CN115006382A - 肉豆蔻酸在制备用于抗老年性骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化合物领域，尤其涉及肉豆蔻酸在制备用于抗老年性骨质疏松药物中的应用。本发明利用自然衰老小鼠构建的老年性骨质疏松症(SOP)小鼠模型，评估肉豆蔻酸(MA)对老年性骨质疏松症(SOP)的影响和作用机制。通过实验发现肉豆蔻酸可提高SOP模型小鼠骨量，并能促进小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化，抑制小鼠骨髓造血干细胞(BMMs)破骨分化，为老年性骨质疏松症的治疗提供了一种新的药物选择，并为老年性骨质疏松症治疗的研究提供了一个新的方向。肉豆蔻酸来源广泛，制备工艺简单，作为药物较安全，无明显毒副作用。

Description

肉豆蔻酸在制备用于抗老年性骨质疏松药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化合物领域，尤其涉及肉豆蔻酸在制备用于抗老年性骨质疏松药物中的应用。

背景技术

随着世界人口老龄化的加速，衰老相关疾病如老年性骨质疏松症(SOP)在世界各国发病逐年增高。作为主要老年退行性疾病之一的老年性骨质疏松症已经成为老人身边的“隐形杀手”，由于骨质疏松症状隐匿，平时很容易被忽视。骨质疏松骨折是老年性骨质疏松症(SOP)最常见也是最严重的并发症之一，全世界每小时就有1000例骨质疏松骨折发生，致残率高达50％，致死率最高可达42％，给患者、家庭和社会经济带来了巨大的负担。因此，老年性骨质疏松症已成为影响人类老年生活的重要健康问题，如何防治老年性骨质疏松症也成为一项需要人类长期研究的重要课题。尽管目前抗老年性骨质疏松症药物能够在一定程度上降低骨折风险，但作用有限，且大多存在一定副作用，尚未有特异性改善老年性骨质疏松症的药物。因此探索研发新型抗老年性骨质疏松症的治疗药物迫在眉睫。

肉豆蔻酸(简称MA，IUPAC，又称：十四烷酸，分子式：C₁₄H₂₈O₂，CAS#： 544-63-8)是一种饱和脂肪酸，主要存在于豆蔻油、椰子油和棕榈仁油中。既往研究表明，肉豆蔻酸在体外能促进神经干细胞的增殖和分化，可以改善因衰老引起的认知功能衰退。且衰老过程伴随着MA的下降，这提示MA在治疗衰老相关疾病中能发挥重要作用。肉豆蔻酸(MA)还可抑制小鼠骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs)细胞膜表面toll样受体-2(TLR2)的表达，产生抗炎作用。此外，肉豆蔻酸的异构体肉豆蔻油酸可通过抑制RANKL活化来抑制破骨细胞生成和骨吸收。然而，目前现有技术尚未报道肉豆蔻酸对成破骨分化的影响。

发明内容

为了解决上述问题，在现有利用肉豆蔻酸治疗神经退行性疾病的研究基础上，本发明的目的在于提供肉豆蔻酸在制备抗老年性骨质疏松症的药物中的应用，并为老年性骨质疏松症治疗的研究提供了一个新的方向。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

具体的，肉豆蔻酸在制备用于抗老年性骨质疏松药物中的应用。

在一些实施例中，所述药物可以促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化。

在一些实施例中，所述成骨细胞为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。

在一些实施例中，所述破骨细胞为骨髓造血干细胞(BMMs)。

在一些实施例中，所述药物可以增加骨量。

本发明还提供了一种治疗老年性骨质疏松的药物，所述药物包含肉豆蔻酸和药物学上可接受的辅料。

在一些实施例中，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、丸剂、粉末剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明创新性地发现，肉豆蔻酸(MA)可提高老年性骨质疏松症(SOP) 小鼠模型的骨量，特异性改善老年性骨质疏松症，即可用于制备抗老年性骨质疏松药物，为治疗老年性骨质疏松症(SOP)提供新的有效的药物选择。

2.本发明创新性地发现，肉豆蔻酸(MA)在体外可促进骨髓间充质干细胞 (BMSCs)成骨分化，抑制骨髓造血干细胞(BMMs)破骨分化，为治疗老年性骨质疏松症提供新的研究方向，开拓了新的治疗思路。

3.本发明所述的化合物肉豆蔻酸来源广泛，制备工艺简单，成本低廉，便于大规模生产。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为肉豆蔻酸腹腔注射提供的SOP模型小鼠骨量结果图。

