CN115010794A - 蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用。所述蛋白质介导的mRNA靶向分子由mRNA通过其3’端的PolyA与靶向蛋白基团连接而成，其中，mRNA的结构从5’端至3’端依次包含5’帽子结构、带有Kozak序列的5’UTR、目的基因序列、3’UTR以及PolyA。可通过将表达目的基因的mRNA直接与偶联有蛋白的PolyA序列进行连接，合成出3’端带有蛋白的mRNA分子，从而达到靶向性药物递送的目的。本发明方法简单可靠，解决了现有的mRNA靶向递送至特定细胞的难题。

Description

蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用。
背景技术
mRNA的免疫原性和不稳定性，是限制mRNA研究应用的重要原因。相比DNA，mRNA能介导更优的转染效率和更长的蛋白表达时间。然而，mRNA编码信息中涵盖了核糖体生成蛋白的序列，必须递送至细胞内才能编码蛋白，直到将被修饰的核苷引入到mRNA的序列中，且研发出可以递送mRNA的载体，才算基本解决了应用过程中的技术难题。
mRNA链是带有负电荷的长链大分子，而细胞膜表面也带有负电荷，静电排斥使得mRNA分子较难自动结合细胞膜并穿过细胞膜进入细胞内。目前，mRNA向细胞内的递送可以通过不同的方法实现，例如电穿孔、声孔效应、显微注射或化合物转染，但这些方法的细胞毒性和生物安全性难以满足临床需求，临床转化具有一定难度。
经查，使mRNA靶向递送至特定细胞类型的递送方式在现有技术中尚无深入研究。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用，实现了mRNA与蛋白质分子的直接高效偶联，并通过与细胞表面受体的特异性结合，介导胞吞作用实现mRNA分子的特异性靶向递送。
对此，本发明首先提供了一种蛋白质介导的mRNA靶向分子，该蛋白质介导的mRNA靶向分子由mRNA通过其3’端的PolyA与靶向蛋白基团连接而成，其中，mRNA的结构从5’端至3’端依次包含5’帽子结构、带有Kozak序列的5’UTR、目的基因序列、3’UTR以及PolyA。本发明中，所述蛋白质介导的mRNA靶向分子亦称为mRNA-蛋白靶向分子。
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述靶向蛋白包括VSV-G、透膜蛋白、转铁蛋白、GM-SCF、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽、天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸三肽、抗VEGFR抗体、抗ERBB2抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD33抗体、抗CD25抗体、抗肌腱蛋白抗体、抗MUC1抗体、抗TAG72抗体、抗CEA抗体等。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子中，所述mRNA包括经修饰的核苷和/或未经修饰的核苷，其中所述经修饰的核苷为化学修饰核苷。更具体地，所述的化学修饰核苷包括2-氟-2-脱氧腺苷、2-氟-2-脱氧尿苷、2-氟-2-脱氧胞苷、2-氟-2-脱氧鸟苷、2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷、2-氟-2-脱氧-假尿苷、2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷、2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷、2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷、2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷、2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、假尿苷、N1-甲基-假尿苷、N7-甲基-鸟苷、5-甲氧基尿苷、N4-乙酰基胞苷和N6-甲基腺苷中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子中，所述mRNA的5'帽子结构包括Cap0、Cap1、Cap2、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷和7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-2-甲氧基腺嘌呤-鸟苷中的一种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子中，所述mRNA的3’UTR部分至少包括10个碱基，例如可以是10-500个碱基，优选为50-200个碱基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子中，所述mRNA的PolyA的长度为5-150、优选为5-120、进一步优选为5-100、更进一步优选为5-50。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子中，所述mRNA的目的基因序列不对所述蛋白质介导的mRNA靶向分子在细胞中的递送发挥作用。
