CN114959051A

CN114959051A - 一种与湖羊体重相关的分子标记及其应用

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Publication number: CN114959051A
Application number: CN202111664488.4A
Authority: CN
Inventors: 张小雪; 翟芮; ***; 李发弟; 张德印; 王江荟; 赵利明; 杨晓斌; 曾希文
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明提供了一种与湖羊体重相关的分子标记，以及该分子标记的检测方法和应用。本发明通过对湖羊KLF15基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段上存在一个A/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对1249只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与体重进行关联分析，最终确定了本发明扩增的KLF15基因片段可以作为与湖羊体重相关的分子标记。本发明的分子标记可用于选留AA纯合的湖羊进入核心群，以提高湖羊的体重，有助于增加经济效益。

Description

一种与湖羊体重相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记制备及应用技术领域，具体涉及一种与湖羊体重相关的分子标记及其应用。

背景技术

KLF转录因子家族(Krupple-like factors，KLFs)是锌指转录因子家族成员，在调控动物生长发育、细胞增殖、分化和凋亡方面起着重要作用，尤其在脂肪细胞的分化和脂质代谢过程中起重要调控作用(郭红芳.KLF3和KLF15基因对牛前体脂肪细胞分化和脂质代谢调控研究[D].西北农林科技大学，2018.)。KLF15蛋白有丰富的编码氨酸和脯氨酸的序列，这些序列对于许多转录因子的激活具有积极作用(吕世杰.鸡KLF15基因的组织表达特性及多态性分析研究[D].河南农业大学，2014.)。Gray等研究表明，该基因在机体脂肪细胞和肌肉细胞中表达丰富，在脂肪前体细胞分化为脂肪细胞过程中表达量升高(Gray S,FeinbergMW,Hull S,et al.The Krüppel-like factor KLF15 regulates the insulin-sensitiveglucose transporter GLUT4.Jbiol Chem.2002；277(37):34322-34328.)。

湖羊是多产品种，四季发情，生长快，性成熟早，产羔数高，平均产羔数2.06。湖羊主要分布在江苏、浙江和上海。体重和体型是湖羊产业的关键特征(Tao L,XY He,Pan L X,et al.Genome-wide association study of body weight and conformation traits inneonatal sheep[J].Animal Genetics,2020.)。在湖羊的生产实践中，选择具有良好体重增长的湖羊是至关重要的，对于长势好增重快的湖羊，可大大节约生产成本，并有较好的经济效益。但是湖羊体重的增长是否与KLF转录因子家族的KLF15基因有关联，具体如何关联并不清楚。

本发明通过对KLF15基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与湖羊体重之间的关联，旨在为提高湖羊增重的遗传改良方面提供基因素材，加速拥有自主知识产权的快速增重型优质肉羊新品种的培育进程。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种作为与湖羊体重相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记从湖羊KLF15基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过扩增湖羊KLF15基因的DNA序列并测序，寻找KLF15基因的多态性位点，从而可以建立湖羊体重相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于快速增重型优质肉羊新品种的培育中。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一方面，本发明提供了一种与湖羊体重相关的分子标记，该分子标记通过对湖羊KLF15基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第103位的R表示A或G，由于上述序列在第103位碱基处有一个A/G突变，从而导致了湖羊KLF15基因在该位点的A/G多态性。

其中，SEQ ID NO.1：AGCCCTGACTCGCAAACCCTGTGTTCCTGCTACGGAGGCGGCCGGGCGGCTGAGGGCCAGGACAGTATCCTGGATTTCCTGCTGTCCCAGGCCACCCTGGGCRGTGGCGTTGCGGCTCATGGCAGCCCCATGGCCTGGGGGAGCTGGCGGAAAACACCGGCCCCCGTGAAGGGGGAGCATTTCAGCTTCCCCGAGTTCCCCGTGGGCGACCCTGATGACGTCCCTCGGCCCTTCCAGCCCACCCTGGAGGAGATCGAAGAGTTTCTGGAGGAGAACATGGAGCCCGCGGTGAAGCAGGCCCCAGAGGGCAGTGGCAAGGACTTGGACACCTGTGGCC

第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或扩增包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：