图2-5为肉豆蔻酸促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化结果图。

图6-10为肉豆蔻酸抑制骨髓造血干细胞(BMMs)破骨分化结果图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

肉豆蔻酸(Myristic acid)，分子式：C₁₄H₂₈O₂，CAS#：544-63-8，分子量为 228.37，为白色至带黄白色硬质固体，偶为有光泽的结晶状固体，或者为白色至带黄白色粉末，无气味。肉豆蔻酸在自然界以甘油酯形式存在于豆蔻油(含量70％～80％)、棕榈油(含量1％～3％)、椰子油(含量17％～20％)等植物油脂中。可用于配制各种食用香料，也可作为添加剂、金属加工和香料的溶剂。结构式如下所示：

下面将通过实际研究数据来证明本发明所述肉豆蔻酸特异性改善老年骨质疏松症的有益治疗效果：

一、资料与方法

小鼠：

采用22月龄C57BL/6小鼠，购自广州中医药大学实验动物中心(GZUCM)(动物生产证书#(Yue)20180034)。所有动物实验均经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(批准文号TCMF1-2021026)。将购得的22月龄小鼠随机分为两组：22月龄小鼠(22M，等量溶剂腹腔注射)和MA(MA+22M，2mg/kg·d MA 腹腔注射)两组。药物通过腹腔注射连续给药2个月。

micro-CT检测

采用micro-CT检测小鼠腰椎骨密度、生物力学、骨微细结构、形态变化：取SOP小鼠，将胫骨游离，进行micro-CT扫描。扫描范围选取胫骨生长板下1mm 和胫骨近端1.5mm，扫描180层，每层厚度设置为14μm，扫描时电压和电流分别设定为55kV和145mA。扫描后应用micro-CT自带分析软件μCT80 Evaluation Program(v6.5-1，Scanco Medical，瑞士)进行分析，感兴趣区域设置为胫骨内直径2mm的圆形范围的松质骨区域(以椎体内正中为圆心)，获取感兴趣区域骨微细结构参数。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色

参考TRAP染色试剂盒说明，组织石蜡切片常规脱蜡，用含有醋酸钠、酒石酸钠naphthol-AS-TR-phosphate,N,N-dimethyl formamide,and fast red(德国SigmaAldrich公司)的TRAP溶液染色，37℃孵育50min，苏木精(Fa Shandon, ThermoScientific)复染30s，用甘油明胶(Merck公司)封片，显微镜下观察。

小鼠BMSC提取、培养、诱导成骨分化

麻醉后脱颈椎处死小鼠，75％酒精浸泡5min。用弯镊夹持小鼠足部，剥离下肢皮肤，离断髋关节及踝关节后将下肢浸没于75％酒精中。迅速转移小鼠下肢至细胞房超净台，继续剔干净小鼠剩余附着肌肉。弯镊夹持股骨或胫骨，剪刀除去骨干两端，暴露髓腔，10ml注射器冲洗髓腔至含有20％FBS的α-MEM中，至髓腔发白。注射器反复将骨髓悬液抽吸吹打制成单细胞悬液，转移至25cm²培养皿中，将培养皿置于37℃、5％的CO2的培养箱中培养。P4或P5代BMSC (骨髓间充质干细胞)长满90％后，种至12孔板(1×104/cm²)，细胞融合80％后诱导成骨分化，进行ALP或茜素红染色。

小鼠BMM提取、培养、诱导破骨分化

将获得的小鼠造血骨髓细胞用40μm细胞过滤器进行纯化，在10％胎牛血清 (FBS)的α-MEM培养基中用50ng/ml小鼠巨噬细胞刺激落因子(M-CSF，R&D) 分化3天，然后用25ng/ml M-CSF和50ng/ml RANKL(R&D)分化5-7天，获得成熟的破骨细胞，TRAP染色并计数。

qPCR检测

将小鼠BMSCs、BMMs接种于6孔板，细胞数为2×10⁵。诱导成破骨分化后，每孔加1mLTRIzol试剂提取细胞总RNA。用TAKARA MiniBEST Universal提取试剂盒提取总RNA，用Thermo全波长酶标仪分析RNA浓度和纯度，PrimeScriptTM RTMaster Mix逆转录盒进行cDNA合成反应，根据SYBR PremixEx TaqTM II操作步骤，使用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪进行两步法荧光定量分析，反应条件设置为95℃30s，95℃5s，60℃1min延伸，40个循环，每个样本设置3个技术重复孔。