另一方面，本发明还提供了一种蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，其包括：
将mRNA通过其3’端的PolyA与靶向蛋白基团连接，制备得到蛋白质介导的mRNA靶向分子。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法包括：
提供第一核苷酸片段、3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段；
在连接酶的作用下，将第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接，制备得到蛋白质介导的mRNA靶向分子；其中第一核苷酸片段与第二核苷酸片段形成蛋白质介导的mRNA靶向分子中的mRNA部分。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，将第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接时，采用夹板DNA辅助进行。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，所述夹板DNA包括第一夹板DNA与第二夹板DNA；第一夹板DNA与第一核苷酸片段的3’端序列互补，所述第二夹板DNA与第二核苷酸片段的5’端序列互补。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，将第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接时，所述第一夹板DNA与第二夹板DNA之间无缝连接(即，第一夹板DNA对应在第一核苷酸片段上的序列与第二夹板DNA对应在第二核苷酸片段上的序列之间，无间隔碱基)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，所述第一夹板DNA与第一核苷酸片段的3’端5-40个碱基序列互补，所述第二夹板DNA与第二核苷酸片段的5’端5-40个碱基序列互补。换而言之，所述第一夹板DNA的长度为5-40个碱基，第二夹板DNA的长度为5-40个碱基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，与第一夹板DNA互补的第一核苷酸片段的3’端序列为蛋白质介导的mRNA靶向分子的mRNA的3’UTR中的一部分序列。即，所述第一夹板DNA是针对目标mRNA的3’UTR而设计。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，与第二夹板DNA互补的第二核苷酸片段的5’端序列包括蛋白质介导的mRNA靶向分子的mRNA的3’UTR中的一部分序列，也可以包括或不包括部分或全部的PolyA。即，所述第二夹板DNA是针对目标mRNA的3’UTR、或是3’UTR与PolyA序列而设计。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法中，第二核苷酸片段从5’端至3’端依次包括第三核苷酸片段与PolyA，所述第三核苷酸片段为蛋白质介导的mRNA靶向分子的mRNA的3’UTR中3’端序列的一部分。优选地，所述第三核苷酸片段的长度为5-100个碱基、优选5-80个碱基、进一步优选5-60个碱基、更进一步优选5-40个碱基。具体地，所述PolyA的长度为5-150、优选为5-120、进一步优选为5-100、更进一步优选为5-50。优选地，所述第二核苷酸片段的长度为10-150个碱基、优选10-120个碱基、进一步优选15-100个碱基、更进一步优选15-60个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第一夹板DNA包括但不限于如SEQ ID No.3所示，所述第二夹板DNA包括但不限于如SEQ ID No.4所示。
根据本发明的具体实施方案，本发明的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法包括：
提供第一核苷酸片段：合成带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体，行体外转录，得到第一核苷酸片段；所述第一核苷酸片段的结构从5’端至3’端依次包含5’帽子结构、带有Kozak序列的5’UTR、目的基因序列、3’UTR的5’端的一部分片段；
提供3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段：将靶向蛋白连接至第二核苷酸片段的3’端，得到3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段；其中，蛋白基团直接连接在第二核苷酸片段的3’端序列的PolyA上；
配制反应体系，使得在退火反应中，第一核苷酸片段的3’端序列与第一夹板DNA互补结合，第二核苷酸片段的5’端序列与第二夹板DNA互补结合，在RNA连接酶(例如T4 RNA连接酶)作用下，使第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接，进一步经过DNA酶处理去除夹板DNA，得到蛋白质介导的mRNA靶向分子。在没有夹板DNA的情况下，mRNA分子与3’端带有蛋白基团的PolyA若直接进行偶联，会出现错配率高，而且连接效率低等问题。本发明的技术方案采用夹板DNA，能大大提高链接效率和准确率。
