CN114982958A - 靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂及其制备方法，属于食品工业和纳米制剂领域。本发明利用牛乳外泌体作为载体，利用两亲性的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000作为连接结构，在牛乳外泌体磷脂双分子层膜表面修饰具有靶向功能的透明质酸，利用超声方式装载具有生物活性的虾青素，形成稳定的虾青素靶向载运体系。制得的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂具有良好的综合性能：水溶性、热稳定性、抗氧化性和对脂多糖诱导引起的细胞氧化损伤的抑制作用均较游离虾青素有明显提升，同时还具有良好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂及其制备方法，属于食品工业和纳米制剂领域。
背景技术
虾青素是一种叶黄素、类胡萝卜素、深红色的生物活性物质，主要存在于藻类、酵母和虾类中。虾青素具有抗糖尿病、抗炎、免疫调节等多种保健功能，在功能性食品中具有广阔的应用前景。此外，虾青素具有极强的抗氧化活性和极强的单氧淬灭能力，是一种令人难以置信的活性氧清除剂。由于其结构中存在大量的不饱和键，在紫外线和热的酸性和碱性溶液中不稳定，易降解。另外，虾青素主要以酯类形式存在，水溶性差，限制了其生物利用度。
发明内容
[技术问题]
提供一种基于天然牛乳来源的外泌体靶向递送虾青素的纳米制剂的制备方法，制得的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂具有良好的综合性能：水溶性、热稳定性、抗氧化性和对脂多糖诱导引起的细胞氧化损伤的抑制作用均较游离虾青素有明显提升，同时还具有良好的生物相容性。
[技术方案]
本发明的第一目的在于提供一种靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将牛乳进行第一次离心，以去除牛乳中颗粒较大的脂肪杂质；
(2)取步骤(1)所得上清液调节PH值至4.6，以沉淀蛋白质杂质；
(3)将步骤(2)所得体系进行第二次离心，取上清液过滤，以去掉小颗粒沉淀杂质；
(4)取步骤(3)所得滤液进行第三次离心，取沉淀，即为牛乳外泌体；
(5)将牛乳外泌体与中性磷酸盐缓冲溶液充分溶解混匀，得到牛乳外泌体分散液；
(6)制备透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，其中透明质酸与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为10:1；
(7)将步骤(5)所得牛乳外泌体分散液与步骤(6)所得透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照质量比20:1混合，搅拌反应，获得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液；
(8)将虾青素溶解于醇中，得到虾青素醇溶液；将步骤(7)所得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液与虾青素醇溶液按照牛乳外泌体与虾青素的质量比为(8～50):1混合；冰浴条件下间歇超声、冰上孵育循环多次，温育，即得到透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液；
(9)将步骤(8)所得透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液离心以除去未包埋的虾青素，通过旋转蒸法除去溶剂，得到透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体纳米制剂。
在某些实施方式中，步骤(1)中第一次离心在转速10000～13000g、10℃下离心30min。
在某些实施方式中，步骤(3)中第二次离心在转速10000～13000g、10℃下离心30min。
在某些实施方式中，步骤(4)中第三次离心在转速135000～150000g、10℃超速离心90min。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(8)中，将步骤(7)所得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液与虾青素醇溶液按照牛乳外泌体与虾青素的质量比为10:1混合。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(6)具体包括：先活化透明质酸中的羧基；然后，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶解于二甲基甲酰胺中，将二甲基甲酰胺溶解的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000与活化后的透明质酸溶液按照透明质酸与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为10:1混合，在室温下搅拌12小时，透析纯化后获得透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
作为本发明的一种优选实施方式，活化透明质酸中的羧基的方法：将透明质酸溶于水中，再加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，以活化透明质酸中的羧基。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(7)中4℃条件下搅拌反应12～24h。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(8)中：
