CN115004007A - 用于成像质谱流式细胞术的等离子体和采样几何结构 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于成像质谱法(包括成像质谱流式细胞术)的***和方法。本申请的多个方面包括用于成像质谱法(IMS)的设备和方法，其提高了样品采集速度、信号灵敏度和/或信号稳定性。本文所述的***和方法可以使转移时间最小化并且/或者可以使从样品烧蚀的样品材料的羽流的扩散最小化，其中该样品材料被转移到成像质谱仪或成像质谱流式细胞仪的对该样品材料进行电离和分析的部件。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月16日提交的美国临时申请号63/114,313和2019年12月20日提交的美国临时申请号62/951,556的优先权权益，这两份临时申请的内容均以引用方式并入本文用于所有目的。
背景技术
成像质谱法应用(诸如成像质谱流式细胞术)受益于不同烧蚀羽流的快速采集。例如，激光烧蚀ICP-MS***可以烧蚀直径约1微米的光斑，并且可以单独检测单个样品中数百万光斑的元素或同位素组成。快速输送具有最小瞬时扩展的烧蚀羽流允许快速分析许多烧蚀光斑，并且可以提高灵敏度。由羽流传送取向相比于形成期间羽流膨胀方向的变化引起的湍流可以增加瞬时扩展。该***的部件(诸如光学部件)可以阻挡羽流向等离子体源的快速喷射。此外，对气体流的传统组成的修改可以提高信号灵敏度和/或稳定性。
技术领域
本发明涉及用于基于激光烧蚀的成像质谱法(包括成像质谱流式细胞术)的设备和方法。
发明内容
在本发明中，发明人已经设计了现有的基于激光烧蚀的成像质谱流式细胞仪和成像质谱仪的许多发展。特别地，这些发展涉及使转移时间最小化以及/或者使从样品烧蚀的样品材料的羽流的扩散最小化的修改，其中所述样品材料被转移到成像质谱仪或成像质谱流式细胞仪的对该样品材料进行电离和分析的部件。
本发明的设备(诸如成像质谱仪或成像质谱流式细胞仪)通常包括三个部件。第一部件是激光烧蚀***，其用于从样品产生蒸气材料和颗粒材料的羽流以供分析。在可以通过质谱仪部件(MS部件；第三部件)检测烧蚀样品材料的羽流中的原子(包括如下文所讨论的任何可检测的标记原子)之前，样品必须被雾化和电离(该样品材料的一些电离可以在烧蚀时发生，但是空间电荷效应导致电荷在它们可以被检测之前被充分中和，因此该设备需要单独的电离部件)。因此，该设备包括为电离***的第二部件，其将原子电离以形成元素离子，以使得这些原子能够由MS部件基于质荷比来检测。转移导管位于激光烧蚀***与电离***之间，其适于将激光烧蚀***与电离***耦合；该转移导管具有定位在激光烧蚀***内的入口，该入口被配置用于随着烧蚀羽流产生而捕获该烧蚀羽流，并且用于将所捕获的烧蚀羽流转移到电离***(在一些情况下，诸如在电离***是等离子体(诸如电感耦合等离子体(ICP))的情况下，该转移导管是通过中央喷射器管将样品直接引入ICP焰炬中的同一导管，并且在这种情况下，转移导管可以被称为喷射器)。因此，在操作中，样品被放入设备中，经烧蚀以产生蒸气/颗粒材料，该材料被电离***电离，然后样品的离子被传递到MS部件中。尽管MS部件可以检测许多离子，但这些离子中的大多数将是天然地构成样品的原子的离子。在一些应用例如矿物分析(诸如在地质学或考古学应用中的矿物分析)中，这可能就足够了。在成像质谱法应用(诸如成像质谱流式细胞术)中，MS部件可以是飞行时间(TOF)MS或磁扇区MS。
因此，本发明提供了一种设备，其包括：
(i)激光烧蚀***，其适于从样品产生样品材料的羽流；
(ii)等离子体源，其适于接收由激光烧蚀***从样品移除的材料，并且电离所述材料以形成元素离子；
(iii)质谱仪，其用于从所述电离***接收元素离子并且分析所述元素离子，
其中激光烧蚀***和电离***通过转移导管耦合在一起，该转移导管适于将包含烧蚀样品材料的羽流的气体流从激光烧蚀***运载到电离***，并且
其中等离子体被定向为不在与样品载台相同的轴线上。
本发明还提供了一种设备，其包括：
样品载台，其被配置为在至少两个方向上移动样品；激光烧蚀源，其被配置为烧蚀安装在样品载台上的样品；等离子体源；喷射器，其被配置为将由激光烧蚀源从样品产生的烧蚀羽流传送到等离子体源，其中等离子体源和样品载台中的至少一者彼此正交地定向。例如，等离子体可以被定向为与样品载台的任何轴线(安装在样品载台上的平面状样品的轴线)成大于60度、大于70度或大于80度(诸如90度)的角。
在某些方面，其中该喷射器是刚性的和/或直的。喷射器的内径可以小于2mm、小于1mm或小于0.5mm。喷射器的长度小于20cm、小于10cm、小于5cm或小于3cm。该设备可以被配置为在不穿过喷射器的路径上引导激光。
其中，该设备可以能够操作以每秒向ICP源输送至少500、1000、5000、10000或50000个离散的烧蚀羽流。在某些方面，短等离子体(例如，长度小于5mm、小于3mm、小于2mm)可以有助于防止瞬时扩散，并且可以允许来自分离的烧蚀羽流的离子保持不同，直到质谱检测。
该设备还可以包括耦合到等离子体源的质谱仪(MS)，诸如飞行时间质谱仪或磁扇区质谱仪。MS被配置为接收竖直离子束。
在某些方面，样品载台可以是竖直的，并且能够操作以在竖直位置运行(例如，由可以对抗重力的马达控制，同时仍提供在烧蚀光斑直径尺度上的步长)。
在某些方面，等离子体源可以竖直定向。等离子体源可以是真空密封的(例如，通向等离子体源的喷射器入口除外)。
等离子体源可以是电感耦合等离子体焰炬(ICP源)。例如，该设备可以是LA-ICP-MS***。
一种方法可以包括使用本文所述的设备通过LA-ICP-MS来分析样品。样品是生物样品，并且可以包含标记原子(诸如，附接到生物样品的分析物的SBP的标记原子)。该方法还可以包括在通过LA-ICP-MS分析样品之前用标记原子对样品进行标记。
本申请的多个方面还包括用于将含氢分子引入LA-ICP-MS中的ICP焰炬中(例如，用于信号增强)的设备和方法。含氢分子可以是如本文进一步描述的气体，诸如氢气、氨气或甲烷。替代性地或除此之外，可以将含氢分子诸如水或醇(例如，乙醇)作为蒸气引入气体流中，如本文进一步描述的。
附图说明
本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制申请人的教导内容的范围。
图1是激光烧蚀***的图解视图，示出了通过孔对激光烧蚀的羽流进行采样，该孔被配置用于将该羽流转移到喷射器中。
图2是具有水平等离子体的采样配置的视图。
图3是具有竖直等离子体的采样配置的视图。
图4是本领域的示例性LA-ICP-MS***的示意图。
图5是随氩转移气体的湿度(微巴)而变化的灵敏度(每次发射的Lu离子平均计数)的图形。
图6是适用于LA-ICP-MS的加湿***的图示。
图7是当氩转移气体的湿度被保持时，在长的样品运行(60,000秒)上的灵敏度(每次发射的Lu离子计数)的图形。
图8是随氢气流量(L/min)而变化的灵敏度(每次发射的Lu离子平均计数)的图形。
图9是通过加湿(左)或使用3％氢/氦预混合气体源作为捕获气体(右)实现的成像质谱流式细胞术图像信号改进的比较。
具体实施方式
应当理解，除非上下文另外明确指出，否则与本发明教导内容结合使用的关于各种元件的短语“一个”或“一种”涵盖“一个或多个”、“一种或多种”，或者“至少一个”、“至少一种”。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括一些附加物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指例如x±10％。
词语“基本上”并不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
词语“本发明”是指本发明的某些方面、实施例或实施方案，而不是指本发明的所有实施方案。
虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述发明，但是相关领域的技术人员应当理解，一旦他们熟悉了本公开，在不脱离所附权利要求书中的本发明的真实范围的情况下，可以进行形式和细节上的各种改变。因此，本发明不限于上文提出的方法或构造的确切部件或细节。除非在过程本身中必要或固有的程度上，并不打算或暗示对本公开(包括附图在内)中所述的方法或过程的步骤或阶段采用特定的顺序。在许多情况下，过程步骤的顺序可以变化，而不改变所述方法的目的、效果或输入物。本文引用的所有出版物和专利文献均以引用方式并入本文，如同每份这样的出版物或文献被明确且单独地指出以引用方式并入本文。对出版物和专利文献(专利、公开的专利申请和未公开的专利申请)的引用并不旨在承认任何这样的文献是相关的现有技术，也不构成对其内容或日期的任何承认。
本发明涉及成像质谱法，包括激光烧蚀与电感耦合等离子体质谱法的组合(LA-ICP-MS)。LA-ICP-MS已被描述用于测量生物材料中的内源性元素，并且最近被描述用于通过检测带元素标签的抗体进行成像。参见例如，Antonov,A.和Bandura,D.,2012，美国专利公开2012/0061561(其以引用方式并入本文)；Seuma等人，“Combination ofimmunohistochemistry and laser ablation ICP mass spectrometry for imaging ofcancer biomarkers”2008,Proteomics 8:3775-3784；Hutchinson等人，“Imaging andspatial distribution ofβ-amyloid peptide and metal ions in Alzheimer'splaques by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry”Analytical biochemistry 2005,346.2:225-233；Becker等人，“Laser ablationinductively coupled plasma mass spectrometry(LA-ICP-MS)in elemental imagingof biological tissues and in proteomics.”2007,Journal of Analytical AtomicSpectrometry 22.7:736-744；Binet等人，“Detection and characterization of zinc-and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis andlaser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry”AnalyticalBiochemistry 2003,318:30-38；Quinn等人，“Simultaneous determination of proteinsusing an element-tagged immunoassay coupled with ICP-MS detection Journal ofAnalytical Atomic Spectrometry”2002,17:892-96；Sharma等人，“Sesbania drummondiicell cultures:ICP-MS determination of the accumulation of Pb and CuMicrochemical Journal”2005,81:163-69；以及Giesen等人，“Multiplexedimmunohistochemical detection of tumor markers in breast cancer tissue usinglaser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry”2011,Anal.Chem.83:8177-8183，这些文献中的每一者均以引用方式并入本文。不同于ICP的等离子体源也在本申请的范围内。
由于纳米级定位载台的限制、对高NA光学器件的接入要求以及/或者将样品在IMC设备中保持在尽可能靠近等离子体的位置的期望，本文考虑并且在下表中描述了几种不同的等离子体和采样取向：
通过将等离子体旋转到最佳取向，我们可以克服先前的配置的一些不期望的特性(这些配置由于90度转向和长转移长度而导致瞬时展宽，由于重力将大粒子拉回到样品表面上而导致交叉污染)。值得注意的是，竖直等离子体已经用在ICP-OES机器中，因为该取向使得沿焰炬的轴线成像更简单(因为等离子体的圆柱对称性得以保存)。相比之下，由于等离子体在其离开焰炬体时的对流提升，水平取向上的对称性被打破。
在某些方面，焰炬可以是密封焰炬。密封焰炬是气密的，并且不与焰炬之外的空气流体连通(例如，供应气体流的气体源除外)。密封焰炬可以是真空密封的。在某些方面，激光烧蚀室是气密的，并且不与仪器之外的空气流体连通。在某些方面，整个激光烧蚀ICP-MS***被密封，以防止空气进入焰炬。密封焰炬中的气体流和气体动力学相比对流效应可以占据主导地位。密封焰炬可以在任何取向上表现得几乎相同(例如，对于相同的气体流、样品材料和感应条件具有相似的电离效率)，并且可以在竖直方向上定向(例如，指向背离重力矢量的方向或指向重力的方向)。
通过气体流传送烧蚀材料给我们的应用带来了一些挑战。即，使羽流剧烈地转向导致瞬时展宽，就如同样品与等离子体之间的气体通道的总体长度过大造成的效果。因此，为了获得最佳的像素采集速度，我们希望使等离子体垂直于样品基片定向，并且尽可能靠近样品基片。
我们选择取向的一个限制与我们的纳米级定位载台的具体规格有关。具有我们的应用所需的速度和动态定位精度的载台通常没有足够的最大力来对抗重力支撑住样品和相关联的硬件(弹簧、夹钳等)。这意味着从XYZ载台工程的视角来看，涉及竖直定向样品的配置更具有挑战性。然而，此类装置在等离子体工程方面的风险相对较低，因为我们已经有了构造具有水平等离子体的质量分析仪的经验。
另一种选择是保持样品水平，并且向上或向下引导等离子体。这些配置中的每一者都具有其自身的潜在益处和缺陷。
对于被向上引导的等离子体，一个益处是来自等离子体的热量离开样品上升到质量分析仪的界面区中。由于我们已经对该界面进行了液体冷却，因此这在机器的热预算中只呈现小的(可能可忽略不计的)增量。该方法的缺点是，未被气体流拾取的任何烧蚀材料(即，较大粒子)将落回到样品上，从而引起串扰和污染。
就被向下引导的等离子体而言，由于重力将较大的烧蚀粒子从样品拉离，因此这种粒子污染样品的风险不太大。然而，从等离子体上升的热量有可能带来挑战，因为该热量将朝着样品上升。这可以通过在样品与等离子体约束之间包括热隔断来克服，但这是以潜在地延长样品与等离子体之间的气体路径为代价的，从而导致瞬时展宽。在这种等离子体中，还存在对流力将导致额外的瞬时展宽的可能性。
