CN115015200B - 一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,其特征在于,所述基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置包括激发模块、激活模块、成像模块,其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器,激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并,得到合并光线,合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像;本发明提供的装置实现无机械运动、无激光扫描的新型激光光斑调制,能够分辨单个荧光分子或者亚细胞精细结构,大幅降低了荧光成像装置的复杂度,提高了定位和成像效率。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像领域,特别是指一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法。
背景技术
生物技术和荧光成像技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。虽然STED、MINFLUX等荧光成像方法先后克服了衍射极限的限制,达到了100nm甚至10nm的横向分辨能力,但是它们难以对生物分子、亚细胞精细结构等进行主动积极的精准定位。其中,STED荧光显微技术,利用受激辐射选择性消耗激发光斑中边沿区域的激发态荧光分子从而减少有效荧光的发光范围,压缩有效PSF(点扩散函数)尺度,提高***分辨率。但是也存在相应的缺点例如:1、耗损光需要很强的亮度,激光器造价昂贵;2、对样品损伤较大;3、激发光斑与损耗光斑的同步定位比较复杂,操作相当繁琐;4、对***的稳定性要求很高,需经常性的检查和***维护;5、损耗光斑的质量、荧光样品的漂白、光路校准上的误差等因素都会限制其分辨率;6、难以对生物分子、亚细胞精细结构等进行主动积极的精准定位。而MINFLUX荧光显微技术,通过结合STED(通过在传统的激发光的***,同时加上一个甜甜圈状的损耗光,来使得实际激发的区域得以大大减小来实现超分辨成像)和单分子定位显微术(使用随机点亮荧光分子,进而通过高斯拟合定位来实现超分辨)两项技术,实现了可以在很小的区域内随机点亮荧光分子,再通过甜甜圈状的激光作为激发然后进行定位。同样的MINFLUX也存在一些缺点例如:1、造价昂贵;2、光路复杂,操作起来相当繁琐;3、对***的稳定性要求很高,需经常性的检查和***维护。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的上述缺陷,提出一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,实现无机械运动、无激光扫描的新型激光光斑调制,能够分辨单个荧光分子或者亚细胞精细结构,大幅降低荧光成像装置的复杂度,提高了定位和成像效率。
本发明采用如下技术方案:
一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,所述基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置包括激发模块、激活模块、成像模块,其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器,激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并,得到合并光线,合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像。
具体地,所述激发模块按照光路传播方向,依次包含:激光光源Ⅰ、扩束镜Ⅰ、均匀光透镜组Ⅰ、聚焦透镜Ⅰ、全内反射透镜Ⅰ、空间光调制器Ⅰ;扩束镜Ⅰ用于对激光光源Ⅰ发出的激发光线进行扩束;均匀光透镜组Ⅰ和聚焦透镜Ⅰ用于会聚激发光线;全内反射透镜Ⅰ将激发光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅰ中;空间光调制器Ⅰ对入射的激发光线进行整形并出射。