Werstern blot检测

小鼠BMSCs、BMMs接种于含2×106细胞的100mm培养皿中。诱导成破骨分化后，加入200μL由磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂制备的RIPA裂解缓冲液 (Beyotime)提取蛋白，样品终浓度为4.0μg/μl，加入5倍稀释蛋白样品缓冲液， 95℃，5分钟。根据目的蛋白的分子量制胶，常规上样、电泳、转膜。转膜后将膜完全浸没于5％BSA-TBST中水平摇床室温孵育6小时进行封闭。用 5％BSA-TBST稀释一抗，4℃水平摇床孵育过夜。次日，TBST洗膜3次后相应二抗室温孵育40分钟(1︰10000)。TBST洗膜3次后ECL显影，胶片曝光。 Tanon-2500R型全自动数码凝胶成像***成像，Scion Image软件分析蛋白电泳条带灰度值，以GAPDF作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白灰度值/GAPDF 条带灰度值来表示目标基因的相对蛋白表达水平。

分组干预及检测指标

BMSC分组及干预：

①对照组：提取对照组小鼠BMSC，诱导成骨分化；

②SOP组：提取SOP组小鼠BMSC，诱导成骨分化；

③SOP+肉豆蔻酸组：提取SOP组小鼠BMSC，诱导成骨分化，并用肉豆蔻酸干预；

BMM分组及干预：

①对照组：提取对照组小鼠BMM，诱导破骨分化；

②SOP组：提取SOP组小鼠BMM，诱导破骨分化；

③SOP+肉豆蔻酸组：提取SOP组小鼠BMM，诱导破骨分化，并用肉豆蔻酸干预。

检测BMSC及BMM生长、增殖能力及成骨、破骨细胞分化能力，成、破骨相关标志基因、蛋白检测。

二、实验结果

检查所有数据的正态性和方差齐性。所有数据均以平均值±标准差表示。所有数据均符合正态循环，且方差齐。独立样本t检验用于比较两个不同的样本。多组间单变量样本的比较采用单因素方差分析。多组间的双变量样本采用双因素方差分析(ANOVA)进行比较(p<0.05为差异有统计学意义)。

肉豆蔻酸腹腔注射处理的SOP模型小鼠骨量如图1所示：A.肉豆蔻酸腹腔注射雌性和雄性小鼠，各组micro-CT代表性图像；B.雌性和雄性两组小鼠骨组织是BV/TV值。图中可以明显看出，经MA处理的实验组小鼠较SOP模型组小鼠的骨量有明显的改善。

肉豆蔻酸促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的效果如图2-5所示，图2为CCK8检测肉豆蔻酸对BMSCs增殖的影响，肉豆蔻酸浓度在不超过100μ mol/L的情况下既不促进也不抑制BMSCs的增殖；图3为碱性磷酸酶(ALP)、茜素红(ARS)染色检测肉豆蔻酸促进BMSCs成骨分化的效果；图4、5为qPCR、 Western-blot检测成骨分化特异性蛋白RUNX2、OPG的表达。

肉豆蔻酸抑制骨髓造血干细胞(BMMs)破骨分化的效果如图6-10所示：图 6为CCK8检测肉豆蔻酸对BMMs增殖的影响，肉豆蔻酸浓度在不超过100μmol/L 的情况下既不促进也不抑制BMMs的增殖；图7、8为TRAP染色及骨陷窝形成实验鉴定肉豆蔻酸对BMMs破骨分化和破骨细胞骨吸收能力的影响,结果提示随着肉豆蔻酸浓度的增加，成熟破骨细胞的数量明显减少，骨吸收能力被抑制，证明肉豆蔻酸能够抑制BMMs破骨分化。图9、10为qPCR、Western-blot检测破骨分化特异性蛋白CTSK、TNFα的表达。

上述结果表明，肉豆蔻酸(MA)2mg/kg·d腹腔注射给药2个月可以改善 SOP小鼠骨量，在体外可促进成骨分化，抑制破骨分化，能显著改善SOP小鼠模型老年骨质疏松症状，可用于制备抗老年性骨质疏松药物。

在本说明书的描述中，参考术语“一实施例”、“另一实施例”、“其他实施例”、或“第一实施例～第X实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料、方法步骤或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中

以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。

Claims (7)

1.肉豆蔻酸在制备抗老年性骨质疏松的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述成骨细胞为骨髓间充质干细胞。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞为骨髓造血干细胞。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可以增加骨量。

6.一种治疗老年性骨质疏松的药物，其特征在于，所述药物包含肉豆蔻酸和药物学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、丸剂、粉末剂。

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