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述启动子可以为T3或T7或SP6启动子。
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含：本发明所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子，和药学上可接受的辅料。
另一方面，本发明还提供了所述的药物组合物或所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子在制备用于在哺乳动物或人类受试者中表达目标多肽的药物中的应用。所述目标多肽可以是诸如GLP-1、尿酸氧化酶、胰岛素、胶原蛋白等蛋白替代药物。
根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明通过使用带正电荷的蛋白实现了不依赖于传统脂质体、脂质纳米颗粒的体内递送。同时这些特定蛋白分子在靶细胞表面存在特异性受体，实现组织器官靶向递送。
本发明的mRNA-蛋白靶向分子能够用于药物递送***中，mRNA的3’端连接有特定蛋白基团，通过与靶细胞表面蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达，解决了核酸药物在药物递送过程中的靶向递送的技术难题。
整体而言，采用本发明的技术方案，通过将表达目的基因的mRNA直接与偶联有蛋白基团的PolyA序列进行连接，合成出3’端带有蛋白基团的mRNA，在正电荷蛋白的作用下实现体内靶向递送，达到靶向性给药的目的，本发明的方法不依赖脂质体、脂质纳米颗粒等传统载体，方法更加简单可靠，解决了现有的mRNA与蛋白质的耦合难题，以及体内靶向递送的难题。进一步地，通过夹板DNA的设计能大大提高连接效率和准确率。
附图说明
图1是本发明实施例1一种mRNA-蛋白靶向分子的制备方法的流程示意图；其中(a)为质粒DNA中DNA片段以及进行体外转录得到mRNA分子的结构示意图；(b)为mRNA分子与3’端带有VSV-G的PolyA待结合的示意图；(c)为得到的mRNA-蛋白靶向分子的示意图。
图2是mRNA-VSV-G靶向分子与mRNA分子转染细胞对比。
图3是本发明实施例2一种mRNA-蛋白靶向分子的制备方法的流程示意图；其中(a)为质粒DNA中DNA片段以及进行体外转录得到mRNA分子的结构示意图；(b)为mRNA分子与3’端带有抗ERBB2抗体的PolyA待结合的示意图；(c)为得到的mRNA-蛋白靶向分子的示意图。
图4是mRNA-ERBB2抗体靶向分子转染无ERBB2表达的细胞与细胞膜上表达ERBB2的细胞对比。
图5是mRNA-CD22抗体靶向分子转染无CD22表达细胞与CD22+细胞对比。
图6显示mRNA-VSV-G分子结构和连接效率结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中未特别注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。
实施例1、mRNA-VSV-G蛋白靶向分子的制备
本实施例提供一种mRNA-蛋白靶向分子，即mRNA-VSV-G蛋白靶向分子，其是mRNA的3’端PolyA上带有VSV-G蛋白的结构。其中所述mRNA分子的序列包含5’帽子、带有Kozak序列的5'UTR、目的基因序列、3'UTR和PolyA。
如图1所示，所述mRNA-蛋白靶向分子采用以下步骤制备得到：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体，质粒载体购自金唯智科技有限公司的pUC-GW-KANA，***位点EcoRVI，各部分链接顺序是5’UTR-mRNA编码基因序列-3’UTR；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含5’帽子、包含Kozak序列的5'UTR、目的基因序列、3'UTR；
步骤S3，在连接酶的作用下，mRNA分子与VSV-G修饰的多聚腺苷酸结合制备得到mRNA-VSV-G靶向分子。
本实施例中，步骤S1所设计的带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体中，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。进一步地，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
SEQ ID No.1：taatacgactcactatagg；
SEQ ID No.2：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
本实施例中，步骤S2的mRNA分子的具体合成方法如下：
1、构建好的表达质粒按如下反应体系进行DNA模板的扩增：
反应体积，50μl(为单个管的反应体积，一次同时反应多管)；
