CN115003318A - 包含细菌菌株的组合物 - Google Patents

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Abstract

一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。

Description

包含细菌菌株的组合物
技术领域
本发明涉及的领域为包含从哺乳动物消化道中分离的细菌菌株的组合物以及此类组合物在治疗疾病中的用途。
发明背景
人类肠道在子宫内被认为是无菌的，但它在出生后立即暴露于多种母体和环境微生物。此后，发生了微生物定殖和演替的动态期，所述动态期受例如分娩方式、环境、饮食和宿主基因型等因素的影响，所有所述因素都会影响肠道微生物群的组成，尤其是在生命早期。随后，微生物群稳定下来并变得像成年人一样[1]。人类肠道微生物群含有超过1,500种不同的种系型，其丰度水平由两个主要细菌分支(门)，拟杆菌门和厚壁菌门占主导地位[2-3]。由人类肠道细菌定殖产生的成功共生关系产生了多种代谢、结构、保护和其它有益功能。定殖肠道增强的代谢活动确保了原本难以消化的饮食成分随着副产物的释放而降解，为宿主提供了重要的营养来源和额外的健康益处。同样，肠道微生物群的免疫学重要性已得到广泛认可，并在无菌动物中得到例证，所述动物的免疫***受损，在引入共生细菌后功能重建[4-6]。
越来越多的临床前文献证明了大脑与肠道微生物组之间的双向信号传导，涉及多个神经分泌和内分泌信号传导***。事实上，微生物组中梭菌物种的增加与脑部病症有关[7]，且拟杆菌门和厚壁菌门的失衡也与脑部发育病症有关[8]。表明患者与健康受试者之间的微生物群缺乏改变的研究对以下意见提出了质疑：肠道共生体水平的改变，包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、萨特氏菌属(Sutterella)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和瘤胃球菌属 (Ruminococcus)以及产碱菌科(Alcaligenaceae)的肠道共生体水平的改变与免疫介导的中枢神经***(CNS)病症有关[9]。这表明，目前，微生物组与人脑疾病之间的联系的实际效果尚不明确。因此，需要更直接的分析研究来确定改变微生物组对CNS病症的治疗影响。
鉴于某些细菌菌株可能对动物肠道产生的潜在积极影响，各种菌株已被提议用于治疗各种疾病(参见例如[9-12])。此外，某些菌株，主要包括乳杆菌和双歧杆菌菌株已被提议用于治疗与肠道不直接相关的各种炎症和自身免疫疾病(关于综述，参见[13]和[14])。另外，已经在动物模型中研究了一系列益生菌，以确定肠道微生物组在调节情绪行为中的作用，且双歧杆菌和乳杆菌是显示出有益作用，减少焦虑和重复行为，并增加社会互动的主要属[15-17]。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系，以及特定细菌菌株对肠道和全身水平以及任何特定类型疾病的确切影响尚不明确，特别是对于中枢神经***疾病。
越来越多的证据表明，神经发育和神经精神障碍，例如自闭症谱系障碍(ASD)会影响微生物群-肠-脑轴。动物模型为微生物群如何参与ASD提供了相当多的见解。此外，临床前研究表明，通过施用有益的活生物治疗剂来靶向肠道微生物群在改善动物模型中与自闭症相关的行为方面显示出功效。
参考文献[18]论述了通过施用包含选自拟杆菌属和/或肠球菌属的细菌物种的组合物来治疗神经发育障碍的可能方法，但仅提供拟杆菌属的数据。参考文献[19]论述了拟杆菌属和肠球菌属的类似用途，数据仅限于脆弱拟杆菌、普通拟杆菌和粪肠球菌。参考文献[78]讨论了屎肠球菌用于治疗和预防中枢神经***病症和病况的用途。参考文献[79]公开了利用细菌生产GABA。所述文献的表10列出了2219种能够通过工程改造来生产GABA的细菌种类。参考文献[79]中唯一提及的耐久肠球菌见表10；根本没有任何迹象表明耐久肠球菌物种的菌株固有地能够治疗任何CNS病症。
本领域需要治疗中枢神经***病症的新方法。
发明概述
本发明人开发了用于治疗或预防中枢神经***病症和病况，例如由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症和病况的新疗法。特别地，本发明人已经确定，耐久肠球菌物种的细菌菌株可以有效地治疗或预防由微生物群-肠-脑轴介导的疾病和病况。如实施例中所述，口服施用包含耐久肠球菌的组合物可减轻与微生物群-肠-脑轴功能障碍相关的症状。
因此，本发明提供一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。中枢神经***病症或病况可由微生物群-肠-脑轴介导。本发明进一步提供一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防神经发育病症或神经精神病况的方法中。例如，本发明人已经确定用来自此种类的细菌菌株进行治疗可以在中枢神经***病症，特别是那些由微生物群-肠-脑轴介导的病症的小鼠模型中提供临床益处。特别地，用来自此物种的细菌菌株进行治疗可调节中枢、自主和肠道神经***的信号传导；可调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴途径的活性；可调节神经内分泌和/或神经免疫途径；和/或可调节受试者的共生代谢物、炎症标志物和/或胃肠通透性的水平。
在特定实施方案中，本发明提供一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防选自由以下组成的组的病症或病况的方法中：自闭症谱系障碍(ASD)；儿童发育障碍；强迫症(OCD)；重度抑郁症(MDD)；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；精神***症谱系障碍；精神***症；双相障碍；精神病；情绪障碍；痴呆；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；慢性疼痛，例如中枢敏化或纤维肌痛；运动神经元病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和/或脑膜炎。耐久肠球菌物种的细菌菌株对微生物群-肠-脑轴和微生物群-肠-脑轴介导的病症或病况所展示的影响表明对微生物群-肠-脑轴介导的其它疾病和病况(例如上文列出的那些)的治疗益处。
在其它实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，其用于治疗由微生物群-肠-脑轴介导的病症和病况(例如上文列出的疾病和病况)引起的共病的方法。在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，其用于治疗与微生物群-肠-脑轴介导的疾病和病况(例如上文列出的疾病和病况)相关的胃肠道共病的方法。本申请中用于评估自闭症谱系障碍症状的小鼠模型实验在本领域中已知适用于评估其它中枢神经***病症(包括上文列出的那些)的症状[20-21]。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌 (Enterococcusdurans)物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防自闭症谱系障碍，例如自闭症的方法中。例如，用耐久肠球菌菌株治疗可以降低自闭症谱系障碍小鼠模型中的症状严重程度，并且可以减少刻板、重复、强迫和焦虑行为。在优选实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含耐久肠球菌物种的细菌菌株，用于减少刻板、重复、强迫或焦虑行为，特别是用于治疗自闭症谱系障碍。本发明人还确定用耐久肠球菌菌株治疗可以增强学***，所有这些都与自闭症谱系障碍的神经病理学有关。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可调节催产素和/或加压素激素的水平。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防强迫症(OCD)的方法中。在优选实施方案中，本发明提供了一种用于减少OCD治疗中的刻板、重复、强迫或焦虑行为，或改善学***，所有这些都与OCD的神经病理学有关。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防重度抑郁症(MDD)的方法中。例如，用耐久肠球菌菌株治疗可以在抑郁症小鼠模型中提供临床益处。在优选实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗抑郁症。在优选实施方案中，本发明提供了一种用于减少抑郁症治疗中的刻板、重复、强迫或焦虑行为，或改善学***，所有这些都与MDD的神经病理学有关。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可以增加催产素激素的水平和 /或降低加压素激素的水平。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可降低胃肠道通透性。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防焦虑症的方法中。例如，如实施例中所示，用耐久肠球菌菌株治疗可降低焦虑小鼠模型中的疾病发病率和疾病严重程度。在优选实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗焦虑症。使用耐久肠球菌的组合物对于治疗焦虑症可能特别有效。在优选实施方案中，本发明提供了一种用于减少焦虑症治疗中的刻板、重复、强迫或焦虑行为，或改善学习或记忆功能的组合物。在优选实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于减少焦虑症治疗中的绝望或无助感。在优选实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防焦虑症治疗中的恐新症和/或社交能力缺陷的组合物。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防应激障碍，例如创伤后应激障碍的方法中。例如，包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物可以减轻应激障碍小鼠模型中的应激。用耐久肠球菌菌株治疗可调节中枢、自主和肠道神经***的信号传导；可调节HPA轴途径的活性；可调节神经内分泌和/或神经免疫途径；并且可调节受试者的共生代谢物、炎症标志物和/或胃肠道通透性的水平，所有这些都与应激障碍的神经病理学有关。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可以增加催产素激素的水平和/或降低加压素激素的水平。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防精神***症谱系和精神病性障碍，例如精神***症的方法中。用耐久肠球菌菌株治疗可调节中枢、自主和肠道神经***的信号传导；可调节HPA轴途径的活性；可调节神经内分泌和/或神经免疫途径；且可调节受试者的共生代谢物和/ 或胃肠道通透性的水平，所有这些都与精神***症谱系和精神病性障碍的神经病理学有关。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可降低胃肠道通透性。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防双相障碍的方法中。例如，包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物可以减少双相障碍小鼠模型中的躁狂和/或抑郁的发生。用耐久肠球菌菌株治疗可调节中枢、自主和肠道神经***的信号传导；可调节HPA轴途径的活性；可调节神经内分泌和/或神经免疫途径；并且可调节受试者的共生代谢物、炎症标志物和/或胃肠道通透性的水平，所有这些都与双相障碍的神经病理学有关。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可调节催产素和/或加压素激素的水平。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防神经认知障碍，例如阿尔茨海默氏病的方法中。例如，包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物可改善神经认知障碍小鼠模型中的认知和行为功能。用耐久肠球菌菌株治疗可调节中枢、自主和肠道神经***的信号传导；可调节HPA轴途径的活性；可调节神经内分泌和/或神经免疫途径；且可调节受试者的共生代谢物和/或胃肠道通透性的水平，所有这些都与神经认知障碍的神经病理学有关。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗或预防帕金森氏病的方法中。用耐久肠球菌菌株治疗可调节中枢、自主和肠道神经***的信号传导；可调节HPA轴途径的活性；可调节神经内分泌和/或神经免疫途径；并且可调节受试者的共生代谢物、炎症标志物和/或胃肠道通透性的水平，所有这些都与帕金森氏病的神经病理学有关。在某些实施方案中，用耐久肠球菌菌株治疗可调节催产素和/或加压素激素的水平。
在某些实施方案中，本发明组合物用于在治疗或预防由微生物群 -肠-脑轴介导的疾病或病症中调节微生物群-肠-脑轴的方法。特别地，本发明组合物可用于调节微生物群-肠-脑轴以治疗或预防自闭症谱系障碍；强迫症；重度抑郁症；焦虑症；应激障碍；精神***症谱系障碍；双相障碍；神经认知障碍和帕金森氏病。
在优选实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株具有与SEQ ID NO:1或2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列。优选地，序列同一性是与SEQ ID NO:2。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ IDNO:2表示的16s rRNA序列。在这些实施方案中，对耐久肠球菌细菌物种的菌株的提及将被解释为具有本段中定义的序列同一性的任何细菌菌株。
在本发明的优选实施方案中，组合物中的细菌菌株是耐久肠球菌。细菌菌株可以具有与耐久肠球菌细菌菌株的16s rRNA序列至少 95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列。优选地，细菌菌株具有与SEQ IDNO:1或2 至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列。优选地，序列同一性是与SEQ ID NO:2。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的 16s rRNA序列。
在某些实施方案中，本发明组合物用于经口施用。本发明菌株的经口施用可有效地治疗中枢神经***病症和病况，特别是那些由微生物群-肠-脑轴介导的病症和病况。此外，经口施用对患者和从业者来说是方便的，并且允许递送至和/或部分或全部定殖于肠道。
在某些实施方案中，本发明组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
本发明还提供了以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株的生物纯培养物。纯培养物是在没有其它菌株的情况下生长的细胞群。
在某些实施方案中，本发明组合物已经冻干。本发明组合物还可以包含耐久肠球菌物种的冻干细菌菌株。冻干是用于制备允许细菌递送的稳定组合物的有效且方便的技术。
在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述组合物的食品。
在某些实施方案中，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含如上所述的耐久肠球菌物种的细菌菌株，或来自所述细菌的抗原。
另外，本发明提供一种治疗或预防由微生物群-肠-脑轴介导的疾病或病况的方法，其包括施用包含如本文所述的耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物。
如本领域技术人员将认识到的，相对而言，耐久肠球菌物种在遗传上与屎肠球菌细菌物种相似。然而，尽管如此，这些物种在分类学和表型上是不同的。已经发表了许多详细介绍它们的表型差异的文章，包括参考文献[30、31和77]。据报道，这些生物体具有不同的抗生素耐药性和其它功能特性。此外，如果将本申请实施例中呈现的行为动物研究的结果与参考文献[78]中的相应研究进行比较，可以观察到在施用本申请中的耐久肠球菌菌株和参考文献[78]中的屎肠球菌后观察到的结果存在显著差异，证明了对CNS病症的出人意料但有利的互补作用。
在开发上述发明的过程中，本发明人已经鉴定和表征了对疗法特别有用的细菌菌株。本发明的耐久肠球菌菌株被证明对于治疗本文所述的疾病，例如自闭症谱系障碍有效。因此，另一方面，本发明提供了以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其生物型或衍生物的细胞。本发明还提供了包含此类细胞或此类细胞的生物纯培养物的组合物。本发明还提供了以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其生物型或衍生物的细胞，用于治疗，特别是用于本文所述的疾病。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含以登录号NCIMB 43456保藏的菌株的组合物，用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含以登录号 NCIMB 43456保藏的菌株的组合物，用于治疗或预防神经发育病症或神经精神病况的方法中。在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含以登录号NCIMB 43456保藏的菌株的组合物，用于治疗或预防自闭症谱系障碍或优选自闭症的方法中。在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含以登录号NCIMB 43456保藏的菌株的组合物，用于减少刻板、重复、强迫和/或焦虑行为和/或改善学习和/或记忆功能，例如治疗自闭症的方法中。在优选实施方案中，本发明提供了包含以登录号NCIMB 43456保藏的菌株的组合物，用于减少例如在抑郁症和/焦虑症的治疗中的绝望或无助感。在优选实施方案中，本发明提供了包含以登录号NCIMB 43456保藏的菌株的组合物，用于治疗或预防恐新症和/或社交能力缺陷。
下面提供了本发明的另外编号的实施方案：
1.一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。
2.如实施方案1所述的组合物，其中所述中枢神经***病症或病况由微生物群-肠-脑轴介导。
3.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防神经发育病症或神经精神病况的方法中。
4.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防选自由以下组成的组的病症或病况的方法中：自闭症谱系障碍 (ASD)；儿童发育障碍；强迫症(OCD)；重度抑郁症(MDD)；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；精神***症谱系障碍；精神***症；双相障碍；精神病；情绪障碍；痴呆；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；慢性疼痛，例如中枢敏化或纤维肌痛；运动神经元病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和脑膜炎。
5.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍的方法中。
6.如实施方案5所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防自闭症的方法中。
7.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物预防、减少或减轻刻板、重复、强迫和/或焦虑行为和/或改善学习和/ 或记忆功能。
8.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防强迫症的方法中。
9.如实施方案8所述的组合物，其中所述组合物预防、减少或减轻重复、强迫和/或焦虑行为。
10.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防MDD的方法中。
11.如实施方案10所述的组合物，其中所述组合物治疗或预防急性重度抑郁发作和/或预防新发作(预防复发)。
12.如实施方案10或11所述的组合物，其中所述组合物预防、减少或减轻轻度、中度或重度MDD发作的发生。
13.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防焦虑症的方法中。
14.如实施方案13所述的组合物，其中所述焦虑症为广泛性焦虑症(GAD)；特定恐惧症；社交焦虑症；分离焦虑症；广场恐惧症；恐慌症和/或选择性缄默症。
15.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防神经认知障碍的方法中。
16.如实施方案15所述的组合物，其中神经认知障碍为血管性痴呆；混合型阿尔茨海默氏病和血管性痴呆；路易体病；额颞叶痴呆；帕金森氏痴呆；克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)；亨廷顿氏病；和韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoffsyndrome)。
17.如实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物用于治疗癫痫的方法中。
18.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于调节微生物群-肠-脑轴的方法中。
19.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与耐久肠球菌细菌菌株的16s rRNA序列至少95％、96％、97％、 98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA 序列。
20.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ IDNO:1或2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列。
21.如实施方案20所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列，或其中所述细菌菌株具有由 SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列。
22.一种包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列，所述组合物用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。
23.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于经口施用。
24.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
25.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。
26.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株是有活力的并且能够部分或完全定殖于肠道。
27.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含耐久肠球菌的单一菌株。
28.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其包含耐久肠球菌细菌菌株作为微生物聚生体的一部分。
29.一种包含如前述实施方案中任一项所述的组合物的食品，所述食品供前述实施方案中任一项使用。
30.一种包含如前述实施方案中任一项所述的组合物的疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防如前述实施方案中任一项所述的中枢神经***病症或病况的方法中。