原则上，烧蚀光可以从样品的任一侧入射。但是，还有一些折衷问题需要考虑。
如果烧蚀光从样品传送/等离子体的同一侧入射，则必须在对烧蚀光斑的光学访问与样品传送访问之间达成妥协，并且可能导致以下一种或多种折衷。
-聚焦光学器件将显著增加最小样品转移距离。
-聚焦光学器件将更难以制造和组装。
-可达到的最大吞吐量将更低。
-样品区域的任何光学检查将在视场、分辨率、照明均匀度等方面受到损害。
-仪器的模块化程度将变低。
另一方面，从样品传送/等离子体的相对侧入射的烧蚀光可能导致以下一种或多种折衷。
-烧蚀光必须穿过样品基片，这意味着必须将石英显微镜载片用于UV激光烧蚀，或者必须穿过对于UV光至少部分透明的另一种基片(诸如二氧化硅)。
-如果样品传送是直通的，则样品区域的光学检查可能受到来自等离子体的光的损害。
-样品固持件和载台组件必须为烧蚀/检查光学器件提供通光孔径，从而导致更昂贵/更复杂的组件。
在某些方面，激光烧蚀可以是非UV激光烧蚀(例如，可以在可见光谱或IR光谱中，诸如绿色激光烧蚀源)。非UV激光可以具有类似于本文所述的UV激光烧蚀源的特性，诸如频率和/或功率。这可以允许激光辐射穿过玻璃载片(其通常用于显微镜检查)。然而，生物样品(诸如组织切片、细胞涂片或细胞培养物)在UV光谱中可以比在可见(例如，绿色)或IR光谱中更好地烧蚀。
在某些方面，可以用有助于激光烧蚀(例如，降低激光烧蚀阈值)的化合物来处理样品(例如，在用带质量标签的SBP染色之后)。该化合物可以是吸收激光烧蚀波长(诸如非UV波长(例如，绿色或IR))下的光的染料。该化合物可以非特异性地分布在整个样品中。
在某些方面，对侧载片烧蚀可以用于烧蚀样品下面的层以将样品的一部分从载片上抬起，诸如美国专利公开号20160194590所描述的，该专利公开据此以引用方式并入。在某些方面，用于将动能转移到样品(例如，在烧蚀下转变到气态)的化合物可以嵌入样品自身中。
如本文所述，激光可以是飞秒(fs)激光。例如，近IR范围内的fs激光能够以第二谐波工作以提供绿色范围内的激光辐射，或者以第三谐波工作以提供UV范围内的激光辐射。较低波长(诸如绿色或UV)可以允许较高的分辨率(例如，较小的光斑尺寸)。当激光辐射行进穿过样品支撑件以撞击在样品上时，样品支撑件需要对该激光辐射透明。玻璃和二氧化硅对绿光波长是透明的，其中二氧化硅(而非玻璃)对UV也是透明的。为了在允许使用玻璃载片的同时实现高分辨率，IR fs激光能够以第二谐波(例如，大约50％的转换效率)工作，以提供绿色激光辐射。值得注意的是，可商购获得的物镜通常在绿色范围内具有最佳校正。通过绿色激光或UV fs激光实现的分辨率可以是以下尺寸或小于以下尺寸的光斑尺寸：1μm、800nm、500nm、400nm、300nm、200nm、150nm或100nm。
例如，激光***的烧蚀频率在200Hz至100MHz、200Hz至10MHz、200Hz至1MHz、200Hz至100kHz的范围内，在500Hz至50kHz的范围内，或在1kHz至10kHz的范围内。激光的烧蚀频率应当与如上文所讨论的激光扫描***的扫描速率相匹配。
图2示出了其中等离子体(例如，ICP)为水平等离子体的多种配置。激光辐射被描绘为阴影三角形。样品被描绘为安装在较宽的样品载台上。
图2A示出了如先前所做的那样向水平等离子体中喷射羽流的水平载台。图2A示出了从上方采样的水平样品–保持在水平定向的载片(也被描述为盖片或基片)上的样品被烧蚀(从上方，或者从下方穿过基片)并且羽流被向上引导。羽流被捕获在气体流中并且正交转向进入水平等离子体。这可能由于重力而引起再沉积。
图2B示出了从下方采样的配置–通过从下方烧蚀，或通过从上方烧蚀穿过基片，羽流从水平基片被向下引导。羽流被气体流捕获并且正交转向进入水平等离子体。在这种配置中可能不会发生再沉积(例如，由于重力)。
图2C示出了竖直样品。用于烧蚀的光可以被引导穿过基片(从后面)或者从样品侧引导。羽流被水平引导，然后被气体流捕获并直接转移到等离子体中，而无需转向。
图3与图2相似，但示出了其中等离子体(例如，ICP)为竖直等离子体的多种配置。
图3A示出了从上方采样的水平样品–等离子***于样品上方，并且气体流被向上引导。烧蚀光从样品的上方或下方引导，并且羽流被向上投射。羽流被气体流捕获并转移到等离子体中。
图3B示出了从下方采样的水平样品–这里，朝向等离子体的气体流被向下引导，因此等离子***于样品下方。从上方或下方施加的烧蚀光和离开样品向下投射的烧蚀羽流被气体流捕获并直接转移到等离子体中。
图3C示出了从侧面(例如，穿过样品)采样的竖直样品。羽流离开基片的表面，并且在被转向90度进入等离子体之前被气体流捕获，该等离子体可以被向上或向下引导。
本申请的设备可以包括下文描述的一个或多个部件。
这些方面包括用于激光烧蚀质谱流式细胞术分析的方法和***，其中：将激光束的脉冲引导至样品，以便针对这些脉冲中的每个脉冲产生样品羽流；有区别地针对这些脉冲中的每个脉冲捕获每个羽流；将所述有区别地捕获的羽流中的每个羽流转移到电离***；以及在电离***中电离所述有区别地捕获和转移的羽流中的每个羽流，并且产生用于质量分析的离子，以及用于执行该方法的设备。在各种实施方案中，该设备具有用于从样品产生烧蚀羽流的激光烧蚀***，以及适于将激光烧蚀***与该设备的电离***耦合的转移导管。在一些实施方案中，该转移导管可以具有定位在激光烧蚀***内的入口，使得该入口可以被配置用于在烧蚀羽流产生时捕获该烧蚀羽流。气体入口可以耦合到转移导管的入口，用于使气体在两者间穿过，以便将捕获的烧蚀羽流转移到电离***中。在电离***是ICP的情况下，如果转移导管的输出端直接处于ICP的等离子体内，则该导管可以被称为喷射器。下文将分别更详细地讨论激光烧蚀***、电离***和质谱仪的部件。如上文所指出的，本发明的焦点是对将激光烧蚀***连接到电离***的转移导管的修改。
转移导管
转移导管在激光烧蚀***与电离***之间形成连接，并且允许由激光烧蚀***产生的样品材料的羽流从激光烧蚀***传送到电离***。转移导管的一部分(或全部)可以例如通过钻通合适的材料以产生用于运送羽流的内腔(例如，具有圆形、矩形或其他横截面的内腔)而形成。转移导管有时具有在0.2mm至3mm范围内的内径。在一些实施方案中，转移导管的内径沿其长度变化。例如，转移导管的一端可以是锥形的。转移导管有时具有在1厘米至100厘米范围内的长度。在一些实施方案中，长度不超过10厘米(例如，1厘米至10厘米)、不超过5厘米(例如，1厘米至5厘米)，或不超过3厘米(例如，0.1厘米至3厘米)。在一些实施方案中，转移导管内腔沿着从烧蚀***到电离***的整个距离或接近整个距离是直的。在一些实施方案中，转移导管内腔并非在该整个距离上都是直的，而是改变了取向。例如，转移导管可以逐渐转向90度。该配置允许由烧蚀激光烧蚀***中的样品而产生的羽流当转移导管入口处的轴线将笔直向上指向时最初在竖直平面内移动，并且在其接近电离***(例如，ICP焰炬，其通常水平定向以利用对流冷却)时水平移动。在一些实施方案中，转移导管在从羽流穿过其进入或形成的入口孔开始至少0.1厘米、至少0.5厘米或至少1厘米的距离上是直的。在一些实施方案中，转移导管适于最大限度缩短将材料从激光烧蚀***转移到电离***所花费的时间。
该设备的喷射器可以包括本文所述的转移导管。
采样锥入口
转移导管包括激光烧蚀***中的入口，该入口接收从激光烧蚀***中的样品烧蚀的样品材料，并且将其转移到电离***。在一些情况下，激光烧蚀***入口是沿转移导管到达电离***的所有气体流的来源。在一些情况下，从激光烧蚀***接收材料的激光烧蚀***入口是第二“转移”气体从单独的转移流入口开始沿着其流动的导管的壁中的孔(如例如在WO2014146724和WO2014147260中所公开的)。在这种情况下，转移气体在流到电离***的气体中占相当大的比例，并且在许多情况下，构成流到电离***的气体的大部分。包括转移流入口、激光烧蚀***入口并且起始于向电离***运载烧蚀样品材料的转移导管的部件也可以被称为流动池(如WO2014146724和WO2014147260中所述)。
转移流至少完成三项任务：在电离***的方向上冲洗进入转移导管的羽流，并且防止羽流材料接触转移导管的侧壁；在样品表面上方形成“保护区”，并且确保烧蚀羽流在受控气氛下进行；并且增加转移导管中的流速。在一些实施方案中，捕获气体的粘度低于最初转移气体的粘度。这有助于将样品材料羽流限制在转移导管中心的捕获气体中，并且使样品材料羽流在激光烧蚀***下游的扩散最小化(因为在流的中心，传送速率更恒定且几乎持平)。所述气体可以是例如氩气、氙气、氦气、氮气或这些气体的混合物，但又不限于此。在一些实施方案中，转移气体是氩气。氩气尤其适合于在羽流到达转移导管的壁之前停止羽流的扩散(并且还有助于提高其中电离***是基于氩气的ICP的设备中的仪器灵敏度)。捕获气体优选地为氦气。然而，捕获气体可以被其他气体替代或含有其他气体，例如氢气、氮气或水蒸气。在25℃下，氩气的运动粘度(动态粘度/密度)为约1.3E-5m2/s，而氦气的运动粘度为约1.2E-4m2/s。因此，氩气的运动粘度值和氦气的运动粘度值可以相差至少5倍，或至少10倍。在一些实施方案中，捕获气体是氦气，并且转移气体也是氦气。
使用采样锥可以最大限度缩短目标与包括转移气体流的导管之间的距离。由于捕获气体在采样锥的采样点处流过的距离减小，这还导致以较小的湍流改善样品材料的捕获，并且因此减少烧蚀样品材料羽流的扩展。因此，转移导管的入口是采样锥尖端处的孔。采样锥突出到烧蚀室中。
另一种不对称性是由两个椭圆形半部形成的采样锥，这两个椭圆形半部共用共同的高度(z)和一个底部直径(x直径)，但它们在另一个底部(y直径)中存在差别(或者一个椭圆形半部和一个圆形半部)。
所有上述修改均可以存在于单个不对称的采样锥中，如在本发明中使用的。例如，采样锥可以被不对称地截短并且由两个不同的椭圆形锥体半部形成，采样锥可以被不对称地截短并且包括一个或多个孔口，诸如此类。
因此，采样锥适于捕获从激光烧蚀***中的样品烧蚀的材料羽流的全部或部分。采样锥可操作地贴近样品定位，例如通过在激光烧蚀***内操纵可移动样品承载托盘上的样品，如下文更详细地描述的。如上文所指出的，烧蚀样品材料的羽流通过采样锥窄端处的孔进入转移导管。在一些实施方案中，该孔的直径：a)是可调节的；b)大小被确定成在烧蚀羽流进入转移导管时防止对其造成扰动；并且/或者c)约等于烧蚀羽流的横截面直径。在一些实施方案中，该孔的直径介于约100μm至1mm之间。例如，该孔的直径介于约200μm至900μm之间，诸如300μm至800μm。在一些实施方案中，该孔的直径介于约500μm至700μm之间。在一些实施方案中，该孔的直径为约500μm。在一些实施方案中，该孔的直径为约700μm。
锥形导管
在具有较小内径的管中，相同流量的气体以较高的速度移动。因此，通过使用具有较小内径的管，在气体流中运载的烧蚀样品材料的羽流能够以给定的流量更快速地被传送穿过限定的距离(例如，在转移导管中从激光烧蚀***被传送到电离***)。单独的羽流可以被多快地分析的关键因素之一是，在从通过烧蚀产生羽流直到其组成离子被设备的质谱仪部件检测到的时间(检测器处的瞬态时间)期间羽流已经扩散了多少。因此，通过使用窄转移导管，缩短了烧蚀与检测之间的时间，从而意味着扩散减少，因为可以发生扩散的时间较短，最终结果是检测器处每个烧蚀羽流的瞬态时间缩短。较短的瞬态时间意味着每单位时间可以产生和分析更多的羽流，从而产生质量更高和/或更快的图像。
锥形可以包括沿转移导管长度的所述部分，转移导管内径的逐渐变化(也就是说，管的内径(穿过管截取的横截面)沿着该部分从该部分的末端朝向入口(在激光烧蚀***端)到出口(在电离***端)减小)。如图3B和图7C所示，对转移导管的锥形修改适用于本文所述设备的所有实施方案，无论这些实施方案在转移导管的电离***入口端处是包括直接喷射器入口、采用锥，还是任何其他结构。导管在该锥形之前的体积较大有利于限制由烧蚀产生的材料。当烧蚀粒子从烧蚀光斑飞离时，它们以高速行进。气体中的摩擦使这些粒子减慢，但羽流仍可以在亚毫米至毫米尺度上扩散。允许与壁有足够的距离有助于将羽流限制在气体流的中心附近。
由于宽内径部分很短(大约1mm至2mm)，所以它对总体瞬态时间没有显著的贡献，前提是羽流在转移导管的具有较窄内径的较长部分中花费更多时间。因此，较大内径的部分用于捕获烧蚀产物，保持将其限制在气体流速度更均匀的中央流线附近，而较小内径的导管则用于将这些粒子快速传送到电离***。羽流将膨胀至少部分地由粒子尺寸和对气体的选择确定的特定量。喷射器管初始部分的大小可以被确定成使得大部分羽流将落在中央流线附近，从而使得羽流不会由于抛物线流动剖面形成的影响而展宽。喷射器可以包括锥形，该锥形使喷射器管的直径在初始部分之后变窄，例如以提高转移速度。
在一些实施方案中，该锥形起始于电离***入口通向转移导管的50mm之内。在一些实施方案中，该锥形起始于电离***入口的40mm内，诸如电离***入口的30mm内、20mm内、15mm内或10mm内。在一些实施方案中，该锥形起始于电离***入口下游的5mm内、4mm内、3mm内、2mm内或1mm内。在一些实施方案中，该锥形起始于电离***入口下游1mm至2mm处。
大内径部分与小内径区域之间的锥形可以被制得足够平缓，以避免湍流的发生。例如，该锥形可以为至少5度的角度。在一些实施方案中，该锥形的角度可以为至少10度，诸如至少15度、至少20度、至少25度或30度或更多度，甚至诸如60度。在一些实施方案中，该锥形为小于40度的角度，诸如小于30度、小于25度、小于20度、小于15度或小于10度的角度。在一些实施方案中，该锥形为小于8度的角度，诸如小于5度、小于4度、小于3度、小于2度或小于1度的角度。在一些实施方案中，该锥形的角度介于10度与30度之间。在一些实施方案中，该锥形的角度可以沿该锥形的长度增大或减小。
在一些实施方案中，该锥形的长度为至少5mm，例如至少10mm、至少20mm、至少30mm、至少40mm或至少50mm或至少100mm。在一些实施方案中，该锥形的长度小于10mm，例如小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm或1mm或更小。
转移导管内径在该导管的输入端处可以为x毫米(mm)，但其在输出端附近可以逐渐减小到1/5，即x/5mm(例如，输入端处为4mm，而输出端处为800μm)。在一些实施方案中，该锥形使转移导管的内径减小到大于1/5，诸如1/4或更大、1/3或更大，或者1/2或更大。内径是穿过导管的最长横截面的量度。例如，如果导管是圆形的，则内径就是圆的直径，但如果导管是矩形的，则内径为对角线。在一些实施方案中，该锥形后导管的内径窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm、窄于900μm、窄于800μm、窄于700μm、窄于600μm，或为500μm或更窄。在一些实施方案中，该锥形后导管的内径为400μm或更窄、300μm或更窄、200μm或更窄，或者100μm或更窄。