所述PCR扩增的体系(50μl)：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl、引物F(SEQ IDNo.6：TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG，10μmol/L)1.2μl、引物R(SEQ ID No.7：TACCGGTTAGCTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA，10μmol/L)1.2μl、DNA模板(1ng/μl)1μl和水21.6μl。
所述PCR的扩增程序如下：预变性98℃3min；变性98℃10s，退火60℃5s，延伸72℃2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。
反应结束后，将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，5V/min，40min)。根据电泳目的条带的大小对反应成功与否进行确认。
合格标准：电泳检测出现单一的条带，且大小正确。
2、DNA模板超滤
利用Millipore 30Kd超滤管浓缩上述获得的DNA模板。
3、DNA模板FPLC纯化
将上述超滤得到的DNA，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(苯酚/氯仿/异戊醇＝25/24/1)，充分震荡后，12000g离心15min。
去掉沉淀，转移上清至新的离心管中，加入上清体积的1/10 3M NaAc(pH5.2)，混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀，至于-20℃静置30min。
4℃，12000g离心10min，弃上清。
用70％乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，取上清，于超净台晾干5min。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的DNA模板。
用NanoDrop检测纯化后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测(1.5％琼脂糖，5V/min，40min)。
合格标准：260/280介于1.8至2.1之间，260/230在1.6至2.2之间。
4、FPLC纯化后模板超滤
Millipore 30Kd超滤管浓缩FPLC纯化后的DNA模板，用RNase-free水洗脱溶解。用NanoDrop检测超滤后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。最终用RNase-free水稀释至150ng/μl。
5、mRNA的体外合成
在恒温反应器中，进行mRNA的体外合成。
按照如下合成体系进行(反应试剂按照从上至下添加)：
反应体积，1600μl(置于2ml RNase-free Tube管中，为单个管的反应体积，一次同时反应多管)：RNA-free水440μl、7.5mM的ATP 160μl、7.5mM的UTP 160μl、7.5mM的CTP 160μl、7.5mM的GTP 160μl、7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl、150ng/μl的DNA模板40μl、10×Buffer 160μl和Enzyme Mix 160μl。
所述RNA体外合成的程序为37℃，10h。
6、DNase I消化去除DNA模板
向mRNA体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNase I。
上下颠倒10次混匀，1000rpm离心10s。
重新置于恒温反应器中，37℃，1h。
7、mRNA沉淀回收
向上一步骤中的每个50ml Tube管中，加入等体积的醋酸铵溶液。
上下颠倒10次混匀。
置于-20℃2h，沉淀。
17000g，4℃离心，30min。
去掉上清，用70％乙醇洗涤沉淀。
17000g，4℃离心，10min。
去掉70％乙醇，于超净台中蒸干，每管加入RNase-free水20ml。
静置10min后，用枪头轻吹混匀。
用NanoDrop检测回收后的mRNA浓度为5μg/μl，A260/A280为1.90、A260/A230为2.0。
取1μl，稀释10倍，进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。
8、LiCl沉淀纯化mRNA
将上一步骤中回收的mRNA按照其1.5倍体积加入Rnase-free水，混匀。
加入原mRNA 1.5倍体积-20预冷的LiCl溶液，混匀。
然后于-20℃静至2h。
16000g离心20min。
弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，16000g离心15min。
取上清，于超净台晾干5min。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的mRNA。
本实施例中，所得到的mRNA序列如SEQ ID No.5所示。
SEQ ID No.5：
Cap-UAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCGCCACCAUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCAAGCUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGUAAGCUGCCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAGCGAAGGUA
其中，Cap结构为3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
本实施例中，步骤S3中，所述VSV-G修饰的多聚腺苷酸采用多聚腺苷酸(10个A组成的PolyA)的3’端暴露的氨基，与蛋白基团的氨基酸的羧基进行反应得到。通常情况下，反应时可加CDI，室温下反应2个小时。
本实施例中，步骤S3具体过程包括：
构建如下反应体系：1M Tris-HCl(pH 7.5)，1mM MgCl2，5％(wt/vol)PEG 8000，20units/ul RNase Inhibitor，100units/ul T4 RNA Ligase 1，1mM ATP，2.5mM mRNA以及VSV-G修饰的多聚腺苷酸；其中mRNA和VSV-G修饰的多聚腺苷酸的摩尔比控制在1：2；
25℃反应30分钟(或者16℃反应2小时至32小时之间)；
在反应产物中加入氯化锂溶液至氯化锂终浓度为0.5M，可得到沉淀产物，即为本发明的mRNA-VSV-G靶向分子。
本实施例制备得到的mRNA-VSV-G靶向分子，可以用于制备特异性药物递送的mRNA药物中。所述特异性药物递送的mRNA药物中除本发明的mRNA-VSV-G靶向分子外，还可包括药学上可接受的载体，例如保护剂、缓冲液等中的一种或多种。mRNA-VSV-G靶向分子的3’端连接有VSV-G蛋白，通过VSV-G介导细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。具体操作步骤为：293T细胞传代后约24小时，观察6孔板内的细胞状态，汇合度在90％左右即可进行转染。取两份200μl opti-MEM，分别加入10μg编码GFP的mRNA(作为对照)和本实施例中制备的mRNA-VSV-G，用枪头轻轻吹打充分混匀，静置10min，得到配制好的转染体系。将配制好的转染体系，直接均匀滴加进入培养的细胞中，再前后左右摇匀，使得转染体系均匀分布于细胞上。转染后6h换液，吸掉旧的培养基，每孔换为2ml新鲜培养基(90％DMEM+10％FBS)。转染后24h显微镜下观察。
如图2所示，编码GFP的mRNA转染体系加入细胞后24小时，荧光显微镜下未能发现GFP的存在，即未能实现GFP的表达；编码GFP的mRNA-VSV-G转染体系加入细胞后24小时，荧光显微镜下明显看到GFP的存在，即实现了GFP的表达。
实施例2、mRNA-抗ERBB2抗体靶向分子的制备
本实施例提供一种mRNA-蛋白靶向分子，即mRNA-抗ERBB2抗体靶向分子，其为mRNA的3’端PolyA上带有抗ERBB2抗体的产物。其中，mRNA的序列包含5’帽子、带有Kozak序列的5'UTR、目的基因序列、3'UTR、PolyA(mRNA的序列与实施例1相同)。PolyA的3’端带有抗ERBB2抗体。
如图3所示，所述mRNA-抗ERBB2抗体靶向分子采用以下步骤制备得到：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列和第一夹板DNA序列的互补序列的质粒载体；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子。所述mRNA分子的序列包含依次连接的5’帽子、带有Kozak序列的5'UTR、目的基因序列、3'UTR的一部分(目标mRNA的3’UTR中5’端序列部分，包括与第一夹板DNA序列的互补序列对应的mRNA序列)。mRNA合成方法与实施例1相同；
步骤S3，3’端带有蛋白基团的PolyA片段，其具有10个A，PolyA的5’端带有一段能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列(即，目标mRNA的3’UTR中3’端序列的一部分)。所述第一夹板DNA序列和第二夹板DNA序列无缝连接构成夹板DNA。在退火反应中，带有第一夹板DNA序列的互补序列的mRNA分子与带有与第二夹板DNA序列互补配对序列的PolyA分子分别与夹板DNA互补结合，在T4RNA连接酶I作用下，所述mRNA分子的3’端羟基与带有抗ERBB2抗体的PolyA的5’端磷酸基团连接，经过DNase I处理后，得到带有抗ERBB2抗体的mRNA靶向分子。
本实施例中，所述第一夹板DNA序列如SEQ ID No.3所示，所述第二夹板DNA序列如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.3：5’-ttcaaagacc-3’；
SEQ ID No.4：5’-tcaggcttta-3’。
所述启动子的序列如SEQ ID No.1所示。
所述目的基因如SEQ ID No.2所示。
进一步的，所述连接酶为T4 RNA Ligase I。