31.一种治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物。
32.一种以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其生物型或衍生物的细胞，所述细胞用于治疗，或供实施方案1-28中任一项使用。
33.一种包含如实施方案32所述的细胞的组合物，所述组合物供实施方案32使用。
34.如实施方案33所述的组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。
35.一种以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其衍生物的生物纯培养物。
附图简述
*表示相对于媒剂对照组p<0.05；**表示相对于媒剂对照组p< 0.01；***表示相对于媒剂对照组p<0.001；****表示相对于媒剂对照组p<0.0001。
图1：NCIMB 43456的保藏收据。
图2：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对(A)回肠中闭合蛋白 mRNA表达和(B)结肠中闭合蛋白mRNA表达的影响。
图3：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对回肠中IDO1 mRNA 表达和(B)结肠中IDO1mRNA表达的影响。
图4：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对回肠中TJP1 mRNA表达和(B)结肠中TJP1mRNA表达的影响。
图5：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对回肠中Tph1 mRNA表达和(B)结肠中Tph1mRNA表达的影响。
图6：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对短链脂肪酸(SCFA)生产的影响。
图7：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对海马体中的基因表达的影响。
图8：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对杏仁核中的基因表达的影响。
图9：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对前额叶皮层中的基因表达的影响。
图10：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的弹珠掩埋测试中的刻板印象相关行为的影响。
图11：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的梳理测试中的刻板印象相关行为的影响。
图12：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的高架十字迷宫测试中的焦虑样行为的影响。
图13：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的露天场地测试中的焦虑样行为的影响。
图14：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的三室测试中的社交行为的影响。
图15：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的新物体识别测试中的抑郁样行为的影响。
图16：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的强迫游泳测试中的抑郁样行为的影响。
图17：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的肠运动的影响。
图18：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的肠道通透性的影响。
图19：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的动物体重的影响。
图20：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的器官重量和结肠长度的影响。
图21：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的脑干单胺水平的影响。
图22：用菌株NCIMB 43456或媒剂治疗对野生型小鼠和自闭症小鼠模型的杏仁核基因表达的影响。
本发明的公开内容
细菌菌株
本发明提供一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，用于治疗，例如用于治疗或预防中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况。本申请中用于评估自闭症谱系障碍症状的小鼠模型实验在本领域中已知适用于评估其它中枢神经***病症(包括上面列出的那些)的症状。
在某些实施方案中，本发明组合物包含耐久肠球菌并且不含任何其它细菌物种。在某些实施方案中，本发明组合物包含单一耐久肠球菌菌株并且不含任何其它细菌菌株或物种。
耐久肠球菌是肠球菌属的革兰氏阳性球菌。耐久肠球菌是一种兼性厌氧菌。耐久肠球菌的模式菌株为98D＝ATCC 19432＝DSM 20633 ＝CCM 5612＝NCDO 596＝NCTC 8307＝NCIMB 700596[22]。耐久肠球菌菌株98D的16S rRNA基因序列的GenBank登录号是 NR_036922(在本文中公开为SEQ ID NO:1)。[23]中描述了这种示例性耐久肠球菌菌株。
用于本发明的其它耐久肠球菌菌株包括：NCIMB 662[24]、 NCIMB 8587[24]、NCIMB 8782[24]、NCIMB 11077[25]、NCIMB 701624[26]、NCIMB 701630[26]、NCIMB 701632[26]、NCIMB 701724(NCDO1724)、NCIMB 701951[27]。在某些实施方案中，本发明组合物包含这些菌株之一或其衍生物或生物型。实施例中测试的耐久肠球菌细菌保藏于国际保藏机构NCIMB,Ltd.(Ferguson Building, Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB219YA,Scotland)，所述细菌由4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences InnovationBuilding, Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)于2019年8月9日保藏为“耐久肠球菌”，并被分配登录号NCIMB 43456。SEQ ID NO:2中提供了菌株 NCIMB 43456的16S rRNA序列。
在保藏于NCIMB,Ltd之前，菌株NCIMB 43456使用本领域技术人员已知的技术在分类学上被鉴定为属于耐久肠球菌物种，并在文献中报道为能够在分类学上将耐久肠球菌物种与肠球菌属中的其它物种，包括屎肠球菌和粪肠球菌区分开来，包括16S rRNA和 MALDI-TOF分析。
此外，虽然已知道屎肠球菌菌株作为益生菌的用途，特别是在动物饲料中，但据本发明人所知，耐久肠球菌作为益生菌或在疾病治疗中的用途尚未得到全面探索。
与实施例中测试的菌株密切相关的细菌菌株，包括以登录号 NCIMB 43456保藏的细菌生物型也预期有效地治疗或预防自闭症谱系障碍和中枢神经***病症和病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症和病况。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与耐久肠球菌细菌菌株的16srRNA序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列。优选地，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:1或2至少95％、96％、97％、 98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA 序列。优选地，序列同一性是与SEQ ID NO:2。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA序列。
生物型是密切相关的菌株，其具有相同或非常相似的生理和生化特征。可以通过对以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的其它核苷酸序列进行测序来鉴定作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。例如，可以对基本上整个基因组进行测序，并且用于本发明的生物型菌株可在其整个基因组的至少80％上 (例如，在其整个基因组的至少85％、90％、95％或99％上)具有至少 95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性。例如，在一些实施方案中，生物型菌株在其基因组的至少98％上具有至少98％序列同一性或在其基因组的99％上具有至少99％序列同一性。用于鉴定生物型菌株的其它合适序列可包括hsp60 或重复序列，例如BOX、ERIC、(GTG)5或REP[28]。生物型菌株可具有与以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的对应序列具有至少 95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与SEQ ID NO:2的16S rRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
或者，可通过使用登录号NCIMB 43456保藏物以及限制性片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(FAFLP) 和重复DNA元件(rep)-PCR指纹图谱，或蛋白质图谱，或部分16S 或23s rDNA测序来鉴定作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。在优选实施方案中，此类技术可用于鉴定其它耐久肠球菌菌株。
在某些实施方案中，作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是当通过扩增的核糖体DNA限制性分析(ARDRA)进行分析时，例如当使用Sau3AI限制酶时提供与以登录号NCIMB 43456保藏的细菌相同的模式的菌株(示例性方法和指导参见例如[29])。或者，生物型菌株被鉴定为具有与以登录号NCIMB 43456保藏的细菌相同碳水化合物发酵模式的菌株。
在一些实施方案中，作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是不从甘油产生酸的肠球菌菌株。在一些实施方案中，作为以登录号NCIMB43456保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是不从甘露糖醇产生酸的肠球菌菌株。在一些实施方案中，作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是不从蔗糖产生酸的肠球菌菌株。在一些实施方案中，酸是否由甘油、甘露糖醇和/或蔗糖产生是通过API 50CH***，在1％(wt/vol)蛋白胨水中使用溴甲酚紫(0.002％，wt/vol)作为指示剂确定的(参见参考文献23)。
肠球菌在特定条件下的生长能力被广泛用于其选择性分离 ([30])。在一些实施方案中，作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型且适用于本发明的菌株是不能代谢甘油、D-甘露糖醇、D- 山梨糖醇、L-***糖、葡糖酸盐、蜜二糖和/或蔗糖中的一种或多种(例如多于1、2、3、4、5、6或全部7种)，优选甘油、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇和/或蔗糖中的一种或多种(例如多于1、2、3或全部 4种)的肠球菌菌株；此类菌株是根据参考文献[30、31和77]中提供的耐久肠球菌的表型。
在一些实施方案中，作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型且适用于本发明的菌株是不能代谢D-甘露糖醇的肠球菌菌株 (例如根据参考文献[30和31]中提供的耐久肠球菌的表型)。
在一些实施方案中，作为以登录号NCIMB 43456保藏的细菌的生物型且适用于本发明的菌株是在亚碲酸盐中生长的肠球菌菌株(如耐久肠球菌的情况，参见参考文献[30和31])。
在一些实施方案中，生物型不是酪黄肠球菌(E.casseliflavus)菌株。在一些实施方案中，生物型不是病臭肠球菌(E.malodoratus)菌株。在一些实施方案中，生物型不是屎肠球菌菌株。
在一些实施方案中，生物型是海氏肠球菌(E.hirae)菌株。
在本发明组合物和方法中适用的其它耐久肠球菌菌株，例如以登录号NCIMB43456保藏的细菌的生物型可使用任何适当方法或策略，包括实施例中所述的分析来鉴定。例如，用于本发明的菌株可通过在厌氧YCFA中培养和/或将细菌施用于自闭症谱系障碍小鼠模型，且接着评估细胞因子水平来鉴定。具体地，与以登录号NCIMB 43456 保藏的细菌具有类似生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可用于本发明。具体地，生物型菌株对自闭症谱系障碍模型产生的影响将与实施例中所示的影响相当，这可以通过使用实施例中所述的培养和施用方案来识别。
本发明特别优选的菌株是以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株。这是在实施例中测试的示例性耐久肠球菌菌株，并显示对治疗疾病有效。因此，本发明提供了以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其衍生物的细胞，例如分离的细胞。本发明还提供了一种组合物，其包含以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其衍生物的细胞。本发明还提供了以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株的生物纯培养物。本发明还提供了以登录号 NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其衍生物的细胞，用于治疗，特别是用于本文所述的疾病。
以登录号NCIMB 43456保藏的菌株的衍生物可以是子菌株(后代) 或从原始菌株培养(亚克隆)的菌株。本发明菌株的衍生物可例如在遗传水平上被修饰，而不消除生物活性。特别地，本发明的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将具有与原始NCIMB 43456菌株相当的免疫调节活性。具体地，衍生菌株对自闭症谱系障碍模型产生的影响将与实施例中所示的影响相当，这可以通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。例如，衍生菌株将对BTBR小鼠模型和/或母体免疫激活(MIA)小鼠模型产生相当的影响，这可以通过如实施例2中所述的弹珠掩埋测试、高架十字迷宫测试、三室社会互动测试、新物体识别测试、强迫游泳测试、脑干单胺水平和/或杏仁核基因表达来鉴定。 NCIMB 43456菌株的衍生物将通常是NCIMB 43456菌株的生物型。
细菌菌株还可以是与以登录号NCIMB 43456保藏的菌株具有相同安全性和治疗功效特征的菌株，并且此类细胞包括于本发明中。
在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是海氏肠球菌菌株。
在优选实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是有活力的并且能够部分或完全定殖于肠道。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株对以下中的一种或多种具有耐药性：阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿贝卡星(arbekacin)和地贝卡星(dibekacin)、阿洛西林(azlocillin)、巴卡西林 (bacampicillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、头孢托比普罗 (ceftobiprole)、克拉霉素(clarithromycin)、多利培南(doripenem)、红霉素(erythromycin)、夫西地酸(fusidic acid)、庆大霉素(gentamicin)、格雷帕沙星(grepafloxacin)、亚胺培南(imipenem)、交沙霉素(josamycin)、美罗培南(meropenem)、美西西林(meziocillin)、哌拉西林(piperacillin)、利福平(rifampin)、利福昔明(rifaximin)、罗克他霉素(rokitamycin)、罗莎霉素(rosaramicin)、罗红霉素(roxithromycin)、螺旋霉素(spiramycin)、链霉素(streptomycin)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(sulfamethoxazole/trimethoprim)、泰利霉素(telithromycin)、替卡西林(ticarcillin)、替卡西林/克拉维酸(ticarcillin/clavulanate)、托氟沙星(tosufloxacin)、甲氧苄啶(trimethoprim)和维吉尼亚霉素 (virginiamycin)。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株对喹诺普汀-达福普汀(Quinopristin-dalfopristin)敏感。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株对β-内酰胺抗生素具有耐药性。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株对万古霉素具有耐药性。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株对氨苄西林具有耐药性。
治疗用途
调节微生物群-肠-脑轴
肠道与大脑之间的通信(微生物群-肠-脑轴)通过双向神经体液通信***发生。最近的证据表明，存在于肠道中的微生物群可以通过微生物群-肠-脑轴调节大脑发育并产生行为表型。事实上，许多综述表明微生物群-肠-脑轴在维持中枢神经***功能中的作用，并暗示微生物群-肠-脑轴的功能障碍与中枢神经***病症和病况的发展有关[8]、 [9]、[32]。
大脑与肠道之间的双向通信(即肠-脑轴)包括中枢神经***；神经内分泌和神经免疫***，包括下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴；自主神经***(ANS)的交感和副交感臂，包括肠神经***(ENS)和迷走神经；以及肠道微生物群。
如实施例中所证明的，本发明组合物可以调节微生物群-肠-脑轴并减少与CNS病症相关的行为症状。因此，本发明组合物可用于治疗或预防中枢神经***(CNS)病症，特别是与微生物群-肠-脑轴功能障碍相关的那些病症和病况。本发明组合物可用于减轻与CNS病症相关的行为症状。
本发明组合物还可用于治疗或预防神经发育病症和/或神经精神病况。神经发育疾病和神经精神病况通常与微生物群-肠-脑轴有关。本发明组合物可用于治疗或预防由微生物群-肠-脑轴功能障碍介导的神经发育疾病和/或神经精神病况。在进一步优选的实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防神经发育病症或神经精神病况。
在特定实施方案中，本发明组合物可用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病或病况：自闭症谱系障碍(ASD)；儿童发育障碍；强迫症(OCD)；重度抑郁症；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；精神***症谱系障碍；精神***症；双相障碍；精神病；情绪障碍；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；痴呆；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；慢性疼痛(例如中枢敏化或纤维肌痛)；运动神经元病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和/或脑膜炎。
本发明组合物可特别适用于治疗或预防慢性疾病，治疗或预防对其它疗法(例如用抗精神病药和/或抗抑郁药治疗)没有反应的患者的疾病，和/或治疗或预防与微生物群-肠-脑轴功能障碍相关的组织损伤和症状。
在某些实施方案中，本发明组合物调节CNS。在一些实施方案中，本发明组合物调节自主神经***(ANS)。在一些实施方案中，本发明组合物调节肠神经***(ENS)。在一些实施方案中，本发明组合物调节下丘脑、垂体、肾上腺(HPA)轴。在一些实施方案中，本发明组合物调节神经内分泌途径。在一些实施方案中，本发明组合物调节神经免疫途径。在一些实施方案中，本发明组合物调节CNS、ANS、 ENS、HPA轴和/或神经内分泌和神经免疫途径。在某些实施方案中，本发明组合物调节受试者的共生代谢物和/或胃肠道通透性的水平。
微生物群-肠-脑轴的信号传导由神经***调节。因此，在一些实施方案中，本发明组合物调节神经***中的信号传导。在某些实施方案中，本发明组合物调节中枢神经***的信号传导。在一些实施方案中，本发明组合物调节感觉神经元中的信号传导。在其它实施方案中，本发明组合物调节运动神经元中的信号传导。在其它实施方案中，本发明组合物调节ANS中的信号传导。在一些实施方案中，ANS是副交感神经***。在优选实施方案中，本发明组合物调节迷走神经的信号传导。在其它实施方案中，ANS是交感神经***。在其它实施方案中，本发明组合物调节肠神经***中的信号传导。在某些实施方案中，ANS和ENS神经元的信号传导直接响应胃肠道的管腔内容物。在其它实施方案中，ANS和ENS神经元的信号传导间接响应由管腔细菌产生的神经化学物质。在其它实施方案中，ANS和ENS神经元的信号传导响应由管腔细菌或肠内分泌细胞产生的神经化学物质。在某些优选实施方案中，ENS的神经元激活影响CNS功能的迷走神经传入。在一些实施方案中，本发明组合物调节肠嗜铬细胞的活性。
在某些实施方案中，本发明组合物调节动物模型中的恐惧条件反射。在某些实施方案中，本发明组合物可用于调节恐惧和/或焦虑的发展，和/或调节恐惧和/或焦虑在受试者中消失的程度。在某些实施方案中，本发明组合物可用于调节动物模型中应激诱导的体温过高的程度。在某些实施方案中，本发明组合物调节受试者的应激和/或焦虑水平。
自闭症谱系障碍(ASD)
自闭症谱系障碍是一组异质的神经发育病况，其特征是社会互动、沟通方面的早发困难以及异常受限、重复的行为和兴趣。症状可能从很小的时候就被识别出来，但ASD通常在开始接受主流教育的更有能力的儿童中被诊断出来。自闭症是ASD的主要类型。
从历史上看，自闭症的诊断基于三个核心领域：社会互动受损、沟通异常以及行为和兴趣受限和重复。在国际疾病分类(ICD-10R, WHO 1993)以及诊断和统计手册(DSM-IV,American Psychiatric Association,2000)中，自闭症属于广泛性发育障碍(PDD)的总称，有四种可能的诊断亚型：阿斯伯格综合征(Asperger Syndrome)，儿童自病症/自闭性障碍、非典型自闭症和PDD-未另行指定。在DMS-5中，这些诊断亚型被合并为一个单一的自闭症谱系障碍(ASD)类别，且先前使用的三个核心障碍领域已减少到两个主要领域，即社会沟通和互动，以及重复行为，其包括感觉统合功能障碍。
ASD是一种“谱系障碍”，因为它以多种不同的方式影响每个人，并且范围可能从非常轻微到严重。受影响个体的功能因语言能力、智力水平、共病、症状的构成和获得服务的机会而有很大差异。认知功能、学习、注意力和感觉处理通常受损。
DSM-IV指出，自闭症的诊断需要存在至少六种症状，包括至少两种定性社会互动障碍的测量、一种定性沟通障碍的症状以及一种限制和重复行为的症状。DMS-5将ASD的诊断重新定义为两个症状领域：(i)社会互动和社会沟通缺陷；和(ii)受限、重复的行为、兴趣或活动模式。
