CN114967093A - 一种基于显微高光谱成像平台的自动对焦方法及*** - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于显微高光谱图像的自动对焦方法及***，方法包括：获取降采样图像；基于降采样图像，获取视场清晰度，并对视场清晰度进行判断，基于判断结果，获取图像序列，基于图像序列，获取正向差值数列及反向差值数列，基于正向差值数列及反向差值数列，得到最清晰图像位置。通过上述技术方案，能够提高获取高光谱图像的准确性与实时性，并能够获取定位物体的最佳聚焦位置。

Description

一种基于显微高光谱成像平台的自动对焦方法及***
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域，特别涉及一种基于显微高光谱成像平台的自动对焦方法及***。
背景技术
高光谱图像拥有极为丰富的空间信息与光谱信息，为物体的分类鉴别提供了新思路。然而传统显微镜的光谱范围非常有限，因此将显微高光谱成像技术应用在医学领域十分必要。而由于被成像物体的厚薄不均，并且采用数字扫描显微镜逐视场采集高光谱图像数据是常规的做法。被成像物体不同区域的准焦平面位置是未知的，但物体相邻区域内的准焦平面在一定范围内。因此，获得物体的清晰成像与获取清晰成像的时间都亟待改进。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种基于显微高光谱成像平台的自动对焦方法及***，来提高获取高光谱图像的准确性与实时性，能够获取定位物体的最佳聚焦位置。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于显微高光谱图像的自动对焦方法，包括：
获取降采样图像；基于降采样图像，获取视场清晰度，并对视场清晰度进行判断，基于判断结果，获取图像序列，基于图像序列，获取正向差值数列及反向差值数列，基于正向差值数列及反向差值数列，得到最清晰图像位置。
可选的，获取降采样图像的过程包括：
设置采集条件，其中采集条件包括波段范围、波段数目、曝光时间、物镜倍数及图像标签；
基于采集条件，对单视场的图像进行降采样，得到降采样图像。
可选的，获取视场清晰度的过程包括：
通过拉普拉斯算子对降采样图像进行计算得到视场清晰度。
可选的，获取图像序列的过程包括：
对视场清晰度进行判断，若视场清晰度大于期望值，则对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列，否则对镜头进行上下移动，并在第二范围内获取降采样图像序列，基于降采样图像序列计算拉普拉斯评价值，将移动显微镜电动载物台移动至拉普拉斯评价值的最大值处，并对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列。
可选的，得到最清晰位置的过程包括：
通过拉普拉斯算子对正向差值数列及反向差值数列进行过滤，将过滤结果与图像序列中的第一张图像位置的中值作为最清晰图像位置。
另一方面，为了更好的实现上述技术目的，本发明提供了一种基于显微高光谱图像的自动对焦***，包括：
控制计算机，光学显微镜、移动显微镜电动载物台、分光器、声光可调谐滤波器、灰度相机及彩色相机；
灰度相机及彩色相机用于获取光学显微镜中的降采样图像，其中降采样图像包括彩色图像及灰度图像；
其中控制计算机用于控制移动显微镜电动载物台移动，并基于降采样图像，获取视场清晰度，并对视场清晰度进行判断，基于判断结果，获取图像序列，基于图像序列，获取正向差值数列及反向差值数列，基于正向差值数列及反向差值数列，得到最清晰图像位置；
声光可调谐滤波器用于实时显示光学显微镜中的降采样图像及图像序列。
可选的，通过设置灰度相机及彩色相机采集条件，其中采集条件包括波段范围、波段数目、曝光时间、物镜倍数及图像标签；基于采集条件，对单视场的图像进行降采样，得到降采样图像。
可选的，控制计算机包括计算模块，计算模块用于通过拉普拉斯算子对降采样图像进行计算得到视场清晰度。
可选的，控制计算机包括判断模块，判断模块用于对视场清晰度进行判断，若视场清晰度大于期望值，则对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列，否则对镜头进行上下移动，并在第二范围内获取降采样图像序列，基于降采样图像序列计算拉普拉斯评价值，将移动显微镜电动载物台移动至拉普拉斯评价值的最大值处，并对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列。