窄内径部分的直径受到对应于湍流发生的直径的限制。可以计算圆管和已知气体流的雷诺数。一般来讲，高于4000的雷诺数将指示湍流，因此应当避免。高于2000的雷诺数将指示过渡流(介于非湍流与湍流之间)，因此也可能希望避免。对于给定的气体质量流量，雷诺数与导管的直径成反比。因此，在一些实施方案中，转移导管的窄内径部分的内径窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm，但大于该导管中每分钟4升的氦气流量具有大于4000的雷诺数时的直径。
转移导管的恒定直径部分与锥形之间的过渡区域中的粗糙或甚至成角度的边缘可以引起气体流中的湍流。因此，在一些实施方案中，进入和离开该锥形的过渡区域应当具有适于抑制湍流发生的平滑边缘。例如，边缘可以是倒圆的和/或倒角的。
包括锥形导管的设备还可以包括采样锥(任选地是非对称的)。如本领域技术人员将理解的，锥形导管可以用于本文所述的使用替代性转移导管布置的任何设备中，这些替代性转移导管布置如例如图2至图10中所展示，并且如本文在以下部分中所详细讨论。
牺牲流
在较高的流量下，导管中发生湍流的风险增加。在转移导管具有小内径(例如，1mm或小于1mm)的情况下尤其如此。然而，发明人已发现，如果使用轻气体(诸如氦气或氢气)代替传统上用作气体转移流的氩气，则有可能在具有小内径的转移导管中实现高速转移(高达且超过300m/s)。在某些实施方案中，使用主要包含氦气或氢气的气体混合物。
高速转移带来了一些问题，因为其可能导致烧蚀样品材料的羽流穿过电离***而不发生可接受水平的电离。电离水平可能下降，因为增加的冷却气体流降低了焰炬末端处的等离子体的温度。如果样品材料的羽流未被电离至合适的水平，则信息从烧蚀样品材料丢失—因为质谱仪无法检测到它的组分(包括任何标记原子/元素标签)。例如，样品可以在ICP电离***中相当快地穿过焰炬末端处的等离子体，以致等离子体离子没有足够长的时间作用于样品材料以对其进行电离。发明人已发现，由在窄内径转移导管中的高流量高速转移所引起的这个问题可以通过在转移导管的出口处引入流量牺牲***来解决。流量牺牲***适于从转移导管接收气体流，并且仅使该气体流的一部分(该气体流的中央部分包括任何烧蚀样品材料羽流)向前进入通向电离***的喷射器中。为了便于将来自转移导管的气体分散到流量牺牲***中，转移导管出口可以向外呈喇叭形张开。
流量牺牲***靠近电离***定位，使得从流量牺牲***通向电离***的管(例如，喷射器)的长度与转移导管的长度相比较短(例如，约1cm长；转移导管的长度通常为大约数十厘米，诸如约50cm)。因此，从流量牺牲***通向电离***的管内的较低气体速度不会显著影响总转移时间，因为总体传送***的相对较慢的部分要短得多。
因此，本发明提供了一种设备，其包括：
(i)激光烧蚀***，其适于从样品产生样品材料的羽流；
(ii)电离***，其适于接收由激光烧蚀***从样品移除的材料，并且电离所述材料以形成元素离子；
(iii)质谱仪，其用于从所述电离***接收元素离子并且分析所述元素离子，
其中激光烧蚀***和电离***通过转移导管和流量牺牲***耦合在一起，
其中转移导管适于将含有烧蚀样品材料羽流的气体流从激光烧蚀***中的入口运载到流量牺牲***中的出口，
其中该流量牺牲***包括腔室，该腔室包括：
(a)转移导管的出口；
(b)电离***入口，其被定位成从转移导管出口接收样品材料并且将该样品材料引入电离***中；以及
(c)牺牲流出口，
其中流量牺牲***适于通过将进入流量牺牲***的气体流中的一部分引导出牺牲流出口，来使通过电离***入口进入电离***的气体流相比于通过转移导管进入流量牺牲***的气体流减少，并且
其中流量牺牲***中的转移导管的出口任选地呈喇叭形张开。
在一些实施方案中，电离***入口与转移导管出口同轴地定位(因为沿该导管转移的样品材料羽流将被夹带在转移流的中心内)，以使材料从转移导管开始穿过流量牺牲***到电离***入口、并且因此到达电离***喷射器的传输最大化。在一些实施方案中，转移导管的内径与电离***入口的内径之比小于2:1，例如1.5:1或1:1。在一些实施方案中，转移导管的内径与电离***喷射器的内径之比小于2:1，例如1.5:1或1:1。在一些实施方案中，电离***喷射器(或通向电离***的入口)的内径大于转移导管的内径。例如，在一些实施方案中，转移导管的内径与电离***入口的内径之比小于1:1，例如1:1.5或1:2。在一些实施方案中，转移导管的内径与电离***喷射器的内径之比小于1:1，例如1:1.5或1:2。
在大多数布置中，不希望或在一些情况下可能不希望显著增加从流量牺牲***通向电离***的管(例如，喷射器)的直径来作为降低气体速度(以体积流量衡量)的方式。例如，在电离***是ICP的情况下，来自流量牺牲***的导管在ICP焰炬的中心形成喷射器管。当使用较宽内径的喷射器时，信号质量降低，因为烧蚀样品材料的羽流不能被如此精确地喷射到等离子体的中心(这是等离子体的最高效电离部分)。强烈偏好的是内径为1mm或甚至更窄(例如，内径为800μm或更小，诸如600μm或更小、500μm或更小，或者400μm或更小)的喷射器。其他电离技术依赖于材料要在三维空间中相对小的体积内电离(因为电离所必需的能量密度仅能够在小体积中实现)，因此具有较宽内径的导管意味着穿过该导管的样品材料中的大部分处于能量密度足以将样品材料电离的地带之外。因此，在具有非ICP电离***的设备中也采用从流量牺牲***进入电离***的窄直径管。如上文所指出的，如果样品材料的羽流未被电离至合适的水平，则信息从烧蚀样品材料丢失—因为质谱仪无法检测到它的组分(包括任何标记原子/元素标签)。
转移导管的恒定直径部分与出口处的喇叭形之间的过渡区域中的粗糙或甚至成角度的边缘可以引起气体流中的湍流。因此，在一些实施方案中，进入该向外张开的喇叭形的过渡区域应当具有适于抑制湍流发生的平滑边缘。例如，边缘可以是倒圆的。
可以使用泵送来帮助确保牺牲流与进入电离***入口的流之间的所需分流比。因此，在一些实施方案中，流量牺牲***包括附接到牺牲流出口的泵。可以在泵上添加可控限流器以控制牺牲流。因此，在一些实施方案中，流量牺牲***的泵还包括适于控制通过牺牲流出口的气体流的限制器。在一些实施方案中，流量牺牲***包括适于控制限流器的质量流量控制器。
在使用昂贵气体的情况下，可以使用已知的气体净化方法对从牺牲流出口泵出的气体进行清洁并且将其再循环回到同一***中。如上文所指出的，氦气特别适合作为传送气体，但过于昂贵；因此，减少***中的氦气损耗(即，当氦气被传递到电离***中并电离时)是有利的。流量牺牲***将氦气流分成近轴流和牺牲流。牺牲流可以在***中清洁和再循环，而近轴流(气流的运载来***蚀羽流的夹带粒子的中央部分)将被传递到电离***(例如，ICP焰炬的等离子体)中。来自近轴流的氦气将因回收而损失。因此，在一些实施方案中，气体净化***连接到流量牺牲***的牺牲流出口。在一些实施方案中，气体净化***提供流到设备中的气体的一部分，例如通过进入激光烧蚀***的烧蚀烧蚀室的入口和/或通过转移导管中的入口。
如前所述，较大的转移流量沿转移导管向下输送，并且仅允许该流的中央部分成为喷射器流的将进入ICP焰炬等离子体的那部分。通常，氦气将用作转移流，因为如上文所指出的，其特性非常适合于在长导管上以高速传送羽流材料(即，对于相同的流速(与氩气相比)，触发湍流的可能性较小)。即使结合了从牺牲流中回收利用氦气的气体净化***，继续穿过该流量牺牲***进入电离***的近轴氦气流也将损失。
因此，在一些实施方案中，流量牺牲***适于将进入电离***入口(例如，ICP焰炬电离***的喷射器)的气体流量减小到低于1Lpm，诸如0.5Lpm或更小、0.4Lpm或更小、0.3Lpm或更小，或者0.2Lpm或更小。在一些实施方案中，ICP喷射器包括第二入口，气体可以流入该第二入口以补充喷射器中的流量。在一些实施方案中，第二入口包括围绕喷射器附接到电离***入口的同心管，其将补充气体作为鞘流引入来自流量牺牲***的包含样品的气体流周围。这种补充流入口不同于也在支持等离子体的中部同心管和外部同心管中提供的氩气流。该喷射器也可以被称为双同心喷射器。
包括流量牺牲***的设备还可以包括如上所述的采样锥(任选地不对称)或锥形导管。在一些实施方案中，该设备包括如上所述的流量牺牲***、采样锥(任选地不对称)和锥形导管。如本领域技术人员将理解的，流量牺牲***可以用于本文所述的使用替代性转移导管布置的任何设备中。
激光烧蚀***
激光烧蚀***(也称为“烧蚀单元”或“激光烧蚀源”)在烧蚀期间容纳样品。通常，烧蚀单元包括激光透明窗口，以允许激光能量撞击样品。任选地，烧蚀单元包括用于固持待分析样品的载台。在一些实施方案中，该载台可在x-y或x-y-z维度上移动。在本文的附图和实施例中，激光烧蚀***有时被示为开放式布置。然而，此类配置仅用于说明，并且应当理解，存在用于防止来自周围环境的污染或渗入的某种形式的合适的封壳。例如，配置有气体入口和/或光学端口的腔室可以布置在激光烧蚀***周围，以提供适用于捕获和转移烧蚀羽流以供质量分析的封闭环境。气体入口和光学端口被定位成使得激光束、样品、羽流膨胀和转移导管的取向适用于本文所公开的方法和装置。应当理解，烧蚀单元通常是气密的(设计的出口和端口除外)。即使烧蚀室在工作之前包括空气，它也可以从环境中充分封闭，使得气体流(例如，穿过样品腔室的捕获气体和/或进入烧蚀单元的喷射器管中的转移气体)可能足以减少样品运行期间来自空气的污染。然而，初始存在空气可能提供影响灵敏度和/或信号漂移的湿度水平。本申请的激光烧蚀***可以具有图2、图3或图4中的一者或多者所示的气体流。
用于根据本发明的激光烧蚀的激光通常分为三类：飞秒脉冲激光、深紫外脉冲激光，以及波长被选择用于烧蚀材料中的高吸收的脉冲激光(“波长选择性激光”)。深紫外激光和波长特定激光将可能以纳秒或皮秒脉冲工作。每一类激光都有其缺陷和益处，并且可以基于特定的应用来选择。在一些实施方案中，激光是飞秒脉冲激光，其被配置为以介于10Hz与10000Hz之间的脉冲速率工作。飞秒激光是已知的(参见例如，Jhanis等人，“Rapidbulk analysis using femtosecond laser ablation inductively coupled plasmatime-of-flight mass spectrometry”J.Anal.At.Spectrom.,2012,27:1405-1412)。
飞秒激光允许激光烧蚀几乎所有的材料，且激光烧蚀的唯一先决条件是足够大的功率密度。当光束被紧密聚焦例如至1微米直径并且持续时间短(时间集中)时，即便用相对低的脉冲能量也可以实现这一点。深紫外激光也可以烧蚀一大类材料，因为大多数常用的材料都吸收深紫外光子。波长选择性激光烧蚀可以利用具有目标是基片材料中的吸收的特定激光波长的激光。波长特定激光的益处可以是激光和光学***的成本低且容易实现，尽管基片材料的光谱更为有限。合适的激光可以具有不同的工作原理，诸如固态激光(例如Nd:YAG激光)、准分子激光、光纤激光和OPO激光。
飞秒激光辐射的有用特性是仅在达到阈值功率密度的情况下才被吸收。因此，会聚的飞秒激光辐射可以穿过较厚的材料部分而不会被吸收或造成任何损坏，但仍正好在出现焦点的表面上烧蚀相同的材料。然后，随着样品层被烧蚀，焦点可以在材料内部逐渐移动。纳秒激光脉冲可能被基片部分吸收，但仍可以用于烧蚀，因为焦点处的能量密度将是最高的(只要其足以用于烧蚀)。
以这种方式产生的信号的空间分辨率取决于两个主要因素：(i)激光的光斑尺寸，因为信号在被烧蚀的总面积上积分；以及(ii)相对于产生羽流的速度，可以对羽流进行分析的速度，以避免来自连续羽流的信号发生重叠，如上文所讨论的。被称为光斑尺寸的距离对应于光束的最长内部尺寸，例如对于圆形光束，它是直径2μm的光束，而对于正方形光束，它对应于相对角之间的对角线的长度。激光脉冲可以使用孔成形、使用光束均化器均化(如果需要)、聚焦(例如使用物镜)，以产生期望的光斑尺寸。通常，光斑尺寸为100μm或更小，诸如50μm或更小、25μm或更小、20μm或更小、15μm或更小，或者10μm或小于10μm。示例性光斑尺寸包括在以下范围内的直径(或者其他形状的等同尺寸烧蚀区域)：0.10μm至3μm(例如，约0.3μm)、1μm至5μm(例如，约3μm)、1μm至10μm(例如，约1μm、约2μm、约3μm、约4μm或约5μm)、小于10μm和小于5μm。在具体实施方案中，激光***被配置为用充分聚焦的激光脉冲工作，以烧蚀约1μm(例如，100nm至1μm)数量级的样品区域。
为了分析各个细胞，激光烧蚀***中的激光具有不大于这些细胞的光斑尺寸。该尺寸将取决于样品中的特定细胞，但一般来讲，激光光斑因此将具有小于4μm(例如，在0.1μm至4μm、0.25μm至3μm，或者0.4μm至2μm范围内)的直径。因此，激光光斑可以具有以下直径：约3μm或更小、约2μm或更小、约1μm或更小、约0.5μm或小于0.5μm，诸如约400nm或更小、约300nm或更小、约200nm或更小、约100nm或小于100nm。为了以亚细胞分辨率分析细胞，本发明使用不大于这些细胞的激光光斑尺寸，并且更具体地使用能够以亚细胞分辨率烧蚀材料的激光光斑尺寸。有时，单细胞分析可以使用大于细胞尺寸的光斑尺寸进行，例如，当细胞在载片上铺开时，细胞之间具有空间。此处，可以使用较大的光斑尺寸并且实现单细胞表征，因为感兴趣细胞周围的附加烧蚀区域不包含附加的细胞。因此，可以根据被分析细胞的尺寸适当地选择所使用的特定光斑尺寸。在生物样品中，细胞很少会全部具有相同的尺寸，因此，如果需要以亚细胞分辨率成像的话，倘若在整个烧蚀过程中维持恒定的光斑尺寸，则烧蚀光斑尺寸应当小于最小的细胞。可以使用较宽激光束和近场光学器件的缩小来实现小光斑尺寸。1μm的激光光斑直径对应于1μm的激光聚集点(即，光束焦点处的激光束直径)，但是由于目标上能量的空间分布(例如，高斯光束形状)和总激光能量相对于烧蚀阈值能量的变化，激光聚集点可以变化±20％或更多。例如，使用25μm直径的激光束，并且使其在组织样品上缩小到1/25，将得到直径为1μm的光斑尺寸。
这种小尺度的烧蚀产生极少量的羽流材料，这进而确保羽流的尺寸保持较小。较小的羽流更可能保持在捕获流的中间，而不接触烧蚀单元或转移导管的壁。1微米尺度上的烧蚀还意味着烧蚀表面与其中羽流膨胀减缓且变得受环境气体支配的区域之间的距离非常短。该距离可以在几微米至几百微米的范围内。在本发明的一些版本中，在羽流停止膨胀的位置存在捕获流。因此，为了说明而非限制的目的，若干幅附图示出了烧蚀表面与具有捕获流的区域之间的距离，该距离被示为约100微米。
虽然1微米(或更小)尺度上的烧蚀对于某些应用(例如，成像)是有利的，但是当产生较大的烧蚀光斑(诸如在约5微米至约35微米直径范围内(例如在5微米至15微米、10微米至20微米、15微米至25微米、20微米至30微米和25微米至35微米范围内)的烧蚀光斑)时，本发明的方法和仪器也是有用的。在其中产生大烧蚀光斑的一些应用中，仅一部分羽流材料被捕获。