共病医学病况在ASD中非常普遍。共病医学病况包括焦虑和抑郁、癫痫发作、注意力缺陷、攻击性行为、睡眠问题、胃肠道病症、癫痫、智力迟钝、智力障碍和/或喂养困难。
实施例证明本发明组合物在自闭症谱系障碍的动物模型中实现了疾病发病率和疾病严重程度的降低，并且它们因此可用于治疗或预防ASD。
ASD是一种部分由环境因素引发的中枢神经***病症。因此，微生物群-肠-脑轴的功能障碍可能是导致ASD发展和持续的原因。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防ASD。在一些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防自闭症。在一些实施方案中，自闭症是广泛性发育障碍(PDD)。在另一个实施方案中，PDD 是阿斯伯格综合征、童年自病症/自闭性障碍，非典型自闭症和/或 PDD-未另行指定。因此，在一些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍、自闭症、广泛性发育障碍；阿斯伯格综合征；童年自闭症/自闭性障碍、非典型自闭症和/或PDD-未另行指定。
本发明组合物可用于调节受试者的微生物群-肠-脑轴。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于预防已被鉴定为具有ASD风险的患者或已在产前或早期发育阶段、在童年和/或在成年期被诊断患有ASD的患者的ASD。本发明组合物可用于预防ASD的发展。
本发明组合物可用于控制或减轻ASD。ASD的治疗或预防可指例如减轻症状的严重性或减少对患者来说是个问题的恶化的频率或触发因素的范围。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻ASD的至少一种核心症状。
在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻在DMS-5 中分类的ASD的两个症状域中的至少一个。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻社会互动和/或社会沟通障碍。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻限制、重复的行为、兴趣或活动模式。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻社会互动、社会沟通缺陷和/或限制、重复的行为、兴趣或活动模式。
在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻重复行为、刻板行为、强迫行为、常规行为、相同行为和受限行为。在一些实施方案中，本发明组合物改善患有ASD的受试者的社会意识、学习、记忆功能、社会信息处理、社会沟通能力、社交焦虑/回避和自闭性专注和特征。在优选实施方案中，本发明组合物减少了患有ASD的受试者的绝望或无助感。在优选实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防患有ASD的受试者的恐新症和/或社交能力缺陷的组合物。
在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与ASD核心症状相关的额外症状。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有ASD的受试者的易怒(包括攻击性、故意自残和发脾气)、激动、哭泣、嗜睡、社交退缩、刻板行为、多动、不服从、言语不当、焦虑、抑郁和/或行为过度或控制不足。在一些实施方案中，本发明组合物改善患有ASD的受试者的认知功能、学习、记忆功能、注意力和/或感觉处理。
在其它实施方案中，本发明组合物改善患有ASD的受试者的次要结果量度。在一些实施方案中，次要结果量度包括额外的症状和/ 或功能评定量表、行为量表和其它感兴趣的量度。
在一些实施方案中，本发明组合物引起用于评估患有ASD的受试者的核心症状的诊断和/或症状量表的积极变化。在一些实施方案中，诊断和/或症状量表是自闭症诊断访谈–修订版(ASI-R)。在一些实施方案中，诊断或症状量表是现在为ADOS-2的自闭症诊断观察时间表-通用(ADOS-G)。在其它实施方案中，诊断或症状量表是修订的自闭症诊断访谈(ADI-R)。在其它实施方案中，诊断或症状量表是社交和沟通障碍诊断访谈(DISCO)。在其它实施方案中，诊断或症状量表是儿童自闭症评定量表(CARS和CARS2)。
在一些实施方案中，本发明组合物引起ASD功效终点的一般量度的积极变化。在某些实施方案中，通用量度包括但不限于异常行为检查表(ABC)、儿童行为检查表(CBCL)、Vineland-II适应性行为量表 (VABS)、社会反应量表(SRS)和/或重复行为量表–修订版(RBS-R)。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有ASD的受试者的总体功能表现出积极的影响。
对于本领域技术人员来说，其它量表是已知的。在一些实施方案中，本发明组合物将改善本领域技术人员已知的诊断和/或症状量表的结果。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻ASD共病的发生率。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻焦虑和抑郁、癫痫发作、注意力缺陷、攻击性行为、睡眠问题、胃肠道病症(包括肠易激综合征(IBS))、癫痫、智力迟钝、智力障碍和/或喂养困难的发生率。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻胃肠道共病，例如腹痛、腹泻和/或肠胃胀气。
在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻临床上可能与自闭症类似的某些精神和行为障碍的症状。因此，在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻注意力缺陷障碍(ADHD)；情感障碍/焦虑症；依恋障碍；对立违抗障碍(ODD)；强迫症(OCD)和/或包括精神***症(认知障碍)在内的精神病。
在一些实施方案中，当与用于治疗ASD的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻ASD方面特别有效。此类疗法包括抗精神病药、抗焦虑药和抗抑郁药。此类药物包括利培酮
Figure BDA0003767152760000271
奥氮平
Figure BDA0003767152760000272
氟西汀
Figure BDA0003767152760000273
舍曲林
Figure BDA0003767152760000274
氟伏沙明
Figure BDA0003767152760000275
氯米帕明
Figure BDA0003767152760000276
氟哌啶醇
Figure BDA0003767152760000277
硫利达嗪；氟奋乃静；氯丙嗪；齐拉西酮
Figure BDA0003767152760000278
卡马西平
Figure BDA0003767152760000279
拉莫三嗪
Figure BDA00037671527600002710
托吡酯
Figure BDA00037671527600002711
丙戊酸
Figure BDA00037671527600002712
哌醋甲酯
Figure BDA00037671527600002713
***
Figure BDA00037671527600002714
和劳拉西泮
Figure BDA00037671527600002715
强迫症(OCD)
OCD是属于焦虑症的一种异质、慢性且致残的病症。根据 DSM-IV定义，OCD的基本特征是反复出现的强迫观念和/或强迫行为(标准A)，其严重且耗时(每天超过一小时)或引起明显痛苦或显著干扰受试者的正常日常生活、职业功能、日常社会活动或关系(标准 C)。在病症过程中的某个时刻，患者已经认识到强迫观念或强迫行为是过度的或不合理的(标准B)。
强迫观念被定义为反复和持续的想法、冲动或图像，其被认为是侵入性的和不恰当的，并导致明显的焦虑或痛苦。所述想法、冲动或图像不仅仅是对现实生活问题的过度担忧，它们被患者认为是他自己思想的产物(例如对污染的恐惧、对称强迫观念)。人们试图用其它一些想法或行为来忽略、抑制或中和所述强迫观念。
强迫行为被定义为人们感到被驱使执行以响应强迫观念或根据必须严格应用的规则的重复行为(例如洗手、订购、囤积、检查)或精神行为(例如祈祷、数数、默默地重复单词)。
OCD通常与其它精神疾病，包括重度抑郁症、其它焦虑症(广泛性焦虑症、社交焦虑症、恐慌症)、物质滥用和饮食失调(厌食症和贪食症)的共病率有关。
OCD是一种精神病症，其可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的OCD。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻OCD的基本症状特征。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的反复出现的强迫观念和/或强迫行为。在某些实施方案中，强迫观念是反复出现的或持续的想法、冲动或图像，它们被体验为侵入性和不适当的，并导致明显的焦虑或痛苦。在某些实施方案中，强迫行为是受试者感到被驱使执行以响应强迫观念或根据必须严格应用的规则的重复行为。
在某些实施方案中，本发明组合物根据Y-BOCS和/或NIMH-OC 诊断和/或症状量表改善受试者的OCD症状。在一些实施方案中，Y-BOCS量表用于监测主要终点的改善。在一些实施方案中， NIMH-OC量表用于监测次要参数的改善。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有ASD的受试者的总体社会功能(关系、工作等)表现出积极的影响。在一些实施方案中，总体量表是希恩残疾量表(Sheehan disability scale)。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻OCD的至少一种共病。OCD的共病包括重度抑郁症、其它焦虑症(广泛性焦虑症、社交焦虑症、恐慌症)、物质滥用和饮食失调(厌食症和贪食症)、妥瑞综合征(Gilles de la Tourette syndrome)、ADHD(注意力缺陷/多动障碍)和发育障碍。
在一些实施方案中，当与用于治疗OCD的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻OCD方面特别有效。此类疗法包括血清素和多巴胺再摄取抑制剂；氯米帕明和抗精神病药。
重度抑郁症(MDD)
MDD与严重的社会心理功能障碍和高度的个体精神紧张以及过高的发病率和死亡率(***风险相当大)有关。重度抑郁症一词包括临床抑郁症、重度抑郁症、单相抑郁症、单相障碍、复发性抑郁症和单纯性抑郁症。重度抑郁症一词涵盖了情绪障碍；心境恶劣；慢性抑郁症；季节性情感障碍和边缘型人格障碍。
根据DMS-5标准，MDD症状包括抑郁情绪，或对日常活动失去兴趣或乐趣超过两周；以及社会、职业和教育功能受损。几乎每天都会出现以下九种特定症状中的至少五种：抑郁情绪或一天中大部分时间易怒；每天大部分时间对大多数活动的兴趣或乐趣降低；体重显著变化或食欲改变；睡眠改变(失眠或嗜睡)；活动变化(精神运动性激越或迟缓)；疲劳或能量损失；内疚或无价值(无价值感或过度或不适当的内疚感)；注意力降低(思考或集中注意力的能力下降，或更加优柔寡断；和***倾向(死亡或***的想法，或受试者有***计划)。此外， MDD与焦虑症状有关，包括不合理的担忧；专注于不愉快的担忧；难以放松和/或感到紧张。MDD发作可以是轻度、中度或重度。
MDD发作通常与其它精神病症或躯体病症(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、脑血管病症、癌症和慢性疼痛综合征)的共病有关。MDD 经常与广泛的其它精神病症相关，包括广泛性焦虑症；焦虑症；物质使用障碍；创伤后应激障碍(PTSD)；人格障碍；疼痛；应激；肠易激综合征；失眠；头痛和人际关系问题。
重度抑郁症是一种精神病症，其可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的MDD。
在某些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防急性重度抑郁发作和/或预防新发作(预防复发)。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻轻度、中度或重度MDD发作的发生。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻如由本文所列的DMS-5标准分类的MDD的一种或多种症状。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的抑郁情绪。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者对大多数活动的兴趣或愉悦感的降低。在一些实施方案中，本发明组合物在2周时段内减少MDD症状的发生。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断量表改善 MDD的症状。这种评估症状改善的量表包括汉密尔顿抑郁评定量表 (Hamilton Rating Scale ofDepression，HAMD)和蒙哥马利阿斯伯格抑郁评定量表(Montgomery Asberg DepressionRating Scale)。此外，祖恩氏自评抑郁量表(Zung Self-Rating Depression Scale，SDS)和祖恩氏自评焦虑量表(Zung Self-Rating Anxiety Scale，SAS)也是合适的症状改善量表。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有MDD的受试者的总体社会和职业功能表现出积极的影响。
在某些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防治疗抵抗性 MDD。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻MDD的至少一种共病。MDD的共病包括广泛性焦虑症；焦虑症；物质使用障碍；创伤后应激障碍(PTSD)；人格障碍；疼痛；应激；IBS；失眠；和头痛。
在一些实施方案中，当与用于治疗MDD的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻MDD方面特别有效。此类疗法包括抗抑郁药、增强策略(例如组合疗法、锂和其它情绪稳定剂、甲状腺激素和非典型抗精神病药)或甚至第二代抗精神病药。
焦虑症
焦虑症是由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而可能发展或持续存在的精神病症。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的焦虑症。在某些实施方案中，焦虑症为广泛性焦虑症 (GAD)；特定恐惧症；社交焦虑症；分离焦虑症；广场恐惧症；恐慌症和选择性缄默症。
GAD是根据DMS-5中的六项标准来诊断。第一个标准是超过六个月的过度焦虑或担忧，其中焦虑或担忧大部分时间都存在于许多活动中。第二个标准是受试者不能控制第一个标准的症状。第三个标准是至少出现以下中的三种(儿童为一种)：躁动；容易疲劳；注意力问题；易怒；肌肉紧张和睡眠问题。最后三个标准是症状导致严重的社会、职业和功能障碍；症状不是由药物治疗、药物或其它身体健康问题引起的；并且所述症状不与另一种精神问题(例如恐慌症)更相符。所有其它焦虑症均可被视为GAD的鉴别诊断。
GAD经常与广泛的其它作为共病的精神病症相关联，所述精神病症包括：抑郁症；物质使用障碍；应激；IBS；失眠；头痛；疼痛；心脏事件；人际关系问题和ADHD。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻如由本文所列的DMS-5标准分类的受试者的GAD的一种或多种症状。根据 DMS-5，相同的症状与其它焦虑症有关。因此，在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的焦虑症的一种或多种症状。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的焦虑或担忧。在某些实施方案中，本发明组合物在六个月时段内减少症状的发生。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻躁动；疲劳；注意力不集中；易怒；肌肉紧张；和/或睡眠问题。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与焦虑症相关的社交、职业和功能障碍。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断量表改善焦虑症的症状。在某些实施方案中，用于评估症状改善的量表包括汉密尔顿焦虑评定量表(HAM-A)。在一些实施方案中，HAM-A总量表用于评估主要终点。在其它实施方案中，HAM-A精神焦虑因子可用作次要终点。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有焦虑症的受试者的总体社会、职业和功能障碍表现出积极的影响。在一些实施方案中，总体量表是希恩残疾量表(Sheehan disability scale)。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻GAD和焦虑症的至少一种症状。GAD的共病包括抑郁症；物质使用障碍；应激；IBS；失眠；头痛；疼痛；心脏事件；和ADHD。
在一些实施方案中，当与用于治疗焦虑症的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻焦虑症方面特别有效。此类疗法包括选择性血清素再摄取抑制剂(文拉法辛、度洛西汀、依他普仑和帕罗西汀)；苯二氮卓类药物(阿普***、劳拉西泮和氯硝西泮)；普瑞巴林
Figure BDA0003767152760000331
和加巴喷丁
Figure BDA0003767152760000332
血清素受体部分激动剂(丁螺环酮和坦度螺酮)；非典型血清素能抗抑郁药(如丙咪嗪和氯米帕明)；单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)(如吗氯贝胺和苯乙肼)；羟嗪；心得安；可乐定；胍法辛和哌唑嗪。
创伤后应激障碍(PTSD)
PTSD是一种严重且致残的病症，其基本特征为包括创伤事件作为此病症的诱发因素。
根据DMS-V标准，PTSD的症状分为四大类：(i)侵入：实例包括噩梦、对创伤事件的不必要想法、闪回以及对创伤性提醒作出情绪困扰或生理反应的反应；(ii)回避：实例包括避免触发创伤性记忆，包括地点、对话或其它提醒；(iii)认知和情绪的负面改变：实例包括对创伤事件的自我或他人的扭曲责备、对自己或世界的负面信念、持续的负面情绪(例如恐惧、内疚、羞耻)、疏离感和情感受限(例如无法体验积极情绪)；(iv)觉醒和反应的改变：实例包括愤怒、鲁莽或自毁行为、睡眠问题、注意力问题、惊吓反应增加和过度警觉。
在创伤事件后4周内消退的症状符合急性应激障碍的标准。DSM 区分急性(症状持续时间少于三个月)与慢性PTSD(症状持续时间超过3个月)。如果症状在应激源后超过6个月开始出现，则所述病症被定义为迟发性PTSD。
PTSD带有与重度抑郁症和物质使用障碍的高共病。
PTSD是一种精神病症，其可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的PTSD。根据类似的发病机制，在某些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防应激障碍。在某些实施方案中，本发明组合物治疗急性应激障碍。在一些实施方案中，本发明组合物治疗急性和/或慢性PTSD。在一些实施方案中，本发明组合物治疗迟发性 PTSD。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻如由本文所列的DMS-5标准分类的受试者的PTSD(或应激障碍)的一种或多种症状。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有PTSD 的受试者的侵入性思维。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有PTSD的受试者的回避行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有PTSD的受试者的认知和情绪的负面改变。在优选实施方案中，本发明组合物防止患有PTSD的受试者的觉醒和反应性的改变。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断量表改善 PTSD和应激障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估症状改善的量表是临床施用的PTSD(CAPS)量表。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有PTSD和应激障碍的受试者的总体社会、职业和功能障碍表现出积极的影响。在一些实施方案中，总体量表是希恩残疾量表(Sheehan disability scale)。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻PTSD和应激障碍的至少一种共病。PTSD和应激障碍的共病包括MDD、物质使用障碍；应激和焦虑。
在一些实施方案中，当与用于治疗PTSD和应激障碍的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻PTSD和应激障碍方面特别有效。此类疗法包括血清素能药、三环类抗抑郁药、情绪稳定剂、肾上腺素能抑制剂、抗精神病药、苯二氮卓类药物、舍曲林
Figure BDA0003767152760000351
氟西汀
Figure BDA0003767152760000352
和/或帕罗西汀
Figure BDA0003767152760000353
精神***症谱系和精神病性障碍
这些疾病会影响受试者清晰思考、作出良好判断、情绪反应、有效沟通、理解现实和行为得体的能力。精神病包括精神***症(下面列出的症状)；***情感障碍(受试者有精神***症和情绪障碍的症状，如抑郁症或双相障碍)；类精神***症(表现出精神***症的症状，但症状持续时间较短：1至6个月)；短暂的精神病性障碍(受试者表现出突然的、短期的精神病行为，通常是对非常紧张的事件，例如家庭中的死亡的反应-通常在不到一个月内恢复)；妄想障碍(妄想持续至少1个月)；共有型精神病性障碍；物质诱发的精神病性障碍；由于另一种医学病况引起的精神病性障碍；妄想痴呆(表现出与精神***症类似的症状，并且在晚年，当人们上了年纪时开始出现)。最著名的精神病性障碍是精神***症，且大多数精神病性障碍表现出与精神***症类似的症状。
精神***症是一种具有异质病程和症状谱的严重精神疾病。精神***症在临床上表现为所谓的阳性和阴性症状。阳性症状包括妄想、幻觉、言语混乱以及混乱或紧张性行为。阴性症状包括情感扁平化、思维和言语的流畅性和生产力受限以及目标导向行为的开始。阳性症状似乎反映了正常功能的过度或扭曲，而阴性症状似乎反映了正常功能的减少或丧失。另外，认知缺陷(工作记忆、信息处理、注意力/警觉、学习、推理和社会认知的缺陷)很常见。目前的抗精神病药物治疗通常显示较差的认知缺陷改善。精神***症患者也会罹患情绪症状。除了这些主要症状外，精神***症还与其它精神症状的共病相关，如躁狂和抑郁症状、焦虑或强迫症状、物质滥用和依赖以及人格障碍。
根据DMS-5，对于精神***症的诊断，受试者必须具有以下症状中的至少两种：妄想；幻觉；言语混乱；混乱或紧张性行为和阴性症状。至少一种症状必须是存在妄想、幻觉或言语混乱。持续的干扰迹象必须持续至少6个月，在此期间受试者必须经历至少1个月的活动性症状，并在相当长的时间内出现社会或职业恶化问题。
