CN114958991A - 一种超高通量多重pcr扩增子捕获方法 - Google Patents
一种超高通量多重pcr扩增子捕获方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114958991A CN114958991A CN202210687838.7A CN202210687838A CN114958991A CN 114958991 A CN114958991 A CN 114958991A CN 202210687838 A CN202210687838 A CN 202210687838A CN 114958991 A CN114958991 A CN 114958991A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- artificial sequence
- dna
- enzyme
- amplification
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及二代测序领域,具体是一种用于二代测序的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,所述NGS捕获方法包括以下步骤:1)利用包含可消化复合修饰引物对待检测的样本进行多重PCR扩增,得到PCR产物;2)利用包含引物消化酶、纠错酶和末端修复酶的第二酶混液对PCR产物进行酶切反应,包括用于消化酶去除扩增产物上多余引物部分,利用错配纠错酶去除非特异扩增产物;3)利用包含Index的全长接头进行连接反应,直接得到测序用的文库或者扩增后得到测序用文库。本发明的方法显著提高了扩增效率和特异性,而且步骤简单、成本低、时间短,在遗传病检测、肿瘤伴随诊断等基因检测和科学研究领域有广泛应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及二代测序领域,具体涉及一种基于超高通量多重PCR扩增子捕获方法,特别适用于PCR扩增子较多的二代测序应用。
背景技术
高通量测序技术,在有些文献中称其为下一代测序技术(Next generationSequencing,NGS),是对传统测序(Sanger测序)一次划时代的革命性的改变,一次测序可对几十万到几百万条DNA分子序列进行测定。
NGS中的靶向捕获技术包含基于探针的液相杂交捕获和基于多重PCR的扩增子法捕获技术。多重PCR(Multiplex PCR)捕获,又称多重引物PCR捕获,它是在同一个PCR反应体系中加入两对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同,但多重PCR在很多应用中有巨大的优势:1.更高的通量(每个反应孔可分析更多片段);2.更低的样本用量和试剂用量(特别适合珍稀样品,降低成本)。
随着近几年高通量测序技术的发展,科研及临床应用端对单次反应引物对数的要求不断增加,传统多重PCR技术所面对的一个难题是,不同的引物对之间,杂交动力学性质不同。结合效率更高的引物能更充分的利用PCR反应试剂,从而导致其它PCR产物的减少。这通常会导致一些本应该被扩增的产物没有扩增。这一难题,成为了多重PCR单管扩增子数量增长的主要限制因素,行业内主流的解决方案是通过将多个扩增子分成多管进行扩增反应,但是这会导致样本及试剂用量的增加。另外传统的多重PCR扩增子扩增均一性不好,需要反复调整,单管中引物对数过多会产生严重干扰。因此有必要开发一种能够提高多重PCR单管扩增子数量,同时又确保或提高扩增均一性的方法。
专利文献CN110592200A公开了一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。该方法包括:从样本中提取基因组DNA;将所提取到的基因组DNA进行片段化,并进行纯化;以经纯化的基因组DNA为模板,使用多个特异性引物对,进行PCR扩增反应,其中,在所述PCR扩增反应中,使用由低到高的差异化温度进行退火。该发明对DNA片段化并纯化处理,可以使模板与引物快速结合,提高引物使用率。先在较低的退火温度模式下,让扩增引物充分结合到模板DNA上,再逐步提高退火温度,提高各引物结合的特异性;这使得多重PCR的扩增特异性和均一性得到明显改善。
而目前未见如本申请所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种多重PCR单管扩增子数量多、扩增均一性好、能显著提高扩增效率的超高通量多重PCR扩增子捕获方法。
本发明采取的技术方案如下:
一种超高通量多重PCR扩增子捕获方法,所述超高通量多重PCR扩增子捕获方法包括以下步骤:
1)利用包含可消化复合修饰的扩增引物池和第一酶混液对待检测的样本进行多重PCR扩增,得到扩增子产物;所述扩增引物池中的扩增引物至少有一条包含复合修饰碱基核苷酸,且修饰方式存在下列中的一种或几种情况:T碱基替换为U(尿嘧啶)修饰碱基,T碱基替换为+T(锁核苷酸胸腺嘧啶)修饰碱基,T碱基替换为5mC(5甲基胞嘧啶)修饰碱基,T碱基替换为+A(锁核苷酸腺嘌呤)修饰碱基,G碱基替换为8-oxo G(8-羟基脱氧鸟苷)修饰碱基,和T碱基替换为I(次黄嘌呤)修饰碱基;所述第一酶混液为QuarTaq HotStart混合液;
2)利用包含引物消化酶、错配纠错酶和末端修复酶的第二酶混液对扩增子产物进行酶切反应,包括用引物消化酶去除扩增产物上多余引物部分,利用错配纠错酶去除非特异扩增产物;所述第二酶混液包括引物消化酶、错配纠错酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq聚合酶和QuarPrep末端修复加尾缓冲液;所述引物消化酶选自UDG酶和FPG酶中的一种或两种;所述错配纠错酶选自T7核酸内切酶I、T4核酸内切酶VII、E coli核酸内切酶V、Surveror核酸内切酶和CEL I核酸内切酶中的一种或几种;
3)利用包含Index的全长接头、第三酶液和第二缓冲液进行连接反应,直接得到测序用的文库或者扩增后得到测序用文库;所述第三酶液为DNA连接酶。
优选地,对于任一条包含复合修饰碱基核苷酸的扩增引物,其被修饰的碱基数量为0到n之间的任一整数,n代表该条扩增引物总长度。
优选地,利用包含Index的全长接头和第三酶液进行连接反应后直接得到测序用文库。
优选地,所述错配纠错酶用于降低PCR扩增产生的非特异。
优选地,所述包含Index的全长接头替代通用短接头进行连接反应构建测序用文库。
优选地,所述待检测的样本选自原核或真核微生物基因组、动物或植物基因组或人基因组。
优选地,所述扩增引物池包含如SEQ ID NO:1-262所示的引物。优选地,所述的SEQID NO:1和SEQ ID NO:2为引物对,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物对,以此类推。
本发明还提供如上任一实施方案所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法在如下任一方面的应用:病原体检测,遗传病检测,肿瘤早筛检测,肿瘤伴随诊断检测,易感基因检测等。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明方法对扩增引物部分的特殊修饰设计处理,每条扩增引物包含复合修饰碱基核苷酸,A,T,C,G四种碱基的核苷酸进行如下修饰替换,包括:T碱基替换为U(尿嘧啶)修饰碱基,+T(锁核苷酸胸腺嘧啶)修饰碱基,5mC(5甲基胞嘧啶)修饰碱基或+A(锁核苷酸腺嘌呤)修饰碱基,G碱基替换为8-oxo G(8-羟基脱氧鸟苷)修饰碱基或I(次黄嘌呤)修饰碱基等。替换数目为0到n个之间,n代表引物总长度。包含修饰碱基的引物提高了引物结合时的特异性,可以大大提高每个反应中扩增引物对数。更适合超高通量的NGS扩增子建库。
(2)部分消化的产物通过连接酶构建NGS文库,相比两步扩增法提高整体均一性。
(3)利用包含Index的全长接头代替常规的通用截短接头进行连接反应,避免短扩增产物造成的测序数据过滤造成的浪费。
(4)将扩增引物用引物消化酶进行消化,避免了测序过程中对于扩增引物部分产生无效数据的测序浪费。
(5)在部分消化引物步骤同时引入错配纠错酶,修复PCR扩增产物的错配,提高了多重扩增的准确性和特异性。
(6)本发明方法在提高引物扩增效率的同时,相较于液相探针杂交捕获目的片段的方法,又减少了杂交捕获的步骤,既节省了试剂成本,又大大缩短了实验时间。
(7)本发明在病原检测、遗传病检测、肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛等基因检测和科学研究领域有广泛应用价值。
附图说明
图1:验证数据的测序质量。
图2:超多重扩增子法捕获后的片段分析图谱。
图3:超多重扩增子法测序比对和捕获效率图。
图4:超多重扩增子法测序覆盖深度(1×和100×)。
图5:超多重扩增子法测序均一性。
图6:超多重扩增子法和常规两步法PCR捕获法的均一性比较。
图7:超多重扩增子法中纠错酶效果比较。纠错酶可以降低非特异扩增产物。5U的浓度和15min孵育产生最佳效果,T7E1代表T7核酸内切酶I。
图8:带Index全长接头对于有效数据比例的提升图。