在一些实施方案中，激光器位于烧蚀室之外，并且激光束(激光能量)例如穿过光学窗口进入烧蚀室。如本文所用，激光束可以被描述为从一个表面(例如，激光透镜或反射镜)发射，该表面可以被定向成将光束引导至特定的位置或位置类型。为了便于本发明的描述，可以认为被引导的光束具有特定的取向；该光束的取向可以指与光束齐平并且越过实际光束延伸(例如当光束撞到不透明表面时)的假想线。如根据上下文将显而易见的，提及激光束的取向或位置有时是指，在使用激光时，无功率激光***的光束将产生的取向或位置。
为了快速分析组织样品，需要高烧蚀频率，例如超过20Hz(即，每秒超过20次烧蚀，从而每秒获得超过20个羽流)。在一些实施方案中，激光烧蚀的频率是至少40Hz，诸如至少50Hz或至少100Hz。在一些实施方案中，激光烧蚀的频率在40Hz至2000Hz范围内、在40Hz至1500Hz范围内、在40Hz至500Hz范围内、在40Hz至200Hz范围内、在40Hz至150Hz范围内，或者在75Hz至150Hz范围内。超过40Hz的烧蚀频率允许在合理时间内实现典型组织样品的成像。激光脉冲可以被引导为样品上的光斑(假设材料在该光斑处被完全烧蚀)并且仍然被单独分辨的频率决定了可以获得图像像素的速度。因此，如果在一个点处烧蚀材料所需的激光脉冲持续时间意指每秒只能将少于5个脉冲引导至样品上，则研究以1μm的光斑尺寸烧蚀1mm×1mm区域所花费的时间将超过两天。在40Hz的速率下，该时间将为约6至7小时，随着脉冲频率进一步增加，分析时间进一步缩短。在这些频率下，如果期望单独地分辨每个烧蚀羽流，则仪器必须能够足够快地分析烧蚀材料，以避免连续烧蚀之间的显著信号重叠。优选的是，源自连续羽流的信号之间的重叠的强度小于10％，更优选地小于5％，并且理想地小于2％。分析羽流所需的时间将取决于烧蚀室的冲洗时间(参见下文的烧蚀室部分)、样品材料羽流到达并穿过电离***的渡越时间(上文讨论了向电离***传送的优化方案)，以及分析电离材料所花费的时间。每个激光脉冲均可以与随后构建的样品图像上的一个像素相关联，如下文更详细讨论的。
烧蚀室
具有短冲洗时间(例如，100ms或更短)的烧蚀室(其在本文中也可以被称为样品腔室)对于与本发明的设备和方法一起使用是有利的。具有长冲洗时间的单元将限制图像能够生成的速度，或者将导致源自连续样品光斑的信号之间发生重叠(例如，Kindness等人，(2003)Clin Chem49:1916-23，其信号持续时间超过10秒)。因此，在不增加总扫描时间的情况下，样品材料羽流从激光烧蚀单元的冲洗时间是实现高分辨率的关键限制因素。冲洗时间≤100ms的烧蚀室是本领域已知的。例如，Gurevich和Hergenroder(2007)JAnal.At.Spectrom.,22:1043-1050公开了冲洗时间短于100ms的烧蚀室。参考文献Wang等人，(2013)Anal.Chem.85:10107-16(还可参见参考文献WO 2014/146724)中公开了一种烧蚀室，其具有30ms或更短的冲洗时间，从而准许高烧蚀频率(例如，高于20Hz)，因此准许进行快速分析。另一种这样的烧蚀室公开于参考文献WO2014/127034中。本文献中的烧蚀室包括样品捕获单元，该样品捕获单元被配置为可操作地布置在目标附近(这里描述的样品捕获单元是转移导管入口修改的示例，该修改可以与如上所述的转移导管的锥形和流量牺牲修改相结合)，该样品捕获单元包括：捕获腔，该捕获腔具有形成在捕获单元表面中的开口，其中该捕获腔被配置为通过该开口接收从激光烧蚀位点喷射或产生的目标材料；以及导向壁，该导向壁暴露在捕获腔内并且被配置为将捕获腔内的运载气体(在本文中也被称为捕获气体)流从入口引导至出口，使得捕获腔内所接收的目标材料的至少一部分可作为样品转移到出口中。参考文献WO 2014/127034的烧蚀室中的捕获腔的体积小于1cm3，并且可以小于0.005cm3。有时，烧蚀室的冲洗时间为25ms或更短，诸如20ms或10ms或更短。转移导管的采样锥入口(例如不对称的采样锥)也可以有助于缩短烧蚀室的冲洗时间，因此是这里所讨论的捕获单元的替代方案。
图4示出了包括激光烧蚀室的现有LA-ICP-MS***。该烧蚀室可以包括用于定位样品的可移动样品载台。气体源可以提供捕获气体，该捕获气体流过烧蚀室并且将烧蚀羽流运载到通向ICP焰炬的喷射器管(本文也称为喷射器或转移导管)中。喷射器管可以具有在烧蚀室与ICP焰炬之间的柔性管件，或者可以是刚性的和/或直的。在某些方面，喷射器可以与样品正交，并且与图2或图3所示的气体流成一直线。LA-ICP-MS***可以包括一个或多个用于供应转移气体和/或内部气体和外部气体(也称为辅助气体和等离子体气体)的附加气体源。在某些方面，喷射器管可以在引入喷射器管的激光烧蚀羽流的下游接收补充气体。一个或多个气体流可以包含氢。例如，气体流可以包含如本文进一步描述的水蒸气或醇蒸气。替代性地或除此之外，气体流可以来自如本文进一步描述的预混合压缩气体源，该预混合压缩气体源包含氢(诸如氢气、氨气或甲烷)。
在某些方面，激光烧蚀室可以包括捕获气体(其进入烧蚀室并且将烧蚀羽流运载到喷射器管中)并且任选地还可以包括转移气体(即，其在烧蚀羽流的上游进入喷射器)。喷射器还可以包括补充气体(即，其在烧蚀羽流进入喷射器的位置下游对喷射器中的气体进行补充)。ICP焰炬可以包括内部气体(即，辅助气体，其流向ICP焰炬的内管)和外部气体(即，等离子体气体，其流入ICP焰炬的外管)。可以存在附加的气体流。在某些方面，如本文进一步描述的，可以将氢(例如，氢气或水蒸气)引入上述气体流中的一者或多者中。
电离***
样品材料可以通过多种技术电离，诸如在等离子体中电离。使用ICP适合于IMS分析和IMC分析。ICP是其中能量由通过电磁感应产生的电流供应的等离子体源。通常，等离子体源基于氩气。例如，电离***可以包括ICP焰炬。在电离***中使用ICP的IMC在以下文献中报道过：例如，Giesen等人，(2014)Nature Methods.11:417-422以及Wang等人，(2013)Anal.Chem.85:10107-16。
因此，电离***从激光采样***接收样品材料，并且将其转换成元素离子，以供质谱仪检测。如果样品材料未被雾化(例如，样品材料的羽流仍然是分子的形式，或者甚至是颗粒材料的气溶胶)，则作为电离过程的一部分，电离***起作用以将材料分解成元素离子。
质谱仪
如上文所指出的，该设备的第三部件是质谱仪。在本发明中使用的质量分析仪可以基于操作者的需要或特定的应用来选择。示例性类型的质量分析仪包括四极杆质谱仪、飞行时间(TOF)质谱仪、磁扇区质谱仪、高分辨率质谱仪、基于单接收器或多接收器的质谱仪。
分析电离材料所花费的时间将取决于用于检测离子的质量分析仪/质谱仪的类型。例如，使用法拉第杯的仪器对于分析快速信号可能太慢，但并非所有的分析都需要对信号进行快速分析，因此本领域技术人员将能够适当地选择质谱仪或质量分析仪。总而言之，期望的分析速度(以及因此可以询问烧蚀羽流的频率)和复用程度(要同时/准同时监测的原子的数量)将决定应当使用的质量分析仪的类型(或者相反地，对质量分析仪的选择将确定可以实现的速度和复用)。
通常，飞行时间质谱仪用于记录快速瞬时事件，这些快速瞬时事件具有从快速激光烧蚀装置预期的运送持续时间。
TOF检测器可以准同时地记录单个样品中的多个质量。尽管TOF质量分析仪由于处理TOF加速器和飞行管中的空间电荷效应所需的折衷而对于原子分析通常是不受欢迎的，但是通过仅使用它来检测范围的子集，可以提高该技术的有效性。例如，在质谱流式细胞术和成像质谱流式细胞术中，可以选择范围，使得仅检测来自用于标记生物样品中的目标分子的标记原子的离子，并且因此可以去除其他原子(例如，原子质量低于80的那些)。这导致质量富集在(例如)80至210道尔顿区域的密度较小的离子束，该离子束可以被更有效地操纵和聚焦，从而有利于TOF检测并且利用TOF的高光谱扫描速率。因此，通过将TOF检测与选择在样品中不常见并且理想地具有比在未标记样品中所见的质量高的质量的标记原子(例如通过使用质量较高的过渡元素)结合，可以实现快速分析。关于质谱流式细胞术的进一步细节可以在以下文献中找到：Tanner等人，Cancer Immunol Immunother(2013)62:955-965以及美国专利号7,479,630；并且关于成像质谱流式细胞术的进一步细节可以在以下文献中找到：Giesen等人，(2014)Nature Methods.11:417-422。
使用中的设备和可以应用上述转移导管修改的本发明的附加变型
本发明的设备可以用于对生物样品进行分析或成像，该生物样品可以在透明基片上。在成像实施方案中，通常激光能够用连续脉冲串或以脉冲群来工作，所述脉冲串或脉冲群被引导至样品的不同位置，这些位置被称为“感兴趣的光斑”或“烧蚀位置或地带”。脉冲可以被引导至设定图案(诸如用于二维成像的光栅)中的光斑。替代性地，可以在不同的位置处烧蚀多个单独的光斑(例如，对应于单独的细胞)。在一些实施方案中，激光器发射脉冲群，从而产生来自相同像素(即，目标上的相同位置)的羽流。由脉冲群内的各个脉冲产生的烧蚀羽流预期融合成一个羽流，并且在仪器内以它们将与从另一像素产生的羽流不同的方式行进。为了区分各个像素，脉冲群(可以是仅一个脉冲或100个脉冲的像素询问)之间的持续时间被保持大于特定限值，该特定限值由来自各个像素的离子信号(在检测器处)的时间扩展确定。
根据本发明教导内容，每个单独的样品羽流可以通过质量分析仪区别性地分析。在一个方面，所述装置被配置为使得羽流在烧蚀单元(烧蚀***)和转移导管中的扩展小于在电离***和质量分析仪中发生的扩展。在一个方面，可以通过在以下时间段内将每个烧蚀羽流转移至电离***而区别性地分析羽流，该时间段在羽流到达电离***和质量分析仪进行的离子检测的累积渡越时间内。这可以借助通过气体流捕获每个样品羽流，并且在使得转移时间段(即，烧蚀羽流从烧蚀位点转移至等离子体)期间的羽流展宽与离子渡越时间段(即，离子从等离子体转移至质量分析仪)期间的展宽之间的比率等于或小于1的转移配置下实现。
通常，电离***(例如，ICP)为了分析检测的目的可以有效地气化并电离的样品的粒子尺寸限值为约10μm数量级或更小。通过1微米尺度上的激光烧蚀所产生的粒子小于1微米，并且非常适合于ICP离子源。对于离散粒子的分析(诸如可以使用Fluidigm CanadaInc.的
仪器来进行)，这些粒子可被电离和分析性检测的典型速率可以是粒子正在被蒸发和电离时样品在等离子体中的渡越时间的累积展宽或扩展以及在ICP与其由质量分析仪进行的检测之间的离子渡越时间的展宽或扩展的函数。通常，累积时间展宽或扩展可以具有约200μs数量级的持续时间。因此，对于空间上分开的10μm或更小的粒子，分析每个不同的粒子可以通过在约200μs的时间段内将每个粒子转移至电离***(例如，ICP)来实现。在一些实施方案中，粒子以小于200μs或小于150μs的尺寸被转移至电离***(例如，ICP)。因此，在其中可以通过激光烧蚀进行生物样品成像的样品引入***中，激光***可以被配置为以足够聚焦的激光脉冲工作，以烧蚀约1μm数量级的样品区域，诸如飞秒脉冲激光的应用。在采用这种配置时，由每个激光脉冲形成的烧蚀羽流可以包括具有通常约1μm或更小的尺寸的样品颗粒。在如本文所述的某些条件下，这些颗粒可以被捕获并被转移以满足所要求的转移时间段，并且随后，每个不同的羽流可以被电离***有效地气化和电离。
除此之外，当以连续的一连串脉冲操作激光器时，诸如在样品表面上进行光栅化以便二维成像的情况下，可以在羽流的形成地带与电离***离子源中的气化和电离点之间保持每个羽流的独特性和每个随后的羽流之间的空间分离。例如，当羽流被运载通过导管时，羽流中的粒子在进入电离***(例如，ICP的等离子体)之前可以在径向方向上向外扩展和膨胀。羽流中产生的粒子的扩展可以取决于当羽流形成时和当羽流在运送至电离***期间演变时羽流的扩散系数、载体流的速度剖面以及粒子密度的分布。例如，1μm的飞秒激光烧蚀光斑尺寸可以产生初始横截面直径为约100μm或更小的羽流，之后该羽流在其运送期间进一步扩展。羽流扩展的程度还可以是烧蚀粒子尺寸的函数；较大的粒子倾向于具有较低的扩散，但具有较高的动量，从而由于接触转移导管/喷射器管的内壁而导致潜在的损失。由此，在扩展的程度呈现任何具有挑战性的影响之前，期望最小化羽流扩展并且/或者将羽流在足以气化和电离的时间内转移至电离***。
因此，在各种实施方案中，激光用于烧蚀1μm的样品光斑并有效地传送羽流使得扩展保持在转移导管/喷射器管的内径内的用途可以通过本文所述和附图中的示例性布置来实现。
对于给定的激光烧蚀***和给定的样品，在激光烧蚀之后，烧蚀羽流膨胀直到它们达到称为“采样体积”的特征性体积为止。希望配置该***以最小化采样体积并且增大气体流运载羽流远离采样体积的速度。小采样体积和快速气体流的组合减小了羽流转移到转移导管/喷射器中的时间扩展。采样体积可以由任何维度上的羽流膨胀速度大幅下降(降至约1/10)至低于周围气体介质的声速的时刻该羽流的包络来描述。非限制地，示例性采样体积可以在10-6mm3至10mm3的范围内。通常，采样体积在0.001mm3至1mm3的范围内。捕获流(当存在时)流入采样体积的至少一部分，并且运载羽流的至少一部分进入转移导管/喷射器，随之它可以被转移流传送到电离***(例如，ICP)。期望的是，当捕获流进入采样体积时其速度相当大(例如，>1m/s、>10m/s、>100m/s或>500m/s)。在一些实施方案中，当捕获流进入采样体积时其速度可以通过测量捕获流进入转移导管/喷射器(例如，通过转移导管/喷射器孔)的速度来估计。在一些实施方案中，该测量的速度为>1m/s、>10m/s、>100m/s或>500m/s。与本发明相比，如果羽流未被迅速扫除，则其将继续膨胀并扩散，从而充满整个烧蚀单元，这是不期望的。
在一个方面，本发明提供了一种激光烧蚀配置，其中激光束被引导至目标。在一个实施方案中，目标包括基片和设置在基片上的样品。在一个实施方案中，基片是透明的，并且目标是透明目标。
在一个方面，本发明提供了一种用于“穿透目标”烧蚀的激光烧蚀配置。在该配置中，激光束的脉冲被引导穿过透明目标，并且样品羽流(“烧蚀羽流”或“羽流”)在光束下游形成并进入转移导管/喷射器中。由于从羽流的直线路径中移除了光学元件(窗口、物镜等)，所以穿透目标照射对于优化渡越时间展宽是有利的。在一个方面，本发明提供了一种激光烧蚀***，其包括：(a)能够产生激光照明的激光器；(b)激光烧蚀单元(或激光烧蚀***)，透明目标可以被引入其中，以及转移导管/喷射器，该转移导管/喷射器具有烧蚀羽流可以穿过其中进入的开口，其中激光照明源自透明目标一侧的表面，而转移导管/喷射器开口在另一侧。可以被包括在***中的其他特征在整个本公开(包括实施例)中描述。
在某些方面，较小的烧蚀光斑尺寸(较高的分辨率)可以采用高数值孔径透镜(诸如浸没透镜)来实现。这样的浸没透镜可以被配置用于穿透目标烧蚀(例如，薄样品，诸如直径小于500nm的组织切片)。