正向引物M-F(SEQ ID NO.2):5＇-AGCCCTGACTCGCAAACCC-3＇；

反向引物M-R(SEQ ID NO.3):5＇-GGCCACAGGTGTCCAAGTCC-3＇。

此外，本发明还提供可用于检测SEQ ID NO.1所示的分子标记的KASPar引物对，优选地，所述KASPar引物对包括：

用于检测AlleleC的正向引物A1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

SEQ ID NO.4:5＇-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCATGAGCCGCAACGCCACT-3＇；

用于检测AlleleT的正向引物A2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

SEQ ID NO.5：5＇-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCTTTTCTTAAAGACCCAGGTCG-3＇；

通用反向引物C，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

SEQ ID NO.6：5＇-TGGATTTCCTGCTGTCCCAGGC-3＇。

第三方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了本发明第二方面的引物对或KASPar引物对。

第四方面，本发明提供了一种检测与湖羊体重相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对湖羊KLF15基因进行检测，本发明的具体检测方法包括如下步骤：

a)使用本发明的检测分子标记的引物对或KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对湖羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点(SNP)进行分型鉴定。

其中，在步骤b)中，任何SNP分型方法均可适用于上述分子标记的检测，上述SNP分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

在本发明的分子标记序列和多态性位点已知的情况下，针对该多态性位点设计相应的探针，以及利用上述SNP分型方法对分子标记和多态性位点进行检测均属于本领域中较为常规且成熟的技术，针对该多态性位点设计的探针也可包含于本发明的第三方面的试剂盒中。

进一步地，本发明中利用上述引物对检测与湖羊体重相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以湖羊血液为样品，提取基因组DNA；利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

b)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与湖羊体重相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以湖羊血液为样品，提取基因组DNA；利用SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示的引物对组进行PCR扩增；

b)扩增结束后，通过检测荧光信号并查看分型结果。

第五方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在湖羊体重检测中的应用，通过在待测湖羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定湖羊体重的优劣，进而筛选出快速增重型的湖羊。

第六方面，本发明提供了上述分子标记及多态性位点、引物对或试剂盒的检测方法在湖羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对湖羊的基因组DNA进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出快速增重型湖羊品种。

本发明通过对湖羊KLF15基因进行了大量的PCR扩增和测序，发现在扩增片段上存在一个A/G多态性位点，并通过检测1249只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与湖羊体重相关的分子标记，该分子标记可以用于快速增重型湖羊的选育，为湖羊体重的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

本发明通过设计KASPar引物对分子标记及多态性位点进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种与湖羊体重相关的分子标记及导致多态性的位点，该分子标记通过对湖羊KLF15基因进行扩增而获得，存在一个A/G多态性位点，通过测定该多态性的基因型来有效鉴别是否为快速增重型湖羊，为利于快速增重型湖羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留AA纯合的湖羊进入核心群，以提高湖羊的体重，有助于增加经济效益。

附图说明

图1为本发明中用于作为分子标记的湖羊KLF15基因片段的凝胶电泳图；其中，M泳道：DL 2000Marker，1-10泳道：KLF15基因扩增结果。

图2为本发明中湖羊KLF15基因突变位点的测序结果。

图3为本发明中湖羊KLF15基因g.103A>G突变位点KASPar SNP分型结果；其中，靠近左侧的红色点表示GG基因型，靠近中间的绿色点表示GA基因型，靠近右侧的蓝点表示AA基因型。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1 KLF15基因的扩增

(1)引物设计

以湖羊KLF15基因DNA(GenBank收录号：NC_056072.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物M-F和M-R，引物序列如下

M-F(SEQ ID NO.2)：5＇-AGCCCTGACTCGCAAACCC-3＇，

M-R(SEQ ID NO.3)：5＇-GGCCACAGGTGTCCAAGTCC-3＇

(2)KLF15基因的扩增和测序

PCR扩增采用25μL反应体系，其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，正向引物0.8μL，反向引物0.8μL，ddH₂O 10μL。PCR扩增的反应程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

将PCR扩增的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，结果显示得到337bp特异扩增片段。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示，该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该337bp大小的片段中存在一个多态性位点，即扩增的KLF15基因片段在第103bp位点处存在A/G多态性，如图2所示。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与湖羊KLF15基因DNA(GenBank收录号：NC_056072.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2 基因分型检测方法的建立