图9:超多重扩增子法在新生儿遗传病(α-地贫SEA)检测中的应用检出示例。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
针对背景技术部分提到的多重PCR引物相互作用导致扩增效率降低的问题,在本发明一种典型的实施方式中,提供了一种高通量测序文库的构建方法,该构建方法包括:利用第一酶混液、第一缓冲液及特殊设计的扩增引物对基因组DNA进行多重PCR扩增,得到PCR产物;利用第二酶混液对PCR产物进行酶切反应并进行引物消化、错配校正和末端加A,得到扩增子产物;利用第三酶液及第二缓冲液以及包含index的全长接头对扩增子产物进行接头连接,得到NGS文库;利用第四酶混液和P5/P7通用引物对NGS文库扩增放大(可选步骤)。
本发明的上述构建方法,所述的基因组DNA是指待检测样本。如待检测的样本可以是各种原核或真核微生物基因组、动物或植物基因组以及人或小鼠基因组等,浓度控制在10ng/μl左右。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明。
实施例1
该实施例以人基因组DNA作为实验材料,具体实验步骤如下:
1、样本准备:用Qubit精确测定基因组DNA的浓度。按测定浓度计算将基因组DNA稀释至10ng/μl,备用。
2、本超高通量PCR扩增子捕获方案验证实验采用131对扩增引物,覆盖BRCA1和BRCA2的全部外显子,分为2个pool进行扩增反应,引物的序列如SEQ ID NO:1-262所示。另外采用包含4780对(2个pool)引物的新生儿遗传病筛查Panel进行超高通量方案验证。
3、特异性PCR扩增:利用第一酶混液(2×QuarTaq HotStart混合液)和第一缓冲液(QuarTaq PCR增强剂)以及扩增引物,进行PCR扩增,得到PCR产物。具体反应体系如下表所示。
组分 | 体积 |
基因组DNA | 2μl |
第一酶混液 | 10μl |
扩增引物 | 5μl |
第一缓冲液 | 2μl |
无核酸酶水 | 1μl |
总计 | 20μl |
体系配制完成后将反应管置于PCR仪或者其他热孵育反应仪器中,按照如下程序进行反应:
4、引物消化处理及加A:将PCR产物补水至50μl,用1.5×的纯化磁珠进行纯化,用35μl无核酸酶水进行洗脱,向其中加入9.5μl的第二酶混液(T4多聚核苷酸激酶、Taq聚合酶、FPG酶,UDG酶、T7核酸内切酶I和QuarPrep末端修复加尾缓冲液),并进行如下反应:
温度 | 时间 |
37℃ | 10min |
50℃ | 10min |
65℃ | 5min |
4℃ | ∞ |
5、接头连接:取出第三酶液(T4 DNA连接酶)和第二缓冲液(Tris-HCL、MgCl2、DTT、ATP、PEG6000和1,2-丙二醇混合而成),还有带index的接头引物,按照下表,配制接头连接的反应体系:
组分 | 体积(μl) |
上一步产物 | 44.5 |
带Index全长接头 | 2.5 |
第三酶液 | 10 |
第二缓冲液 | 16 |
无核酸酶水 | 6.9 |
吹打混匀,瞬时离心。
放置于PCR仪上执行以下程序,同时取出磁珠室温孵育30min备用,用无核酸酶水配制足够的80%乙醇。
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 25℃ | 15min |
2 | 4℃ | Hold |
连接完成后的反应体系使用0.8×磁珠进行纯化,然后分别经过80%乙醇漂洗、无核酸酶水洗脱得到纯化后的带接头片段。
6、第二轮PCR扩增(可选步骤):利用第四酶混液(2×QuarTaq HiFi HotStart混合液)和P5/P7通用引物对待接头片段进行PCR富集,得到DNA文库。具体见下表:
组分 | 体积(μl) |
上一步产物 | 17 |
第四酶混液 | 25 |
通用引物 | 8 |
总计 | 50 |
其中,第四酶混液的工作浓度为1×。
接着按下表的PCR程序进行PCR扩增:
PCR后纯化:反应完成后,将PCR管拿出,瞬时离心,将所有液体收集到管底,用等体积的磁珠进行纯化,纯化完毕后用21μl无核酸酶水进行洗脱即可出库。
7、文库质检:使用dsDNA HS Assay Kit检测文库的浓度,使用2100生物分析仪检测文库片段大小,均按照说明书要求进行操作。第一步特异性PCR扩增采用22个循环,第二轮PCR扩增为7个循环,文库产量在150-160ng左右。
8、对质检合格的文库进行上机测序,测序服务委托给北京诺禾致源科技股份有限公司具体实施,采用Illumina基因测序仪,测序模式为PE150(即双端测序,每条序列测150个碱基),每个样本测序数据量为1G碱基。为保证上机前的文库质量,需进行文库浓度检测、***片段大小检测、文库摩尔浓度精确检测。
文库检测主要包括3种方法:
(1)Qubit 2.0对文库浓度进行初步定量;
(2)Agilent 2100检测文库DNA片段的完整性及***片段大小;
(3)Q-PCR方法对文库有效浓度进行精确定量。
文库检测合格后,按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell,cBOT成簇后使用Illumina高通量测序平台(HiSeq/MiSeq)进行测序。
9、对由测序公司返回的数据,我们按照标准的流程进行分析,具体而言,分为如下步骤:
(1)数据质量控制:如果测序错误率用e表示,Illumina平台测得数据的碱基质量值用Qphred表示,则有:Qphred=-10log10(e)。Illumina软件中碱基识别正确率与Phred分值之间的简明对应关系见下表:
Phred分值 | 不正确的碱基识别 | 碱基正确识别率 | Q-score |
10 | 1/10 | 90% | Q10 |
20 | 1/100 | 99% | Q20 |
30 | 1/1000 | 99.9% | Q30 |
40 | 1/10000 | 99.99% | Q40 |
测序错误率与碱基质量有关,根据测序技术的特点,测序片段前端几个cycles和末端的错误率会偏高。一般而言,Q20≥99%,Q30≥95%代表测序质量理想,其中Q20、Q30分别表示Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。本次验证数据的测序质量分布如图1所示,可以看到全部碱基的Q-score值都大于30,该次测序质量满足分析要求。对于质量合格的数据,还需要进行接头含量检测,以除去通过实验引入的外源非人基因组序列。接头检测使用专业开源生信软件TrimGalore(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/),该软件通过内置算法可自动识别接头类型(Illuminauniversal adapter/Nextera transposase adapter/Illumina small RNA adapter等)。通过检测和去除接头序列,我们得到了处理过的数据clean data,用于下一步分析。
(2)数据比对分析:为了进一步识别clean data,进而评估本超多重PCR引物扩增的效率,需要将数据与人标准参考基因组进行比对(alignment)。具体地,我们使用开源工具bwa(http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml)的mem算法,采用双端比对模式,比对对象为人类标准参考基因组GRCh37(hg19)。比对结果为sam(Sequence Alignment/Mapformat)格式,使用开源工具samtools(http://samtools.sourceforge.net/)对该结果按照比对到基因组上的位置进行排序,建立索引,同时转化成更大文件压缩比的bam(BinaryAlignment/Map format)格式,以节省存储空间。
(3)比对结果质控:一般而言,针对超多重PCR扩增子捕获的实验方案,有如下几个指标用于评估扩增效率,分别是:
a.比对率(MappingRate)表示经过预处理之后的数据中人源的比例,越高越好;
b.捕获效率(TargetRate)表示人源数据中,多重引物预期扩增区域的数据占比,越高越好;
c.覆盖度(Coverage)表示目标扩增区域实际扩增覆盖的比例,100%说明每对引物都完成了扩增;
d.均一性(Uniformity)表示每对引物扩增能力的一致性高低,均一性越高,表示扩增一致性越好。
本次测试的样本结果展示见附图3-5,可以看出该方法下的各评估指标理想,而且具有非常高的样本间一致性。
与目前市面上最常见的两步PCR法比较,均一性显著提高。见附图6。
(4)变异检出分析:对比对生成的bam文件结果,使用开源工具VarScan(http://varscan.sourceforge.net/)进行突变分析,获取明确的变异位点结果文件,该结果以vcf(variant calling format)格式保存,包含了变异位置/变异形式/位点深度/变异频率等信息。基于已知阳性结果,对实际检测的变异结果展示如附图9:该阳性位点为α-地贫SEA,变异形式为Deletion of 20kb from HBA2 to HBA1,具有明确的致病性和家族遗传性,与已知临床样本情形一致。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围,而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