因此，在根据本发明的一种设备的操作中，样品被放入该设备中，使用包括光学器件的激光***对样品采样以产生电离材料，在所述光学器件中，激光辐射穿过浸没透镜被引导至样品上(采样可以产生蒸气/颗粒材料，其随后被电离***电离)，然后样品材料的离子被传递到检测器***中。
本发明通过利用浸没介质克服了传统IMC和IMS的局限性。浸没介质具有大于1.0的折射率，并且被置于物镜与样品载台之间。以这种方式，本发明的设备实现了大于1.0的数值孔径，因此激光的光斑尺寸小于200nm、小于150nm或小于100nm。所以，本发明提供了一种用于以200nm或更佳、150nm或更佳、或者100nm或更佳的空间分辨率实施成像质谱流式细胞术的设备。
因此，在操作中，样品载台固持样品，通常其中样品在样品载体上，并且同一个载台固持该样品载体。然后，激光辐射被引导穿过设备的光学器件、穿过物镜和浸没介质到达样品，其中该辐射从样品烧蚀材料。
为了实现激光的最佳聚焦条件，本发明的浸没介质的折射率大于1.00，诸如1.33或更大、1.50或更大、2.00或更大，或者2.50或更大。
此外，为了重建生物细胞的单层厚度(或小于厚度)的图像，或者逐层地读取较厚的样本并产生3D图像，如本文进一步讨论的，样品优选地具有以下厚度：100微米或低于100微米，诸如10微米或低于10微米、5微米或低于5微米、2微米或低于2微米，或者100nm或低于100nm，或者50nm或低于50nm，或者30nm或低于30nm。在本文更详细地描述的一些实施方案中，物镜和浸没介质的组合被称为浸没透镜。
当使用液体浸没介质时，样品需要被定位在样品载体的与液体介质相对的一侧(如图3所展示)，使得运载气体可以收集烧蚀材料。因此，这里必须应用穿透样品载体烧蚀技术。这具有附加的益处，即，对于烧蚀材料收集硬件而言可实现的工作距离较小，并且不需要弯曲样品腔室与检测器之间的传送导管。这还导致瞬时时间的缩短，从而增大以每秒的光斑计的可实现的烧蚀速率。
因此，本发明提供了一种设备，其中固体浸没介质是半球状固体浸没透镜或Weierstrass固体浸没透镜。生物样品可以安装在样品载台的与固体浸没材料相对的一侧。其上安装样品的载台可以由与固体浸没透镜相同折射率的材料制成，并且固体浸没透镜可以被制得更薄(其厚度等于基片的厚度)，以维持焦斑位置。
在各种实施方案中，感兴趣的样品可以通过使用被格式化为与透明目标相容的样品来被配置用于激光烧蚀。样品可以被放置到透明基片上、被结合到透明基片中，或者可以被制成透明目标。合适的激光透明基片可以包含玻璃、塑料、石英和其他材料。通常，基片基本上是平面的或平坦的。在一些实施方案中，基片是弯曲的。在某些实施方案中，基片的厚度为0.1mm直到3mm。在一些实施方案中，基片被编码(参见例如Antonov,A.和Bandura,D.,2012，美国专利公开2012/0061561，其以引用方式并入本文)。在该配置中，激光束的脉冲被引导穿过透明目标，并且样品羽流(“烧蚀羽流”或“羽流”)在光束下游形成并进入转移导管/喷射器中。
该转移导管(即，喷射器管)可以具有被配置为捕获烧蚀羽流的入口；诸如，被制成具有小开口或孔的采样锥的入口。在该配置中，采样锥可以定位在形成羽流的区域或地带附近。例如，采样锥的开口可以定位成距离透明目标10μm至1000μm，诸如离开透明目标约100μm远。因此，烧蚀羽流可以至少部分地在采样锥的膨胀区域内产生和形成。在一些实施方案中，孔的直径和/或间隔的尺寸(包括角度)是可调节的，以准许在各种条件下进行优化。例如，对于具有100μm尺度的横截面直径的羽流，孔的直径的大小可以被确定成约100μm，具有足够大的间隙以防止在羽流经过时对其造成扰动。
转移导管可以在采样锥的下游继续，以便在这样的配置下接收烧蚀羽流，从而促进羽流的移动并且保留作为激光脉冲的函数的每个随后的羽流的空间独特性。因此，可以引入气体流以帮助引导羽流穿过采样锥的孔，以便有区别地捕获(捕获流)每个羽流，同时可以将附加气体流引入转移导管/喷射器，以用于朝电离***转移(转移流或鞘流)每个被区别性地捕获的羽流。转移流或鞘流的另一个功能是防止羽流中产生的粒子接触转移导管/喷射器的壁。所述气体可以是例如氩气、氙气、氦气、氮气或这些气体的混合物，但又不限于此。在一些实施方案中，气体是氩气。捕获流气体和转移流气体可以相同或不同。
选择或确定适用于本发明的气体流量在本公开所指导的本领域普通技术人员的能力范围内。通过转移导管的总流量通常由电离源(例如，ICP电离源)的要求来决定。激光烧蚀设置需要提供将符合这些要求的流量。例如，转移导管可以具有1mm或更小的内径，任选地与约1升每分钟的累积气体流量(0.1升每分钟的捕获流加上0.9升每分钟的转移流)结合。可以预期的是，更小或更大直径的转移导管连同相应选择的气体流量可以应用于呈现类似预期结果的各种几何结构。为了保持每个单独烧蚀羽流的独特性，期望的是在转移导管内具有用于维持非湍流气体动力学的条件。
如本文所述，在给定的元件特定配置(例如，气体入口位置、孔、转移导管特性和其他元件的特定配置)下，选择捕获流量和转移流量以导致每个烧蚀羽流在某个时间段内转移到电离***(例如，ICP)，该时间段在羽流处于电离***与质量分析仪对其进行的检测之间的累积渡越时间内。这可以借助通过气体流捕获每个样品羽流，并且在使得转移时间段期间的羽流展宽与离子渡越时间段期间的展宽之间的比率等于或小于1的转移配置下实现。也就是说，运送信号的时间展宽(或时间扩展)很重要。ICP-MS装置(诸如
ICP-TOF仪器，Fluidigm Canada Inc.)的特征在于该信号的固有展宽。就激光烧蚀而言，喷射单个羽流的动作可能比ICP-MS自身的时间扩展快，也可能不比其快。电离前羽流的扩展取决于激光烧蚀***的设计，并且特别地取决于烧蚀室和转移导管的设计。希望激光烧蚀***和转移导管不比其余仪器的固有展宽更多地扩展初始烧蚀羽流。该条件确保由烧蚀羽流产生的检测信号中的尖峰与其对于所选择仪器可能有的形态一样锐利(及时地)。如果羽流的扩展比例如ICP-MS***中的扩展长得多，则来自单个脉冲的激光烧蚀事件将在检测器处以宽得多的形态呈现。但是，如果激光烧蚀区段中的扩展小于仪器扩展，则总扩展将受仪器扩展支配。因此，可以使用校准珠测量仪器扩展，然后测量来自单个激光脉冲的总扩展，并且对这两个数值进行比较。如果来自激光烧蚀的扩展小于来自仪器的扩展，则总扩展将小于仪器扩展的2倍。
特征性仪器时间展宽可以通过实验来测量，例如使用标记的细胞或校准珠。在单颗珠进入质谱流式细胞仪(例如，
ICP-TOF仪器)的任何时候，该珠在等离子体中经历蒸发和电离，然后通过质量分析仪直到其信号到达检测器为止。瞬时事件被检测并且用于记录关于特定珠的信息，诸如瞬时信号的宽度(其表示从单个事件开始的时间扩展)以及发生的从ICP源开始并且在检测器处结束的扩展的值。
在一些实施方案中，该装置被配置为允许在样品与质量分析仪的离子检测器之间限定的路径具有介于10微秒与1000微秒之间的时间扩展。
典型捕获流量在0.1Lpm至1Lpm范围内。最佳捕获流量可以通过实验来确定，但通常在该范围的下端(例如，约0.1Lpm)。典型转移流量在0.1Lpm至1Lpm范围内。最佳转移流量可以通过实验来确定，但通常在该范围的上端(例如，约0.9Lpm)。在一些实施方案中，捕获流量低于转移流量。在某些情况下，例如，如果捕获流量为大约1Lpm，则转移流量可以为0。通常，转移流量在0.4Lpm至1Lpm范围内(例如，0.4Lpm、0.6Lpm、0.8Lpm或1Lpm)。
虽然结合各种实施方案描述了本发明教导内容，但是并不意图将本发明教导内容限于此类实施方案。相反，如本领域技术人员所理解的，本发明教导内容涵盖各种替代方案、修改方案和等同方案。例如，在附图所展示的各种实施例中，转移导管/喷射器管通常一直被描述为具有1mm的内径，结合约1升每分钟(0.1+0.9升每分钟)的累积气体流量。可以预期的是，更小或更大直径的转移导管/喷射器连同相应选择的气体流量可以应用于呈现类似预期结果的各种几何结构。然而，为了保持每个单独烧蚀羽流的独特性，可能期望的是在喷射器管内具有用于维持非湍流或近似非湍流气体动力学的条件。
此外，在激光脉冲速率升高的一些情况下，可以在如上文所讨论的累积渡越时间扩展内区别性地捕获多于一个烧蚀羽流并将其转移到电离***(例如，ICP)。例如，在10kHz的重复率下，脉冲激光可以在200μs内产生两个烧蚀羽流，其随后可以转移到ICP进行电离。由这两个离散羽流产生的离子可以作为单一的离散离子包被质量分析仪分析。因此，虽然激光保持在同一烧蚀光斑处，或者虽然激光在连续光斑的迹线上的移动速率小于重复率，但烧蚀羽流和随后的离子可以分别提供同一烧蚀光斑处的累积质量分析或提供沿着该迹线的平均质量分布。应当指出的是，可以采用高达几MHz的激光重复率，从而产生代表许多激光脉冲的平均值的信号。激光还能够以脉冲群的形式激发，以便在各个采样位置(或像素)之间的数据流中提供间隙。
应当理解，本发明的方法和装置可以与多种类型的样品中的任一种(例如，生物样品)一起使用。在一种方法中，样品是细胞材料，诸如组织切片、细胞单层、细胞制备物，等等。样品可以是厚度最多至100微米的切成薄片的生物组织、毫米数量级厚度的组织样品，或未切片的组织样品。在一个示例中，可以使用薄组织切片(诸如石蜡包埋的切片)。为了说明的目的，一些组织切片具有10纳米至10微米的厚度。在某些情况下，样品是一组细胞，或者从一组细胞中选择的一个或多个细胞。参见例如，Antonov,A.和Bandura,D.,2012，美国专利公开2012/0061561，其以引用方式并入本文。
构建图像IMS和IMC可以提供用于羽流中的多个标记原子/元素标签的信号。在羽流中检测到标记揭示了在烧蚀位置(或相应地，材料块的解吸位置)处存在其同源目标。通过在样品表面上的已知空间位置处产生一系列羽流，MS信号揭示了样品上的标记物的位置，因此这些信号可以用于构建样品的图像。通过用可区分的标记物对多个目标进行标记，可以将标记原子的位置与同源目标的位置相关联，因此本发明可以构建复杂的图像，达到远远超过使用现有技术可实现的那些水平的复用水平。例如，可以使用来自KylebankSoftware的GRAPHIS程序包，但是也可以使用其他程序包，诸如TERAPLOT、ImageJ和CellProfiler。使用来自诸如MALDI-MSI等技术的MS数据进行成像是本领域已知的，例如Robichaud等人，(2013)J Am Soc Mass Spectrom 24(5):718-21公开了在Matlab平台上查看和分析MS成像文件的“MSiReader”界面，并且还存在用于以全空间和光谱分辨率进行快速数据探查以及2D和3D MSI数据集可视化的仪器，例如“Datacube Explorer”程序。
样品
本发明提供了一种对样品成像的方法。所有种类的样品都可以通过这些方法来分析，包括合金、地质样品和考古样品。还可以对生物样品进行分析。此类样品包括多个细胞，多个这些细胞可以经受IMS和/或IMC，以便提供样品中这些细胞的图像。一般来讲，本发明可以用于分析目前通过IHC技术来研究的组织样品，但使用了适于由IMC检测的标记物。
可以对任何合适的组织样品进行分析。例如，组织可以是上皮组织、肌肉组织、神经组织等，以及它们的组合。出于诊断或预后目的，组织可以来自肿瘤。在一些实施方案中，样品可以来自已知的组织，但可能不知道该样品是否含有肿瘤细胞。成像可以揭示存在指示肿瘤存在的目标，从而有利于诊断。组织样品可以包含乳腺癌组织，例如人乳腺癌组织或人乳腺上皮细胞(HMLE)。组织样品可以包括***固定的石蜡包埋(FFPE)组织，可以是冷冻组织，或者可以是包埋在合适树脂中的组织。组织可以从任何活的多细胞生物体获得，但通常会是人的组织。
组织样品将通常是例如具有2μm至10μm范围内(诸如介于4μm至6μm之间)的厚度的切片。还可以分析厚度小于2μm(诸如小于1μm、小于500nm、小于250nm，或者甚至为100nm或更小)的较薄组织切片。较薄组织样品将由于稍后的脉冲烧蚀的样品体积减小而产生较低的信号，但是切片越薄，可以从组织样品产生的切片就越多，这在通过对多个切片成像的3D成像方面提供了益处。然而，较薄的切片(例如，等于或小于激光烧蚀的分辨率)可以允许更容易地通过载片进行烧蚀(例如，组织切片在激光烧蚀光斑处的整个深度可以被烧蚀)。用于制备此类切片的技术在IHC领域是众所周知的，例如使用切片机，包括脱水步骤，包括包埋，等等。因此，可以对组织进行化学固定，然后可以在期望的平面中制备切片。冰冻切片或激光捕获显微切割也可以用于制备组织样品。样品可以被透化，例如以准许试剂对细胞内的目标进行标记(参见上文)。
待分析组织样品的尺寸将与当前的IHC方法类似，但是最大尺寸将由激光烧蚀设备来决定，并且特别地由可以配合到其烧蚀室中的样品的尺寸来决定。最多为5mm×5mm的尺寸是典型的，但较小的样品(例如1mm×1mm)也是有用的(这些尺寸是指切片的大小，而不是其厚度)。
组织样品的标记
在一些实施方案中，如上所述，本发明的设备和方法检测已被添加到样品中的原子(即，通常不存在的原子)。此类原子被称为标记原子(标记原子因此表示元素标签)。样品通常是包含细胞的生物样品，并且标记原子用于标记细胞中/细胞表面上的目标分子。在一些实施方案中，允许同时检测多于一种标记原子，从而准许进行多重标记检测，例如，至少3种、4种、5种、10种、20种、30种、32种、40种、50种或甚至100种不同的标记原子。通过用不同的标记原子来标记不同的目标，可以确定单个细胞上多个目标的存在。
可以与本发明一起使用的标记原子包括能由MS检测并且基本上不存在于未标记样品中的任何种类。因此，例如，12C原子将不适合用作标记原子，因为它们在自然中大量存在，而11C在理论上可以使用，因为它是非天然存在的人工同位素。然而，在优选的实施方案中，标记原子是过渡金属，诸如稀土金属(15种镧系元素，加上钪和钇)。这17种元素提供了许多不同的同位素，这些同位素能够容易地通过MS来区分。这些元素中的很多种可以以富集同位素的形式获得，例如钐具有6种稳定的同位素，并且钕具有7种稳定的同位素，所有这些元素都可以以富集的形式获得。15种镧系元素提供至少37种具有非冗余独特的质量的同位素。适合用作标记原子的元素的示例包括镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)。除稀土金属之外，其他金属原子也适用于通过MS来检测，例如，金(Au)、铂(Pt)、铱(Ir)、铑(Rh)、铋(Bi)等。使用放射性同位素不是优选的，因为它们不太便于处理并且不稳定，例如，Pm不是镧系元素中的优选标记原子。
为了便于TOF分析(参见上文)，使用原子质量在80至250范围内(例如在80至210范围内，或在100至200范围内)的标记原子是有帮助的。该范围包括所有的镧系元素，但排除了Sc和Y。100至200的范围准许通过使用不同的标记原子进行理论上的101-plex分析，同时准许本发明利用TOF MS的高光谱扫描速率。如上文所提到的，通过选择其质量在窗口中位于比在未标记样品中看到的那些质量高的位置(例如在100至200范围内)的标记原子，TOF检测可以用于提供生物学显著水平的快速分析。