(1)引物序列设计

针对实施例1中KLF15基因扩增片段的A/G多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，经大量实验验证后，最后获得的KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleC的正向引物A1(SEQ ID NO.4)：

5＇-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCATGAGCCGCAACGCCACT-3＇；

用于检测AlleleT的正向引物A2(SEQ ID NO.5)：

5＇-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCTTTTCTTAAAGACCCAGGTCG-3＇；

通用反向引物C(SEQ ID NO.6)：5＇-TGGATTTCCTGCTGTCCCAGGC-3＇。

上述引物经北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成浓度为10μmol/L，并按照引物A1：引物A2：引物C的体积比为12:12:30的比例混匀作为引物混合液备用。

(2)DNA质控

通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对从湖羊的血液中提取得到的基因组DNA的质量进行检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间，说明DNA样品没有蛋白污染；A260/230介于1.8-2.0之间，说明DNA样品盐离子浓度低；270nm没有明显的光吸收，说明DNA样品没有酚污染。根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA浓度成为10～20ng/μL备用。

(3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5μL和空白对照(No template control，NTC)分别加入384孔反应板中，在干燥箱中温度为60℃进行烘干，烘干时间为30min，所用的为LGC公司，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作***下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板货号PartNo.

KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴***Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃～55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“GA”或“AG”；黑色圆点表示NTC(图2中未能显示出来)，即空白对照为水。

(4)本发明的分子标记在湖羊体重标记关联分析中的应用

试验共检测了1249只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立最小二乘模型如下，进行基因型与体重的关联分析。

Y_ijk＝μ+Genotype_i+P_j+S_K+ε_ijk

其中，Y_ijk为体重的观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，S_k为季节效应，ε_ijk为随机误差，假定ε_ijk相互独立，服从N(0，σ2)分布。

基因型检测结果表明在1249个湖羊个体中，AA基因型有1023个，AG基因型有208个，GG基因型有18个。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，BW80表示湖羊第80天日龄的体重；BW100天表示湖羊第100天日龄的体重；BW120表示湖羊第120天日龄的体重；BW140表示湖羊第14天日龄的体重；BW160表示湖羊第160天日龄的体重；BW180表示湖羊第180天日龄的体重，单位为kg。表中数据以SPSS 26.0软件利用上述线性模型关联分析获得，数据表示平均值±标准差。

表1 湖羊KLF15基因多态性与体重关联分析

注：同行数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

结果显示，随着测定周期的延长，KLF15 g.103A>G突变位点与湖羊体重显著相关。携带AA基因型羊的体重要优于携带GG基因型的羊(P<0.05)。由此可知A等位基因为优势等位基因。表明KLF15 g.103A>G突变位点可作为影响湖羊体重的分子标记位点(P<0.05)。为在育种中鉴别是否为快速增重型湖羊提供检测技术手段。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 一种与湖羊体重相关的分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agccctgact cgcaaaccct gtgttcctgc tacggaggcg gccgggcggc tgagggccag 60

gacagtatcc tggatttcct gctgtcccag gccaccctgg gcrgtggcgt tgcggctcat 120

ggcagcccca tggcctgggg gagctggcgg aaaacaccgg cccccgtgaa gggggagcat 180

ttcagcttcc ccgagttccc cgtgggcgac cctgatgacg tccctcggcc cttccagccc 240

accctggagg agatcgaaga gtttctggag gagaacatgg agcccgcggt gaagcaggcc 300

ccagagggca gtggcaagga cttggacacc tgtggcc 337

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccctgact cgcaaaccc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccacaggt gtccaagtcc 20

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tccatgagcc gcaacgccac t 41

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tgtcttttct taaagaccca ggtcg 45

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggatttcct gctgtcccag gc 22

Claims

1.一种与湖羊体重相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其中在序列SEQ ID NO.1中的第103bp处的R是A或G，该突变导致分子标记的A/G多态性。

2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的正向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，所述KASPar引物对包括：

用于检测AlleleC的正向引物A1，所述A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

用于检测AlleleT的正向引物A2，所述A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

和通用反向引物C，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对。

5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对湖羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，所述鉴定的方法采用测序法、荧光探针法、基因芯片法或高分辨率溶解曲线法中的任一项。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记及多态性位点、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在湖羊体重检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记及多态性位点、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在湖羊育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述育种为培育快速增重型湖羊。