序列表
<110> 111111111
<120> 一种用于二代测序的超高通量多重PCR扩增子捕获方法
<160> 262
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gtcttcagaa tgccagagat atacagg 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
aagccatcag tattgtagac aaacacat 28
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gttccctctg cgtgttctca taa 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
attcctgcac taatgtgttc attct 25
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ttttaaggca gttctagaag aatgaaaact ct 32
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tcatacctgt atagggtatg ctctttgaat aat 33
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tgacattgaa gactgacttt actctttcaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gctttttgaa gcctttaagg atttttcttg 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
agaagaagaa aacaaatggt tttaccaagg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ctctaactgc aaacataatg ttttcccttg 30
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
aggaggactg cttctagcct 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gccaaaagac ttctacagag tgaacc 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
atcatggaaa atttgtgcat tgttaaggaa 30
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
cctctcctct gtcattcttc ctgt 24
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
atggacattc taagttatga ggaaacagac 30
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
cactttgtcc aaagattcct ttgca 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ctgggcagat tctgcaactt tc 22
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
aactttgtaa ttcaacattc atcgttgtgt 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ttctctaatg ttattacggc taattgtgct 30
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
gaggctctag gttttgtcta tcatctc 27
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
agggaaacac tcagattaaa gaagatttgt 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
gcaattcttc tggtttctga tcaaagaaat 30
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
acttaccaga tgggacactc taagatt 27
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gacgttgtca ttagttcttt ggtttgtat 29
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
tcagaaaact actttgaaac agaagcagt 29
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
tgattggcaa cacgaaaggt aaaaat 26
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
cgctgatgaa tgtgaaaaat ctaaaaacca 30
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
attttctcca tctgggctcc attt 24
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
ttcagtgatg gaggaaatgt tggtt 25
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gtggtggctc agctacttga g 21
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
gctgatttct gttgtatgct tgtactg 27
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gtaatcggct ctaaagaaac atgatgc 27
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
tccaggaaga ctttgtttat agacctca 28
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
ctgaaagaga aatgggaaat gagaacattc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
tgagctctaa ttttgttgta tttgtcctgt 30
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
acttccacac ggttgtgaca tc 22
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
gcaataaaac tagtagtgca gataccca 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
caatgactga tttttaccaa gagtgcaa 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
aggtcccaaa tggtcttcag aataatc 27
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
gctttctgta atcgaaagag ctaaaatgtt 30
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
tgatgaatgg ttttatagga acgctatgt 29
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
cagttgtgag attatctttt catggctatt 30
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
gtttccagca gctgaaattt gtga 24
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
acttatctct ttgtggtgtt acatgtgtac 30
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
atctgagaaa ccccacagcc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
tgtccctccc atcctctgat 20