精神***症谱系和精神病性障碍是由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而可能发展或持续存在的精神障碍。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的精神***症谱系和/或精神病性障碍。在某些实施方案中，精神***症谱系和精神病性障碍选自精神***症；***情感障碍；类精神***症；短暂的精神病性障碍；妄想症；共有型精神病性障碍；物质诱发的精神病性障碍；由于另一种医疗病况引起的精神病性障碍和妄想痴呆。在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防精神***症。在某些实施方案中，精神***症选自偏执型、紊乱型、紧张型、未分化和残留型精神***症。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻如由本文所列的DMS-5标准分类的受试者的精神***症的一种或多种症状。这些实施方案适用于预防、减少或减轻其它精神***症谱系和精神病性障碍的症状。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻精神***症的阴性症状。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻精神***症的阳性症状。阳性症状是大多数人通常不会经历但存在于精神***症患者身上的症状，例如妄想、幻觉、言语障碍。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻精神***症的阴性和阳性症状。阴性症状是正常情绪反应或其它思维过程的缺陷，例如情感扁平化和紧张性行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有精神***症的受试者的妄想、幻觉、言语混乱以及混乱或紧张性行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有精神***症的受试者的情感扁平化、思维和言语的流畅性和生产力受限以及目标导向行为的开始。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻患有精神***症的受试者的认知缺陷和/或情绪障碍。
在某些实施方案中，本发明组合物在6个月时间段内减少受试者中精神***症阳性和/或阴性症状的发生。在某些实施方案中，本发明组合物改善患有精神***症谱系或精神病性障碍的受试者的社会和/或职业功能。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断量表改善精神***症谱系或精神病性障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估症状改善的量表是阳性和阴性症状量表(PANSS)和简要精神病评定量表(BPRS)。在某些实施方案中，使用阴性症状评定量表(SANS)。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有精神***症谱系或精神病性障碍的受试者的总体社会和职业障碍显示出积极作用。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻精神***症谱系或精神病性障碍的至少一种共病。在某些实施方案中，共病是：躁狂和/或抑郁症状、焦虑或强迫症状、物质滥用和依赖以及人格障碍。
在某些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防治疗抵抗性难治性精神***症。
在一些实施方案中，当与用于治疗PTSD和应激障碍的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻精神***症谱系或精神病性障碍方面特别有效。在某些实施方案中，此类疗法包括第一代抗精神病药，包括氯丙嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇和/或奋乃静。在某些实施方案中，此类疗法包括第二代疗法，包括阿立哌唑
Figure BDA0003767152760000371
阿塞那平
Figure BDA0003767152760000372
依匹哌唑
Figure BDA0003767152760000373
卡利拉嗪
Figure BDA0003767152760000374
氯氮平
Figure BDA0003767152760000375
伊潘立酮
Figure BDA0003767152760000376
鲁拉西酮
Figure BDA0003767152760000377
奥氮平
Figure BDA0003767152760000381
帕利哌酮(Invega)；喹硫平
Figure BDA0003767152760000382
利培酮
Figure BDA0003767152760000383
齐拉西酮
Figure BDA0003767152760000384
双相障碍
双相障碍通常是一种慢性疾病。躁狂是双相障碍的主要症状。根据躁狂和抑郁发作的特定持续时间和模式，有几种类型的双相障碍。在DMS-5中，对双相I型障碍、双相II型障碍、循环型障碍、快速循环型双相障碍和NOS双相障碍进行了区分。
根据DSM，躁狂症是一个明显的异常和持续升高、膨胀或易怒情绪的时期。发作必须持续一周，并且情绪必须具有至少三种以下症状：高自尊；睡眠需求减少；语速加快；思想快速跳跃；容易分心；对目标或活动的兴趣增加；精神运动性激越；对具有高危险风险的活动的追求增加。
双相I型障碍包括一次或多次躁狂或混合(躁狂和抑郁)发作和至少一次重度抑郁发作(有关MDD发作的症状见上文)。双相II型障碍有一次或多次重度抑郁发作并伴有至少一次轻躁狂发作。没有躁狂或混合发作。轻躁狂症是一种较轻的躁狂症形式。所述症状是造成重大社会、职业和功能障碍的原因。循环精神病(Cyclothymia)的特征是随着轻躁狂期的改变而改变低水平的抑郁症。在作出诊断之前，成人的症状必须至少存在两年或儿童的症状必须存在一年。成人和儿童的无症状期分别持续不超过两个月或一个月。快速循环型双相障碍是一种严重的双相障碍形式。当一个人在一年内至少有四次重度抑郁症、躁狂症、轻躁狂症或混合状态发作时，就会发生这种情况。未明确指定 (NOS)双相障碍将双相障碍分类为不明确适合其它类型的双相障碍。当存在多种双相障碍状但不足以满足任何其它亚型的标签时，即可诊断为NOS。
双相障碍与以下共病有关：ADHD；焦虑症；物质障碍；肥胖和代谢综合征。
双相障碍是一种精神病症，其可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的双相障碍。在某些实施方案中，双相障碍是双相 I型障碍。在某些实施方案中，双相障碍是双相II型障碍。在某些实施方案中，双相障碍是循环型障碍。在某些实施方案中，双相障碍是快速循环型双相障碍。在某些实施方案中，双相障碍是NOS双相障碍。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的双相障碍的一种或多种症状。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者中躁狂发作的发生。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻异常和持续升高、膨胀或易怒的情绪的发生。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻以下一种或多种症状：高自尊；睡眠需求减少；语速加快；思想快速跳跃；容易分心；对目标或活动的兴趣增加；精神运动性激越；对具有高危险风险的活动的追求增加。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者中一种或多种躁狂或混合发作的发生。在某些实施方案中，本发明组合物减少受试者中至少一次重度抑郁发作的发生。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻至少一种伴有至少一种轻躁狂发作的重度抑郁发作的发生。
在优选实施方案中，本发明组合物治疗双相障碍的急性期和/或预防进一步发作的发生。在某些实施方案中，本发明组合物治疗患有双相障碍的受试者的躁狂/抑郁发作的急性期并预防进一步躁狂/抑郁发作的发生。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断量表改善双相障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估躁狂发作症状改善的量表是躁狂状态评定量表和杨氏躁狂评定量表。在某些实施方案中，量表是倍克-拉范森躁狂量表(Bech-Rafaelsen Mania Scale，BRMAS)。在某些实施方案中，用于评估从躁狂发作转变为抑郁发作的症状改善的量表包括汉密尔顿抑郁评定量表、蒙哥马利-阿斯伯格评定量表和倍克- 拉范森抑郁量表。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有双相障碍的受试者的总体社会、职业和功能障碍表现出积极的影响。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻双相障碍的至少一种共病。在某些实施方案中，共病选自ADHD、焦虑症、物质障碍、肥胖症和代谢综合征。
在某些实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防对锂和双丙戊酸钠无反应的躁狂抑郁症和双相障碍。
在一些实施方案中，当与用于治疗双相障碍的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻双相障碍方面特别有效。在某些实施方案中，此类疗法包括碳酸锂、抗惊厥药(包括丙戊酸盐、双丙戊酸钠、卡马西平和拉莫三嗪)和抗精神病药(包括阿立哌唑、奥氮平、喹硫平和利培酮)。
神经认知障碍和阿尔茨海默氏病
在DSM-5中，术语痴呆被替换为术语重度神经认知障碍和轻度神经认知障碍。神经认知障碍是一类异质的精神疾病。最常见的神经认知障碍是阿尔茨海默氏病，其次是血管性痴呆或两者的混合形式。其它形式的神经退行性病症(例如路易体病、额颞叶痴呆、帕金森氏痴呆、克雅氏病、亨廷顿氏病和韦尼克-科尔萨科夫综合征)伴有痴呆。
根据DSM-5的痴呆症的症状标准是在选自以下的一个或多个认知领域中相比于先前表现水平显著认知下降的证据：学习和记忆；语言；执行功能；复杂的注意力；知觉运动和社会认知。认知缺陷必须干扰日常活动的独立性。另外，认知缺陷不仅仅发生在谵妄的情况下，并且不能用另一种精神障碍(例如MDD或精神***症)更好地解释。
除了主要症状外，患有神经认知障碍的受试者还表现出行为和精神症状，包括激越、攻击性、抑郁、焦虑、冷漠、精神病和睡眠-觉醒周期紊乱。
神经认知障碍是由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而可能发展或持续存在的精神病症。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的神经认知障碍。在优选实施方案中，神经认知障碍是阿尔茨海默氏病。在其它实施方案中，神经认知障碍选自血管性痴呆；混合型阿尔茨海默氏病和血管性痴呆；路易体病；额颞叶痴呆；帕金森氏痴呆；克雅氏病；亨廷顿氏病；和韦尼克-科尔萨科夫综合征。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的神经认知障碍的一种或多种症状。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者中认知衰退的发生。在某些实施方案中，本发明组合物改善患有神经认知障碍的受试者在选自以下的一个或多个认知领域中的表现水平：学习和记忆；语言；执行功能；复杂的注意力；知觉运动和社会认知。在一些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与选自激越、攻击性、抑郁、焦虑、冷漠、精神病和睡眠 -觉醒周期紊乱的神经认知障碍相关的一种或多种行为和精神症状的发生。
在某些实施方案中，本发明组合物通过在临床前阶段干预可疑的致病机制来预防、减少或减轻症状性疾病。在某些实施方案中，本发明组合物改善疾病修饰，减缓或阻止症状进展。在一些实施方案中，症状进展的减缓或阻止与延迟潜在神经病理学过程的证据相关。在优选实施方案中，本发明组合物改善神经认知障碍的症状，包括增强的认知和功能改善。在优选实施方案中，本发明组合物改善痴呆的行为和精神症状(BPSD)。在优选实施方案中，本发明组合物改善患有神经认知障碍的受试者进行日常活动的能力。
在优选实施方案中，本发明组合物改善患有阿尔茨海默氏病的受试者的认知和功能。在一些实施方案中，本发明组合物改善患有阿尔茨海默氏病的受试者的认知终点。在一些实施方案中，本发明组合物改善患有阿尔茨海默氏病的受试者的功能终点。在优选实施方案中，本发明组合物改善患有阿尔茨海默氏病的受试者的认知和功能终点。在进一步优选的实施方案中，本发明组合物改善患有阿尔茨海默氏病的受试者的整体临床反应(整体终点)。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断测试改善神经认知障碍的症状。在某些实施方案中，用于评估阿尔茨海默氏病(和其它神经认知障碍)的症状改善的测试选自客观认知、日常生活活动、整体变化评估、健康相关的生活质量测试和评估神经认知障碍的行为和精神症状的测试。
在某些实施方案中，用于评估症状改善的客观认知测试使用阿尔茨海默氏病评定量表认知分量表(ADAS-cog)和经典ADAS量表。在某些实施方案中，认知的症状改善使用用于阿尔茨海默氏病的神经生理学测试组合(NTB)来评定。
在一些实施方案中，整体变化评估测试使用临床整体印象-整体改善(CGI-I)量表来评估精神和神经障碍。在一些实施方案中，整体量表是基于临床医生访谈的变化印象加(CIBIC-plus)。在一些实施方案中，整体量表是阿尔茨海默氏病合作研究单位临床医生的整体变化印象(ADCS-CGIC)。
在某些实施方案中，健康相关的生活质量量度是阿尔茨海默氏病相关的QOL(ADRQL)和QOL-阿尔茨海默氏病(QOL-AD)。
在某些实施方案中，评估神经认知障碍的行为和精神症状的测试选自阿尔茨海默氏病行为病理学评定量表(BEHAVE-AD)；痴呆行为评定量表(BRSD)；神经精神量表(NPI)；和柯恩-曼斯菲尔德激越量表 (Cohen-Mansfield Agitation Inventory，CMAI)。
在一些实施方案中，当与用于治疗神经认知障碍的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻神经认知障碍方面特别有效。在某些实施方案中，此类疗法包括乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括多奈哌齐
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加兰他敏
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和卡巴拉汀
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以及美金刚。
帕金森氏病
帕金森氏病是一种常见的神经退行性疾病，其神经病理学特征是异质的神经细胞(产生多巴胺的细胞)群的退化。帕金森氏病的临床诊断需要运动迟缓和至少以下核心症状之一：静止性震颤；肌肉强直和姿势反射障碍。在疾病进展过程中可能出现或发展的其它体征和症状是自主神经障碍(流涎、皮脂溢、便秘、排尿障碍、性功能、直立性低血压、多汗症)、睡眠障碍以及嗅觉或温度感障碍。许多帕金森氏病患者会出现抑郁症状和认知功能障碍共病，以及与路易体相关的神经认知障碍。
帕金森氏病是一种精神病症，其可能由于微生物群-肠-脑轴功能障碍而发展或持续存在。因此，在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防受试者的帕金森氏病。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的帕金森氏病的一种或多种症状。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的帕金森氏病的一种或多种核心症状。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的运动迟缓。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的静止性震颤；肌肉僵硬和/或姿势反射障碍。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与帕金森氏病进展相关的一种或多种症状，所述症状选自自主神经障碍(流涎、皮脂溢、便秘、排尿障碍、性功能、直立性低血压、多汗症)、睡眠障碍以及嗅觉或温度感障碍。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与帕金森氏病共存的抑郁症状。在某些实施方案中，本发明组合物改善语言记忆和/或执行功能。在某些实施方案中，本发明组合物改善注意力、工作记忆、语言流畅性和/或焦虑。
在其它优选的实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与帕金森氏病共存的认知功能障碍。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻帕金森氏病的进展。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻后期运动并发症。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻后期运动波动。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻神经元损失。在某些实施方案中，本发明组合物改善帕金森氏病痴呆(PDD) 的症状。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻执行功能、注意力和/或工作记忆的损害。在某些实施方案中，本发明组合物改善多巴胺能神经传递。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受损的多巴胺能神经传递。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断量表改善帕金森氏病的症状。在某些实施方案中，用于评估帕金森氏病的运动功能症状改善的测试是统一帕金森氏病评定量表。特别地，UPDRS II考虑日常生活活动，且UPDRS III考虑运动检查。
在一些实施方案中，本发明组合物根据症状或诊断测试和/或量表改善与PDD相关的症状。在某些实施方案中，测试或量表选自霍普金斯语言学习测试–修订版(HVLT-R)；德利-卡普兰执行功能*** (D-KEFS)颜色词干扰测试；汉密尔顿抑郁评定量表(HAM-D 17；抑郁)；汉密尔顿焦虑评定量表(HAM-A；焦虑)和统一帕金森氏病评定量表(UPDRS；PD症状严重程度)。
在一些实施方案中，本发明组合物改善了用于评估精神和神经病症的临床总体印象–总体改善(CGI-I)量表。在一些实施方案中，本发明组合物对患有帕金森氏病的受试者的总体社会和职业障碍表现出积极的影响。
在一些实施方案中，当与用于治疗神经认知障碍的另一疗法组合使用时，本发明组合物在预防、减少或减轻神经认知障碍方面特别有效。在某些实施方案中，此类疗法包括多巴胺激动剂(包括L-Dopa+)；单胺氧化酶抑制剂、儿茶酚胺-O-甲基转移酶抑制剂；抗胆碱能药和谷氨酸调节剂。
其它中枢神经***病症
在优选实施方案中，本发明组合物用于治疗或预防与微生物群- 肠-脑轴功能障碍相关的中枢神经***病症。除上述实施方案外，本发明组合物还用于治疗或预防精神病；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)和/或慢性疼痛。在进一步的实施方案中，本发明组合物可用于治疗或预防运动神经元疾病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和/或脑膜炎。
神经化学因子、神经肽和神经递质以及微生物群-肠-脑轴
如上所概述，微生物群-肠-脑轴由许多不同的生理***调节。微生物群-肠-脑轴由许多信号传导分子调节。这些信号传导分子水平的改变导致中枢神经***发育和/或功能的缺陷。实际上，本节中公开的许多分子与微生物群-肠-脑轴的功能和中枢神经***病症或病况的发病机制有关([33]、[9]、[32]、[34])。本发明人进行的实验表明，行为改变可以通过施用耐久肠球菌来触发。这种效应可能是由对信号传导分子，特别是在本节中列出的那些的水平的影响介导。这些改变可能是与耐久肠球菌相关的治疗益处的原因。因此，由于本文公开的中枢神经***病症和病况表现出类似的基本生化和生理发病机制(即通过微生物群-肠-脑轴)，耐久肠球菌也可以对这些病症和病况实现类似的治疗益处。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受神经化学因子、神经肽和神经递质水平的调节。因此，在某些实施方案中，本发明组合物调节神经化学因子、神经肽和神经递质的水平。因此，在某些优选实施方案中，本发明组合物直接改变CNS生物化学。在优选实施方案中，本发明组合物调节脑源性神经营养因子(BDNF)的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节单胺的水平。在某些实施方案中，单胺是血清素(5- 羟色胺(5-HT))、多巴胺、去甲肾上腺素和/或肾上腺素。在某些实施方案中，单胺是儿茶酚胺。在某些实施方案中，儿茶酚胺是多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素。在某些实施方案中，单胺是色胺。在某些实施方案中，色胺是血清素和褪黑激素。在某些实施方案中，本发明组合物调节乙酰胆碱的水平。
在某些优选实施方案中，本发明组合物调节催产素的水平。催产素与情绪、社会、认知和神经内分泌生理学以及自动调节有关。特别地，催产素释放与抗焦虑；积极的情绪；母性行为、夫妻关系；性行为；社会记忆；嗅觉记忆；厌食作用；HPA轴对应激的反应减弱；出生和哺乳期间的自激以及其它生理和心理过程有关。在某些实施方案中，本发明组合物提高催产素的水平。在某些实施方案中，本发明组合物降低催产素的水平。在某些实施方案中，本发明组合物增加或减少催产素信号传导。在某些实施方案中，本发明组合物调节催产素受体的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节钙离子流入或流出神经元、肌肉和胃肠道细胞的流量。在优选实施方案中，本发明组合物通过调节催产素的水平来治疗和预防与微生物群-肠-脑轴相关的神经发育和神经精神病症和疾病。
在某些实施方案中，本发明组合物调节脑单胺和其代谢物的水平。在优选实施方案中，单胺是血清素。在某些实施方案中，本发明组合物调节色氨酸代谢的血清素能和/或犬尿氨酸途径。在某些实施方案中，本发明组合物调节血清素代谢物，例如5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节多巴胺代谢物，例如高香草酸(HVA)的水平。调节这些神经递质和神经化学因子可用于治疗应激、抑郁和焦虑相关障碍。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受γ-氨基丁酸(GABA)水平的调节。因此，在优选实施方案中，本发明组合物调节GABA的水平。GABA 是一种降低神经元兴奋性的抑制性神经递质。在某些实施方案中，本发明组合物提高GABA的水平。在某些实施方案中，本发明组合物降低GABA的水平。在某些实施方案中，本发明组合物改变GABA 能神经传递。在某些实施方案中，本发明组合物调节中枢神经***的不同区域的GABA转录水平。在某些实施方案中，共生来源的GABA 穿过血脑屏障并直接影响神经传递。在某些实施方案中，本发明组合物导致海马体、杏仁核和/或蓝斑中GABA的减少。在某些实施方案中，本发明组合物导致皮质区中GABA的增加。
已发现调节GABA水平的组合物可用于治疗癫痫。因此，在一些实施方案中，本发明组合物用于治疗癫痫。在一些实施方案中，治疗降低受试者的癫痫发作的频率和/或强度。癫痫发作的频率和/或强度在不同受试者中可能有很大差异。在一些实施方案中，治疗包括将癫痫发作的频率和/或强度降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
用于测量癫痫发作频率和/或强度降低的模式是本领域已知的。例如，可以使用查尔方特癫痫发作严重程度量表(Chalfont Seizure Severity Scale)评估癫痫发作的强度。
在一些受试者中，测量一天中频率和/或强度的降低可能是合适的。在一些受试者中，测量一天或更长时间段，例如两天、一周、一个月、六个月、一年或更长时间内频率和/或强度的降低可能是合适的。因此，在一些实施方案中，在一天、两天、三天、一周、两周、一个月、三个月、六个月、一年、两年或超过两年的时间段内测量癫痫发作频率的百分比降低。在一些实施方案中，治疗包括在受试者清醒时降低癫痫发作的频率和/或强度。在一些实施方案中，治疗包括在受试者睡着时降低癫痫发作的频率和/或强度。在一些实施方案中，治疗包括在受试者清醒时降低癫痫发作的频率和/或强度但在受试者睡着时不降低癫痫发作的频率和/或强度，或在受试者睡着时降低癫痫发作的频率和/或强度但在受试者清醒时不降低癫痫发作的频率和/ 或强度。在一些实施方案中，治疗包括消除癫痫发作。在一些实施方案中，癫痫发作的频率降低至每天一次或更少、每两天一次或更少、每周一次或更少、每两周一次或更少、一个月一次或更少、每三个月一次或更少、每六个月一次或更少、一年一次或更少、每两年一次或更少、或每三年一次或更少。在一些实施方案中，治疗使得受试者经历至少一天、至少两天、至少一周、至少一个月、至少三个月、至少六个月、至少一年、至少两年、或至少三年的无癫痫发作期。