可选的，控制计算机包括处理模块，处理模块用于通过拉普拉斯算子对正向差值数列及反向差值数列进行过滤，将过滤结果与图像序列中的第一张图像位置的中值作为最清晰图像位置。
本发明具有如下技术效果：
本发明所提出的基于显微高光谱图像自动对焦方法，通过图像降采样有效减少了清晰度运算量，差值运算则更进一步提升效率。减少了人工对焦的成本投入，能够高效、准确地获取清晰视场，高效准确地提高了显微数字图像拍摄效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的方法流程示意图；
图2为本发明实施例提供的***示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
如图1所述，本发明提供了一种基于显微高光谱图像的自动对焦方法，包括：
移动显微镜电动载物台移动至感兴趣视场，获取该单视场的降采样图像并保存至内存当中；
通过拉普拉斯算子计算当前视场清晰度，大于6直接执行步骤4，否则继续执行步骤3；
以24um为步长上下移动，在±48um范围内获取共5张降采样图片序列，计算拉普拉斯评价值并移动至最大值位置；
以6um为步长上下移动，在±24um范围内共获取9张图像序列，计算图像序列正向和反向两组差值数列，寻找数列中最小值；
用拉普拉斯算子过滤掉不符合条件的一组，得到最清晰位置。
通过拉普拉斯算子计算当前视场清晰度过程中，设定好高光谱图像采集所需要的波段范围，波段数目，曝光时间，拍摄图像的物镜倍数以及图像的名字等数据，手动或者用工业控制机控制显微镜的三轴电动载物台移动至感兴趣区域；将单视场2048*2048像素的图像以0.08的倍率进行降采样，并将其保存在内存当中。计算降采样后图像的拉普拉斯评价值，若评价值大于6则直接进行步骤4的精对焦；
计算拉普拉斯评价值并移动至最大值位置过程中，以24um为步长，移动载物台Z轴分别保存降采样的图像到内存中；分别计算相应的拉普拉斯清晰度评价值，最终移动到评价值最高的值所对应的载物台坐标；
得到最清晰位置过程中，以6um为步长，移动载物台Z轴分别保存降采样的图像到内存中；得到9张图片序列，按照坐标依次从第一张图片，其中第一张图片索引为0，减至最后一张得到一组数列A；按照坐标依次从最后一张减至第一张得到另一组数列B；找到数列中最小的数字，并通过拉普拉斯评价值过滤掉其中较小的点；最终得到的点(若存在于数列A中)与第一张图像的中值即为最清晰图像的位置。
通过控制显微镜电动载物台270来实现自动对焦有很多需要考虑的因素。其中就包括粗对焦步长的选取，粗对焦图像序列数目，精对焦步长的选取，精对焦图像序列数目以及包含清晰图像的范围的选取。由于相邻区域的准焦平面之间的距离会受到切片制作的厚薄影响会有差异，但是一般维持在±50um范围内。粗对焦的步长可由精对焦确定，精对焦的步长选取为6um，采用图像差值需要至少9张图像，故粗对焦的步长设置为24um，受到上述范围的限制，故可以将粗对焦的图像序列的数目设置为5张。
本发明的创意来自于图像降采样与图像差值对于显微高光谱图像自动对焦运算量的双重降低，在此基础上能够实现精确的实时自动对焦。
本发明所提供的一种基于显微高光谱图像的自动对焦方法，其具体算法流程可以参见图1，实施例的实验结果数据如下：
基于步骤100，先对高光谱图像的声光可调谐滤波器210进行设置，将波段范围设置为预期波段范围，设置当前工业控制机的实时显示波段为640nm，并针对曝光时间，卤素灯光源200的光强物镜倍数，样本名字进行一系列初始化设定。通过手动或工业控制机控制显微镜的电动载物台270选取感兴趣视场，或者划定拍摄区域并移动到所划定拍摄区域的第一个视场，获取该视场的降采样图像，即将当前单视场2048*2048像素，640nm波段的灰度图像以0.08的倍率进行降采样；
之后执行步骤110，通过拉普拉斯算子计算步骤100得到的降采样图像的清晰度评价值(取均值)，若该值大于6则直接执行步骤120的精对焦过程，否则继续执行步骤115；