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
tttcaggaag gaatgttccc aatagtag 28
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
ccaggctctt agccaaaata ttagca 26
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
ccccagagca tcacttggg 19
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
attctgagag gctgctgctt ag 22
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
agtgacttgt ttaaacagtg gaattctaga 30
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
gcataccacc catctgtaag ttcaataa 28
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
ccagtggtat gtgggagttt gtt 23
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
agatttgtaa atctcagggc aaaggt 26
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
gtttattgca ttcttctgtg aaaagaagc 29
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
tgctttttgg atcattttca cactgtc 27
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
agcctaatct tactagacat gtcttttctt 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
cgcgttgaag aagtacaaaa tgtcattaat 30
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
ttcccatgga aaagaatcaa gatgtatgt 29
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
tcctttcatt agctacttgg aagacaaaat 30
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
ccattctagg acttgcccct ttc 23
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
cagaaaacac agaaaaatct ccagcaaa 28
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
gaccagctca caagagaaga aaatact 27
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
ggtttctctt atcaacacga ggaagtattt 30
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
gcctgtgaat ggtctcaact aacc 24
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
gcaagaatgc agtctgtatg agattcaa 28
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 67
tctcagccca gatgacttca aag 23
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
gagtcatctg aggagaattc agttcttttt 30
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
gggaatcagg ctttactaga agaaca 26
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
caatgtggtc tttgcagcta tttactt 27
<210> 71
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
cccttcactt cagcaaattt ttagatcc 28
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
ctggtagctc caactaatca taagagattt 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
gtgaaagtat ctagcactgt gtatgtatgt 30
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 74
acttccattg aaggaagctt ctctt 25
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 75
ggtacagcag actgtggaat gt 22
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 76
aaagactctg catttttgct gttaattttt 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 77
cttcctttat ttcaccatca tctaacaggt 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 78
ccaaaattga atgctatgct tagattaggg 30
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 79
tttagtagag acagggtttc tccatt 26
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 80
gcgttgcctt tgtttcttct taattc 26
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 81
ctgtaatgag ctggcatgag tatttg 26
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 82
cacctccaag gtgtatgaag tatgtatttt 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 83
caaatagtag atgtgctttt tgatgtctga 30
<210> 84
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 84
ggtttagaga ctttctcaaa ggcttagat 29
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 85
atgacaaaaa tcatctctcc gaaaaacaag 30
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 86
caagttcctc aacgcaaata tcttcatt 28
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 87
atttggagta atgagtccag tttcgtt 27
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 88
agaagaggaa tgtgcaacat tctctg 26
<210> 89
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 89
aaaatcaaag tgtttgttcc aatacagca 29
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 90
caattggtgg cgatggtttt ctc 23
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 91
tcagcttact ccggccaaaa aa 22
<210> 92
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 92