在一些实施方案中，当与用于治疗癫痫的另一疗法组合使用时，本发明组合物在治疗癫痫方面特别有效。在一些实施方案中，与本发明组合物组合使用的其它疗法选自以下中的一种或多种：乙酰唑胺 (Acetazolamide)、布立西坦(Brivaracetam)、卡马西平(Carbamazepine)、氯巴占(Clobazam)、氯硝西泮(Clonazepam)、醋酸艾司利卡西平(Eslicarbazepine acetate)、乙琥胺(Ethosuximide)、依维莫司 (Everolimus)、加巴喷丁(Gabapentin)、拉考沙胺(Lacosamide)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、左乙拉西坦(Levetiracetam)、奥卡西平 (Oxcarbazepine)、吡仑帕奈(Perampanel)、***(Phenobarbital)、苯妥英钠(Phenytoin)、吡拉西坦(Piracetam)、普瑞巴林(Pregabalin)、扑米酮(Primidone)、卢非酰胺(Rufinamide)、丙戊酸钠(Sodium valproate)、司替戊醇(Stiripentol)、噻加宾(Tiagabine)、托吡酯 (Topiramate)、丙戊酸(Valproic acid)、维加巴林(Vigabatrin)和唑尼沙胺 (Zonisamide)。
在一些实施方案中，治疗使得受试者能够减少剂量或停止服用一种或多种其它抗癫痫药而不会出现症状恶化。例如，在一些实施方案中，可以减少GABA-介体抗癫痫药的剂量或可以不再服用GABA-介体抗癫痫药。在一些实施方案中，GABA-介体抗癫痫药选自丙戊酸、丙戊酸钠和普瑞巴林。
例如血清素、褪黑激素、GABA、组胺和乙酰胆碱等神经活性分子的水平与例如痴呆、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病或癫痫等中枢神经***疾病的病理生理学有关。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受组胺水平的调节。因此，在某些实施方案中，本发明组合物调节组胺的水平。在某些实施方案中，组胺具有免疫调节作用。在某些实施方案中，组胺水平使细菌能够从内腔转移到体循环中。因此，在一些实施方案中，本发明组合物改变胃肠道通透性和/或屏障功能。在某些其它实施方案中，组胺充当与中枢过程相关的神经递质。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受HPA轴的调节。因此，在某些实施方案中，本发明组合物调节HPA活性。在某些实施方案中，本发明组合物减弱HPA应激反应。在某些优选实施方案中，本发明组合物调节与HPA活性相关的炎症反应。在某些实施方案中，本发明组合物调节糖皮质激素的水平。在某些优选实施方案中，本发明组合物调节皮质酮和肾上腺素的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节促皮质激素释放因子和/或加压素的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节加压素和/或其它神经垂体或抗利尿激素的水平。 HPA轴活动的改变与焦虑和应激障碍有关。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受免疫反应以及炎症因子和标志物的改变的调节。因此，在某些实施方案中，本发明组合物可调节免疫反应。在某些实施方案中，本发明组合物调节循环神经免疫信号传导分子的全身水平。在某些优选实施方案中，本发明组合物调节促炎细胞因子的产生和炎症。在某些实施方案中，本发明组合物调节炎症状态。在某些实施方案中，本发明组合物调节脾细胞增殖反应。在某些实施方案中，本发明组合物调节以下各者的全身和/或血浆水平：C 反应蛋白；IL-1家族细胞因子；IL-1β；IL-2；IL-4；IL-6；IL-8；IL-10； IL-12p40；IL-17；IL-17A；IL-21；IL-23；TNF-α和IFN-γ。在一些实施方案中，本发明组合物调节抗炎细胞因子，例如IL-10的水平。在优选实施方案中，本发明组合物提高IL-10的水平。在一些实施方案中，本发明组合物调节TNF-α的水平。在优选实施方案中，本发明组合物调节IFN-γ的水平。在一些实施方案中，本发明组合物调节 IFN-γ:IL-10比率。在某些优选实施方案中，本发明组合物降低 IFN-γ:IL-10比率。在优选实施方案中，本发明组合物降低促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平。细胞因子循环水平的增加与各种神经精神病症，包括抑郁症、焦虑症、精神***症和ASD密切相关。炎症状态改变的证据在例如精神***症、重度抑郁症和双相障碍等病症中尤为突出。
在某些实施方案中，本发明组合物调节耐受介导的树突状细胞的水平并相互调节促炎和抗炎细胞因子反应。在某些实施方案中，本发明组合物降低髓过氧化物酶(炎症和氧化的标志物)的全身水平。免疫***和炎症反应的治疗调节剂可用于治疗自闭症谱系障碍和情绪障碍。
在某些实施方案中，本发明组合物调节对感染或疫苗接种的免疫反应。在某些实施方案中，本发明组合物调节响应于感染或疫苗接种的炎症水平。在某些优选的实施方案中，本发明组合物调节响应于怀孕期间的感染或疫苗接种的母体免疫激活。因此，本发明组合物可在怀孕期间施用以治疗或预防后代的中枢神经***病症。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受共生代谢物水平的调节。因此，在某些实施方案中，本发明组合物调节微生物群代谢物的全身水平。在某些优选实施方案中，本发明组合物调节短链脂肪酸(SCFA)的水平。在某些实施方案中，SCFA的水平提高或降低。在一些实施方案中，SCFA是丁酸(BA)(或丁酸盐)。在一些实施方案中，SCFA是丙酸(PPA)。在一些实施方案中，SCFA是乙酸。在某些实施方案中，本发明组合物调节SCFA穿过血脑屏障的能力。在某些实施方案中，本发明组合物调节多糖A(PSA)的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节强效促炎内毒素脂多糖(LPS)的水平。LPS导致炎性细胞因子的产生，所述细胞因子改变生理性大脑活动并调节神经肽合成。 LPS对CNS的调节具有重要影响，增加了专门控制情绪的区域(例如杏仁核)的活动。在某些实施方案中，本发明组合物调节色氨酸和/或其代谢物的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节4-乙基苯基硫酸盐(4EPS；与ASD相关行为异常相关的***毒素)的水平。在优选实施方案中，本发明组合物降低受试者中4-乙基苯基硫酸盐的水平。由腔内肠道刺激引起的神经元信号传导途径刺激产生的信号强烈调节大脑活动，包括疼痛感知、免疫反应调节、情绪控制和其它稳态功能。因此，能够调节这些因子的水平的组合物在治疗或预防CNS 病症方面具有广泛的治疗应用。
微生物群-肠-脑轴的信号传导受胃肠道通透性水平的调节。因此，在一些实施方案中，本发明组合物改变胃肠道上皮的完整性。在某些实施方案中，本发明组合物调节胃肠道的通透性。在某些实施方案中，本发明组合物调节胃肠道的屏障功能和完整性。在某些实施方案中，本发明组合物调节胃肠道运动。在某些实施方案中，本发明组合物调节共生代谢物和炎症信号传导分子从胃肠道腔向血流中的转移。
微生物群-肠-脑轴的信号传导由胃肠道中的微生物组组成调节。因此，在某些实施方案中，本发明组合物调节胃肠道的微生物组组成。在某些实施方案中，本发明组合物防止微生物组失调和毒性代谢物 (例如LPS)的相关增加。在某些实施方案中，本发明组合物调节胃肠道中梭菌的水平。在优选实施方案中，本发明组合物降低胃肠道中梭菌的水平。在某些实施方案中，本发明组合物降低空肠弯曲杆菌的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节有害厌氧细菌的增殖和由这些细菌产生的神经毒素的产生。在某些实施方案中，本发明组合物调节乳杆菌和/或双歧杆菌的微生物组水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节萨特氏菌属、普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属和/或产碱科的微生物组水平。在某些实施方案中，本发明组合物增加植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和/或布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii) 的水平。
在某些实施方案中，本发明组合物通过广泛使用抗生素来防止微生物组组合物的失调。在某些优选实施方案中，本发明组合物在怀孕期间施用抗生素后维持功能性母体微生物组组成。因此，本发明组合物可在怀孕期间施用以治疗或预防后代的中枢神经***病症。
微生物组的调节已被证明可有效改善与精神病症相关的行为，包括焦虑、抑郁症、自闭症谱系障碍、强迫症和记忆能力(包括空间和非空间记忆)，以及其它CNS相关病症，包括帕金森氏病。某些研究表明，益生菌可以减少心理应激、躯体化、抑郁和愤怒敌意。乳杆菌的水平与抑郁症相关，并且与与胃肠道不适相关的疼痛信号传导有关。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与本文所述的中枢神经***病症相关的行为症状中的至少一种。在优选实施方案中，本发明组合物改善受试者的整体临床反应。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的刻板、重复行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻异常限制性行为和/或兴趣的发生。在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的反复出现的强迫观念和/或强迫行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的社会行为缺陷。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的回避行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的沟通行为缺陷。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻恐新症和/或社交能力缺陷。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的认知和情绪的负面改变。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的焦虑相关行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的应激相关行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的抑郁相关行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的攻击性行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻异常和持续升高、膨胀或易怒的情绪的发生。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的侵入性思维。在优选实施方案中，本发明组合物防止受试者的觉醒和反应性的改变。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的妄想、幻觉、言语混乱以及混乱或紧张性行为。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的情感扁平化、思维和言语的流畅性和生产力受限以及目标导向行为的开始。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻以下一种或多种症状：绝望、无助、高自尊；睡眠需求减少；语速加快；思想快速跳跃；容易分心；对目标或活动的兴趣增加；精神运动性激越；对具有高危险风险的活动的追求增加。
在优选实施方案中，本发明组合物改善了受试者的记忆功能，例如空间和/或非空间记忆缺陷。在优选实施方案中，本发明组合物改善受试者的学习。在优选实施方案中，本发明组合物改善了受试者的认知和功能。在优选实施方案中，本发明组合物改善受试者的自主活动。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的运动迟缓。在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻受试者的静止性震颤；肌肉僵硬和/或姿势反射障碍。
在优选实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与本文公开的CNS病症相关的至少一种共病。
在优选实施方案中，本发明组合物提高受试者在本文所述的CNS 病症的症状和/或诊断量表中的至少一个上的得分。在某些其它实施方案中，症状和/或诊断量表选自一般健康问卷(GHQ)；抑郁焦虑和应激量表(DASS)；莱顿抑郁敏感性指数-修订版(LEIDS-r)；阳性和阴性症状量表(PANSS)；状态-特质焦虑量表(STAI)；开发行为检查表 (DBC)；贝克抑郁量表(BDI)；贝克焦虑量表(BAI)；霍普金斯症状检查表(HSCL-90)；医院焦虑和抑郁量表(HADS)；感知应激量表(PSS)；应对检查表(CCL)(也用于应对日常生活应激)；以及基于问卷的情绪状态图(POMS)。
在某些实施方案中，当在本领域技术人员已知的CNS病症的其它动物模型中评估治疗功效时，本发明组合物可以改善症状和/或诊断量表。除了实施例中公开的行为分析外，本发明组合物还可以改善相互的社会互动；嗅觉沟通；超声波发声；运动刻板现象(如盘旋和垂直跳跃)，重复行为，如自我梳理和挖掘；以及在空间任务中的毅力。
此外，本发明组合物可用于治疗和/或预防其它CNS病症动物模型中的CNS病症。其它小鼠模型包括近交小鼠品系(包括BALB/cJ 和C58/J)以及转基因小鼠品系(包括NEUREXIN1、NEUROLIGIN3、 NEUROLIGIN4、SHANK2、SHANK3、CNTNAP2、Tsc1/2和Fmr1基因突变小鼠品系)。
在某些实施方案中，本发明组合物改善受试者的社会行为。在优选实施方案中，本发明组合物改善受试者对社会新颖性的认识。在优选实施方案中，本发明组合物改善社交能力缺陷。在优选实施方案中，本发明组合物改善区分熟悉的与新颖的物体以及熟悉的与新颖的受试者的能力。在优选实施方案中，本发明组合物改善识别其它受试者的能力。
在某些实施方案中，本发明组合物调节血浆氨基酸水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节氨基酸的生物合成或分解代谢。在优选实施方案中，本发明组合物调节血浆脯氨酸水平。在优选实施方案中，本发明组合物降低血浆脯氨酸水平。已知升高的脯氨酸会通过增加前额叶皮层中的多巴胺而对大脑功能产生负面影响[35]。另外，脯氨酸被认为是一种调节海马体中的谷氨酸能神经传递和大脑其它部位的神经传递的神经递质。因此，脯氨酸与CNS病症和精神病症，特别是精神病有关。在优选实施方案中，血浆脯氨酸水平的降低治疗或预防CNS病症，特别是ADHD、OCD、情绪障碍、自闭症谱系障碍、精神病和精神***症。
在某些实施方案中，本发明组合物预防、减少或减轻与22q11.2 缺失综合征(22q11DS)相关的精神病症，例如精神***症和双相障碍的症状[35]。在某些实施方案中，本发明组合物改善患有22q11DS的受试者的社会行为和社会认知问题。在优选实施方案中，本发明组合物调节22q11DS受试者中相关的认知和行为结果。在优选实施方案中，这些结果的调节是脯氨酸血浆水平降低的结果。在某些实施方案中，本发明组合物调节脯氨酸氢化酶的活性。
在某些实施方案中，本发明组合物调节NMDA受体和/或其亚单位的水平。在优选实施方案中，本发明组合物调节NMDA受体2B 的水平。在某些实施方案中，本发明组合物增加NMDA受体2B的水平。在优选实施方案中，本发明组合物降低NMDA受体2B的水平。NMDA受体的失调与CNS病症，特别是ASD和精神***症有关。有人认为NMDA受体拮抗剂可能对治疗ASD有效[36]。另外，抑制NMDA受体功能已被证明可以改善社交缺陷并减少丙戊酸诱导的ASD模型中的重复行为[37]。在某些实施方案中，本发明组合物引起NMDA受体2B功能减退。在某些实施方案中，本发明组合物引起NMDA受体2B功能亢进。在某些实施方案中，由于NMDA受体 2B活性的调节，本发明组合物预防、减少或减轻CNS病症，例如 ASD或精神***症的症状。在优选实施方案中，本发明组合物抑制 NMDA受体活性并减少患有CNS病症的受试者的社交缺陷和刻板行为。
在某些实施方案中，本发明组合物调节BDNF的水平。在优选实施方案中，本发明组合物降低BDNF的水平。在某些实施方案中， BDNF的增加局限于杏仁核。对ASD人群的荟萃分析表明，与对照相比，在ASD受试者中检测到更高水平的BDNF[38]。在优选实施方案中，由于BDNF水平的降低，本发明的组合物预防、减少或减轻 CNS病症，特别是ASD的症状。BDNF水平的改变与许多神经发育病症以及精神病和精神***症有关。在某些实施方案中，本发明组合物调节BDNF的水平以预防、减少或减轻神经发育和精神病症的症状。
在某些实施方案中，本发明组合物调节响应于抗原攻击而产生的炎症标志物的水平。在优选实施方案中，本发明组合物响应于病毒抗原攻击而增加IL-1β的水平。在某些实施方案中，本发明组合物调节先天性免疫反应。在某些实施方案中，本发明组合物调节适应性免疫反应。在某些实施方案中，本发明组合物调节炎症反应。
施用模式
优选地，本文公开的组合物将被施用至胃肠道，以使得能够将本发明的细菌菌株递送至和/或部分或完全定殖于肠道。换句话说，细菌可能已经定殖于一些或全部胃肠道，和/或这种定殖可能是暂时的或永久的。
更具体地，在一些实施方案中，“完全定殖于肠道”意指细菌已定殖于肠道的所有部分(即小肠、大肠和直肠)。另外或替代地，术语“完全定殖”意指细菌永久地植入肠道的一些或所有部分。
在一些实施方案中，“部分定殖于肠道”意指细菌已定殖于肠道的一些部分但不是所有部分。另外或替代地，术语“部分定殖”意指细菌暂时地植入肠道的一些或所有部分。
植入的短暂性可以通过在给药间隔结束后定期(例如每天)评估 (例如在粪便样品中)本发明的细菌菌株的丰度来确定，以确定洗脱期，即在给药间隔结束与不存在可检测水平的本发明的细菌菌株之间的时期。在本发明的实施方案中，洗脱期为14天或更少、12天或更少、 10天或更少、7天或更少、4天或更少、3天或更少、2天或更少或1 天或更少。
在本发明的实施方案中，本发明的细菌暂时地植入大肠中。
通常，本发明组合物是经口施用的，但它们可以通过直肠、鼻内或经颊或舌下途径施用。
在一些实施方案中，本发明组合物是经口施用的。经口施用可能涉及吞咽，以使化合物进入胃肠道。
适合经口施用的药物调配物包括固体塞、固体微粒、半固体和液体(包括多相或分散***)，如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒、液体(例如水溶液)、乳液或粉末的软或硬胶囊；***锭(包括充液)；咀嚼剂；凝胶；快速分散剂型；膜剂；胚珠；喷雾剂；和口腔/粘膜粘附贴片。
在某些实施方案中，本发明组合物可以作为泡沫、喷雾或凝胶施用。
在某些实施方案中，本发明组合物可作为栓剂，例如直肠栓剂施用，例如以可可油(可可脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油明胶、聚乙二醇或肥皂甘油组合物的形式。
在某些实施方案中，本发明组合物如下地施用至胃肠道：通过管，例如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠造口管(J管)、经皮内窥镜胃造口术(PEG)或端口，例如提供进入胃、空肠的胸壁端口和其它合适的进入端口。
本发明组合物可以施用一次，或者它们可以作为治疗方案的一部分依序施用。在某些实施方案中，本发明组合物将每天施用(一次或数次)。
在某些实施方案中，本发明组合物定期施用，例如每天、每两天或每周，持续例如至少一周、两周、一个月、两个月、六个月或一年的延长时间段。
在一些实施方案中，本发明组合物被施用7天、14天、16天、 21天或28天或不超过7天、14天、16天、21天或28天。例如，在一些实施方案中，本发明组合物被施用16天。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随着对患者肠道微生物群的评估。如果未实现细菌菌株的递送和/或部分或完全定殖以致未观察到功效，则可以重复治疗，或者如果递送和/或部分或完全定殖成功并且观察到功效，则可以停止治疗。
在某些实施方案中，可将本发明组合物施用于怀孕的动物，例如哺乳动物，例如人类，以防止在她的孩子在子宫内和/或在其出生后患上炎症性疾病或自身免疫疾病。
本发明组合物可施用于已被诊断患有中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况，或已被鉴定为有中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况的风险的患者。所述组合物也可以作为预防措施施用，以预防健康患者患上中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况。
本发明组合物可施用于已被鉴定为具有异常肠道微生物群的患者。例如，患者的耐久肠球菌定殖可能减少或不存在。
本发明组合物可作为食品，例如营养补充剂施用。
通常，本发明组合物用于治疗或预防人类疾病，尽管它们可用于治疗或预防动物，包括单胃哺乳动物，例如家禽、猪、猫、狗、马或兔的疾病。本发明组合物可用于增强动物的生长和性能。如果对动物施用，则可使用经口管饲。
在一些实施方案中，待施用组合物的受试者是人类。人类可以是成人、儿童或婴儿。
组合物
本发明组合物包含细菌。在本发明的优选实施方案中，将组合物调配成冻干形式。本发明组合物可包含颗粒或明胶胶囊，例如硬明胶胶囊，其包含本发明的细菌菌株。
优选地，本发明组合物包含冻干细菌。细菌的冻干是一个成熟的程序，且相关指南可在例如参考文献[39-41]中获得。
或者，本发明组合物可包含活的、有活性的细菌培养物。
在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株未被灭活，例如，未被热灭活。在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株未被杀灭，例如，未被热杀灭。在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株未被减弱，例如，未被热减弱。例如，在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株未被杀灭、灭活和/或减弱。例如，在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是活的。例如，在一些实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是有活力的。在优选实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株能够部分或完全定殖于肠道。在优选实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是有活力的并且能够部分或完全定殖于肠道。
在一些实施方案中，组合物包含活细菌菌株和已被杀灭的细菌菌株的混合物。
在优选实施方案中，本发明组合物被囊封以使细菌菌株能够递送至肠道。囊封保护组合物免于降解，直到通过例如压力、酶活性或物理分解等化学或物理刺激破裂而递送到目标位置，这可能由pH变化触发。可以使用任何适当的囊封方法。示例性的囊封技术包括在多孔基质中的截留、在固体载体表面上的附着或吸附、通过絮凝或使用交联剂的自聚集以及微孔膜或微胶囊后面的机械密封。可用于制备本发明组合物的囊封的指南可在例如参考文献[42-43]中获得。
组合物可口服施用并且可呈片剂、胶囊或粉末的形式。优选囊封产品。
本发明组合物包括治疗有效量的本发明的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者产生有益效果。治疗有效量的细菌菌株可能足以使得递送至和/或部分或全部定殖于患者肠道。