具体地,所述激活模块按照光路的传播方向,依次包含:激光光源Ⅱ、扩束镜Ⅱ、均匀光透镜组Ⅱ、聚焦透镜Ⅱ、全内反射透镜Ⅱ、空间光调制器Ⅱ、二向色镜、准直透镜组、滤镜片转盘、物镜、载物台;扩束镜Ⅱ用于对激光光源Ⅱ发出的激活光线进行扩束;均匀光透镜组Ⅱ和聚焦透镜Ⅱ用于会聚激活光线,全内反射透镜Ⅱ激活光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅱ中,激活光线经过空间光调制器Ⅱ整形后以特定角度入射到二向色镜上,与激发光线形成合并光线;滤光片转盘将合并光线反射到达物镜;合并光线经由准直透镜组和物镜的放大后以纳米尺寸照射到样品上。
具体地,所述成像模块按照光路的传播方向,依次包含:压电陶瓷电机、管镜、探测器;压电陶瓷电机实现轴向精密对焦;荧光在滤光片转盘发生透射,并经由管镜聚焦后进入到探测器中。
本发明实施例另一方面提供应用上述装置的一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法,包括以下步骤:
1)首先将样品放置于载物台上,由上位机控制空间光调制器Ⅰ所有微镜状态为“开”;然后粗调物镜相对载物台的位置,使探测器成像达到较好清晰度;再由压电陶瓷电机细调物镜相对载物台的位置,使探测器成像达到最优清晰度;
2)根据ROI区域的位置信息与形状信息,控制空间光调制器Ⅰ,将激发光线整形为几何形状Ⅰ;控制空间光调制器Ⅱ,将激活光线整形为几何形状Ⅱ;其中几何形状Ⅰ和几何形状Ⅱ的位置可以是包含、相交或者互斥的关系;
3)由荧光定位算法和单个微元可调的空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ,实现对几何形状Ⅰ、几何形状Ⅱ中心位置的实时调整;并通过持续迭代中心位置来记录ROI区域的荧光分子;
4)由步骤3)得到几何形状Ⅰ和Ⅱ的中心位置所记录的在ROI区域荧光分子的位置;并且所述荧光分子发出的荧光经由滤光片转盘透射、管镜聚焦后被探测器获取并进行成像。
具体地,所述空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ是单个微元可调的空间光调制器,包括但不限于DMD或透射式LCD。
具体地,在迭代中心位置时几何形状Ⅱ包含于几何形状Ⅰ;几何形状Ⅱ和几何形状Ⅰ包括但不限于是甜甜圈形、矩形或三角形等。
具体地,所述荧光定位算法在定位的过程中,通过控制空间光调制器Ⅰ和Ⅱ形成光斑并投射到样品区域内,再然后调整空间光调制器Ⅰ和Ⅱ,不同位置微镜的开关使光斑以随机开始的位置为圆心、L=600nm为直径的圆周上移动完成一次迭代,完成迭代后缩小直径L进行下一次迭代,不断重复上述操作,迭代至直径L=60nm时结束,并最终确定荧光分子所在位置,迭代过程中荧光分子距离最近的光斑中心点的距离r可表示为:
其中,表示是估计值,MLE表示是最大似然法,最大似然估计值/>的结果近似表示为在迭代中荧光分子距离最近光斑中心点的概率的多项式分布/>如下式所示:
其中是甜甜圈光斑移动过程中探测器收集到的光子数的集合;N是单次迭代过程中收集光子的总数;n0!…nk-1!是/>集合中的元素,代表单次迭代中,每一次移动几何形状Ⅰ、Ⅱ时收集到的光子数;k是单次迭代过程中空间光调制器Ⅰ、Ⅱ控制几何形状Ⅰ、Ⅱ中心位置移动的次数;pi是向量参数,/>其中λi表示几何形状Ⅰ引起的背景噪声的波长,λbi表示几何形状Ⅱ引起的背景噪声的波长。
由上述对本发明的描述可知,与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本方法提出一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,包括激发模块、激活模块、成像模块,其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器,激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并,得到合并光线,合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像,实现无机械运动、无激光扫描的新型激光光斑调制;且实现的纳米精度荧光显微成像,能够分辨单个荧光分子或者亚细胞精细结构。
(2)本方法提出的新型激光甜甜圈光斑调制方法,由于采用了MEMS器件作为空间光调制器,从而大幅降低荧光成像装置的复杂度。
(3)本发明提出的使用单个微元可调的空间光调制器并结合荧光分子定位算法,实现了主动积极的荧光分子定位与成像,提高了定位和成像效率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置;