间歇超声：冰浴条件下间歇超声、冰上孵育循环多次具体为：在超声功率为200～250W、冰浴条件下间歇超声处理2分钟，间歇超声处理程序按照开启15s/关闭15s进行；
冰上孵育：间歇超声后，在冰上继续孵育2分钟；
前述间歇超声、冰上孵育步骤循环3次。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(8)中超声功率为200W。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(8)中，在37℃下温育1小时。
本发明的第二目的在于提供由前述的方法制得的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂。
本发明的第三目的在于提供前述的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂在制备食品、保健品中的应用。
[有益效果]
(1)本发明利用具有与细胞膜相似磷脂双分子层结构、由细胞分泌的牛乳外泌体作为载体，利用两亲性的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000作为连接结构，在牛乳外泌体磷脂双分子层膜表面修饰具有靶向功能的透明质酸，利用超声方式装载具有生物活性的虾青素，形成稳定的虾青素靶向载运体系。
(2)本发明在牛乳外泌体的表面修饰透明质酸能够提高牛乳外泌体作为纳米载体的靶向能力；通过二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000实现了透明质酸在牛乳外泌体上的修饰，克服了透明质酸与牛乳外泌体相容性差，难以复合的技术难题。
(3)本发明提供的基于天然牛乳来源的外泌体靶向递送虾青素的纳米制剂的制备方法，制得的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂具有良好的综合性能：水溶性、热稳定性、抗氧化性和对脂多糖诱导引起的细胞氧化损伤的抑制作用均较游离虾青素有明显提升，同时还具有良好的生物相容性。
(4)本发明研究发现，相较于游离的虾青素，经牛乳外泌体包载后虾青素对于LPS诱导所造成RAW264.7细胞的抗氧化损伤保护以及降低细胞内促炎因子的产生作用有所提高，进一步经过透明质酸修饰后形成的靶向载运体系具有与单独牛乳外泌体装载相比较表现出更优的抗氧化及抗炎活性。
(5)本发明研究发现，相经过透明质酸修饰后的牛乳外泌体可以作为虾青素的理想递送体系，能够有效提高虾青素生物活性，增加虾青素的抗逆性。
附图说明
图1为本发明实例1的步骤S4所得的牛乳外泌体的透射电镜图。
图2为本发明实例1的步骤S5所得的负载虾青素的牛乳外泌体的透射电镜图。
图3为本发明实例2所得透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体的透射电镜图。
图4为本发明对比例1的只通过差速离心方法分离得到的牛乳外泌体的透射电镜图。
图5为本发明实例3测定的虾青素包埋率比较图。
图6为游离虾青素与本发明实例2中步骤S6所得的透明质酸修饰的牛乳外泌体处理后的虾青素的紫外光谱图。
图7为游离虾青素、本发明实例1的负载虾青素的牛乳外泌体、实例2的透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体的热重分析图。
图8为本发明不同浓度的实例1的牛乳源细胞外囊泡(牛乳外泌体)对细胞活力的影响图。
图9为不同浓度的本发明实例1所得负载虾青素的牛乳外泌体对细胞活力的影响图。
图10为不同浓度的本发明实例2的透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体对细胞活力的影响图。
图11为本发明中在相同虾青素浓度条件下，游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)对脂多糖(LPS)诱导的炎症细胞模型的保护荧光强度对比图。
图12为本发明中在相同虾青素浓度条件下，游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)对脂多糖(LPS)诱导的炎症细胞模型的肿瘤坏死因子的抑制作用对比图。
具体实施方式
本申请不仅限于下述实施方案中的具体条件及细节。各种具体技术特征在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对所有可能的组合方式不再另行说明。任何熟悉本技术领域的技术人员可根据自身情况在本发明描述的技术范围内进行简单的变型和置换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。在实践本发明中，可以使用本申请所述的本发明实施方案的各种备选方案。下面将结合附图详细描述本发明的实例，旨在解释本发明，将技术方案清楚、完整的描述，并未对发明中使用的试剂或仪器等进行限制。
下面通过具体实例对本发明作进一步说明。
实例2中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的购买渠道及产品信息：购自上海麦克林生化科技有限公司，纯度≥98％。
实例1：负载虾青素的牛乳外泌体的制备方法
S1、将牛乳置于高速离心瓶中，在转速13000g、10℃下离心30min，以除掉牛乳中的颗粒较大的脂肪杂质；
S2、取步骤S1中离心后的上清液，使用2mol/L盐酸溶液调节该上清液的PH值至4.6，以使该上清液中的蛋白质杂质被沉淀；
S3、将步骤S2所得体系在10000g、10℃下离心30min，取上清液，再经孔径大小为0.22μm滤膜，以去掉细胞碎片等小颗粒沉淀；
S4、将步骤S3所得滤后清液在135000g、10℃超速离心90min，取沉淀，即为牛乳来源的外泌体(牛乳外泌体)，使其完全溶解于中性磷酸盐缓冲溶液中，得到牛乳外泌体的分散液。
S5、将步骤S4所得牛乳外泌体的分散液与虾青素的乙醇溶液按照牛乳外泌体与虾青素的质量比为10:1混合，采用超声负载方法在超声功率为200～250W、冰浴条件下间歇超声处理2分钟，间歇超声处理程序按照开启15s/关闭15s进行，然后在冰上继续孵育2分钟；前述间歇超声孵育步骤循环3次，即得到负载虾青素的牛乳外泌体分散液。将负载虾青素的牛乳外泌体分散液在37℃下温育1小时，以恢复牛乳外泌体膜的稳定性。