例如对于成年人来说，合适的细菌日剂量可以是约1×103至约 1×1011菌落形成单位(CFU)；例如，约1×107至约1×1010CFU；在另一实例中，约1×106至约1×1010CFU；在另一实例中，约1×107至约 1×1011CFU；在另一实例中，约1×108至约1×1010CFU；在另一实例中，约1×108至约1×1011CFU。
在某些实施方案中，细菌的剂量是每天至少109个细胞，例如每天至少1010、至少1011或至少1012个细胞。
相对于组合物的重量，一剂组合物可包含约1×106至约1×1011菌落形成单位(CFU)/g的细菌菌株。所述剂量可能适合成年人。例如，所述组合物可包含约1×103至约1×1011CFU/g的细菌菌株；例如，约 1×107至约1×1010CFU/g；在另一实例中，约1×106至约1×1010CFU/g；在另一实例中，约1×107至约1×1011CFU/g；在另一实例中，约1×108至约1×1010CFU/g；在另一实例中，约1×108至约1×1011CFU/g、约 1×108至约1×1010CFU/g。剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。
所述组合物可以调配成益生菌。益生菌由FAO/WHO定义为一种活的微生物体，当以足够的量施用时，它会给宿主带来健康益处。
典型地，益生菌，例如本发明组合物任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。在某些实施方案中，相对于组合物的总重量，本发明的益生菌组合物包括的益生元化合物的量为约1至约30重量％(例如5至20重量％)。已知的益生元包括商业产品，例如菊粉和反式半乳糖寡糖。
益生元化合物通常是不可消化的碳水化合物，例如寡糖或多糖，或糖醇，它们不会在上消化道中被降解或吸收。碳水化合物可以选自由以下组成的组：低聚果糖(或FOS)、短链低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、果胶、低聚木糖(或XOS)、低聚壳聚糖(或COS)、β-葡聚糖、可耕树胶改性和抗性淀粉、聚右旋糖、D-塔格糖、***胶纤维、角豆、燕麦和柑橘纤维。一方面，益生元是短链低聚果糖(为简单起见，下文中显示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c是不可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化获得并且包括与三个葡萄糖分子结合的蔗糖分子。
可包括其它益生元化合物(例如维生素C)作为除氧剂并改善体内递送和/或部分或完全定殖和存活。或者，本发明的益生菌组合物可以作为食品或营养产品，例如基于牛乳或乳清的发酵乳制品，或作为药物产品经口施用。
在某些实施方案中，本发明组合物与用于治疗或预防中枢神经***病症的另一种治疗化合物组合使用。在一些实施方案中，本发明组合物与调节中枢神经递质和神经肽的营养补充剂一起施用。在优选实施方案中，营养补充剂包含营养维生素或由营养维生素组成。在某些实施方案中，维生素是维生素B6、镁、二甲基甘氨酸(维生素B16) 和维生素C。在某些实施方案中，本发明组合物与另一益生菌组合施用。在某些优选实施方案中，益生菌包含猪鞭虫卵或由其组成。
本发明组合物可包含药学上可接受的赋形剂或载体。此类合适赋形剂的实例可在参考文献[44]中找到。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在药学领域是众所周知的，并且在例如参考文献[45]中进行了描述。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。药物组合物可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂作为载体、赋形剂或稀释剂或外加载体、赋形剂或稀释剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如***胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。合适载体的另一个实例是蔗糖。防腐剂的另一个实例是半胱氨酸。
本发明组合物可以调配成食品。例如，除了本发明的治疗效果，食品还可以提供营养益处，例如在营养补充剂中。类似地，可以调配食品以增强本发明组合物的味道，或通过与普通食品而不是药物组合物更相似而使组合物更具消费吸引力。在某些实施方案中，本发明组合物被调配成乳基产品。术语“乳基产品”意指具有不同脂肪含量的任何基于液态或半固态乳或乳清的产品。乳基产品可以是例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、脱脂奶、全脂奶、由奶粉和乳清未经任何加工而重组的奶，或加工产品，例如酸奶、凝乳(curdled milk)、凝乳(curd)、酸性奶、酸性全脂奶、酪乳和其它酸性奶制品。另一重要组包括乳饮料，例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、婴幼儿乳、调味乳、冰淇淋、含乳食品，例如糖果。
在一些实施方案中，本发明组合物包含耐久肠球菌物种的一种或多种细菌菌株并且不含来自任何其它物种的细菌，或仅包含来自另一物种的微量或生物学无关量的细菌。因此，在一些实施方案中，本发明提供包含耐久肠球菌物种的一种或多种细菌菌株的组合物，所述组合物不含来自任何其它物种的细菌或仅包含来自另一物种的微量或生物学无关量的细菌，用于治疗。
在某些实施方案中，本发明组合物含有单一细菌物种并且不含任何其它细菌物种。在某些实施方案中，本发明组合物含有单一细菌菌株并且不含任何其它细菌菌株。此类组合物可仅包含微量或生物学无关量的其它细菌菌株或物种。此类组合物可以是基本上不含其它生物体物种的培养物。在一些实施方案中，此类组合物可以是基本上不含其它生物物种的冻干物。
在一些实施方案中，本发明提供包含耐久肠球菌物种的单一细菌菌株的组合物，所述组合物不含来自任何其它菌株的细菌或仅包含来自另一菌株的微量或生物学无关量的细菌，用于治疗。
在本发明的实施方案中，本发明组合物不含来自拟杆菌属的细菌或仅包含来自拟杆菌属的微量或生物学无关量的细菌，用于治疗。
在一些实施方案中，本发明组合物包含多于一个细菌菌株或物种。例如，在一些实施方案中，本发明组合物包含多于一个来自相同物种的菌株(例如多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、35、40或45个菌株)，并且任选地不含来自任何其它物种的细菌。在一些实施方案中，本发明组合物包含来自相同物种内的少于50个菌株(例如少于45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、 5、4或3个菌株)，并且任选地不含来自任何其它物种的细菌。在一些实施方案中，本发明组合物包含1-40、1-30、1-20、1-19、1-18、 1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、 2-30、2-20、2-15、2-10、2-5、6-30、6-15、16-25或31-50个来自相同物种内的菌株，并且任选地不含来自任何其它物种的细菌。在一些实施方案中，本发明组合物包含来自相同属内的多于一个物种(例如多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、23、25、30、35或40个物种)，并且任选地不含来自任何其它属的细菌。在一些实施方案中，本发明组合物包含来自相同属内的少于50个物种(例如少于50、45、40、35、30、25、20、15、12、10、8、7、6、5、4 或3个物种)，并且任选地不含来自任何其它属的细菌。在一些实施方案中，本发明组合物包含1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10、 1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-50、2-40、2-30、2-20、 2-15、2-10、2-5、6-30、6-15、16-25或31-50个来自相同属内的物种，并且任选地不含来自任何其它属的细菌。在一些实施方案中，组合物包含少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、 6、5或4个细菌菌株。本发明包含前述的任何组合。
在一些实施方案中，所述组合物包含微生物聚生体。例如，在一些实施方案中，所述组合物包含耐久肠球菌细菌菌株作为微生物聚生体的一部分。例如，在一些实施方案中，耐久肠球菌细菌菌株与可以在体内于肠道中共生的来自肠球菌属和/或其它属的一个或多个(例如至少2、3、4、5、10、15或20个)其它细菌菌株组合存在。例如，在一些实施方案中，组合物包含与来自不同属的细菌菌株组合的耐久肠球菌细菌菌株。在另一实施中，组合物包含与来自肠球菌属的细菌菌株组合的耐久肠球菌细菌菌株，或组合物包含与来自肠球菌属的细菌菌株和来自不同属的细菌菌株组合的肠球菌细菌菌株。在一些实施方案中，微生物聚生体包含从单一生物体，例如人的粪便样品中获得的两种或更多种细菌菌株。在一些实施方案中，微生物聚生体在自然界中不在一起被发现。例如，在一些实施方案中，微生物聚生体包含从至少两个不同生物体的粪便样品中获得的细菌菌株。在一些实施方案中，两个不同生物体来自相同物种，例如两个不同的人。在一些实施方案中，两个不同生物体是婴儿和成人。在一些实施方案中，两个不同生物体是人和非人哺乳动物。
在一些实施方案中，本发明组合物另外包含细菌菌株，其具有与菌株NCIMB 43456相同的安全性和治疗功效特征，但不是菌株 NCIMB 43456或不是耐久肠球菌。
在一些实施方案中，本发明组合物不包含芽孢杆菌属的细菌菌株。在一些实施方案中，本发明组合物不包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或不包含凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。在一些实施方案中，待用本发明组合物治疗的CNS病症不是双相障碍。在一些实施方案中，待用本发明组合物治疗的患者没有真菌感染。在一些实施方案中，待用本发明组合物治疗的患者未罹患念珠菌病。在一些实施方案中，待用本发明组合物治疗的患者尚未被诊断为患有真菌感染和 /或尚未被诊断为罹患念珠菌病。在优选的此类实施方案中，待用本发明组合物治疗的患者从未被诊断为患有真菌感染和/或从未被诊断为罹患念珠菌病。
在一些实施方案中，本发明组合物不包含屎肠球菌物种和/或粪肠球菌物种的细菌菌株。
在其中本发明组合物包含多于一个细菌菌株、物种或属的一些实施方案中，各个细菌菌株、物种或属可用于单独、同时或依序施用。例如，所述组合物可包含所有的多于一个细菌菌株、物种或属，或者细菌菌株、物种或属可单独储存并且单独、同时或依序施用。在一些实施方案中，多于一个细菌菌株、物种或属单独储存，但在使用前混合在一起。
在一些实施方案中，用于本发明的细菌菌株获自成人粪便。在本发明组合物包含多于一个细菌菌株的一些实施方案中，所有细菌菌株均获自成人粪便，或者如果存在其它细菌菌株，则它们仅以微量存在。细菌可在从成人粪便中获得并用于本发明组合物之后进行培养。
在一些实施方案中，一个或多个耐久肠球菌细菌菌株是本发明组合物中唯一的治疗活性剂。在一些实施方案中，组合物中的细菌菌株是本发明组合物中唯一的治疗活性剂。
根据本发明使用的组合物可能需要或不需要市场批准。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述细菌菌株是喷雾干燥的。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中细菌菌株是冻干的或喷雾干燥的并且其中它是活的。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中细菌菌株是冻干的或喷雾干燥的并且其中它是有活力的。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的或喷雾干燥的，并且其中它能够部分或完全定殖于肠道。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的或喷雾干燥的，并且其中它是有活力的且能够部分或完全定殖于肠道。
在一些情况下，冻干或喷雾干燥的细菌菌株在施用前被复原。在一些情况下，复原是通过使用本文所述的稀释剂。
本发明组合物可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：如前所述的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量为在施用于有需要的受试者时足以治疗病症；并且其中所述病症选自由以下组成的组：自闭症谱系障碍(ASD)；儿童发育障碍；强迫症(OCD)；重度抑郁症；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；精神***症谱系障碍；精神***症；双相障碍；精神病；情绪障碍；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；痴呆；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；慢性疼痛(例如中枢敏化或纤维肌痛)；运动神经元病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和/或脑膜炎。
在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含：如在本发明中使用的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况。在优选实施方案中，所述疾病或病况选自由以下组成的组：自闭症谱系障碍 (ASD)；儿童发育障碍；强迫症(OCD)；重度抑郁症；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；精神***症谱系障碍；精神***症；双相障碍；精神病；情绪障碍；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；痴呆；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；慢性疼痛(例如中枢敏化或纤维肌痛)；运动神经元病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和/或脑膜炎。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中相对于组合物的重量，细菌菌株的量为每克约1×103至约1×1011个菌落形成单位。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述组合物以1g、3g、5g或10g的剂量施用。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述组合物通过选自经口、经直肠、皮下、经鼻、经颊和舌下组成的组的方法施用。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇和山梨糖醇组成的组的载体。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由乙醇、甘油和水组成的组的稀释剂。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自有以下组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、***胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其进一步包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一种。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯组成的组的防腐剂。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中当组合物在约4℃或约25℃下储存在密封容器中并且容器放置在具有50％相对湿度的气氛中时，至少80％以菌落形成单位测量的细菌菌株在至少约以下的一段时间后仍然存在：1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年。
在一些实施方案中，本发明组合物在包含如本文所述的组合物的密封容器中提供。在一些实施方案中，密封容器是小袋或瓶子。在一些实施方案中，本发明组合物在包含如本文所述的组合物的注射器中提供。
在一些实施方案中，本发明组合物可作为药物调配物提供。例如，所述组合物可作为片剂或胶囊提供。在一些实施方案中，胶囊是明胶胶囊(“凝胶帽”)。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊。在一些实施方案中，调配物是软胶囊。软胶囊是由于添加软化剂，例如存在于胶囊壳中的甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇和聚乙二醇而可具有一定弹性和柔软性的胶囊。例如，可基于明胶或淀粉生产软胶囊。基于明胶的软胶囊可从各种供应商处商购获得。根据施用方法，例如经口或经直肠施用，软胶囊可以具有各种形状，例如，它们可以是圆形、椭圆形、长方形或鱼雷形。软胶囊可以通过常规方法生产，例如通过谢勒法(Scherer process)、阿科格尔法(Accogel process)或液滴法或吹制法。
在一些实施方案中，药物制剂是肠溶调配物，即适于通过经口施用将本发明组合物递送至肠道的耐胃调配物(例如，耐胃pH)。当组合物中的细菌或另一组分对酸敏感，例如在胃条件下易于降解时，肠溶调配物可能特别有用。
在一些实施方案中，肠溶调配物包含肠溶包衣。在一些实施方案中，调配物是肠溶剂型。例如，调配物可以是肠溶片剂或肠溶胶囊等。肠溶包衣可以是常规的肠溶包衣，例如用于经口递送的片剂、胶囊等的常规包衣。调配物可包含薄膜包衣，例如肠溶聚合物，例如酸不溶性聚合物的薄膜层。
在一些实施方案中，肠溶调配物本质上是肠溶的，例如耐胃的，而不需要肠溶包衣。因此，在一些实施方案中，调配物是不包含肠溶包衣的肠溶调配物。在一些实施方案中，调配物是由热胶凝材料制成的胶囊。在一些实施方案中，热胶凝材料是纤维素材料，例如甲基纤维素、羟甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在一些实施方案中，胶囊包含不含任何成膜聚合物的壳。在一些实施方案中，胶囊包含壳并且所述壳包含羟丙基甲基纤维素并且不包含任何成膜聚合物 (例如参见[46])。在一些实施方案中，调配物是固有肠溶胶囊(例如来自Capsugel的
Figure BDA0003767152760000691
)。
培养方法
可使用例如参考文献[47]-[49]中详述的标准微生物学技术来培养用于本发明的细菌菌株。
用于培养的固体或液体培养基可以是YCFA琼脂或YCFA培养基。YCFA培养基可包括(每100ml，近似值)：酪蛋白(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO3(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、K2HPO4(0.045g)、 KH2PO4(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH4)2SO4(0.09g)、MgSO4·7H2O(0.009g)、CaCl2(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)和吡哆胺(15 μg)。
用于疫苗组合物的细菌菌株
本发明人已经确定本发明的细菌菌株可用于治疗或预防中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况。这可能是由于本发明的细菌菌株对宿主中枢、自主和/ 或肠神经***的影响；HPA途径的活性；神经免疫和神经内分泌途径；以及宿主胃肠道中共生代谢物的水平和/或宿主的胃肠道通透性。因此，当作为疫苗组合物施用时，本发明组合物还可适用于预防中枢神经***病症或病况，特别是由微生物群-肠-脑轴介导的中枢神经***病症或病况。在某些此类实施方案中，本发明的细菌菌株是有活力的。在某些此类实施方案中，本发明的细菌菌株能够部分或完全定殖于肠道。在某些此类实施方案中，本发明的细菌菌株是有活力的并且能够部分或完全定殖于肠道。在其它某些此类实施方案中，本发明的细菌菌株可以被杀死、灭活或减毒。在某些此类实施方案中，组合物可包含疫苗佐剂。在某些实施方案中，组合物用于通过注射，例如通过皮下注射施用。
总则
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。此类技术在文献中有充分的解释。参见例如参考文献[51]-[57]等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可包括额外的东西，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的，例如x±10％。
在某些实施方案中，术语“调节”意指增加或激活。在替代实施方案中，术语“调节”意指减少或抑制。
“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，本发明的定义中可以省略“基本上”一词。
提及两个核苷酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，在比较两个序列时所述百分比的核苷酸是相同的。此比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域中已知的软件程序，例如在参考文献[58]的第7.7.18节中所述的那些来测定。优选的比对由Smith-Waterman同源性搜索算法确定，所述算法使用仿射空位搜索，空位开放罚分为5，且空位扩展罚分为2，BLOSUM矩阵为62。 Smith-Waterman同源搜索算法在参考文献[59]中公开。
治疗或预防可指例如减轻症状的严重性，或减少对受试者来说是个问题的恶化的频率或触发因素的范围，或预防复发。
除非特别说明，否则包括许多步骤的过程或方法可包括在方法开始或结束时的额外步骤，或可包括额外的中间步骤。此外，如果合适，步骤可被组合、省略或以替代顺序执行。
本文描述了本发明的各种实施方案。应理解，每个实施方案中指定的特征可以与其它指定特征组合，以提供另外的实施方案。特别地，本文中强调为合适的、典型的或优选的实施方案可以彼此组合(除非它们是相互排斥的)。
本说明书中引用的所有专利和文献参考特此以引用的方式整体并入。
对包括向患者施用药剂的治疗方法的任何提及也涵盖用于所述治疗方法中的所述药剂，以及所述药剂在所述治疗方法中的用途，以及所述药剂在制造药物中的用途。
以下实施例仅用于说明目的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施本发明的方式
实施例1-离体筛选对微生物群-肠-脑轴的影响
自闭症谱系障碍(ASD)是一种神经发育障碍，其特征为社交行为缺陷、重复行为增加、焦虑和胃肠道症状。自闭症的病因很复杂，并且很可能涉及遗传和环境因素[vi0]。最近的证据表明，居住在胃肠道***中的微生物通过微生物群-肠-脑轴在调节大脑健康状态、行为和情绪方面发挥着基本作用[61]。新兴的临床前和临床研究已经记录了肠道细菌在ASD中的潜在作用，且因此，微生物群代表了开发针对这种神经发育障碍的新治疗剂的潜在目标。
其它行为并发症包括自闭症患者的抑郁、焦虑、认知障碍和癫痫发作。此外，例如胃肠道功能障碍等非神经症状越来越被认为是这种神经发育病症的主要合并症。例如，一些研究记录了ASD患者的明显胃肠道不适，例如腹痛、胀气、腹泻、气胀和便秘[62、63、64、65]。这些胃肠道紊乱与患有ASD的个体肠道微生物群改变的报道相对应。例如，一些研究记录了潜在致病菌株(例如梭状芽胞杆菌和脱硫弧菌)的丰度的增加，以及有益菌属(例如双歧杆菌)的存在的减少 [66、67、68、69]。鉴于ASD中微生物群的这些显著改变，新出现的临床证据表明，通过益生元或微生物群转移疗法靶向微生物群可以改善自闭症儿童的胃肠道和行为症状[70、71]。这些初步研究表明，靶向微生物群可能代表一种治疗自闭症的新治疗策略。
BALB/c小鼠表现出固有的焦虑样表型，并且因此是筛选活生物治疗菌株对肠-脑轴的有益作用的有用模型。
实施例1a–材料和方法
动物
将BALBc(Envigo,UK)成年雄性小鼠分组饲养在12小时光暗循环下；可随意获得标准啮齿动物食物和水。在科克大学学院动物伦理实验委员会(University College CorkAnimal Ethics Experimentation Committee)批准后，所有实验均按照欧洲指南进行。动物在实验开始时为8周大。
给药和菌株