图2为本发明实施例提供解决二维光栅衍射问题的示意图;其中(a)衍射现象,(b)扩大衍射间距,(c)保留零级衍射。
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
具体实施方式
本发明提供一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,本发明提供的装置实现无机械运动、无激光扫描的新型激光光斑调制,能够分辨单个荧光分子或者亚细胞精细结构,大幅降低荧光成像装置的复杂度,提高了定位和成像效率。
如图1,为本发明实施例提供的一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,所述基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置包括激发模块、激活模块、成像模块,其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器,激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并,得到合并光线,合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像。
具体地,所述激发模块按照光路传播方向,依次包含:激光光源Ⅰ-1、扩束镜Ⅰ-2、均匀光透镜组Ⅰ-3、聚焦透镜Ⅰ-4、全内反射透镜Ⅰ-5、空间光调制器Ⅰ-6;扩束镜Ⅰ-2用于对激光光源Ⅰ-1发出的激发光线进行扩束;均匀光透镜组Ⅰ-3和聚焦透镜Ⅰ-4用于会聚激发光线;全内反射透镜Ⅰ-5将激发光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅰ-6中;空间光调制器Ⅰ-6对入射的激发光线进行整形并出射。
具体地,所述激活模块按照光路的传播方向,依次包含:激光光源Ⅱ-7、扩束镜Ⅱ-8、均匀光透镜组Ⅱ-9、聚焦透镜Ⅱ-10、全内反射透镜Ⅱ-11、空间光调制器Ⅱ-12、二向色镜-13、准直透镜组-14、滤镜片转盘-15、物镜-17、载物台-16;扩束镜Ⅱ-8用于对激光光源Ⅱ-7发出的激活光线进行扩束;均匀光透镜组Ⅱ-9和聚焦透镜Ⅱ-10用于会聚激活光线,全内反射透镜Ⅱ-11激活光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅱ-12中,激活光线经过空间光调制器Ⅱ-12整形后以特定角度入射到二向色镜-13上,与激发光线形成合并光线;滤光片转盘15将合并光线反射到达物镜-17;合并光线经由准直透镜组-14和物镜-17的放大后以纳米尺寸照射到载物台-16上的样品上。
具体地,所述成像模块按照光路的传播方向,依次包含:压电陶瓷电机-18、管镜-19、探测器-20;压电陶瓷电机-18实现轴向精密对焦;荧光在滤光片转盘-15发生透射,并经由管镜-19聚焦后进入到探测器-20中。
本发明实施例中通过中继透镜组及聚焦透镜组合,解决了空间光调制器调制纳米精度光斑时出现的二维光栅衍射问题;其原理为利用光路中的中继凸透镜放大激光光斑,同时放大各衍射级间的间距,然后仅保留零级衍射光斑进入光路,后续由聚焦透镜再将零级光斑压缩至初始大小;如图2为示意图,其中(a)衍射现象,(b)扩大衍射间距,(c)保留零级衍射。
本发明实施例另一方面提供应用上述装置的一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法,包括以下步骤:
1)首先将样品放置于载物台上,由上位机控制空间光调制器Ⅰ所有微镜状态为“开”;然后粗调物镜相对载物台的位置,使探测器成像达到较好清晰度;再由压电陶瓷电机细调物镜相对载物台的位置,使探测器成像达到最优清晰度;
2)根据ROI区域的位置信息与形状信息,控制空间光调制器Ⅰ,将激发光线整形为几何形状Ⅰ;控制空间光调制器Ⅱ,将激活光线整形为几何形状Ⅱ;其中几何形状Ⅰ和几何形状Ⅱ的位置可以是包含、相交或者互斥的关系;
3)由荧光定位算法和单个微元可调的空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ,实现对几何形状Ⅰ、几何形状Ⅱ中心位置的实时调整;并通过持续迭代中心位置来记录ROI区域的荧光分子;