agccgcggca gcgaccc 17
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 93
tatgtgggtt tgcaatttat aaagcagc 28
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 94
tatacaacag aatatacgat ggcctccata 30
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 95
cccatcgtgg gatcttgctt at 22
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 96
aaagctcttc ctttttgaaa gtctgttttt 30
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 97
ctgaagcctc tgaaagtgga ct 22
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 98
catttgcttc aaactgggct gaa 23
<210> 99
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 99
caacaagaca aacaacagtt ggtattagg 29
<210> 100
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 100
tgtcagttca tcatcttcca taaaagctt 29
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 101
tggtattgaa attttagcac tgtaagcaac 30
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 102
ttaaggtcta tccaaaactt tattgccagt 30
<210> 103
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 103
aggatgttaa agctcattca gtcaaagat 29
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 104
aggaacgggc ttggaagaaa ataat 25
<210> 105
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 105
ttttacctca gtcacataat aaggaatgca 30
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 106
ggttctaagc aacactgtga cgta 24
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 107
ataggaaaat accagcttca tagacaaagg 30
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 108
gccacagtag atgctcagta aatatttcta 30
<210> 109
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 109
tgggtgtttt atgcttggtt ctttagt 27
<210> 110
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 110
agagagtcta aaacagcttc tcacct 26
<210> 111
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 111
tgaggaaaca gtggtaaata agagagatga 30
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 112
tcctccttct gtgagcaaac ag 22
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 113
aatactgcta ctctctacag atctttcagt 30
<210> 114
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 114
gccaaatgaa cagacaagta aaagacat 28
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 115
caaaatatgt ggaggcccaa caa 23
<210> 116
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 116
tgttgctatt ctttgtctaa caccaaaaa 29
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 117
gagttgtggc accaaatacg aaac 24
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 118
agtcctagtg gattcactga cagatataaa 30
<210> 119
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 119
gtgacttttg gactttgttt ctttaagga 29
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 120
ccaagggact aattcatggt tgttc 25
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 121
caagctcttt tgtctggttc aacag 25
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 122
tcttataaac tggaaaggtt aagcgtcaat 30
<210> 123
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 123
atgtagtata gggaagcttc ataagtcagt 30
<210> 124
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 124
agcctttttg ggatattaaa tgttctgga 29
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 125
cccattgcag cacaactaag ga 22
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 126
ctaacacact gttcaactct gtgaaaatg 29
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 127
actgtgccca aacactacct tt 22
<210> 128
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 128
ttaaggacaa agttggttct tcagaatca 29
<210> 129
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 129
cccaaagtgt aaagaaatgc agaattct 28
<210> 130
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 130
ggctgaattt tcaatgactg aataaggg 28
<210> 131
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 131
acaggatttg gaaaaacatc agggaat 27
<210> 132
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 132
tttggttcca cttcagatac aaatgagt 28
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 133
gaaaaatatt agtgtcgcca aagagtcatt 30
<210> 134
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 134
caactgggac actttctttc agtattttg 29