对样品进行标记通常要求标记原子附接到特异性结合对(sbp)的一个成员。使该标记的sbp与样品接触，使得它可以与该sbp的另一个成员(目标sbp成员)(如果存在的话)相互作用，从而将标记原子定位于样品中的目标分子。然后，本发明的方法在通过质谱流式细胞仪分析时检测粒子上该标记原子的存在。稀土金属和其他标记原子可以通过已知技术缀合至sbp成员，例如，Bruckner等人，(2013)Anal.Chem.86:585-91描述了镧系元素原子附接到寡核苷酸探针用于MS检测，Gao和Yu(2007)Biosensor Bioelectronics 22:933-40描述了钌对寡核苷酸进行标记的用途，并且Fluidigm Canada出售MaxParTM金属标记试剂盒，其可以用于将超过30种不同的标记原子缀合至蛋白质(包括抗体)。
各种数目的标记原子可以附接到单个sbp成员，并且当更多的标记原子附接到任何sbp成员时，可以实现更大的灵敏度。例如，多于10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个标记原子可以附接到sbp成员。例如，含有多个单体单元的单分散聚合物可以用于形成元素标签，其各自含有螯合剂(诸如DTPA)。例如，DTPA以约10-6M的解离常数结合3+镧系元素离子[Tanner等人Cancer Immunol Immunother(2013)62:955-965]。这些聚合物可以终止于硫醇反应性基团(例如，马来酰亚胺)，该硫醇反应性基团可以用于附接到sbp成员。例如，该硫醇反应性基团可以与抗体的Fc区结合。其他官能团也可以用于这些聚合物的缀合，例如胺反应性基团(诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或者对羧基或对抗体糖基化具有反应性的基团。任何数目的聚合物可以结合到每个sbp成员。可以使用的聚合物的具体示例包括直链(“X8”)聚合物或第三代树枝状(“DN3”)聚合物，两者均可作为MaxParTM试剂获得。金属纳米粒子的使用也可以用于增加标记中的原子数目。
如上文所提到的，标记原子附接到sbp成员，并且使该标记的sbp成员与样品接触，在样品中该sbp成员可以找到目标sbp成员(如果存在的话)，从而形成标记的sbp。该标记的sbp成员可以包含适合于附接到标记原子然后用于根据本发明的检测的任何化学结构。
一般而言，本发明的方法能够以下列各项为基础：任何已知用于确定样品中存在目标分子的sbp(例如，如IHC或荧光原位杂交(FISH)中所用的)，或者基于荧光的流式细胞术，但与样品接触的sbp成员将携带能由MS检测的标记原子。因此，本发明可以容易地通过使用可获得的流式细胞术试剂，仅仅通过对标记进行修饰来实施，这些标记先前已经用于例如修饰FISH探针以携带可以由MS检测的标记。
sbp可以包含以下项中的任一项：核酸双链体；抗体/抗原复合物；受体/配体对；或适体/目标对。因此，标记原子可以附接到核酸探针，然后该核酸探针与样品接触，使得该探针可以与其中的互补核酸杂交，例如以形成DNA/DNA双链体、DNA/RNA双链体或RNA/RNA双链体。类似地，标记原子可以附接到抗体，然后该抗体与样品接触，使得该抗体可以与其抗原结合。标记原子可以附接到配体，然后该配体与样品接触，使得该配体可以与其受体结合。标记原子可以附接到适体配体，然后该适体配体与样品接触，使得该适体配体可以与其目标结合。因此，标记的sbp成员可以用于检测样品中的多种目标分子，包括DNA序列、RNA序列、蛋白质、糖、脂质或代谢物。
在一个典型的实施方案中，标记的sbp成员是抗体。对抗体进行标记可以通过将一个或多个标记原子结合分子与抗体缀合来实现，例如使用如上所述的MaxParTM缀合试剂盒。抗体的目标分子被称为其抗原，并且可以是蛋白质、碳水化合物、核酸等。可用于质谱流式细胞术的识别细胞蛋白质的抗体己经广泛用于IHC使用，并且通过使用标记原子来代替当前的标记技术(例如荧光)，这些已知的抗体可以容易地适用于本发明的方法，但是有益于提高复用能力。与本发明一起使用的抗体可以识别细胞表面上的目标或细胞内的目标。抗体可以识别多种目标，例如，它们可以特异性地识别单独的蛋白质，或者可以识别共用共同表位的多种相关蛋白质，或者可以识别蛋白质上的特定翻译后修饰(例如，以区分感兴趣蛋白质上的酪氨酸和磷酸酪氨酸，以区分赖氨酸和乙酰基赖氨酸，以检测泛素化等)。在结合到其目标之后，可以检测到与抗体缀合的标记原子，以揭示样品中存在该目标。
标记的sbp成员通常将直接与样品中的目标sbp成员相互作用。然而，在一些实施方案中，标记的sbp成员有可能间接地与目标sbp成员相互作用，例如一级抗体可以与目标sbp成员结合，然后标记的二级抗体能够以夹心测定的方式与一级抗体结合。然而，通常本发明依赖于直接相互作用，因为这可以更容易地实现并且准许更高的复用效率。但是，在这两种情况下，使样品均与sbp成员接触，该sbp成员可以与样品中的目标sbp成员结合，并且在稍后阶段检测附接到该目标sbp成员的标记物。
本发明的一个特征是其能够检测样品中的多个(例如，10个或更多个，并且甚至多达100个或更多个)不同目标sbp成员(例如以检测样品中的多种不同的蛋白质和/或多种不同的核酸序列)。为了准许这些目标sbp成员的差异化检测，它们各自的sbp成员应当携带不同的标记原子，使得它们的信号可以通过MS区分。例如，在检测10种不同蛋白质的情况下，可以使用10种不同的抗体(各自对于不同的目标蛋白质具有特异性)，其中每种抗体均携带独特的标记物，使得可以区分来自不同抗体的信号。在一些实施方案中，期望使用针对单个目标的多种不同的抗体，例如，这些抗体识别相同蛋白质上的不同表位。
如果使用多于一种标记的抗体，则优选的是这些抗体对其各自的抗原应当具有相似的亲和力，因为这有助于确保由MS检测到的标记原子的量与目标抗原的丰度之间的关系将在不同sbps上更为一致(特别是在高扫描频率下)。
如果目标sbp成员位于细胞内，则通常有必要在样品与标记物接触之前或期间将细胞膜透化。例如，当目标是DNA序列，但是标记的sbp成员不能穿透活细胞的膜时，可以将样品的细胞固定并透化。然后，该标记的sbp成员可以进入细胞并且与目标sbp成员形成sbp。
通常，本发明的方法将检测至少一种细胞内目标和至少一种细胞表面目标。然而，在一些实施方案中，本发明可以用于在忽略细胞内目标的同时检测多个细胞表面目标。总而言之，对目标的选择将由该方法期望的信息决定。
对样品进行标记不完全依赖于sbp。在一些情况下，经典染料可以用于突出显示组织上的期望特征。在许多情况下，用于显微镜检查的染料含有天然细胞状态下罕见的元素。所以，在对组织染色的过程中，组织变得富含可由本文所述的设备和方法读取的特定元素。
因此，在一些实施方案中，上述分析方法包括用至少一个标记原子对样品进行标记的步骤。然后可以使用上述方法检测该原子。
信号增强
本申请的多个方面包括通过在LA-ICP-MS中添加氢来增强信号，如本文进一步描述的。LA-ICP-MS***可以具有图4所示的一个或多个气体流，诸如捕获气体流、转移气体流、到内部焰炬管的内部(辅助)气体流，以及/或者到外部焰炬管的外部(等离子体)气体流。值得注意的是，图4中所示的气体源可以被不同地配置，使得预混合或加湿的气体被供应到捕获气体流、转移气体流、内部气体流和/或外部气体流中的任何一者或多者。在某些方面，LA-ICP-MS***可以包括3个气体源，诸如与内部气体流和外部气体流相比用于转移流的单独气体源。替代性地或除此之外，激光烧蚀***可以包括与样品正交的喷射器，例如，如图2至图3所示。在某些方面，仅一个气体流(例如，捕获气体)可以流过喷射器。在某些方面，该喷射器包括位于激光烧蚀羽流下游的补充气体流。
本申请的多个方面包括用于成像质谱法(IMS)的设备和工作流程，其提高了样品采集速度、信号灵敏度和/或信号稳定性。成像质谱流式细胞术(IMC)是通过具有细胞或亚细胞空间分辨率的成像质谱法对质量标签进行检测。IMC***和方法可以包括本申请中所述的任何方面。在某些方面，质谱流式细胞术可以包括激光烧蚀(LA)电感耦合等离子体(ICP)质谱法(MS)。使用非内源性元素(诸如重金属质量标签)允许检测内源性元素。此类内源性元素(诸如碳、氧、氮和轻金属(诸如钙))可以被质谱仪(诸如被高通质量过滤器(例如，RF四极杆))耗尽。在某些方面，氩二聚体(基于ICP的氩副产物)也可以被耗尽，诸如通过具有至少80amu的截止值的高通质量过滤器。
重金属质量标签可以包含高于80amu的重金属，例如，如本文进一步描述的。在某些方面，各个质量标签可以包含富集的重金属同位素的多个标记原子。此类标记原子可以在聚合物上，诸如通过螯合聚合物上的侧基而结合，该聚合物然后缀合至结合特异性目标的特异性结合配偶体(SBP)，诸如结合特定蛋白质目标的抗体。例如，由Fluidigm提供的Maxpar标签各自包含负载有单一同位素(诸如镧系元素同位素)的多个标记原子的聚合物，并且可以缀合至结合由细胞表达的特定蛋白质的抗体。通过ICP-MS检测到同位素表明存在对应的目标(例如，蛋白质)。
使用富集同位素作为标记原子可以检测到的不同目标的数目相比用包含同位素的天然混合物的元素质量标签可以检测到的不同目标的数目增加。然而，使用超过20个、超过30个或超过40个同位素质量标签通常包括彼此相差16amu的同位素，使得一个质量标签的氧化物可能干扰包含具有大16amu的质量的同位素的另一个质量标签的检测。氧化物(诸如用作质量标签的镧系元素的氧化物)是基于ICP的雾化和电离的副产物。在某些方面，用于增加灵敏度或信号稳定性的方法或***能够以避免过量氧化物形成的方式实施。
因此，与其他形式的IMS(诸如MALDI)相反，氧化对于原子IMC可能是独有的问题，因为来自其他质量标签的16amu金属同位素的原子质量检测易受氧化物溢出的影响。由于期望在每个激光烧蚀光斑(像素)中进行灵敏和稳定的检测，所以这种考虑进一步复杂化。每次烧蚀产生小的(例如，微米或亚微米大小的)烧蚀坑，其中可能存在少量的给定质量标签。另外，IMC依赖于准确比较样品(诸如组织切片)上的不同目标的表达(例如，各自被测量为对应于不同质量的同位素质量标签的不同质量通道中的信号)的能力。
在某些方面，IMC***可以用于悬液质谱流式细胞术，诸如当该***的ICP焰炬可以耦合到用于引入全细胞的喷雾室而不是激光烧蚀源时。因此，ICP焰炬可以能够雾化和电离全细胞(例如，直径至少高达15微米或至少高达20微米的细胞)。所以，由ICP焰炬产生的等离子体可以不被专门设计用于激光烧蚀羽流的有效电离和/或雾化(例如，可以具有比激光烧蚀羽流所需的路径长度更长的路径长度)。替代性地，将LA-ICP-MS***设计成具有短瞬态可以包括缩短等离子体的路径长度，并且可能导致低效的电离和/或雾化(例如，除非如本文所述通过引入氢来修改)。发明人已经发现，湿度水平影响IMC***的灵敏度，并且可能导致信号漂移，诸如当该***中的湿度在样品运行中倾向于降低时(例如，当由于操作之前烧蚀室中的空气而存在一些初始湿度水平时)。实际上，如本文进一步讨论的，已经发现水蒸气或氢气都能增加信号灵敏度，并且可以进一步提高信号稳定性。因此，电离和/或雾化的效率(例如，通过一个或多个质量通道中(诸如对于一个或多个标记原子)增加的灵敏度来测量)可以通过将一种或多种含氢分子添加到气体流中来提高，如本文进一步描述的。例如，合适的含氢分子可以是作为蒸气的水或醇(诸如乙醇)。替代性地或除此之外，合适的含氢分子可以是氢气、甲烷或氨气，例如以与氦或氩的预混物提供。
在某些方面，LA-ICP-MS***的多个部分可以通向大气，使得空气可以存在于激光烧蚀室、流体和/或ICP焰炬中。这种空气最终可以通过ICP-MS***的操作被吹扫或消耗。然而，由于这种空气引起的湿度和/或氧气水平的变化可能影响ICP等离子体的效率，诸如电离效率和/或氧化物形成。在某些方面，可以在如本文所述的整个样品运行中控制湿度(例如，使得质量信号增大和/或稳定化，但氧化最小化)。替代性地或除此之外，氢可以与气体(诸如氦气或氩气)预混合，以增大灵敏度和/或信号稳定性。
发明人已经发现，在重金属质量标签的LA-ICP-MS分析期间添加水或氢可以提高灵敏度和控制信号稳定性。在某些方面，可以在LA-ICP-MS期间引入一种或多种含氢气体，诸如氢气、水蒸气、甲烷和/或氨气。在某些方面，可以在加压气体源中提供与ICP气体(诸如氦气或氩气)预混合的气体(诸如氢气、甲烷或氨气)。在某些方面，水蒸气可以与气体(诸如氩气)混合。
一般来讲，氢气能够以足以提供信号增强和/或稳定性的流量被提供给ICP源。
信号增强可以用于一个或多个质量通道，诸如用于质量标签的金属同位素通道，所述质量标签用于标记由该设备分析的生物样品。在某些方面，所述金属同位素包括镧系元素同位素。与不存在氢气的信号相比，信号增强可以是至少20％、至少30％、至少50％、至少80％或至少100％。在某些方面，信号增强是其中检测到信号(例如来自金属同位素质量标签)的质量通道范围内的平均信号增强。在某些方面，通过至少10次计数测量的镧系元素同位素的平均信号增强为至少20％、至少30％或至少50％。信号增强(也称为灵敏度提高)可以被测量为诸如当分析样品的标记原子时或者当分析包含已知量的可检测原子的元素标准物时每个激光烧蚀羽流的计数(例如，计数的平均值)的增加。
在某些方面，进入ICP源的氢气流量的量对于氢气流量的变化是稳健的，使得该量的20％变化或50％变化将具有小于10％的信号变化，诸如小于5％的信号变化(例如，对于标准物，对于一种标记原子、一些标记原子，或者对于以大于10的计数被检测到的所有标记原子)。
本文描述了用于引入含氢分子(诸如在预混合气体或蒸气中)以提高信号灵敏度和/或稳定性的设备和方法。在某些方面，引入氢气提高了信号稳定性，使得在一定范围内(例如，介于0至2000微巴之间或介于0至4000微巴之间)的外部湿度产生小于10％或小于5％的信号灵敏度变化。
用于信号增强的氢气
在某些方面，可以提供用于将氢气引入ICP焰炬的设备、方法和/或预混合压缩气体源，以便提高信号灵敏度和/或信号稳定性。
在某些方面，设备包括以下项中的一者或多者：样品载台，其被配置为在至少两个方向上移动样品；激光烧蚀源，其被配置为烧蚀安装在样品载台上的样品；电感耦合等离子体(ICP)焰炬；喷射器，其被配置为将由激光烧蚀源从样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬；以及压缩预混合气体源，其包含氦气和氩气中的至少一者与氢气的混合物。
压缩预混合气体源中的氢气按体积计可以介于0.1％与5％之间，诸如介于1％与4％之间。
压缩预混合气体源可以是按体积计至少50％的氦气或按体积计至少50％的氩气。压缩预混合气体源可以将气体供应到包括样品载台的烧蚀室。预混合气体源可以提供将烧蚀羽流运载到喷射器中的捕获气体。替代性地或除此之外，预混合气体源可以提供转移气体(即，在烧蚀羽流的上游进入喷射器)、补充气体(即，在烧蚀羽流进入喷射器的位置的下游对喷射器中的气体进行补充)，和/或内部气体(即，辅助气体，其流向ICP焰炬的内管)。