4)由步骤3)得到几何形状Ⅰ和Ⅱ的中心位置所记录的在ROI区域荧光分子的位置;并且所述荧光分子发出的荧光经由滤光片转盘透射、管镜聚焦后被探测器获取并进行成像。
具体地,所述空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ是单个微元可调的空间光调制器,包括但不限于DMD或透射式LCD。
具体地,在迭代中心位置时几何形状Ⅱ包含于几何形状Ⅰ;几何形状Ⅱ和几何形状Ⅰ包括但不限于是甜甜圈形、矩形或三角形等。
具体地,所述荧光定位算法在定位的过程中,通过控制空间光调制器Ⅰ和Ⅱ形成光斑并投射到样品区域内,再然后调整空间光调制器Ⅰ和Ⅱ,不同位置微镜的开关使光斑以随机开始的位置为圆心、L=600nm为直径的圆周上移动完成一次迭代,完成迭代后缩小直径L进行下一次迭代,不断重复上述操作,迭代至直径L=60nm时结束,并最终确定荧光分子所在位置,迭代过程中荧光分子距离最近的光斑中心点的距离r可表示为:
其中,表示是估计值,MLE表示是最大似然法,最大似然估计值/>的结果近似表示为在迭代中荧光分子距离最近光斑中心点的概率的多项式分布/>如下式所示:
其中是甜甜圈光斑移动过程中探测器收集到的光子数的集合;N是单次迭代过程中收集光子的总数;n0!…nk-1!是/>集合中的元素,代表单次迭代中,每一次移动几何形状Ⅰ、Ⅱ时收集到的光子数;k是单次迭代过程中空间光调制器Ⅰ、Ⅱ控制几何形状Ⅰ、Ⅱ中心位置移动的次数;pi是向量参数,/>其中λi表示几何形状Ⅰ引起的背景噪声的波长,λbi表示几何形状Ⅱ引起的背景噪声的波长。需特别说明的:
所述激发光源、损耗光源,可以是其他不同波长的单色激光光源。
所述空间光调制器Ⅰ、Ⅱ,只要满足上述单个微元可调的任意空间光调制器都应看作是本发明方法的替代方案。
所述空间光调制器Ⅰ、Ⅱ,只要是遵循相互嵌套的方式实现对激光光斑的整形和调整,都应看作本发明方法的替代方案。
所述中继透镜组及聚焦透镜组合,解决了数字微镜器件调制纳米精度光斑时出现的二维光栅衍射问题;用其他措施达到相似的效果,都应看作是本发明方法的替代方案。
所述探测器,凡是对荧光进行探测的装置如相机等,都应看作是本发明方法的替代方案。
所述压电陶瓷电机,凡是实现轴向对焦的装置,都应看作是本发明方法的替代方案。
本方法提出一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,包括激发模块、激活模块、成像模块,其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器,激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并,得到合并光线,合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像,实现无机械运动、无激光扫描的新型激光光斑调制;且实现的纳米精度荧光显微成像,能够分辨单个荧光分子或者亚细胞精细结构。
本方法提出的新型激光甜甜圈光斑调制方法,由于采用了MEMS器件作为空间光调制器,从而大幅降低荧光成像装置的复杂度。
本发明提出的使用单个微元可调的空间光调制器并结合荧光分子定位算法,实现了积极主动的荧光分子定位与成像,提高了定位和成像效率。
上述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的设计构思并不局限于此,凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动,均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (6)
1.一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,其特征在于,所述基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置包括激发模块、激活模块、成像模块,其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器,激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并,得到合并光线,合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像;