<210> 135
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 135
tgataatcac ttcttccatt gcatctttct 30
<210> 136
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 136
atggagattc cataaactaa caagcactt 29
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 137
atgccttaac aaaagtaatc catagtcaag 30
<210> 138
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 138
tgtggagttt taaataggtt tggttcgtaa 30
<210> 139
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 139
tccaatgtaa aagatgcaaa tgcatacc 28
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 140
ggtggcccta cctcaaaatt attactatta 30
<210> 141
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 141
tggatactta aagccttctg tgtcatttc 29
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 142
cccaaagatc tcatgttaag tggagaaa 28
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 143
gtaactcaga ctcagcatca gca 23
<210> 144
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 144
aaaactgagg ctctttagct tcttagg 27
<210> 145
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 145
gaacccattt tcaagaactc taccatg 27
<210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 146
ctgaagctac ctccaaaact gtga 24
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 147
cagccttagc tttttacaca agttgt 26
<210> 148
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 148
gaatagctgt tagacatgct actgttact 29
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 149
ggttttcata cagctagcgg gaaa 24
<210> 150
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 150
accacagtct caatagaaac aaggttttta 30
<210> 151
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 151
ttgtttccta ggcacaataa aagatcga 28
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 152
ggaagtgtta acttcttaac gttagtgtca 30
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 153
gaagataaca aatatactgc tgccagtaga 30
<210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 154
ttgagctttc gcaacttcca aaaa 24
<210> 155
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 155
ttctgcagag gtacatccaa taagtttatc 30
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 156
tacttgaatc actgccatca aattctaagt 30
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 157
caaatgggca ggactcttag gt 22
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 158
ctgaggcttg ctcagtttct tttg 24
<210> 159
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 159
aactagtttt tgccagtttt ttaaaataac ct 32
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 160
gaaacaaact cccacatacc actg 24
<210> 161
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 161
cctcagatgt tattttccaa gcaggat 27
<210> 162
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 162
gcattcatta tgacatgaag atcagcatct 30
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 163
gggaaggaaa gaattttgct taagatatca 30
<210> 164
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 164
ctcaaagtat ttcattttct tggtgccat 29
<210> 165
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 165
tccagactct gaagaacttt tctcaga 27
<210> 166
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 166
ggttgcttgt ttatcacctg tgtct 25
<210> 167
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 167
aaaagtggaa tacagtgata ctgactttca 30
<210> 168
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 168
tggcaacagc tcaacgtttt tataattt 28
<210> 169
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 169
gcctcgcctc atgtggtttt at 22
<210> 170
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 170
taactagtat tctgagctgt gtgctaga 28
<210> 171
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 171
gggagggaga ctgtgtgtaa tattt 25
<210> 172
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 172
agttcttttg gtcatcaatc tctttctcc 29
<210> 173
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 173
cttctataaa gttaggtgtt tcctgggtt 29
<210> 174
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 174
tcagtcataa cagctcaaag ttgaacttat 30
<210> 175
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 175
gcttttattc tgctcatggc acaa 24