步骤115是以24um为步长上下移动显微镜的电动载物台270，并实时刷新灰度相机240获取到的图像，同样将其以0.08倍率进行降采样，将降采样后的图像一并存入内存当中。在±48um范围内一共可以获取5张降采样640nm波段的灰度图像的图片序列，分别计算这5张图像的拉普拉斯评价值构成一个5个元素的数组，遍历该数组找出其中的最大值所对应的显微镜电动载物台270高度并移动至该位置；计算得到某一视场下Z轴移动后的清晰度如表1所示。
表1
Position(mm) Sharpness
-48 2.436
-24 3.369
0 9.522
24 2.573
48 2.409
以24um为步长，移动载物台270Z轴分别保存降采样的图像到内存中；分别计算相应的拉普拉斯清晰度评价值，最终移动到评价值最高的值所对应的载物台270坐标。
由于上述表格表1中最大值为9.522，在当前位置，故不用移动；
在步骤120中则以6um为步长上下移动显微镜的电动载物台270，与步骤115执行类似操作，同样实时刷新灰度相机240获取到的图像，将其以0.08倍率进行降采样，并把降采样后的图像一并存入内存当中。在±24um范围内可以获取9张显微高光谱的单波段灰度图像所构成的图像序列。在步骤125与步骤130当中，我们分别计算图像序列中第一张图像依次减去第i张图像(1<i≤9)所得到的长度为8的正向差值数组和图像序列中最后一张图像依次减去第i张图像(9>i≥1)所得到的长度为8的反向差值数组两组差值数列，并寻找数列中最小值。该步骤的具体实现数据如表2所示：
表2
正向差 0-1 0-2 0-3 0-4 0-5 0-6 0-7 0-8
均值 4.768 10.255 12.991 7.856 3.187 2.265 4.351 6.076
反向差 8-7 8-6 8-5 8-4 8-3 8-2 8-1 8-0
均值 2.787 5.243 7.922 11.761 15.939 13.672 8.383 6.076
以6um为步长，移动载物台270Z轴分别保存降采样的图像到内存中。得到9张图片序列，按照坐标依次从第一张减至最后一张得到一组图像均值数列A；按照坐标依次从最后一张减至第一张得到另一组图像均值数列B；
按照步骤140所述，遍历两组数组，找到其中的最小值所对应图片序列当中的降采样灰度图像，用拉普拉斯算子分别计算两张图像的清晰度评价值，过滤掉其中评价值较小的一张图像，最终得到该图像所对应的显微镜电动载物台270的位置即为最清晰的位置。则该例子的具体实现为：
找到数列中最小的数字，并通过拉普拉斯评价值过滤掉其中较小的点；最终得到的点(若存在于数列A中)与第一张图像的中值即为最清晰图像的位置。排除掉清晰度评价值低的2.787对应的位置，则最清晰的图像位置为上表中0-6所对应的位置，即为第6张图与第一张图的中点。
本发明所提出的基于显微高光谱图像的自动对焦方法，通过整体使用降采样后的图像进行运算，大大降低了运算量。又由于采用差值运算取代传统清晰度运算，进一步降低了计算复杂度，能够在保证图像清晰的情况下实现实时自动对焦。最快能够在0.9s内完成单视场自动对焦。减少了人工对焦的成本投入，高效准确地提高了数字显微高光谱图像拍摄效率。
实施例二
如图2所示，本发明的实施例基于显微高光谱成像***，该***包括：一台工业控制计算机，光学显微镜，可编程三轴电动载物台270，分光器，声光可调谐滤波器210，灰度相机240与彩色相机250。其中工业控制计算机提供用户友好的操作界面针对用户操作，执行相应代码。在上述操作中，其中有一个操作会基于当前位置对获取的图像进行迭代扫描，并基于扫描结果最终移动到准焦位置，采集图像并刷新工业控制机的实时预览界面。此外，该方法还针对实时性做了自适应的优化，该优化主要基于图像清晰度评价的计算值，超过一定阈值直接进行更细粒度的对焦计算，否则先实施粗粒度的对焦操作。
本发明的实施例基于上述***对自动对焦方法进行具体说明。这个方法采用对整个单视场采集图像进行降采样，若当前位置的降采样图像的清晰度评价值大于阈值则直接进入细粒度的对焦计算，否则通过不断移动载物台270获得一组降采样图像序列，收集其计算得到的离焦数据。找到最大值从而抵达准焦位置附近，以更小步长同样基于当前位置采集一组降采样图像序列，进行差值比较后得到真正的准焦位置。该自动对焦方法对于本显微高光谱采集***的彩色图像和灰度图像均有效。
