制器用于产生超声调制信号对所述窄带斯托克斯光进行高频调制产生一级衍射斯托克斯光或对所述窄带泵浦光进行高频调制产生一级衍射泵浦光；
所述声光驱动器用于驱动所述声光调制器产生所述超声调制信号；
所述一级衍射光准直透镜，用于对所述一级衍射斯托克斯光或所述一级衍射泵浦光进行准直；
所述二向色镜用于对所述一级衍射斯托克斯光与所述窄带泵浦光进行空间合束或对所述一级衍射泵浦光或所述窄带斯托克斯光进行空间合束；
所述二维扫描振镜用于对合束后的激光进行二维扫描；
所述载物台用于放置所述样品；
所述显微物镜用于将合束后的激光聚焦于所述样品上，激发受激拉曼散射信号。
5.如权利要求4所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述受激拉曼信号探测模块包括油浸聚光镜、滤光片、光电探测器、信号发生器和锁相放大器；其中，
所述油浸聚光镜用于收集所述受激拉曼散射信号；
所述滤光片用于滤除所述一级衍射斯托克斯光保留所述窄带泵浦光，或者滤除所述一级衍射泵浦光保留所述窄带斯托克斯光；
所述光电探测器用于将所述所述窄带斯托克斯光或所述窄带泵浦光转化为电信号并传输至所述锁相放大器；
所述信号发生器用于接收所述声光驱动器发出的声光调制信号并将相同频率的参考信号输入至所述锁相放大器；
所述锁相放大器用于接收所述电信号与所述参考信号，并解调得到所述受激拉曼散射信号。
6.如权利要求4所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述所述飞秒脉冲激发模块还包括泵浦光路光挡和斯托克斯光路光挡，所述泵浦光路光挡用于对所述泵浦光路格兰泰勒棱镜反射的光分量进行遮挡；所述斯托克斯光路光挡用于对所述斯托克斯光路格兰泰勒棱镜反射的光分量进行遮挡；
所述受激拉曼信号激发模块还包括衍射光光挡，所述衍射光光挡用于遮挡零级衍射光或一级衍射光，所述一级衍射光为所述衍射斯托克斯光或所述一级衍射泵浦光。
7.如权利要求3所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述斯托克斯光路消色差双胶合透镜组与所述泵浦光路消色差双胶合透镜组分别由两个相同焦距的消色差双胶合透镜组成。
8.如权利要求4所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，所述二维扫描振镜由一对互相垂直的表面镀银膜的反射镜组成。
9.如权利要求5所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***，其特征在于，若所述声光调制器对所述窄带泵浦光进行调制，则所述滤光片采用长波通滤光片，以滤除所述一级衍射泵浦光保留所述窄带斯托克斯光，探测受激拉曼增益信号；若所述声光调制器对所述窄带斯托克斯光进行调制，则所述滤光片采用短波通滤光片，以滤除所述一级衍射斯托克斯光保留所述窄带泵浦光，探测受激拉曼损耗信号。
10.一种快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像方法，利用权利要求5所述的快速光谱扫描受激拉曼散射显微成像***实现，其特征在于，包括如下步骤：
S1、通过双路同步飞秒激光器发出两束不同频率的的线偏振宽带飞秒脉冲激光，频率高的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为泵浦光经泵浦光路功率连续调节组入射至一维扫描振镜的一个反射面，频率低的线偏振宽带飞秒脉冲激光作为斯托克斯光经斯托克斯光路功率连续调节组入射至所述一维扫描振镜的另一个反射面；
S2、所述泵浦光经所述泵浦光路脉冲光谱整形器进行整形获得窄带泵浦光；所述斯托克斯光经所述斯托克斯光路脉冲光谱整形器进行整形获得窄带斯托克斯光；
S3、对所述窄带斯托克斯光或所述窄带泵浦光进行高频调制获得一级衍射斯托克斯光或一级衍射泵浦光，并利用时间延迟线对所述一级衍射斯托克斯光或所述一级衍射泵浦光进行延迟处理，使所述一级衍射斯托克斯光与所述窄带窄带泵浦光完成空间合束或使所述一级衍射泵浦光与所述窄带斯托克斯光完成空间合束。
S4、将合束后的激光通过二维扫描振镜共同导入显微物镜并作用于样品上，经油浸聚光镜进行光信号收集与光电探测器的光电转换后获得受激拉曼散射信号；
S5、连续快速转动所述一维扫描振镜的角度，同时扫描输出所述斯托克斯光和所述泵浦光的光谱成分并作用于所述样品上，获得一段受激拉曼散射光谱。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117405649A (zh) * 2023-12-12 2024-01-16 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 细胞拉曼流式光谱成像分析***及分析方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115728287A (zh) * 2022-11-16 2023-03-03 北京大学 低波数拉曼光谱测试***及其测量方法
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CN117405649B (zh) * 2023-12-12 2024-03-22 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 细胞拉曼流式光谱成像分析***及分析方法

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