使用的菌株是以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌。
生物治疗剂以甘油储备液形式提供。活的生物治疗剂在厌氧条件下在所述设施中生长。
进入动物单元后，使动物适应它们的饲养室一周。它们连续6天在15:00与17:00之间接受1X109CFU剂量的NCIMB 43456菌株或 PBS(媒剂对照)的经口管饲(200μL剂量)。在第7天，将动物斩首并收集组织用于实验。
组织收集
关于治疗和测试条件以随机方式处死动物；采样发生在上午9.00 与下午2:30之间。将躯干血收集在EDTA(乙二胺四乙酸)钾管中，并以4000g离心15分钟。分离血浆并储存在-80℃下以供进一步分析。大脑被快速切除、解剖并且每个大脑区域在干冰上快速冷冻并储存在 -80℃下以供进一步分析。取出脾脏，收集在5mL RPMI培养基(含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，R8758Sigma+10％FBS(F7524，Sigma)+ 1％Pen/Strep(P4333，Sigma))中并在宰杀后立即处理以进行离体免疫刺激。将肠组织(距盲肠最近的2cm回肠和结肠段被切除，并使用距盲肠最远的1cm组织)安装到Ussing室中用于肠道通透性分析。再取 1cm的回肠和结肠组织用于紧密连接基因表达分析。将盲肠取出、称重并储存在-80℃下用于SCFA分析。
统计学分析
正态分布的数据表示为平均值±SEM；非参数数据集表示为具有四分位数范围的中位数。未配对双尾t检验用于分析参数数据，且曼 -惠特尼检验(Mann-Whitney test)用于非参数数据。斯皮尔曼(Spearman) 等级相关系数用于汇集数据集中的相关分析。在所有情况下，p值< 0.05被认为是显著的。
实施例1b–紧密连接蛋白mRNA表达
方法和原理
使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion/Llife technologies, Paisley,UK)和经处理DNA酶(Turbo DNA-free,Ambion/life technologies)，根据制造商的建议提取总RNA。使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.,Wilmington,Delaware,USA)，根据制造商说明书对RNA进行定量。使用Agilent Bioanalyzer(Agilent,Stockport,UK)，根据制造商的程序评估RNA质量，并计算RNA完整指数(RIN)。RIN值>7的RNA用于后续实验。使用Applied Biosystems High Capacity cDNA试剂盒(AppliedBiosystems, Warrington,UK)，根据制造商说明书将RNA逆转录为cDNA。简而言之，Multiscribe逆转录酶(50U/μL)(1)(2)(1)(10)作为RT master mix 的一部分添加，在25℃下培育10分钟，在37℃下培育2小时，在 85℃下培育5分钟并在4℃下储存。使用由AppliedBiosystems设计的针对小鼠特异性靶向基因的探针(6羧基荧光素-FAM)进行定量 PCR，同时使用β-肌动蛋白作为内源性对照。扩增反应含有1μl cDNA、5μl 2X PCR Master mix(Roche)、900nM的每种引物，并通过添加无RNA酶的水达到总共10μl。所有反应均使用
Figure BDA0003767152760000741
480***上的96孔板一式三份地进行。热循环条件按照制造商(Roche)的建议进行55个循环。为了检查扩增子污染，对于每个使用的探针，每次运行均不含模板对照，一式三份地进行。记录循环阈值(Ct)。使用β-肌动蛋白对数据进行标准化，并使用2-ΔΔCT方法进行转换，并呈现为与对照组相比的倍数变化。
包括TJP1和闭合蛋白在内的紧密连接蛋白有助于调节肠上皮的通透性。这些基因的增加将是一个理想的特质。吲哚胺2,3双加氧酶 -1(IDO1)是一种沿着生成几种生物活性犬尿氨酸基代谢物的途径启动色氨酸分解代谢的酶。色氨酸羟化酶-1(TPH-1)催化从L-色氨酸形成5-羟基-L-色氨酸(5-HTP)，这是5-HT生物合成的第一步和限速步骤。因此，这些基因之间的关系在色氨酸/犬尿氨酸***的调节中很重要。
结果
在菌株NCIMB 43456治疗与媒剂治疗的小鼠之间没有观察到回肠或结肠中闭合蛋白mRNA表达的差异(图2)。
相对于媒剂治疗的小鼠(P＝0.062)，菌株NCIMB 43456治疗的小鼠的结肠中的IDO1 mRNA表达增加(图3A)。在菌株NCIMB 43456 治疗与媒剂治疗的小鼠之间没有观察到回肠中IDO1 mRNA表达的差异(图3B)。
相对于媒剂治疗的小鼠，菌株NCIMB 43456治疗的小鼠的回肠中的TJP1 mRNA表达增加(图4A)。在菌株NCIMB 43456治疗与媒剂治疗的小鼠之间没有观察到结肠中TJP1 mRNA表达的差异(图 4B)。
相对于媒剂治疗的小鼠，菌株NCIMB 43456治疗的小鼠的回肠中的Tph1 mRNA表达增加(图5A)。在菌株NCIMB 43456治疗与媒剂治疗的小鼠之间没有观察到结肠中Tph1 mRNA表达的差异(图 5B)。
结论
每天用NCIMB 43456菌株治疗导致回肠中TJP1和Tph1 mRNA 表达的增加，以及结肠中IDO1 mRNA表达的增加。因此，可以预期用菌株NCIMB 43456进行长期治疗会改善对肠上皮通透性的调节。
实施例1c–短链脂肪酸生产
方法和原理
将盲肠内容物与MilliQ水混合并涡旋，并在室温下培育10分钟。通过离心(10000g，5min，4℃)以沉淀细菌和其它固体并进行0.2μm 过滤，获得上清液。将其转移到透明的GC小瓶中，并使用2-乙基丁酸(Sigma)作为内标。使用配备有ZB-FFAP色谱柱(30m×0.32 mm×0.25mm；Phenomenex)的Varian 3500 GC火焰离子化***分析短链脂肪酸(SCFA)的浓度。用含有乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、正丁酸盐、异戊酸盐和戊酸盐(Sigma)的不同浓度的标准混合物建立标准曲线。使用Varian Star Chromatography Workstation 6.0版软件对峰进行积分。所有SCFA数据均表示为μmol/g。
SCFA是膳食纤维的微生物副产品。乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丁酸盐、异丁酸盐或异戊酸盐的增加表明微生物群生产力的增加和理想特质。
结果
与媒剂治疗的小鼠相比，用菌株NCIMB 43456治疗的小鼠的盲肠乙酸盐和丁酸盐水平显著增加(图6)。
结论
用菌株NCIMB 43456治疗导致盲肠中乙酸盐和丁酸盐的水平增加，表明微生物群的生产力增加。
实施例1d–筛选施用活生物治疗剂对中心基因表达的影响
方法和原理
催产素能***(催产素受体和加压素受体)、内分泌***(盐皮质激素(Nr3c1)；糖皮质激素受体(Nr3c2)；皮质酮释放激素(CRH)和受体；脑源性神经营养因子(BDNF))、免疫***(Il-6)；和神经递质*** (NMDA受体2A(Grin2A)；NMDA受体2B(Grin2B)；GABAA受体亚基A2；GABAB受体亚基B1；血清素2C)的标志物的mRNA水平在杏仁核、海马体和前额叶皮层–参与情绪反应的边缘***的关键大脑区域中进行了评估。
如上文实施例1b所述地提取和定量RNA。
结果
相对于媒剂治疗的小鼠，在菌株NCIMB 43456治疗的小鼠中，海马体中催产素受体mRNA、CRH mRNA、IL-6mRNA、Grin2a mRNA 和GABA B1R的表达显著增加(图7)。
相对于媒剂治疗的小鼠，在菌株NCIMB 43456治疗的小鼠中，杏仁核中催产素受体mRNA的表达也显著增加(图8)。
相对于媒剂治疗的小鼠，在菌株NCIMB 43456治疗的小鼠中，前额叶皮层中BDNFmRNA的表达显著增加(图9)。
结论
用菌株NCIMB 43456治疗导致涉及情绪反应的大脑区域中应激标志物(CRH)、免疫蛋白(IL-6)、催产素能***标志物(催产素受体)和神经递质(Grin2A、GABA B1R、BDNF)的mRNA表达增加。
这些数据表明，治疗菌株NCIMB 43456可用于治疗大脑的疾病和病况，例如具有胃肠道成分的疾病和病况。
离体筛选实验的总体结论
离体筛选数据显示，每天用NCIMB 43456菌株治疗使得微生物群的生产力提高，这可以通过膳食纤维的SCFA微生物副产物的产量增加来证明。用菌株NCIMB 43456治疗使得回肠中紧密连接蛋白 TJP1的表达增加，且回肠通透性同时改善(渗漏减少)。分解代谢酶IDO1和Tph1在结肠和回肠中的表达分别增加。
肠道微生物群的这些变化伴随着各种神经标志物的mRNA表达增加，表明用菌株NCIMB 43456治疗将有效地治疗具有胃肠道成分的CNS病症，例如自闭症和帕金森氏病。
实施例2–评估自闭症谱系障碍小鼠模型中的焦虑、抑郁、认知和社会行为领域
本研究旨在评估菌株NCIMB 43456治疗对两种不同小鼠模型的精神和神经病症的影响，所述模型显示出与神经发育和精神病症相关的行为特征。特别地，所述研究侧重于(i)C57BL/6wt小鼠模型、(ii) BTBR近交的转基因小鼠模型和(iii)母体免疫激活(MIA)小鼠模型中的自闭症相关行为。研究了三种小鼠模型中长期菌株NCIMB 43456 与媒剂治疗在焦虑、抑郁以及认知和社会行为领域的影响。另外，还进行了生理学和解剖学分析以及脑干组织中神经递质浓度的分析。
BTBR小鼠模型使用近交的转基因小鼠，所述小鼠显示出稳健的自闭症样表型。据报道，此菌株存在社交行为缺陷、重复行为增加和焦虑相关行为增加[72]。由于这种稳健的行为表型，BTBR小鼠是评估新型治疗剂治疗自闭症相关行为的功效的理想动物模型。活生物治疗剂对此类症状的减轻也可以指示生物治疗剂在治疗其它精神或神经疾病中的功效。
MIA小鼠模型在怀孕小鼠中使用环境免疫挑战来触发后代自闭症谱系障碍的核心症状。MIA小鼠典型地表现出刻板的行为(如梳理和弹珠掩埋测试所示)和社会交流缺陷(如社交游戏、3室社会互动和食物偏好的社会传播测试所示)。后代表现出自闭症的三种核心症状 (交流减少；社交能力降低；以及重复或刻板行为增加)，且因此提供了一个合适的模型来确定施用治疗剂是否可以减轻与自闭症谱系障碍以及许多其它神经病症相关的行为表型。众所周知，动物模型中行为表型的改变表明潜在的临床相关干预，无论对潜在生物或生理机制的理解如何[73]。
EMA关于治疗自闭症谱系障碍的药品临床开发的指南指出，由于疾病的异质性，单一化合物可能无法对所有核心症状产生显著效果，且因此必须对至少一种核心症状证明短期疗效。实施例中测试的菌株NCIMB 43456活生物治疗剂已显示出对自闭症谱系障碍的至少一种核心症状的有效治疗，因此该菌株和相关的肠球菌菌株预期对人类疾病有效。类似地，其它中枢神经***病症或病况表现出具有多种不同症状的复杂病理学，并且几乎没有获批的治疗。因此，应理解，有效治疗不需要治疗中枢神经***病症或病况的所有症状。如果一种治疗能治疗与中枢神经***病症或病况相关的症状之一，则认为所述治疗在治疗上有用。然而，如以下实施例中所示，耐久肠球菌有利地能够引起一系列症状的改善。
实施例2a–材料和方法
小鼠和给药
BTBR动物是在兄弟姐妹交配的室内饲养的。来自这些动物的雄性后代在3周龄时与它们的母亲分开，并且在8周龄时开始每日施用活的生物治疗剂或对照。行为评估从11周龄开始。包括对照年龄匹配的C57BL/6组作为参考对照组。
用于母体免疫激活研究，雌性C57B/6小鼠(8周龄)和年龄匹配的雄性小鼠购自Harlan UK。在适应1周后，这些动物进行交配。在胚胎第12.5天，雌性接受病毒模拟poly-IC注射以激活母体免疫***，或盐水媒剂注射。来自这些动物的雄性后代在3周龄时与它们的母亲分开，并且在8周龄时开始每日施用活的生物治疗剂或对照。行为从 11周龄开始。
对于给药，动物每天接受经口管饲的PBS或在PBS中制备为109 cfu/mL的活生物治疗剂。在整个行为范式过程中每天持续给药。
所有实验均按照欧洲指令2010/63/EEC、2012年S.I No 543的要求进行，并经科克大学学院动物实验伦理委员会批准。
菌株
使用的菌株是以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌。
生物治疗剂以甘油储备液形式提供。活的生物治疗剂在厌氧条件下在所述设施中生长。
施用时间表
所述研究的治疗组如下所示。经口施用的媒剂是PBS。每日经口施用通过经口管饲进行。
组 治疗 BTBR MIA
1 对照 11 10
2 媒剂 11 11
3 NCIMB 43456 11 11
对于MIA和BTBR动物，一旦它们达到8周，就开始每天向它们管饲感兴趣的活生物治疗剂。它们从8周大直至被宰杀时得到此管饲。在第11周(3周后)，动物开始进行行为测试。每组有10-12只动物。MIA和BTBR均各自在2个队列中运行—每个队列中的每只动物以完全相同的顺序在相同的时间长度内经历完全相同的程序。动物总是随机分组的，因此并非所有的一组均在某一天运行。
实验设计和方法
如上所述，当小鼠8周大时开始使用菌株NCIMB 43456进行给药。初始给药在行为实验之前进行了3周。行为组系按以下顺序进行：第4周的弹珠掩埋和梳理测试；第5周的高架十字迷宫和三室测试；第6周的旷场和新物体识别测试，以及体内肠运动分析；以及第7周的强迫游泳测试。最后，在第8周，将小鼠宰杀并解剖大脑、近端和远端结肠和脾脏区域，以及血浆样品。
图形设计和统计分析
正态分布的数据表示为平均值±SEM；非参数数据集表示为具有四分位数范围的中位数。未配对双尾t检验用于分析参数数据，且曼 -惠特尼检验用于非参数数据。斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数用于汇集数据集中的相关分析。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
实施例2b–评估与刻板印象相关的行为–弹珠掩埋测试
原理
弹珠掩埋测试是恐新症、焦虑和强迫行为的有用模型。它还用于测试新型抗抑郁药、抗焦虑药和抗精神病药。与对照小鼠相比，用例如抗焦虑药等药物预治疗的小鼠显示出弹珠掩埋行为减少。掩埋的弹珠数量越多，代表刻板印象行为的提高状态或更高水平的焦虑(恐新症)。
方法
将小鼠单独放置在一个新的有机玻璃笼(35×28×18.5cm，L× W×H)中，里面装满锯末(5-10cm)并且上面有20个弹珠(五排或弹珠，规则地距笼壁2cm且相隔2cm)。三十分钟后，对掩埋超过其表面 2/3的弹珠数量进行计数。
结果
相对于相应的媒剂治疗的对照，菌株NCIMB 43456治疗的BTBR 小鼠和菌株NCIMB43456治疗的MIA小鼠在测试期间掩埋的弹珠数量减少(图10)。
结论
在弹珠掩埋试验中，用菌株NCIMB 43456进行长期治疗可减少 BTBR和MIA小鼠的焦虑样行为。
实施例2c–评估与刻板印象相关的行为–梳理测试
原理
此测试被用作刻板和重复行为的指标。梳理花费的时间增加表明刻板或重复行为的增加。
方法
在一个盖有过滤顶盖的6.5cm直径×10cm高的透明玻璃烧杯中评估自我梳理。实验动物将在测试前1小时被带到测试室进行适应。测试持续时间约为20分钟。调查员记录测试动物梳理所花费的累积时间。在测试之间，烧杯被彻底清洁以供下次使用。
结果
用菌株NCIMB 43456治疗对BTBR或MIA小鼠花在梳理上的时间没有显著影响(图11)。
结论
在梳理测试中，用菌株NCIMB 43456进行长期治疗未明显改变 BTBR或MIA小鼠的重复行为。
实施例2d–评估焦虑样行为–高架十字迷宫
原理
高架十字迷宫(EPM)是一种广泛用于评估啮齿动物焦虑样行为的测试。EPM评估一般焦虑行为，焦虑程度较低的小鼠在迷宫的开放臂中花费更多时间。进入开放臂的时间或次数增加是焦虑减少的指标。
方法
装置由一个距离地面1m的灰色塑料十字形迷宫制成，包括两个开放(可怕的)臂和两个封闭(安全的)臂(50×5×15cm壁或1cm无壁)。实验在红光(约5勒克斯)下进行。将小鼠单独放置在迷宫的中心，面对开放臂(以避免直接进入封闭臂)，并允许它们自由探索5分钟。使用天花板摄像机对实验进行录像，以使用Ethovision软件(3.1版， Noldus,TrackSys,Nottingham,UK)进行进一步的参数分析。测量开放臂中花费的时间和每个臂的进入次数(臂的进入定义为所有四只爪子在臂内)。
结果
相对于媒剂治疗的小鼠，用菌株NCIMB 43456治疗导致MIA小鼠进入迷宫开放臂(OA进入)的次数显著增加(图12)。这种增加对应于媒剂治疗的MIA小鼠相对于野生型对照的OA进入不足的完全恢复。用菌株NCIMB 43456治疗对MIA小鼠在迷宫的开放臂中花费的时间(OA持续时间)没有显著影响，对BTBR小鼠的OA进入或OA 持续时间也没有显著影响(图12)。
结论
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗可显著降低MIA小鼠在高架十字迷宫中的焦虑样行为。用菌株NCIMB 43456进行长期治疗对高架十字迷宫中BTBR小鼠的焦虑样行为没有影响。
实施例2e–评估焦虑样行为–露天场地
原理
露天场地用于评估暴露于新的压力环境和自主活动的反应。初始小鼠自然地沿着场地的墙壁花费大部分时间，因为它比场地的中心暴露得更少。在中心花费的持续时间的增加代表焦虑样行为的减少。
方法
为了评估对新的压力环境和自主活动的反应，将小鼠置于具有约 60勒克斯照明的露天场地(40×32×23cm，L×w×h)中，并允许探索10分钟。使用天花板摄像机对实验进行录像，以使用Ethovision 软件(3.1版，Noldus,TrackSys,Nottingham,UK)进行进一步的参数分析。对行进的距离和进入虚拟中心区域(定义为距离边缘50％处)的等待时间进行评分。
结果
在菌株NCIMB 43456治疗的小鼠与媒剂治疗的对照之间，在区域中心的总行进距离或花费的时间没有显著差异(图13)。
结论
在露天场地测试中，用菌株NCIMB 43456进行长期治疗并没有明显改变BTBR或MIA小鼠的焦虑样行为。
实施例2f–评估社会行为–三室社会互动测试
原理
3室社会互动测试(3-CSIT)是一种经过充分验证的行为学相关模型，所述模型评估性别匹配的同种个体之间的社会互动，并允许读取小鼠的社会新奇和社会偏好。所述测试允许小鼠在无生命物体或性别匹配的同种小鼠之间自由探索。对照动物自然地对同种小鼠的兴趣超过对无生命物体的兴趣(社交性)。类似地，对照动物与一只新的不熟悉的小鼠互动的时间比它们已经有过互动的小鼠要多。
方法
社会测试仪器是一个长方形的三室盒子。每个室为20cm L×40 cm W×22cm H。分隔墙具有小圆形开口(直径5cm)，允许进入每个室。两个相同的金属丝杯状笼，底部直径为10cm，高度为13cm且条间距为1.2cm，允许条之间的鼻子接触，但防止打架，以双边对称的位置放置在每个侧室内。测试分为三个阶段，每个阶段10分钟： 1)适应，2)小鼠与物体，3)新小鼠与熟悉的小鼠。使用天花板摄像机对实验进行录像，以使用Ethovision软件(3.1版，Noldus,TrackSys, Nottingham,UK)进行进一步的参数分析。在第一阶段，将测试小鼠放入中间室，并允许探索里面有一个空的小金属丝笼的整个盒子，进行 10分钟的适应期。在适应期后，将测试小鼠从测试盒子中取出一小段时间，同时将一个物体放置在一个侧室中，并将一只不熟悉的同种雄性小鼠(之前没有与测试对象接触)放在另一侧室中，两者都被封闭在一个金属丝杯状笼中。在第二阶段，测试小鼠被放置在中间室中，并允许探索整个盒子10分钟。评估了在每个室中探索物体或小鼠所花费的时间量以及进入每个室的次数。左侧和右侧室中不熟悉的小鼠的位置在试验之间***地交替。进入被定义为所有四个爪子均在一个室中。在第三阶段，一个物体被替换为一只作为新小鼠的不熟悉的小鼠，并且在另一室中，第二阶段使用的小鼠保持不变，现在作为熟悉的小鼠。每次试验后，用10％乙醇清洁所有室和杯状金属丝笼，干燥并通风几分钟，以防止嗅觉线索偏差并确保适当消毒。在适应整个场地的最初10分钟内，证实了缺乏先天的侧偏好。
结果
对于BTBR和MIA小鼠，用菌株NCIMB 43456治疗导致与不熟悉的小鼠共度的时间相对于无生命物体增加，以及与不熟悉的小鼠共度的时间相对于熟悉的小鼠增加。在每种情况下，用菌株NCIMB 43456治疗导致野生型行为表型完全恢复(图14)。
结论
在三室测试中，用NCIMB 43456菌株进行长期治疗增加了BTBR 小鼠和MIA小鼠的社会新奇性和社会认知。
实施例2g—评估抑郁样行为—新物体识别测试
原理
新物体识别测试用于测试识别记忆和学习。改善的记忆是抑郁样行为减少的反映。对照动物会区分它们有时间探索的物体和新物体。
方法
将小鼠放入灰色塑料矩形盒(40×32×23cm，L×W×H)中间，在场地水平60勒克斯的昏暗灯光下放置10分钟。24小时后，将小鼠放入装有两个相同物体的盒子中，总时间为10分钟(采集阶段)。24 小时后，将两个相同物体中的一个替换为一个新物体，并将小鼠放在盒子中间，在与样品物体相对的壁中点处，总时间为10分钟(保留阶段)。动物在每次实验前适应测试室30分钟。用10％酒精清洁盒子和物品，以避免在每次试验之间产生任何线索气味。使用天花板摄像机对实验进行录像，以进行进一步的参数分析。与物体的直接接触，包括与嘴巴、鼻子或爪子的任何接触或最小定义距离都被计为互动。
结果
媒剂治疗的BTBR小鼠与熟悉的物体互动所花费的时间多于与新物体互动所花费的时间。在BTBR小鼠中，用菌株NCIMB 43456 治疗对与新物体互动所花费的时间相对于与熟悉的物体互动所花费的时间没有可观察到的影响(图15A)。
媒剂治疗的MIA小鼠与熟悉的物体互动所花费的时间也多于与新物体互动所花费的时间。然而，在菌株NCIMB 43456治疗的MIA 小鼠中，此趋势被逆转：菌株NCIMB 43456治疗的MIA小鼠花费更多时间与新物体互动(图15B)。
结论
在新物体识别测试中，用菌株NCIMB 43456进行长期治疗导致 MIA小鼠的抑郁样行为减少。在新物体识别测试中，用NCIMB 43456 菌株进行长期治疗对BTBR小鼠的认知行为没有影响。
实施例2h—评估抑郁样行为—强迫游泳测试
原理
强迫游泳测试(FST)是评估抗抑郁活性的最广泛使用的实验范式。初始动物会在适应不动的漂浮姿势之前以游动、爬动和潜水的形式表现出逃跑行为。不动的持续时间表明行为绝望。不动的增加意味着当动物屈服于其处境(习得性无助)时，抑郁样行为的增加。抗抑郁药减少了在此测试中不动的时间。
方法
将小鼠单独放置在一个透明的玻璃量筒(直径24×21cm)中，其中含有15cm深的水(25±0.5℃)。在每只动物之间换水。测试持续了 6分钟，并使用数字三脚架固定摄像机对实验进行录像；使用视频(视频媒体播放器软件)进一步对数据进行两次评分，并由对条件不知情的实验者计算平均值。对不动的等待时间进行评分。在测试的最后4 分钟测量不动时间，其中不动定义为完全没有运动，除了轻微运动以保持头部高于水面。
结果
对于BTBR和MIA小鼠，用菌株NCIMB 43456治疗均导致不动时间相对于媒剂治疗的小鼠显著减少(图16)。
结论
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗导致BTBR小鼠和MIA小鼠在强迫游泳试验中的抑郁样行为均减少。
实施例2i–体内肠运动分析
原理
据报道，MIA模型会导致肠道屏障功能的变化。因此，重要的是确定用生物治疗剂进行长期治疗是否会改变肠运动。
方法
此程序涉及经口施用给定量的无毒、有色标记(胭脂红)以确定肠道的运动性。将第一次有色便团排出的时间记录为‘全肠转运时间’，并用作全肠蠕动运动的指标。分析前将小鼠单独饲养3小时，以使其适应新笼子。胭脂红染料(每只小鼠100-200ul含6％胭脂红的0.5％甲基纤维素)通过管饲法口服给与。每10分钟目视检查每个笼子。记录第一次有色便团(红色)的时间。在第一次有色便团出现后，小鼠恢复到正常的饲养条件。
结果
对于BTBR或MIA小鼠，相对于媒剂治疗的对照，用菌株NCIMB 43456治疗不会导致肠运动时间的显著差异(图17)。
结论
与BTBR小鼠或MIA小鼠的对照或媒剂组相比，用菌株NCIMB 43456进行长期治疗不会影响肠运动。
实施例2j–离体胃肠道通透性分析
原理
MIA小鼠表现出肠道通透性增加，这与结肠中紧密连接蛋白的表达减少和炎症相对应[74]。
方法
使用Ussing室离体评估回肠和结肠的通透性。FITC浓度的增加代表了不良影响，因为它表明肠道屏障的‘渗漏’增加。
通过颈椎脱臼对小鼠实施安乐死，且取出远端回肠和结肠，置于冷冻的Krebs溶液中，沿肠系膜线切开并仔细冲洗。然后将制备物置于如先前[75]所述的Ussing室(HarvardApparatus,Kent,UK，暴露面积0.12cm2)中，所述室具有含氧(95％O2，5％CO2)Krebs缓冲液，保持在37℃下。将4kDa FITC-葡聚糖以2.5mg/mL的最终浓度添加到粘膜腔中；在接下来的3小时内，每30分钟从浆膜腔中收集200μL 样品。
结果