将负载虾青素的牛乳外泌体分散液通过离心(3000×g，5min，25℃)以除去未包埋的虾青素，在37℃下通过旋转蒸法除去乙醇，即得到负载虾青素的牛乳外泌体纳米制剂。
实例2：透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体的制备方法
实例2的步骤S1-S4同实例1的步骤S1-S4；
S5、制备透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000：首先，将透明质酸(900mg，30μmol)完全溶解在蒸馏水中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(40.0μmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(50.0μmol，得到混合溶液，在低温下连续搅拌4小时，以活化透明质酸中的羧基；然后，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶解于二甲基甲酰胺中，将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000与活化后的透明质酸溶液按照透明质酸与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为10:1混合，在室温下搅拌12小时，将所得粘稠溶液转移至3500道尔顿透析袋中透析48小时，然后冷冻干燥，即获得透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；
S6、将步骤S4所得牛乳外泌体的分散液与步骤S5所得透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照质量比20:1混合，在4℃条件下搅拌12～24h，通过自组装反应获得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液；
S7、将步骤S6所得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液与虾青素的乙醇溶液按照牛乳外泌体与虾青素的质量比为10:1混合；采用超声负载方法在超声功率为200～250W、冰浴条件下间歇超声处理2分钟，间歇超声处理程序按照开启15s/关闭15s进行，然后在冰上继续孵育2分钟；前述间歇超声孵育步骤循环3次，即得到透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液。将透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液在37℃下温育1小时，以恢复牛乳外泌体膜的稳定性。
将透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液通过离心(3000×g，5min，25℃)以除去未包埋的虾青素，在37℃下通过旋转蒸法除去乙醇，即得到透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体纳米制剂。
实例3：透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体的优化-牛乳外泌体与虾青素的质量比对虾青素包埋率的影响
在实例2的基础上，调整步骤S7中牛乳外泌体与虾青素的质量比，即分别按照透明质酸修饰的牛乳外泌体与虾青素的质量比为10:1、50:1混合，分别得到两种透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体纳米制剂。
如图5所示，牛乳外泌体与虾青素的质量比为10:1的条件下的虾青素包埋率(74％)高于质量比为50:1条件下的虾青素包埋率(54％)。
对比例1：只通过差速离心方法分离得到的牛乳外泌体
一种牛乳外泌体的提取方法，参照实例1，区别仅在于，省略步骤S2，即只通过差速离心方法分离得到的牛乳外泌体。
测试方法：
透射电镜表征：分别将20μL的实例1的步骤S4所得的牛乳外泌体、实例1的步骤S5所得的负载虾青素的牛乳外泌体、实例2所得透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体和对比例1的只通过差速离心方法分离得到的牛乳外泌体分别滴入铜网中，用2％乙酸双氧铀进行阴性染色在透射电镜下观察。
溶解性测试：
混合溶液1：将1mg虾青素与10μL实例2的步骤S6所得的透明质酸修饰的牛乳外泌体混合，充分涡旋10分钟并孵育30min，之后向上述溶液中加入1毫升ddH2O。混合溶液2：将1mg虾青素溶解在1毫升ddH2O中。将前述两种混合溶液在冰上静置30min后，在5000rpm下离心5min，去除未溶解的虾青素。使用紫外可见光谱仪测量250-700nm范围内的紫外-可见吸收光谱，计算虾青素浓度以评价虾青素在水中的溶解性。
虾青素包埋率：
将待测透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体纳米制剂持续超声30min，以释放负载与牛乳外泌体中的虾青素，然后使用二氯甲烷/甲醇(2:1，v/v)萃取，使用紫外可见光谱仪测量250-700nm范围内的紫外-可见吸收光谱，得到虾青素浓度，从而确定虾青素包埋率。
热稳定性测试：
Discovery TGA 550仪器(TA,New Castle,USA)用于进行热重分析(TGA)，以表征游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体、透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体的热稳定性，测试条件为：在氮气氛中温度范围为30至700℃，升温速率为每分钟30℃。