本实施例得到的mRNA-蛋白靶向分子可以用于制备特异性药物递送的mRNA药物中。3’端连接有抗ERBB2抗体，通过抗ERBB2抗体与表面表达ERBB2的癌细胞特异性结合引起细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。具体操作步骤如下：293T(无ERBB2表达)和H1781细胞(ERBB2膜定位)传代后约24小时，观察6孔板内的细胞状态，汇合度在90％左右即可进行转染。取两份200μl opti-MEM，分别加入10μg编码GFP的mRNA-ERBB2抗体复合物，用枪头轻轻吹打充分混匀，静置10min。将配制好的转染体系，直接均匀滴加进入培养的细胞中，再前后左右摇匀，使得转染体系均匀分布于细胞上。转染后6h换液，吸掉旧的培养基，每孔换为2ml新鲜培养基(90％DMEM+10％FBS)。转染后24h显微镜下观察。如图4所示，mRNA-ERBB2抗体复合物能够特异性转染表面表达ERBB2的H1781细胞，不能转染普通293T细胞。
实施例3、mRNA-抗CD22抗体靶向分子的制备
本实施例提供一种mRNA-蛋白靶向分子，即mRNA-抗CD22抗体靶向分子，其为mRNA分子与抗CD22抗体的连接产物。其中，所述mRNA分子的序列包含5’帽子、带有Kozak序列的5'UTR、目的基因序列、3'UTR、PolyA(mRNA的序列与实施例1相同)。所述mRNA分子的3’端PolyA上带有抗CD22抗体。所述mRNA-蛋白靶向分子采用与实施例2相同步骤制备得到：
步骤S1，设计并合成一段带有启动子序列、目的基因序列和第一夹板DNA序列的互补序列的质粒载体；
步骤S2，以步骤S1的质粒载体为模板进行体外转录，得到mRNA分子，所述mRNA分子的序列包含依次连接的5’帽子、带有Kozak序列的5'UTR、目的基因序列、3'UTR的5’端部分序列(包括第一夹板DNA序列的互补序列对应的RNA序列)，mRNA体外转录及纯化方案见实施例1；
步骤S3，3’端带有蛋白基团的PolyA片段，其5’端带有一段能与第二夹板DNA序列互补配对的RNA序列；在退火反应中，带有第一夹板DNA序列的互补序列的mRNA分子与带有与第二夹板DNA序列互补配对序列的PolyA分子分别与夹板DNA互补结合，在T4 RNA连接酶作用下，所述mRNA分子的3’端羟基与带有抗CD22抗体的PolyA的5’端磷酸基团连接，经过DNase I处理后，得到带有抗CD22抗体的mRNA靶向分子。
本实施例中，所述第一夹板DNA序列如SEQ ID No.3所示，所述第二夹板DNA序列如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.3：5’-ttcaaagacc-3’；
SEQ ID No.4：5’-tcaggcttta-3’。
所述启动子的序列如SEQ ID No.1所示。
所述目的基因为如SEQ ID No.2所示。
进一步的，所述连接酶为T4 RNA Ligase I。
本实施例得到的mRNA-蛋白靶向分子可以用于制备特异性药物递送的mRNA药物中。3’端连接有抗CD22抗体，通过抗CD22抗体与表面表达CD22的癌细胞特异性结合引起细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。具体操作步骤如下：293T(无CD22表达)和CA46细胞(CD22+)传代后约24小时，观察6孔板内的细胞状态，汇合度在90％左右即可进行转染。取两份200μl opti-MEM，分别加入10μg编码GFP的mRNA-CD22抗体复合物，用枪头轻轻吹打充分混匀，静置10min。将配制好的转染体系，直接均匀滴加进入培养的细胞中，再前后左右摇匀，使得转染体系均匀分布于细胞上。转染后6h换液，吸掉旧的培养基，每孔换为2ml新鲜培养基(90％DMEM+10％FBS)。转染后24h显微镜下观察。如图5所示，mRNA-CD22抗体复合物能够特异性转染表面表达CD22的CA46细胞，不能转染普通293T细胞。
实施例4、mRNA-VSV-G分子结构检测
采用以下方法对mRNA-VSV-G分子结构进行检测：
将抗VSV-G抗体(5μg)加入实施例1制备的mRNA-VSV-G产物中(1mg)，VSV-G蛋白作为阴性对照，4℃轻柔搅动孵育过夜；
加入protein A/G磁珠(40μL)，4℃轻柔搅动孵育1h；
2,500rpm离心30s沉淀磁珠，移去上清液，在500μl RIP缓冲液中重悬磁珠；
磁珠在RIP缓冲液中重复清洗共三次，随后在PBS中清洗一次；
对免疫沉淀后RBP上结合的RNA进行纯化，在1mL TRIzol RNA提取试剂中重悬磁珠，分离共沉淀的RNA；
使用不含核酸酶的水(20μL)洗脱RNA。将约20μL经DEPC处理的水加入mRNA沉淀中；
将mRNA逆转录(RT)为cDNA，并进行RT-PCR分析，同质量的mRNA样品作为阳性对照，检测结合在VSV-G上的mRNA的丰度。其中RT-PCR中使用的引物为F:AAGGAGGACGGCAACATCCTGGGG(SEQ ID No.8)，R:TACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG(SEQ IDNo.9)。
检测结果如图6所示。
综上所述，本发明主要通过多聚腺苷酸和蛋白递送载体的连接，以及多聚腺苷酸/蛋白复合物与mRNA分子末端的连接方法，可实现最终产物可以用来靶向递送mRNA。
序列表
<110> 武汉瑞佶生物科技有限公司
<120> 蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用
<130> GAI21CN8019
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子
<400> 1
taatacgact cactatagg 19