<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 176
caacaaaagt gccagtagtc atttcaatat 30
<210> 177
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 177
ggaatctgct gaacaaaagg aacaag 26
<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 178
gcattagtag tggattttgc ttctctgata 30
<210> 179
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 179
aaaaataccg aaagaccaaa aatcagaact 30
<210> 180
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 180
cctaaacaat catgtataca gatgatgcct 30
<210> 181
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 181
catttgttaa cttcagctct gggaaa 26
<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 182
caaattgata gttgttctag cagtgaagag 30
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 183
aaatctgaaa gagctaacat acagttagca 30
<210> 184
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 184
ctattaggtc cacctcagaa caagatg 27
<210> 185
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 185
aggagaaccc tcaatcaaaa gaaacttatt 30
<210> 186
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 186
tataaagagg tccttgatta ggcacagt 28
<210> 187
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 187
caaccaaagt ctttgttcca cctttta 27
<210> 188
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 188
gaaaggcaaa aattcatcac acaaattgt 29
<210> 189
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 189
tcttcactat tcacctacgt ctagaca 27
<210> 190
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 190
cccaaaacat gaatgttctc aacaagtg 28
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 191
gtgaggtaga ttgtaaagtc aaaggct 27
<210> 192
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 192
aggtgcggta aaatttggat tctgta 26
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 193
aaatatttaa aatgtgccaa gaactgtgct 30
<210> 194
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 194
aaaaatgatg aagtgacagt tccagtagt 29
<210> 195
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 195
gttgttgaat tcagtatcat cctatgtggt 30
<210> 196
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 196
tgccgtatat gattacgtaa tgtaatgct 29
<210> 197
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 197
ccatcatgtg agtcatcaga acct 24
<210> 198
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 198
caacataaca gatgggctgg aagt 24
<210> 199
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 199
gttccctgat ttatcatttc aggagtct 28
<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 200
agagttcact ccaaatcagt agagagtaat 30
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 201
cctcccagag ccctcaaatt ataa 24
<210> 202
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 202
cactgtgcga agacttttat gtctact 27
<210> 203
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 203
ccagaaccac catctttcag taatttg 27
<210> 204
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 204
cttgtttaca gcgatgccaa ca 22
<210> 205
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 205
acgagaataa atcaaaaatt tgccaaacga 30
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 206
tccaatccag acatattttg gttatgttgt 30
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 207
agatgatgtc agcaaaccta agaatgt 27
<210> 208
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 208
ccagtcctgc caatgagaag aa 22
<210> 209
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 209
gcctaccaca aatacaaatt atgaccaag 29
<210> 210
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 210
ttctcttcag gaggaaaagc acag 24
<210> 211
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 211
tgcgtgtgct gcgtgtc 17
<210> 212
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 212
cactaacccg ctccagagg 19
<210> 213
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 213
ttgtgcaaac ttcctgagtt ttcatg 26
<210> 214
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 214
ggttttctac tgttgctgca tcttattttt 30
<210> 215
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 215
cctgcaaaaa taaaaatgca gccattaaa 29
<210> 216
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 216
catccaatgc ctcgtaacaa cc 22
<210> 217