细胞活力表征：将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在96孔板中，孵育24小时使细胞贴壁，除去培养基后加入按照牛乳外泌体浓度定量，浓度分别为(0、1、2、2.5、5、7.5、10μg/mL)的牛乳外泌体(实例1)、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)培养基孵育24小时，结束孵育后加入20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝，振荡10min后在570nm处测定吸光度值，牛乳外泌体浓度为0mg/mL的吸光度值设定为细胞活力值100％。
细胞内活性氧水平评价：将RAW264.7细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在十二孔板中。按照虾青素浓度定量，游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)溶解在培养基中，孵育24小时后，除去培养基并用含有1μg/mL的脂多糖(LPS)的培养基代替，单独培养基作为对照组。处理24小时后，细胞用0.5mL二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，EX＝500nm，EM＝525nm)染色30分钟。在用PBS洗涤三次后，立即在荧光显微镜下对细胞进行观察，细胞所显示的荧光强度结果通过imagineJ软件分析。
细胞内促炎因子分泌水平的评价：将RAW264.7巨噬细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在十二孔板中孵育24小时使细胞粘附在细胞板上，按照相同的虾青素浓度进行定量，更换含有单独虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)、透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)的新鲜培养基孵育24小时，出去培养基后，用含有脂多糖1μg/mL的培养基替换后孵育24小时，使用生化试剂盒测定细胞内肿瘤坏死因子(TNF-α)的细胞内表达水平。
性能对比：
微观形态：如图1所示，实例1的步骤S4所得的牛乳外泌体显示出杯形或球形，尺寸约为100nm；如图2所示，实例1的步骤S5所得的负载虾青素的牛乳外泌体呈现球形，尺寸大小增加至约145nm；如图3所示，实例2所得透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体仍显示球形，尺寸大小约为165nm；如图4所示，对比例1的只通过差速离心方法分离得到的牛乳外泌体的纯度降低，电镜下密集程度降低。
溶解性：如图6所示，紫外光谱显示在250-700nm波长范围内的虾青素的特征吸收峰480nm左右。在虾青素含量相同的情况下，实例2所得透明质酸修饰的牛乳外泌体作用于虾青素后较游离虾青素显示出更高的吸收峰，证明透明质酸修饰的牛乳外泌体能够大幅提高虾青素在水中的溶解性。
热稳定性：如图7的热重分析曲线所示，与游离虾青素相比，负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)均表现出更优的热稳定性：游离虾青素在300℃左右出现较高的重量损失，表明游离虾青素在300℃以上热稳定差；而负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)在20～700℃下重量损失较小，表明在20～700℃下的热稳定性优异。基于此，负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)可以适用于700℃以下的热加工工艺，应用场景较游离虾青素更加广泛。
细胞活力测定显示：浓度为1～10μg/mL的牛乳外泌体(实例1)对细胞活力没有抑制作用，说明牛乳外泌体具有良好的生物相容性，可以作为安全的递送载体。负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)则表现出随着牛乳外泌体浓度的增加细胞活力表现出先增加后下降的趋势，分析可知在牛乳外泌体浓度1μg/mL-5μg/mL范围内，负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)均可以有效的促进细胞增殖。优选地，对于负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)，当牛乳外泌体浓度为1～2.5μg/mL时，相较于未添加牛乳外泌体的空白组，细胞活力显著提升，尤其是当牛乳外泌体浓度为2.5μg/mL时，相较于未添加牛乳外泌体的空白组，细胞活力提升最高，提升比例达到了134％。优选地，对于透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)，当牛乳外泌体浓度为2～5μg/mL时，相较于未添加牛乳外泌体的空白组，细胞活力提升了10％以上，尤其是当牛乳外泌体浓度为5μg/mL时，相较于未添加牛乳外泌体的空白组，细胞活力提升最高，提升比例达到了111％。
细胞内活性氧水平：在相同虾青素浓度条件下，游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)对脂多糖(LPS)诱导的炎症细胞模型的保护荧光强度对比结果如图11所示。与空白组相比，仅用脂多糖诱导组显示出最高的荧光强度，表明其细胞内氧化损伤升高，活性氧增加；经过游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)处理后荧光强度较脂多糖诱导组有所降低，表明活性氧含量下降。其中实例2的荧光强度最低至42％，最接近空白组(30％)，表现出最强的抗氧化性，说明透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体对脂多糖引起的细胞损伤具有更有效的保护。