其中,所述激发模块按照光路传播方向,依次包含:激光光源Ⅰ、扩束镜Ⅰ、均匀光透镜组Ⅰ、聚焦透镜Ⅰ、全内反射透镜Ⅰ、空间光调制器Ⅰ;扩束镜Ⅰ用于对激光光源Ⅰ发出的激发光线进行扩束;均匀光透镜组Ⅰ和聚焦透镜Ⅰ用于会聚激发光线;全内反射透镜Ⅰ将激发光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅰ中;空间光调制器Ⅰ对入射的激发光线进行整形并出射;
所述激活模块按照光路的传播方向,依次包含:激光光源Ⅱ、扩束镜Ⅱ、均匀光透镜组Ⅱ、聚焦透镜Ⅱ、全内反射透镜Ⅱ、空间光调制器Ⅱ、二向色镜、准直透镜组、滤镜片转盘、物镜、载物台;扩束镜Ⅱ用于对激光光源Ⅱ发出的激活光线进行扩束;均匀光透镜组Ⅱ和聚焦透镜Ⅱ用于会聚激活光线,全内反射透镜Ⅱ激活光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅱ中,激活光线经过空间光调制器Ⅱ整形后以特定角度入射到二向色镜上,与激发光线形成合并光线;滤光片转盘将合并光线反射到达物镜;合并光线经由准直透镜组和物镜的放大后以纳米尺寸照射到载物台上的样品上。
2.根据权利要求1所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置,其特征在于,所述成像模块按照光路的传播方向,依次包含:压电陶瓷电机、管镜、探测器;压电陶瓷电机实现轴向精密对焦;荧光在滤光片转盘发生透射,并经由管镜聚焦后进入到探测器中。
3.应用权利要求1~2任一项所述装置的一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)首先将样品放置于载物台上,由上位机控制空间光调制器Ⅰ所有微镜状态为“开”;然后粗调物镜相对载物台的位置,使探测器成像达到较好清晰度;再由压电陶瓷电机细调物镜相对载物台的位置,使探测器成像达到最优清晰度;
2)根据ROI区域的位置信息与形状信息,控制空间光调制器Ⅰ,将激发光线整形为几何形状Ⅰ;控制空间光调制器Ⅱ,将激活光线整形为几何形状Ⅱ;其中几何形状Ⅰ和几何形状Ⅱ的位置可以是包含、相交或者互斥的关系;
3)由荧光定位算法和单个微元可调的空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ,实现对几何形状Ⅰ、几何形状Ⅱ中心位置的实时调整;并通过持续迭代中心位置来记录ROI区域的荧光分子;
4)由步骤3)得到几何形状Ⅰ和Ⅱ的中心位置所记录的在ROI区域荧光分子的位置;并且所述荧光分子发出的荧光经由滤光片转盘透射、管镜聚焦后被探测器获取并进行成像。
4.根据权利要求3所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法,其特征在于,所述空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ是单个微元可调的空间光调制器,包括但不限于DMD或透射式LCD。
5.根据权利要求3所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法,其特征在于,在迭代中心位置时几何形状Ⅱ包含于几何形状Ⅰ;几何形状Ⅱ和几何形状Ⅰ包括但不限于是甜甜圈形、矩形或三角形等。
6.根据权利要求3所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法,其特征在于,所述荧光定位算法在定位的过程中,通过控制空间光调制器Ⅰ和Ⅱ形成光斑并投射到样品区域内,再然后调整空间光调制器Ⅰ和Ⅱ,不同位置微镜的开关使光斑以随机开始的位置为圆心、L=600nm为直径的圆周上移动完成一次迭代,完成迭代后缩小直径L进行下一次迭代,不断重复上述操作,迭代至直径L=60nm时结束,并最终确定荧光分子所在位置,迭代过程中荧光分子距离最近的光斑中心点的距离r可表示为:
其中,表示是估计值,MLE表示是最大似然法,最大似然估计值/>的结果近似表示为在迭代中荧光分子距离最近光斑中心点的概率的多项式分布/>如下式所示:
其中是甜甜圈光斑移动过程中探测器收集到的光子数的集合;N是单次迭代过程中收集光子的总数;n0!…nk-1!是/>集合中的元素,代表单次迭代中,每一次移动几何形状Ⅰ、Ⅱ时收集到的光子数;k是单次迭代过程中空间光调制器Ⅰ、Ⅱ控制几何形状Ⅰ、Ⅱ中心位置移动的次数;pi是向量参数,/>其中λi表示几何形状Ⅰ引起的背景噪声的波长,λbi表示几何形状Ⅱ引起的背景噪声的波长。
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