附加气体源可以向喷射器提供转移气体，诸如当捕获气体将烧蚀羽流提升到喷射器中的转移气体中时。转移气体可以包含氩气(例如，至少50％的氩气)。捕获气体可以包含氦气和氢气的混合物(例如，至少50％的氦气)，或者氩气(例如，至少50％的氩气)和氢气的混合物。
在某些方面，可能没有单独的捕获和转移气体，诸如当只有捕获气体进入喷射器时。在某些方面，喷射器被配置为将激光烧蚀羽流引导至竖直ICP焰炬，例如当该设备包括竖直定向的ICP焰炬时。
该设备还可以包括附加气体源，该附加气体源提供转移气体、补充气体、内部(辅助)气体和/或外部(等离子体)气体中的至少一者。附加气体源可以是压缩气体或液体杜瓦瓶，并且可以是按体积计至少50％的氩气，预混合气体源包含按体积计至少50％的氦气。相比之下，预混合气体源可以不在液体杜瓦瓶中，因为不同的气体在操作期间可能以不同的速率蒸发(并且因此被耗尽)。
当该设备包括在激光烧蚀羽流进入喷射器的位置下游到达喷射器的补充流时，该补充流可以任选地还位于牺牲流的下游。
在某些方面，压缩预混合气体源提供捕获气体、转移气体和内部焰炬气体中的至少一者。
该设备可以被配置为向ICP焰炬中提供介于0.001L/min与0.1L/min之间的氢气流量，诸如介于0.001L/min与0.02L/min之间的氢气流量。替代性地或除此之外，氢气可以介于进入ICP焰炬的总气体流量的0.002％与1％之间，诸如介于进入ICP焰炬的总气体流量的0.01％与0.1％之间。进入ICP焰炬的总气体流量可以介于5L/min与30L/min之间，诸如介于10L/min与25L/min之间。例如，以引用方式并入的美国专利号US8633416报道了约5L/min的气体流量。在某些方面，到达ICP焰炬的氢气流量可以变化超过20％，诸如变化超过50％，而不降低灵敏度(例如，对于一个、一些或全部标记原子)超过5％。在某些方面，在样品分析期间，到达ICP焰炬的氢气流量的量可以改变超过10％、超过20％或超过50％。
该设备还可以包括质谱仪，该质谱仪被配置为检测由ICP焰炬产生的电离原子，如本文进一步描述的。在某些方面，质谱仪包括高通滤波器，该高通滤波器被配置为至少去除质量为80amu及更小的离子。
ICP焰炬被配置为以细胞悬液模式对全细胞进行雾化和电离，在该细胞悬液模式下，ICP焰炬从激光烧蚀源解耦。例如，ICP焰炬可以从激光烧蚀源解耦，并且足以雾化和电离以悬液形式引入ICP上游的喷雾室中的全细胞。ICP焰炬的特征(诸如尺寸和几何形状)可以适用于对全细胞进行雾化和电离。由于这种设计考虑，ICP焰炬在雾化和/或电离激光烧蚀羽流中的材料方面可能效率较低，所述激光烧蚀羽流诸如由光斑尺寸小于2微米(诸如光斑尺寸小于1微米)的激光产生的羽流。
以上实施方案中的任一者的设备可以还包括加湿***(例如，如本文进一步描述的)，该加湿***被配置为对气体流进行加湿。
本申请的方法可以包括使用上述方面中的任一方面的设备通过LA-ICP-MS来分析样品。样品可以是如本文进一步描述的生物样品，诸如组织切片。样品可以包含如本文进一步描述的标记原子，诸如与结合样品中的目标的SBP缔合的标记原子。因此，分析方法还可以包括在通过LA-ICP-MS分析样品之前用标记原子对样品进行标记。在某些方面，没有标记原子具有大于3％的氧化物溢出。
在某些方面，氢气使至少一些标记原子的灵敏度增加至少20％，或使至少一些标记原子的灵敏度增加至少50％，诸如针对每个烧蚀羽流具有至少为10的平均离子计数的标记原子。
在某些方面，在任何给定的5分钟时段内，标记原子(或元素标准物)的平均灵敏度在分析样品的至少1小时内可能变化不超过10％。
虽然上文描述了氢气，但是在以上方面的任何方面中，可以使用另一种含氢气体来代替氢气，或者作为对氢气的补充。例如，可以使用甲烷或氨气来代替氢气，或者作为对氢气的补充。
预混合气体源及其用途
本申请的多个方面包括用于电感耦合等离子体设备的压缩预混合气体源。该预混合气体源可以包含按体积计至少50％(例如，按体积计至少70％、按体积计至少90％)的氦气或氩气，并且还可以包含按体积计至少0.1％的气体，其中该气体包含元素氢。该气体可以是例如氢气、氨气和/或甲烷。
在某些方面，该气体包括氢气。预混合气体源可以包含按体积计介于0.1％与5％之间(诸如按体积计介于1％与4％之间)的氢气。预混合气体源可以包含低于燃点(例如，小于约4％)的氢气。预混合气体源可以是在LA-ICP-MS中使用的压缩气体气瓶。
多个方面包括其中包括上文所述的压缩预混合气体源的LA-ICP-MS***。在某些方面，质谱仪可以改为元素分析仪，诸如光学发射光谱仪。
用于信号增强的气体加湿
本申请的多个方面包括用于LA-ICP-MS的气体加湿设备和方法。
在某些方面，设备包括以下项中的一者或多者：样品载台，其被配置为在至少两个方向上移动样品；激光烧蚀源，其被配置为烧蚀安装在样品载台上的样品；电感耦合等离子体(ICP)源；喷射器，其被配置为将由激光烧蚀源从样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬；以及加湿***，其被配置为对气体流进行加湿。
气体流可以包含转移气体流、捕获气体流、补充气体流和辅助气体流中的一者或多者。在某些方面，气体流是转移气体流。
在某些方面，气体流包含至少50％的氩气(诸如至少70％或至少90％的氩气)，诸如当气体流是转移气体时。替代性地，气体流可以包含至少50％的氦气，诸如当气体流是捕获气体时。
在某些方面，加湿***具有可调范围，其覆盖至少500um(微巴)至5000uB，诸如介于1000uB与4000uB之间，或者介于1500uB与3000uB之间。这可以产生稳定性优于20％(诸如优于20％)的加湿气体。在某些方面，湿度不被控制在小于3％(诸如小于5％)的范围内，因为这种控制对于信号稳定性可能不是必需的。
加湿***可以包括水扩散管件。在某些方面，加湿***控制该扩散管件的温度。替代性地或除此之外，加湿***包括可变分流器，该可变分流器能够调节以使水扩散管件周围的气体流(例如，氩气流)分流。可变分流器可以通过耦合到湿度传感器的控制器来调节。在某些方面，控制器和湿度传感器一起被配置为使扩散管件周围的流动气体流分流，以维持湿度水平。作为扩散管件的替代方案，加湿***可以包括水泵，该水泵被配置为直接将水喷射到气体流中。
一种方法可以包括通过使用包括任何合适的加湿***(诸如上述方面之一的加湿***)的设备的LA-ICP-MS来分析样品。
样品可以是如本文进一步描述的生物样品，诸如组织切片。样品可以包含如本文进一步描述的标记原子，诸如与结合样品中的目标的SBP缔合的标记原子。因此，分析方法还可以包括在通过LA-ICP-MS分析样品之前用标记原子对样品进行标记。在某些方面，没有标记原子具有大于3％的氧化物溢出。例如，高湿度可能导致高于3％的氧化物溢出。因此，湿度和/或等离子体温度可以维持在允许如下所述的灵敏度提高的水平，但是又可以足够低以避免任何标记原子出现超过3％的氧化物溢出(例如，在样品运行的任何5分钟时段期间的平均氧化物溢出)。例如，温度可以通过经由补充气体流调节等离子体温度来控制。如果温度没有得到适当控制，则即便少量的湿度也可能导致极高的氧化物。
在某些方面，加湿使至少一些标记原子的灵敏度增加至少20％，或使至少一些标记原子的灵敏度增加至少50％，诸如针对每个烧蚀羽流具有至少为10的平均离子计数的标记原子(例如，在预处理之后)。在某些方面，在任何给定的5分钟时段内，标记原子(或元素标准物)的平均灵敏度在分析样品的至少1小时内可能变化不超过10％。在某些方面，湿度可以变化超过20％，诸如变化超过50％，而不降低灵敏度(例如，对于一个、一些或全部标记原子)超过5％。
虽然上文描述了气体加湿(用水蒸气)，但是可以将另一种含氢分子作为蒸气引入气体流中，作为水的替代或补充。例如，醇(诸如乙醇)可以通过上述用于水蒸气的任何方面(诸如扩散管件)被引入气体流中。
典型的激光烧蚀电感耦合等离子体装置使用气体流的组合来将烧蚀材料从烧蚀点运载到等离子体。灵敏度受到气体流中的水分量的影响。经由雾化水雾将水添加到气体流中扰乱了该气体流，并且在成像应用中将对瞬时信号和像素速率造成负面影响。在气体流进入机器之前对其进行加湿不会造成该问题。通常，确保稳定的湿度将涉及显著的温度稳定性。可以测量出口气体流的湿度以向加湿器提供反馈来调节湿度。加湿器本身是穿过扩散管件的气体流。穿过该管件的气体流以饱和状态离开，因此发明人使用可变气体分流器来改变穿过扩散管件的气体流，并且因此改变重新结合后的气体流中的水分。改变气体流是一种反馈机制。
用于供应氢以增强信号的设备和方法
本申请的多个方面包括用于将含氢分子引入LA-ICP-MS中的ICP焰炬中的设备和方法。含氢分子可以是气体，诸如氢气、氨气或甲烷。替代性地或除此之外，可以将含氢分子诸如水或醇(例如，乙醇)作为蒸气引入气体流中。
多个方面包括一种设备，其包括以下项中的一者或多者：样品载台，其被配置为在至少两个方向上移动样品；激光烧蚀源，其被配置为烧蚀安装在样品载台上的样品；电感耦合等离子体(ICP)焰炬；喷射器，其被配置为将由激光烧蚀源从样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬；以及压缩预混合气体源，其包含氦气和氩气中的至少一者与含氢气体的混合物。在某些方面，含氢气体是甲烷、氨气或氢气。
多个方面包括一种设备，其包括以下项中的一者或多者：样品载台，其被配置为在至少两个方向上移动样品；激光烧蚀源，其被配置为烧蚀安装在样品载台上的样品；电感耦合等离子体(ICP)源；喷射器，其被配置为将由激光烧蚀源从样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬。该设备可以被配置为供应包含氢气流的蒸气。该蒸气可以包括水蒸气或醇蒸气(例如，乙醇)。
多个方面包括一种设备，其包括以下项中的一者或多者：样品载台，其被配置为在至少两个方向上移动样品；激光烧蚀源，其被配置为烧蚀安装在样品载台上的样品；电感耦合等离子体(ICP)焰炬，其耦合到质谱仪；喷射器，其被配置为将由激光烧蚀源从样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬。该设备可以被配置为在用于激光烧蚀ICP质谱法的操作期间而不是在细胞悬液模式期间将含氢分子供应到ICP焰炬的等离子体(例如，如本文别处所述)。在细胞悬液模式中，ICP焰炬可以从激光烧蚀源解耦，并且能够足以雾化和电离以悬液形式引入ICP上游的喷雾室中的全细胞。
实验
发明人已经发现，生物样品或无机样品(例如，元素标准物)中的镧系元素和其他标记原子的信号稳定性和增强可以用少量的氢实现。氢可以是氢气(低于可燃性限值)，并且这种稳定性和增强对于氢气量的差异(例如，由于在操作期间气体流的变化，该变化用于维持恒定的等离子体)可以是稳健的。替代性地，氢可以作为水蒸气引入，并且信号稳定性和增强可以同样对一定范围的湿度是稳健的。
发明人观察到IMC(Fluidigm Hyperion成像***)的灵敏度在操作期间衰减并且在关闭时恢复。发明人确定，这是由于少量水分扩散到***中、在停机时间期间累积并且在操作期间缓慢干燥。这导致建议减少水分扩散到***中的途径，但是也需要对***中的气体流进行加湿。经过调查，发明人发现重要的因素是***中氢的量。发明人最初放弃了将纯氢混入喷射器气体中的想法，因为纯氢由于额外的气体处理问题和安全预防措施而过于昂贵。发明人首先开发了氩气流加湿器装置。它可以提供所需水平的稳定H2O供应。然而，由生物学专家进行的图像分析揭示了对被氧化物形成污染的质量通道上的图像的关注。在这种情况下，氧来自氩气流中的水分子。于是发明人决定探索一种在不添加氧的情况下，但以消除可燃性和安全性问题的配置获得纯氢混入喷射器气体流中的益处的方式。发明人认识到，稀释到不可燃水平的预混合气体可以通过现有的气体处理部件来管理，并且提供足够大的氢浓度以提高灵敏度并稳定信号。
最初，发明人发现信号对湿度敏感，并且可能随外部湿度(例如，LA-ICP-MS仪器空间中的空气的外部湿度)波动。如图5所示，转移气体的0至4000uB(微巴)的湿度范围导致了含镥元素标准物灵敏度的约30％变化，该灵敏度被测量为在一定湿度范围内每次烧蚀发射的平均镥计数。然而，发明人还注意到信号在一定湿度范围内(约2000uB至3000uB)既稳定又高。所使用的***类似于图4所示的***。
发明人还发现，添加水将导致高得多的氧化物水平，但是可以调节转移气体的流量以将氧化物保持在特定水平，而不是简单地调整以获得最大灵敏度。以下是样品调整结果，示出可以将氧化物比率限制为小于3％(或更小，诸如小于2％或小于1％)，同时仍然在使用加湿器之后实现灵敏度的显著提高：
另外值得注意的是，Ce140至Gd156通常是在所有质量通道中氧化物溢出最差的通道，因此在调整期间将该通道上的氧化物溢出限制到低于3％，而该操作在其他通道上将很少看到。在某些方面，在样品运行期间(例如，在样品运行的超过5分钟、超过10分钟或超过30分钟的时段期间)，氧化物溢出变化小于1个百分点，诸如小于0.5个百分点或小于0.25个百分点。
发明人还已经证实，添加氢(H2)气(在具有氦气的预混合气体源中，其中氢气为3％)与增大的信号/离子图像亮度强烈相关。两种方法的信号增强在图9中示出。具体地讲，转移气体加湿(左)显示了常用标记物的增大的信号，并且预混合氢-氦捕获气体(右)也显示了常用标记物的增大的信号。
发明人还发现，与较亮的通道相比，非常暗的通道经历更少的灵敏度提高，这可能是背景所致。因而，灵敏度提高可能主要在每次烧蚀发射平均检测到10个或更多个离子计数的通道上看到。
下面是对这两种方法的折衷的比较。
| 加湿器 | H<sub>2</sub>/He混合物 | |
| 灵敏度提高 | 是 | 是 |
| 灵敏度稳定性 | 是 | 是 |
| 氧化物溢出 | 是 | 否 |
| 需要的硬件 | 加湿器 | 无 |
| 需要的软件 | 加湿器控制，调整 | 无 |
| 需要的维护 | 最低限度 | 无 |
发明人尝试了如图6所示的多重加湿***，并且发现用水泵(图6顶部)直接喷射水导致与毛细管末端处的润湿和液滴形成相关的一些稳定性问题。发现通过扩散管件(图6底部)的流动气体提供更好的加湿稳定性，其中该扩散管件具有温度和/或湿度反馈以控制该扩散管件周围的气体流的分流。尽管湿度变化+/-10％，但在使扩散管件温度稳定的同时以恒定速率过夜运行给出了相当稳定的信号(如图7所示)。然而，移除温度稳定操作并且替代地使用对气体流的反馈可以提供对湿度的更好控制。湿度通过响应于由扩散管件下游的传感器检测到的湿度改变通过该管件的气体流来控制。控制通过扩散管件的气体流提供更一致的湿度和对变化的良好响应时间。
典型的激光烧蚀电感耦合等离子体装置使用气体流的组合来将烧蚀材料从烧蚀点运载到等离子体。灵敏度受到气体流中的氢气量的影响。