相对于媒剂治疗的MIA小鼠的回肠制剂，针对来自菌株NCIMB 43456治疗的MIA小鼠的回肠制剂观察到浆膜腔中的FITC浓度显著降低。针对菌株NCIMB 43456治疗的MIA小鼠与媒剂治疗的MIA 小鼠的结肠制剂没有观察到显著差异，并且针对菌株NCIMB 43456 治疗的BTBR小鼠与媒剂治疗的BTBR小鼠的结肠或回肠制剂没有观察到显著差异(图18)。
结论
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗可减少MIA小鼠回肠肠屏障的渗漏。用菌株NCIMB 43456进行长期治疗不影响MIA小鼠的结肠肠屏障通透性，并且不影响BTBR小鼠的结肠或回肠肠屏障通透性。
实施例2k–重量监测
在整个研究过程中每周评估动物体重以确定用菌株NCIMB 43456进行长期治疗是否会影响这一特定参数。
结论
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗不会影响BTBR小鼠或MIA 小鼠的体重(图19)。
实施例2l–器官重量和结肠长度
方法
关于治疗和测试条件以随机方式处死动物；采样发生在上午9.00 与下午2:30之间。将躯干血收集在EDTA(乙二胺四乙酸)钾管中，并以4000g离心15分钟。分离血浆并储存在-80℃下以供进一步分析。大脑被快速切除、解剖并且每个大脑区域在干冰上快速冷冻并储存在 -80℃下以供进一步分析。取出脾脏，收集在5mL RPMI培养基(含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，R8758 Sigma+10％FBS(F7524，Sigma)+ 1％Pen/Strep(P4333，Sigma))中并在宰杀后立即处理以进行离体免疫刺激。将肠组织(距盲肠最近的2cm回肠和结肠段被切除，并使用距盲肠最远的1cm组织)安装到Ussing室中用于肠道通透性分析(参见以上实施例2j)。再取1cm的回肠和结肠组织用于紧密连接基因表达分析。将盲肠取出、称重并储存在-80℃下用于SCFA分析。
结果
对于MIA小鼠，相对于媒剂治疗的对照，用菌株NCIMB 43456 治疗不会导致结肠长度、盲肠重量/体重或脾脏重量/体重的显著差异。
对于BTBR小鼠，相对于媒剂治疗的对照，用菌株NCIMB 43456 治疗不会导致结肠长度或脾脏重量/体重的显著差异。相对于媒剂治疗的BTBR小鼠，菌株NCIMB 43456治疗的BTBR小鼠的盲肠重量 /体重增加(p＝0.06)(图20)。
结论
用菌株NCIMB 43456治疗不影响BTBR或MIA小鼠的结肠长度或脾脏重量/体重。用菌株NCIMB 43456治疗导致BTBR小鼠盲肠重量/体重的非显著增加，但对MIA小鼠的盲肠重量/体重没有影响。
实施例2m–脑干单胺水平
原理
在脑干中评估血清素和去甲肾上腺素水平以及5-HIAA/5-HT转换。脑干包含许多用于大脑所有主要神经递质***的细胞体，包括血清素和去甲肾上腺素。5-HIAA是血清素(5HT)的主要代谢物。相对于非精神病、猝死对照，在***者脑干样品中发现5HT和5-HIAA水平升高以及5-HIAA/5HT转换降低，并且可能与重度抑郁症(MDD)有关 [76]
方法
通过HPLC对脑干样品分析神经递质浓度。简而言之，脑干组织在500μl掺加4ng/40μl N-甲基5-HT(Sigma Chemical Co.,UK)作为内标的冷却流动相中进行超声处理。流动相含有0.1M柠檬酸、5.6 mM辛烷-1-磺酸(Sigma)、0.1M磷酸二氢钠、0.01mM EDTA (Alkem/Reagecon,Cork)和9％(v/v)甲醇(Alkem/Reagecon)，并使用4N 氢氧化钠(Alkem/Reagecon)将pH调节至2.8。然后将匀浆在4℃下以 22,000×g离心15分钟，并将40μl上清液注入HPLC***，所述***由SCL 10-Avp***控制器、LECD 6A电化学检测器(Shimadzu)、LC-10AS泵、CTO-10A烘箱、SIL-10A自动进样器(样品冷却器保持在40C下)和在线Gastorr脱气器(ISS,UK)组成。采用保持在30℃下的反相柱(Kinetex 2.6u C18 100×4.6mm，Phenomenex)进行分离(流速0.9ml/min)。玻碳工作电极与Ag/AgCl参比电极(Shimdazu)的组合以+0.8V操作，且生成的色谱图使用Class-VP 5软件(Shimadzu)进行分析。神经递质通过标准注射确定的特征保留时间来识别，所述标准注射在样品分析期间定期运行。测量分析物与内标的峰高比，并与标准注射进行比较。结果表示为ng神经递质/g组织鲜重。
结果
相对于野生型C57BL/6对照，媒剂治疗的BTBR小鼠的脑干去甲肾上腺素水平和5-HIAA/5HT转换显著降低。相对于媒剂治疗的 BTBR小鼠，用菌株NCIMB 43456治疗BTBR小鼠导致脑干中的 5-HIAA/5HT转换显著增加，且血清素(5HT)显著降低。相对于媒剂治疗的对照，在菌株NCIMB 43456治疗的BTBR小鼠中去甲肾上腺素的水平也有所增加(p＝0.061)(图21)。
相对于野生型C57BL/6对照，媒剂治疗的MIA小鼠的脑干5HT 水平显著升高，且5-HIAA/5HT转换显著降低。相对于媒剂治疗的对照，用菌株NCIMB 43456治疗MIA小鼠也导致脑干5HT水平显著降低，但不影响脑干去甲肾上腺素水平或5-HIAA/5HT转换(图21)。
结论
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗导致BTBR和MIA小鼠的5HT水平降低，且5-HIAA/5HT转换增加，表明菌株NCIMB 43456 可能对治疗MDD有效。用菌株NCIMB 43456进行长期治疗也导致 BTBR小鼠的去甲肾上腺素水平增加，但不影响MIA小鼠的去甲肾上腺素水平或5-HIAA/5HT转换。
实施例2n–杏仁核基因表达
方法
使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion/Llife technologies, Paisley,UK)和经处理DNA酶(Turbo DNA-free,Ambion/life technologies)，根据制造商的建议提取总RNA。使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.,Wilmington,Delaware,USA)，根据制造商说明书对RNA进行定量。使用Agilent Bioanalyzer(Agilent,Stockport,UK)，根据制造商的程序评估RNA质量，并计算RNA完整指数(RIN)。RIN值>7的RNA用于后续实验。使用Applied Biosystems High Capacity cDNA试剂盒(AppliedBiosystems, Warrington,UK)，根据制造商说明书将RNA逆转录为cDNA。简而言之，Multiscribe逆转录酶(50U/μL)(1)(2)(1)(10)作为RT master mix 的一部分添加，在25℃下培育10分钟，在37℃下培育2小时，在 85℃下培育5分钟并在4℃下储存。使用由AppliedBiosystems设计的针对小鼠特异性靶向基因的探针(6羧基荧光素-FAM)进行定量 PCR，同时使用β-肌动蛋白作为内源性对照。扩增反应含有1μl cDNA、5μl 2X PCR Master mix(Roche)、900nM的每种引物，并通过添加无RNA酶的水达到总共10μl。所有反应均使用
Figure BDA0003767152760000931
480***上的96孔板一式三份地进行。热循环条件按照制造商(Roche)的建议进行55个循环。为了检查扩增子污染，对于每个使用的探针，每次运行均不含模板对照，一式三份地进行。记录循环阈值(Ct)。使用β-肌动蛋白对数据进行标准化，并使用2-ΔΔCT方法进行转换，并呈现为与对照组相比的倍数变化。
催产素能***(催产素受体)、内分泌***(盐皮质激素(Nr3c1)；糖皮质激素受体(Nr3c2)；皮质酮释放因子(CRF)和受体；脑源性神经营养因子(BDNF))；和神经递质***(NMDA受体2A(Grin2A)；NMDA 受体2B(Grin2B)；GABAA受体亚基A2；GABAB受体亚基B1；血清素1A受体(5HT1AR))的标志物的mRNA水平在杏仁核中进行了评估。
如上文实施例1b所述地提取和定量RNA。
结果
在MIA小鼠中，相对于媒剂治疗的对照，用菌株NCIMB 43456 进行长期治疗导致催产素受体、Grin2A和GABA A2 mRNA表达显著增加。对于任何其它测试的mRNA，在杏仁核表达中没有观察到显著差异(图22)。
在BTBR小鼠中，相对于媒剂治疗的对照，用菌株NCIMB 43456 进行长期治疗导致GABA A2 mRNA表达显著降低。对于任何其它测试的mRNA，在杏仁核表达中没有观察到显著差异(图22)。
结论
用菌株NCIMB 43456治疗导致BTBR小鼠的催产素受体和神经递质Grin2A GABA A2的杏仁核mRNA表达增加，但导致MIA小鼠的杏仁核GABA A2 mRNA表达降低。
关于菌株NCIMB 43456治疗自闭症谱系障碍的总体结论
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗导致在BTBR和MIA小鼠的弹珠掩埋测试期间掩埋的弹珠数量减少，但不影响梳理所花费的时间。用菌株NCIMB 43456治疗也导致MIA小鼠在高架十字迷宫测试中进入迷宫开放臂的次数显著增加，但对MIA小鼠在迷宫开放臂中花费的时间没有影响，并且不影响BTBR小鼠在高架十字迷宫测试中的行为。菌株NCIMB 43456在ASD小鼠模型中改善焦虑相关行为的能力是有前景的，并且表明它可能是一种有效的治疗剂。
在BTBR和MIA小鼠中，用菌株NCIMB 43456进行长期治疗导致在三室社会互动测试中野生型社会行为表型完全恢复。这有力地表明菌株NCIMB 43456治疗可有效地治疗以社会行为受损为特征的疾病。
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗导致BTBR和MIA小鼠在强迫游泳试验中的抑郁样行为均减少。在新物体识别测试中，用菌株 NCIMB 43456治疗也导致MIA小鼠的抑郁样行为减少，但在此测试中不显著影响BTBR小鼠的行为。这伴随着BTBR小鼠在菌株NCIMB 43456治疗后脑干5-HIAA/5HT转换的增加，以及BTBR和MIA小鼠在菌株NCIMB 43456治疗后脑干血清素水平的降低，即可能与重度抑郁症有关的标志物的改善。这些数据强烈表明菌株NCIMB43456 治疗可有效地治疗抑郁和抑郁症。
用菌株NCIMB 43456进行长期治疗不会显著影响测量的大多数生理参数。用菌株NCIMB 43456治疗不影响BTBR或MIA小鼠的体重。肠运动也不受影响，结肠长度和脾脏重量/体重也是如此。盲肠重量/体重在MIA小鼠中不受菌株NCIMB 43456治疗的影响，但在 BTBR小鼠中非显著增加。在MIA小鼠中，在菌株NCIMB 43456治疗后观察到回肠通透性降低(即渗漏减少)，但没有观察到对结肠通透性的影响。用菌株NCIMB 43456治疗不影响BTBR小鼠的肠屏障通透性。
EMA关于治疗自闭症谱系障碍的药品临床开发的指南指出，由于疾病的异质性，单一化合物可能无法对所有核心症状产生显著效果，且因此必须对至少一种核心症状证明短期疗效。菌株NCIMB 43456活生物治疗剂已显示出对至少一种核心症状或自闭症谱系障碍的有效治疗，因此该菌株和相关的耐久肠球菌菌株预期对人类疾病有效。
序列
SED ID NO:1–耐久肠球菌型菌株98D，16S rRNA基因， GenBank登录号NR_036922
Figure BDA0003767152760000961
SED ID NO:2–使用Geneious从2个读段组装的耐久肠球菌菌株NCIMB 43456的16srRNA序列
Figure BDA0003767152760000962
Figure BDA0003767152760000971
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<130> P12646WO
<140> 待分配
<141> 2021-01-27
<160> 2
<170> SeqWin2010, version 1.0
<210> 1
<211> 1534
<212> DNA
<213> 耐久肠球菌(Enterococcus durans)
<400> 1
tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgta cgcttctttt 60
tccaccggag cttgctccac cggaaaaaga agagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 120
taacctgccc atcagaaggg gataacactt ggaaacaggt gctaataccg tataacaatc 180
gaaaccgcat ggttttgatt tgaaaggcgc tttcgggtgt cgctgatgga tggacccgcg 240
gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcc acgatgcata gccgacctga 300
gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 360
agggaatctt cggcaatgga cgaaagtctg accgagcaac gccgcgtgag tgaagaaggt 420
tttcggatcg taaaactctg ttgttagaga agaacaagga tgagagtaac tgttcatccc 480
ttgacggtat ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg tttcttaagt 600
ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggga gacttgagtg 660
cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaggaaca 720
ccagtggcga aggcggctct ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcgtggggag 780
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggag 840
ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 900
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctttgacca ctctagagat 1020
agagcttccc cttcgggggc aaagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttgttagttg ccatcattta 1140
gttgggcact ctagcaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggaagta caacgagtcg 1260
cgaagtcgcg aggctaagct aatctcttaa agcttctctc agttcggatt gtaggctgca 1320
actcgcctac atgaagccgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1440
gtgaggtaac cttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg gtgaagtcgt 1500
aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct ggat 1534
<210> 2
<211> 1436
<212> DNA
<213> 耐久肠球菌(Enterococcus durans)
<400> 2
aaaaggcggc tggctccaaa ggttacctca mcgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcgtgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccggcttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagagaagc 180
tttaagagat tagcttagcc tcgcgacttc gcgactcgtt gtacttccca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtcttgcta gagtgcccaa ctraatgatg gcaactaaca ataagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcactt tgcccccgaa ggggaagctc tatctctaga gtggtcaaag gatgtcaaga 480
cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600
gcgttagctg cagcactgaa gggcggaaac cctccaacac ttagcactca tcgtttacgg 660
cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgagcc tcagcgtcag 720
ttacagacca gagagccgcc ttcgccactg gtgttcctcc atatatctac gcatttcacc 780
gctacacatg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt ctcccagttt ccaatgaccc 840
tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg ctcgctttac 900
gcccaataaa tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960
tagccgtggc tttctggtta gataccgtca agggatgaac agttactctc atccttgttc 1020
ttctctaaca acagagtttt acgatccgaa aaccttcttc actcacgcgg cgttgctcgg 1080
tcagactttc gtccattgcc gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg 1140
tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctatgcatcg tggccttggt 1200
gagccgttac ctcaccaact agctaatgca ccgcgggtcc atccatcagc gacacccgaa 1260
agcgcctttc aaatcaaaac catgcggttt cgattgttat acggtattag cacctgtttc 1320
caagtgttat ccccttctga tgggcaggtt acccacgtgt tactcacccg ttcgccactc 1380
ttctttttcc ggtggagcaa gctccggtga aaaagaagcg tacgacttgc atgtat 1436

Claims (18)

1.一种包含耐久肠球菌物种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述中枢神经***病症或病况由微生物群-肠-脑轴介导，任选地其中所述组合物用于调节所述微生物群-肠-脑轴的方法中。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中：
(a)所述组合物用于治疗或预防神经发育病症或神经精神病况的方法中；
(b)所述组合物用于治疗或预防选自由以下组成的组的病症或病况的方法中：自闭症谱系障碍(ASD)；儿童发育障碍；强迫症(OCD)；重度抑郁症(MDD)；抑郁症；季节性情感障碍；焦虑症；慢性疲劳综合征(肌痛性脑脊髓炎)；应激障碍；创伤后应激障碍；精神***症谱系障碍；精神***症；双相障碍；精神病；情绪障碍；痴呆；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；慢性疼痛(例如中枢敏化或纤维肌痛)；运动神经元病；亨廷顿氏病；格林巴利综合征和脑膜炎；或
(c)所述组合物用于治疗或预防自闭症谱系障碍的方法中，任选地其中所述组合物用于治疗或预防自闭症的方法中。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物预防、减少或减轻刻板、重复、强迫和/或焦虑行为。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物预防、减少或减轻绝望或无助感。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物改善学习和/或记忆功能。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物预防、减少或改善恐新症或社交能力缺陷。
8.如权利要求1或2所述的组合物，其中：
(a)所述组合物用于治疗或预防强迫症的方法中，任选地其中所述组合物预防、减少或减轻重复、强迫和/或焦虑行为；
(b)所述组合物用于治疗或预防MDD的方法中，任选地其中所述组合物治疗或预防急性重度抑郁发作和/或预防新发作(预防复发)和/或所述组合物预防、减少或减轻轻度、中度或重度MDD发作的发生；
(c)所述组合物用于治疗或预防焦虑症的方法中，任选地其中所述焦虑症选自广泛性焦虑症(GAD)；特定恐惧症；社交焦虑症；分离焦虑症；广场恐惧症；恐慌症；和选择性缄默症；
(d)所述组合物用于治疗或预防神经认知障碍的方法中，任选地其中所述神经认知障碍选自血管性痴呆；混合型阿尔茨海默氏病和血管性痴呆；路易体病；额颞叶痴呆；帕金森氏痴呆；克雅氏病；亨廷顿氏病；和韦尼克-科尔萨科夫综合征；或
(e)所述组合物用于治疗癫痫的方法中。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与以下各者至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列：
(a)耐久肠球菌细菌菌株的16s rRNA序列，或
(b)SEQ ID NO:1或2。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列，或其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的所述16s rRNA序列。
11.一种包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一的16s rRNA序列，所述组合物用于治疗或预防中枢神经***病症或病况的方法中。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中：
(a)所述组合物用于口服施用；
(b)所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体；
(c)所述细菌菌株被冻干，和/或
(d)所述细菌菌株是有活力的并且能够部分或完全定殖于肠道。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中：
(a)所述组合物包含耐久肠球菌的单一菌株，或
(b)所述组合物包含耐久肠球菌细菌菌株作为微生物聚生体的一部分。
14.一种包含如前述权利要求中任一项所述的组合物的食品，所述食品供前述权利要求中任一项使用。
15.一种包含如前述权利要求中任一项所述的组合物的疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防如前述权利要求中任一项所述的中枢神经***病症或病况的方法中。
16.一种以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其生物型或衍生物的细胞，所述细胞用于治疗，或供权利要求1至10中任一项使用。
17.一种包含如权利要求16所述的细胞的组合物，所述组合物供权利要求16使用，任选地进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
18.一种以登录号NCIMB 43456保藏的耐久肠球菌菌株或其衍生物的生物纯培养物。
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