本发明的实施例实现高光谱图像的自动对焦步骤主要包括：设定好高光谱图像采集所需要的波段范围，波段数目，曝光时间，拍摄图像的物镜倍数以及图像的名字等数据；采用BSQ的图像数据组合形式进行拍摄，即按波段拍摄图像，工业控制计算机会通过声光可调谐滤波器210实时显示在显微镜载物台270当前位置下，当前波段下的显微高光谱灰度图像；将该图像传入上述自动对焦算法260，对当前单视场进行降采样，计算降采样图像清晰度评价值判断是否大于阈值；大于则直接进行精对焦，否则，移动以大步长载物台270获取图像序列找到最大值并移动；以小步长移动载物台270获取图像序列并进行图像差值得到真正准焦位置并移动到该位置，最终完成显微高光谱图像的自动对焦。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种基于显微高光谱图像的自动对焦方法，其特征在于，包括：
获取降采样图像；基于降采样图像，获取视场清晰度，并对视场清晰度进行判断，基于判断结果，获取图像序列，基于图像序列，获取正向差值数列及反向差值数列，基于正向差值数列及反向差值数列，得到最清晰图像位置。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
获取降采样图像的过程包括：
设置采集条件，其中采集条件包括波段范围、波段数目、曝光时间、物镜倍数及图像标签；
基于采集条件，对单视场的图像进行降采样，得到降采样图像。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
获取视场清晰度的过程包括：
通过拉普拉斯算子对降采样图像进行计算得到视场清晰度。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
获取图像序列的过程包括：
对视场清晰度进行判断，若视场清晰度大于期望值，则对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列，否则对镜头进行上下移动，并在第二范围内获取降采样图像序列，基于降采样图像序列计算拉普拉斯评价值，将移动显微镜电动载物台移动至拉普拉斯评价值的最大值处，并对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
得到最清晰位置的过程包括：
通过拉普拉斯算子对正向差值数列及反向差值数列进行过滤，将过滤结果与图像序列中的第一张图像位置的中值作为最清晰图像位置。
6.一种基于显微高光谱图像的自动对焦***，其特征在于：包括，
控制计算机，光学显微镜、移动显微镜电动载物台、分光器、声光可调谐滤波器、灰度相机及彩色相机；
灰度相机及彩色相机用于获取光学显微镜中的降采样图像，其中降采样图像包括彩色图像及灰度图像；
其中控制计算机用于控制移动显微镜电动载物台移动，并基于降采样图像，获取视场清晰度，并对视场清晰度进行判断，基于判断结果，获取图像序列，基于图像序列，获取正向差值数列及反向差值数列，基于正向差值数列及反向差值数列，得到最清晰图像位置；
声光可调谐滤波器用于实时显示光学显微镜中的降采样图像及图像序列。
7.根据权利要求6所述***，其特征在于：
通过设置灰度相机及彩色相机采集条件，其中采集条件包括波段范围、波段数目、曝光时间、物镜倍数及图像标签；基于采集条件，对单视场的图像进行降采样，得到降采样图像。
8.根据权利要求6所述***，其特征在于：
控制计算机包括计算模块，计算模块用于通过拉普拉斯算子对降采样图像进行计算得到视场清晰度。
9.根据权利要求6所述***，其特征在于：
控制计算机包括判断模块，判断模块用于对视场清晰度进行判断，若视场清晰度大于期望值，则对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列，否则对镜头进行上下移动，并在第二范围内获取降采样图像序列，基于降采样图像序列计算拉普拉斯评价值，将移动显微镜电动载物台移动至拉普拉斯评价值的最大值处，并对移动显微镜电动载物台进行上下移动，并在第一范围内获取图像序列。
10.根据权利要求6所述***，其特征在于：
控制计算机包括处理模块，处理模块用于通过拉普拉斯算子对正向差值数列及反向差值数列进行过滤，将过滤结果与图像序列中的第一张图像位置的中值作为最清晰图像位置。
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