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目的基因
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一夹板DNA序列
<400> 3
ttcaaagacc 10
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二夹板DNA序列
<400> 4
tcaggcttta 10
<210> 5
<211> 865
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录所得mRNA分子序列
<400> 5
uaagagagaa aagaagagua agaagaaaua uaagagccgc caccauggug agcaagggcg 60
aggagcuguu caccggggug gugcccaucc uggucgagcu ggacggcgac guaaacggcc 120
acaaguucag cguguccggc gagggcgagg gcgaugccac cuacggcaag cugacccuga 180
aguucaucug caccaccggc aagcugcccg ugcccuggcc cacccucgug accacccuga 240
ccuacggcgu gcagugcuuc agccgcuacc ccgaccacau gaagcagcac gacuucuuca 300
aguccgccau gcccgaaggc uacguccagg agcgcaccau cuucuucaag gacgacggca 360
acuacaagac ccgcgccgag gugaaguucg agggcgacac ccuggugaac cgcaucgagc 420
ugaagggcau cgacuucaag gaggacggca acauccuggg gcacaagcug gaguacaacu 480
acaacagcca caacgucuau aucauggccg acaagcagaa gaacggcauc aaggugaacu 540
ucaagauccg ccacaacauc gaggacggca gcgugcagcu cgccgaccac uaccagcaga 600
acacccccau cggcgacggc cccgugcugc ugcccgacaa ccacuaccug agcacccagu 660
ccaagcugag caaagacccc aacgagaagc gcgaucacau gguccugcug gaguucguga 720
ccgccgccgg gaucacucuc ggcauggacg agcuguacaa guaagcugcc uucugcgggg 780
cuugccuucu ggccaugccc uucuucucuc ccuugcaccu guaccucuug gucuuugaau 840
aaagccugag uaggaagcga aggua 865
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F
<400> 6
ttggaccctc gtacagaagc taatacg 27
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物R
<400> 7
taccggttag cttcctactc aggctttatt caaagacca 39
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-RCR引物F
<400> 8
aaggaggacg gcaacatcct gggg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RT-PCR引物R
<400> 9
tacagctcgt ccatgccgag agtg 24

Claims (12)

1.一种蛋白质介导的mRNA靶向分子，该蛋白质介导的mRNA靶向分子由mRNA通过其3’端的PolyA与靶向蛋白基团连接而成，其中，mRNA的结构从5’端至3’端依次包含5’帽子结构、带有Kozak序列的5’UTR、目的基因序列、3’UTR以及PolyA。
2.根据权利要求1所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子，其中，所述靶向蛋白选自VSV-G、透膜蛋白、转铁蛋白、GM-SCF、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽、天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸三肽、抗VEGFR抗体、抗ERBB2抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD33抗体、抗CD25抗体、抗肌腱蛋白抗体、抗MUC1抗体、抗TAG72抗体、抗CEA抗体中的一种。
3.根据权利要求1所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子，其中，所述mRNA包括经修饰的核苷和/或未经修饰的核苷，其中所述经修饰的核苷为化学修饰核苷；