细胞内促炎因子分泌水平：在相同虾青素浓度条件下，游离虾青素、负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)对脂多糖(LPS)诱导的炎症细胞模型的肿瘤坏死因子的抑制作用对比如图12所示。与空白组相比，仅用脂多糖诱导组显示出最高的细胞内肿瘤坏死因子(TNF-α)的细胞内表达水平。负载虾青素的牛乳外泌体(实例1)和透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体(实例2)处理后，细胞内肿瘤坏死因子(TNF-α)的细胞内表达水平较脂多糖诱导组相比明显降低，其中实例2的透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体组的细胞内肿瘤坏死因子(TNF-α)的细胞内表达水平最低达到104pg/mL，接近空白组(90pg/mL)，说明其对细胞内促炎因子抑制作用更显著，透明质酸靶向作用更突出。
Claims (10)
1.一种靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将牛乳进行第一次离心，以去除牛乳中颗粒较大的脂肪杂质；
(2)取步骤(1)所得上清液调节PH值至4.6，以沉淀蛋白质杂质；
(3)将步骤(2)所得体系进行第二次离心，取上清液过滤，以去掉小颗粒沉淀杂质；
(4)取步骤(3)所得滤液进行第三次离心，取沉淀，即为牛乳外泌体；
(5)将牛乳外泌体与中性磷酸盐缓冲溶液充分溶解混匀，得到牛乳外泌体分散液；
(6)制备透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，其中透明质酸与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为10:1；
(7)将步骤(5)所得牛乳外泌体分散液与步骤(6)所得透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照质量比20:1混合，搅拌反应，获得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液；
(8)将虾青素溶解于醇中，得到虾青素醇溶液；将步骤(7)所得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液与虾青素醇溶液按照牛乳外泌体与虾青素的质量比为(8～50):1混合；冰浴条件下间歇超声、冰上孵育循环多次，温育，即得到透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液；
(9)将步骤(8)所得透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体分散液离心以除去未包埋的虾青素，通过旋转蒸法除去溶剂，得到透明质酸修饰的负载虾青素的牛乳外泌体纳米制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中，将步骤(7)所得透明质酸修饰的牛乳外泌体分散液与虾青素醇溶液按照牛乳外泌体与虾青素的质量比为10:1混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)具体包括：先活化透明质酸中的羧基；然后，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶解于二甲基甲酰胺中，将二甲基甲酰胺溶解的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000与活化后的透明质酸溶液按照透明质酸与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为10:1混合，在室温下搅拌12小时，透析纯化后获得透明质酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，活化透明质酸中的羧基的方法：将透明质酸溶于水中，再加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，以活化透明质酸中的羧基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中4℃条件下搅拌反应12～24h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中：
间歇超声：冰浴条件下间歇超声、冰上孵育循环多次具体为：在超声功率为200～250W、冰浴条件下间歇超声处理2分钟，间歇超声处理程序按照开启15s/关闭15s进行；
冰上孵育：间歇超声后，在冰上继续孵育2分钟；
前述间歇超声、冰上孵育步骤循环3次。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(8)中超声功率为200W。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中，在37℃下温育1小时。
9.由权利要求1-8任一所述的方法制得的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂。
10.权利要求9所述的靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂在制备食品、保健品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210666267.9A CN114982958B (zh) | 2022-06-13 | 2022-06-13 | 靶向修饰负载虾青素牛乳外泌体纳米制剂及其制备方法 |
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Publications (2)
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