发明人已经使用不同量的氢气来确定类似于图4所示的LA-ICP-MS***所需的适当氢量。发明人针对氦-氢气流使用了混合气体比率，这将在典型的氦气流范围内提供适量的氢气。这允许切换到氢混合气体***，该***除了移除纯氦并且替换为混合的氢-氦气体之外，并未对硬件或软件作出其他改变。气瓶/调节器/质量流量控制器的总数是相同的。与加湿器***不同，混合气体***不添加氧气，并且由MS***检测到的氧化物比率不受影响。
在替代性设置中，将氢气预混合到氩气(诸如，专门用于转移气体和/或捕获气体的气体源)中。在一些LA-ICP-MS***中，氩气可以用作用于烧蚀羽流的捕获气体。除LA-ICP-MS之外，在质谱流式细胞术仪器中。对于一些应用也可以考虑使用氖气，尽管其可能昂贵得让人负担不起。在又一种替代性设置中，将氢气预混合到氩气中的预混物添加到转移气体中。转移气体是总喷射器流的一部分；它与携带羽流的烧蚀捕获气体混合。在将H2/氩预混物添加到转移气体流中的情况下，使用者可以改变纯氩与H2/Ar预混物之间的比例，并且控制进入喷射器的H2的总流量，同时独立地控制最佳的氩气流量。换句话讲，预混物的流量控制H2的质量流量，并且预混物的流量加上剩余的氩气流量控制转移气体的总氩气流量。需要仔细地调整在喷射器的输出端处的总氩气流量，以实现最佳的等离子体温度和最大的灵敏度。然后，H2的水平提供了用于提高灵敏度的第二维度。建议的H2/氩预混物具有低浓度的氢气并且低于可燃性限值。该设置的缺点是，预混物流需要附加的预混物气体气瓶和独立的附加质量流量控制器。但是，该设置的益处是能够独立地控制并且调整给定的仪器和等离子体条件下总流量的氢部分。例如，该布置被视为氘项目的计划B，而H2/氦预混物为计划A。H2/氦混合物是低成本和简单的解决方案，其不对H2流量进行独立控制，而这种限制通常不太有意义。
Claims (91)
1.一种设备，其包括：
样品载台，所述样品载台被配置为在至少两个方向上移动样品；
激光烧蚀源，所述激光烧蚀源被配置为烧蚀安装在所述样品载台上的样品；
等离子体源；
喷射器，所述喷射器被配置为将由所述激光烧蚀源从所述样品产生的烧蚀羽流传送到所述等离子体源；
其中所述等离子体源和所述样品载台中的至少一者彼此正交地定向。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述喷射器是刚性的。
3.如权利要求1或2所述的设备，其中所述喷射器是直的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的设备，其中所述喷射器的内径小于1mm。
5.如权利要求1至4中任一项所述的设备，其中所述喷射器的长度小于10cm。
6.如权利要求5所述的设备，其中所述喷射器的长度小于5cm。
7.如权利要求1至6中任一项所述的设备，其中所述设备被配置为在不穿过所述喷射器的路径上引导激光。
8.如权利要求1至7中任一项所述的设备，其中所述设备能够操作以每秒向ICP源输送至少1000个离散的烧蚀羽流。
9.如权利要求1至8中任一项所述的设备，其还包括质谱仪。
10.如权利要求9所述的设备，其中所述质谱仪是飞行时间质谱仪。
11.如权利要求9或10所述的设备，其中所述MS被配置为接收垂直离子束。
12.如权利要求1至11中任一项所述的设备，其中所述样品载台是竖直的，并且能够操作以在竖直位置运行。
13.如权利要求1至11中任一项所述的设备，其中所述等离子体源竖直定向。
14.如权利要求13所述的设备，其中所述等离子体源是真空密封的，通向所述等离子体源的喷射器入口除外。
15.如权利要求1至14中任一项所述的设备，其中所述等离子体源是ICP源。
16.一种方法，其包括使用权利要求1至15中任一项所述的设备通过LA-ICP-MS来分析样品。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述样品是生物样品。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述样品包含标记原子。
19.如权利要求18所述的方法，其还包括在通过LA-ICP-MS分析所述样品之前用标记原子对所述样品进行标记。
20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中每秒分析至少1000个离散的烧蚀羽流。
21.一种设备，其包括：
样品载台，所述样品载台被配置为在至少两个方向上移动样品；
激光烧蚀源，所述激光烧蚀源被配置为烧蚀安装在所述样品载台上的样品；
电感耦合等离子体(ICP)焰炬；
喷射器，所述喷射器被配置为将由所述激光烧蚀源从所述样品产生的烧蚀羽流传送到所述ICP焰炬；
压缩预混合气体源，所述压缩预混合气体源包含氦气和氩气中的至少一者与氢气的混合物。
22.如权利要求21所述的设备，其中所述压缩预混合气体源中的所述氢气大于0.1％且小于氢气可燃性限值。
23.如权利要求21所述的压缩预混合气体源，其中氢气按体积计介于1％与4％之间。
24.如权利要求21、22或23所述的设备，其中所述压缩预混合气体源包含按体积计至少50％的氦气。
25.如权利要求21、22或23所述的设备，其中所述压缩预混合气体源包含按体积计至少50％的氩气。
26.如权利要求21至25中任一项所述的设备，其中所述压缩预混合气体源将气体供应到包括所述样品载台的烧蚀室。
27.如权利要求21至26中任一项所述的设备，其中所述预混合气体源提供将所述烧蚀羽流运载到所述喷射器中的捕获气体。
28.如权利要求27所述的设备，其中附加气体源向所述喷射器提供转移气体，其中所述捕获气体将所述烧蚀羽流提升到所述喷射器中的所述转移气体中。
29.如权利要求28所述的设备，其中所述转移气体包括氩气，并且所述捕获气体包括氦气和氢气的混合物。
30.如权利要求27所述的设备，其中不存在单独的捕获和转移气体。
31.如权利要求21至30中任一项所述的设备，其中所述喷射器将激光烧蚀羽流引导至竖直ICP焰炬。
32.如权利要求21至29中任一项所述的设备，其还包括将所述转移气体提供到所述喷射器的附加气体源。
33.如权利要求32所述的设备，其中所述附加气体源包含按体积计至少50％的氩气，并且其中所述预混合气体源包含按体积计至少50％的氦气。
34.如权利要求21至33中任一项所述的设备，其中所述附加气体源是液体杜瓦瓶。
35.如权利要求21至34中任一项所述的设备，其中所述压缩预混合气体流被配置为在所述激光烧蚀羽流进入所述喷射器处的下游将补充流引入所述喷射器。
36.如权利要求35所述的设备，其中所述补充流被引入牺牲流的下游。
37.如权利要求36所述的设备，其中所述设备不包括牺牲流。
38.如权利要求21至34中任一项所述的设备，其中所述压缩预混合气体源提供捕获气体、转移气体和内部焰炬气体中的至少一者。
39.如权利要求21至38中任一项所述的设备，其被配置为向所述ICP焰炬中提供介于0.001L/min与0.1L/min之间的氢气流量。
40.如权利要求39所述的设备，其被配置为向所述ICP焰炬中提供介于0.001L/min与0.02L/min之间的氢气流量。
41.如权利要求21至40中任一项所述的设备，其进一步被配置为将介于总气体流量的0.002％与1％之间的氢气提供到所述ICP焰炬中。
42.如权利要求41所述的设备，其中所述设备被配置为将介于总气体流量的0.01％与0.1％之间的氢气提供到所述ICP焰炬中。
43.如权利要求41或42所述的设备，其中进入所述ICP焰炬的所述总气体流量介于5L/min与30L/min之间。
44.如权利要求21至43中任一项所述的设备，其还包括质谱仪，所述质谱仪被配置为检测由所述ICP焰炬产生的电离原子。
45.如权利要求44所述的设备，其中所述质谱仪包括高通滤波器，所述高通滤波器被配置为至少去除质量为80amu及更小的离子。
46.如权利要求21至45中任一项所述的设备，其中所述ICP焰炬被配置为以细胞悬液模式对全细胞进行雾化和电离，在所述细胞悬液模式下，所述ICP焰炬从所述激光烧蚀源解耦。
47.如权利要求21至46中任一项所述的设备，其还包括加湿***，所述加湿***被配置为对气体流进行加湿。
48.如权利要求47所述的设备，其中所述加湿气体流是转移气体流。
49.一种方法，其包括使用权利要求21至48中任一项所述的设备通过LA-ICP-MS来分析样品。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述样品是生物样品。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述样品包含标记原子。
52.如权利要求51所述的方法，其还包括在通过LA-ICP-MS分析所述样品之前用标记原子对所述样品进行标记。
53.如权利要求52所述的方法，进一步地，其中没有标记原子具有大于3％的平均氧化物溢出。
54.如权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述氢气使至少一些标记原子的灵敏度增加至少20％。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述氢气使至少一些标记原子的灵敏度增加至少50％。
56.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中在任何给定的5分钟时段内标记原子的平均灵敏度在分析所述样品的至少1小时内变化不超过10％。
57.一种用于电感耦合等离子体设备的压缩预混合气体源，其包括：
按体积计至少50％的氦气或氩气；以及
按体积计介于0.1％与5％之间的氢气。
58.如权利要求57所述的压缩预混合气体源，其包含按体积计至少50％的氦气。
59.如权利要求57所述的压缩预混合气体源，其包含按体积计至少50％的氩气。
60.如权利要求55、56或57所述的压缩预混合气体源，其中氢气按体积计介于1％与4％之间。
61.一种用于电感耦合等离子体设备的压缩预混合气体源，其包括：
按体积计至少50％的氦气或氩气；
按体积计至少0.1％的气体，其中所述气体包含元素氢。
62.如权利要求61所述的压缩预混合气体源，其中所述气体是甲烷、氨气或氢气。
63.一种设备，其包括：
样品载台，所述样品载台被配置为在至少两个方向上移动样品；
激光烧蚀源，所述激光烧蚀源被配置为烧蚀安装在所述样品载台上的样品；
电感耦合等离子体(ICP)源；
喷射器，所述喷射器被配置为将由所述激光烧蚀源从所述样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬；
加湿***，所述加湿***被配置为对气体流进行加湿。
64.如权利要求63所述的设备，其中所述气体流包括转移气体流。
65.如权利要求63或64所述的设备，其中所述气体流包括捕获气体流。
66.如权利要求63至65中任一项所述的设备，其中所述气体流包括补充气体流。
67.如权利要求63至66中任一项所述的设备，其中所述气体流包括辅助气体流。
68.如权利要求63至67中任一项所述的设备，其中所述气体流包含至少50％的氩气。
69.如权利要求63至68中任一项所述的设备，其中所述加湿***包括水扩散管件。
70.如权利要求69所述的设备，其中所述加湿***控制所述扩散管件的温度。
71.如权利要求69或70所述的设备，其还包括可变分流器，所述可变分流器能够调节以使所述水扩散管件周围的气体流分流。
72.如权利要求69至72中任一项所述的设备，其还包括控制器和湿度传感器，所述控制器和湿度传感器一起被配置为使所述扩散管件周围的流动气体流分流，以维持湿度水平。
73.如权利要求63至68中任一项所述的设备，其中所述加湿***包括水泵，所述水泵被配置为将水直接喷射到所述气体流中。
74.一种方法，其包括使用权利要求63至73中任一项所述的设备通过LA-ICP-MS来分析样品。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述样品是生物样品。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述样品包含标记原子。
77.如权利要求76所述的方法，其还包括在通过LA-ICP-MS分析所述样品之前用标记原子对所述样品进行标记。
78.如权利要求76或77所述的方法，其中没有标记原子具有大于3％的平均氧化物溢出。
79.如权利要求76、77或78所述的方法，其中所述加湿使至少一些标记原子的灵敏度增加至少20％。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述加湿使至少一些标记原子的灵敏度增加至少50％。
81.如权利要求73至80中任一项所述的方法，其中在任何给定的5分钟时段内标记原子的平均灵敏度在分析所述样品的至少1小时内变化不超过10％。
82.一种设备，其包括：
样品载台，所述样品载台被配置为在至少两个方向上移动样品；
激光烧蚀源，所述激光烧蚀源被配置为烧蚀安装在所述样品载台上的样品；
电感耦合等离子体(ICP)焰炬；
喷射器，所述喷射器被配置为将由所述激光烧蚀源从所述样品产生的烧蚀羽流传送到所述ICP焰炬；
压缩预混合气体源，所述压缩预混合气体源包含氦气和氩气中的至少一者与含氢气体的混合物。
83.如权利要求82所述的设备，其中所述含氢气体是甲烷、氨气或氢气。
84.一种设备，其包括：
样品载台，所述样品载台被配置为在至少两个方向上移动样品；
激光烧蚀源，所述激光烧蚀源被配置为烧蚀安装在所述样品载台上的样品；
电感耦合等离子体(ICP)源；
喷射器，所述喷射器被配置为将由所述激光烧蚀源从所述样品产生的烧蚀羽流传送到ICP焰炬；
其中所述设备被配置为在用于激光烧蚀ICP质谱法的操作期间将含氢分子供应到所述ICP焰炬的等离子体。
85.如权利要求84所述的设备，其中所述设备被配置为供应包含氢气流的蒸气。
86.如权利要求84或85所述的设备，其中所述蒸气包括水蒸气或醇蒸气。
87.如权利要求86所述的设备，其中所述蒸气包括水蒸气。
88.如权利要求86所述的设备，其中所述蒸气包括醇。
89.如权利要求88所述的设备，其中所述醇是乙醇。
90.一种方法，其包括使用权利要求84至89中任一项所述的设备通过LA-ICP-MS来分析样品。
91.一种设备，其包括：
样品载台，所述样品载台被配置为在至少两个方向上移动样品；
激光烧蚀源，所述激光烧蚀源被配置为烧蚀安装在所述样品载台上的样品；
电感耦合等离子体(ICP)焰炬，所述ICP焰炬耦合到质谱仪；
喷射器，所述喷射器被配置为将由所述激光烧蚀源从所述样品产生的烧蚀羽流传送到所述ICP焰炬；
其中所述ICP焰炬被配置为以细胞悬液模式对全细胞进行雾化和电离，在所述细胞悬液模式下，所述ICP焰炬从所述激光烧蚀源解耦；
其中所述设备被配置为在用于激光烧蚀ICP质谱法的操作期间而不是在所述细胞悬液模式期间将含氢分子供应到所述ICP焰炬的等离子体。
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