优选地，所述化学修饰核苷包括2-氟-2-脱氧腺苷、2-氟-2-脱氧尿苷、2-氟-2-脱氧胞苷、2-氟-2-脱氧鸟苷、2-氟-2-脱氧-5-甲基胞苷、2-氟-2-脱氧-假尿苷、2-氟-2-脱氧-N1-甲基-假尿苷、2-氟-2-脱氧-N7-甲基-鸟苷、2-氟-2-脱氧-5-甲氧基尿苷、2-氟-2-脱氧-N4-乙酰基胞苷、2-氟-2-脱氧-N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷、假尿苷、N1-甲基-假尿苷、N7-甲基-鸟苷、5-甲氧基尿苷、N4-乙酰基胞苷和N6-甲基腺苷中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子，其中，所述mRNA的5’帽子结构包括Cap0、Cap1、Cap2、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-腺苷、7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷和7-甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-2-甲氧基腺嘌呤-鸟苷中的一种。
5.一种蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，其包括：
将mRNA通过其3’端的PolyA与靶向蛋白基团连接，制备得到蛋白质介导的mRNA靶向分子。
6.根据权利要求5所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，其包括：
提供第一核苷酸片段、3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段；
在连接酶的作用下，将第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接，制备得到蛋白质介导的mRNA靶向分子；其中第一核苷酸片段与第二核苷酸片段形成蛋白质介导的mRNA靶向分子中的mRNA部分。
7.根据权利要求6所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，其中，将第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接时，采用夹板DNA辅助进行。
8.根据权利要求7所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，其中，所述夹板DNA包括第一夹板DNA与第二夹板DNA；第一夹板DNA与第一核苷酸片段的3’端序列互补，所述第二夹板DNA与第二核苷酸片段的5’端序列互补。
9.根据权利要求8所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，其中，将第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接时，所述第一夹板DNA与第二夹板DNA之间无缝连接；
优选地，所述第一夹板DNA与第一核苷酸片段的3’端5-40个碱基序列互补，所述第二夹板DNA与第二核苷酸片段的5’端5-40个碱基序列互补；
优选地，与第一夹板DNA互补的第一核苷酸片段的3’端序列、与第二夹板DNA互补的第二核苷酸片段的5’端序列均为蛋白质介导的mRNA靶向分子的mRNA的3’UTR中的一部分序列；
优选地，第二核苷酸片段从5’端至3’端依次包括第三核苷酸片段与PolyA，所述第三核苷酸片段为蛋白质介导的mRNA靶向分子的mRNA的3’UTR中3’端序列的一部分；更优选地，所述第三核苷酸片段的长度为5-100个碱基；所述PolyA的长度为5-150；所述第二核苷酸片段的长度为10-150个碱基。
10.根据权利要求5-9任一项所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子的制备方法，该方法包括：
提供第一核苷酸片段：合成带有启动子序列、目的基因序列的质粒载体，行体外转录，得到第一核苷酸片段；所述第一核苷酸片段的结构从5’端至3’端依次包含5’帽子结构、带有Kozak序列的5’UTR、目的基因序列、3’UTR的5’端的一部分片段；
提供3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段：将靶向蛋白连接至第二核苷酸片段的3’端，得到3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段；其中，蛋白基团直接连接在第二核苷酸片段的3’端序列的PolyA上；
配制反应体系，使得在退火反应中，第一核苷酸片段的3’端序列与第一夹板DNA互补结合，第二核苷酸片段的5’端序列与第二夹板DNA互补结合，在RNA连接酶作用下，使第一核苷酸片段的3’端与3’端带有蛋白基团的第二核苷酸片段的5’端连接，进一步经过DNA酶处理去除夹板DNA，得到蛋白质介导的mRNA靶向分子。
11.一种药物组合物，其包含：如权利要求1-4任意一项所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子，和药学上可接受的辅料。
12.权利要求11所述的药物组合物或权利要求1-4任一项所述的蛋白质介导的mRNA靶向分子在制备用于在哺乳动物受试者中表达目标多肽的药物中的应用。
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