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 217
accagatgac tatcttaaag accacttct 29
<210> 218
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 218
agctttttgc agagcttcag taga 24
<210> 219
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 219
aattcgagtt ccatattgct tatactgct 29
<210> 220
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 220
tcctgaggat tttatcaaga aagcagattt 30
<210> 221
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 221
aagaaaacaa gctagcagaa cattttgtt 29
<210> 222
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 222
caagaaatta gagtcctcag aagagaact 29
<210> 223
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 223
caggcaattc agtaaacgtt aagtgaaa 28
<210> 224
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 224
acaattatca acctcatctg ctctttct 28
<210> 225
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 225
agcttgtgtt gaaattgtaa ataccttgg 29
<210> 226
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 226
gccttttggc taggtgttaa attatgg 27
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 227
ctgactggca tttggttgta cttt 24
<210> 228
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 228
agaatctgct ttcaaaacga aagctg 26
<210> 229
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 229
tgaacctgca gaagaatctg aacat 25
<210> 230
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 230
gtttgcctaa attcctagtt tgtagttctc 30
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 231
gacagtagaa ggactgaaga gtgag 25
<210> 232
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 232
agaatgaatt gacactaatc tctgcttgt 29
<210> 233
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 233
ccttcttccg ataggttttc ccaaatatt 29
<210> 234
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 234
agaaagttaa tgagtggttt tccagaagt 29
<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 235
gtagctgtat acgtatggcg tttct 25
<210> 236
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 236
ggatgaggga atacataaaa gttaacacac 30
<210> 237
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 237
gcgttatacc tttgccctga ga 22
<210> 238
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 238
acctcagctc ctagactttc aga 23
<210> 239
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 239
gtgcctggcc tgatacaatt aac 23
<210> 240
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 240
aattcctcct gaattttagt gaataaggct 30
<210> 241
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 241
cataaaactc tttccagaat gttgttaagt c 31
<210> 242
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 242
taccatcttc aacctctgca ttgaaa 26
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 243
tttttggacc taggttgatt gcaga 25
<210> 244
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 244
aaaaacctgt agttcaacta aacagagga 29
<210> 245
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 245
tccaatacct aagtttgaat ccatgctt 28
<210> 246
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 246
caaaggcatc tcaggaacat cac 23
<210> 247
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 247
acataaggtt tttgctgaca ttcagagt 28
<210> 248
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 248
tgctgtgcta aaaatcccac aagtat 26
<210> 249
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 249
aaataaagat gtcagatacc acagcatctt 30
<210> 250
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 250
cctgaattat cactatcaga acaaagcagt 30
<210> 251
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 251
cccagaagct gattctctgt catg 24
<210> 252
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 252
tgctggcatt ttcatgatca tataaaagac 30
<210> 253
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 253
ggaagcaggg aagctcttca tc 22
<210> 254
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 254
tcatgcatct caggtttgtt ctga 24
<210> 255
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 255
aagagaagct gcaagtcatg gt 22
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 256
gctcacgacc atttgagacc a 21
<210> 257
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 257
ccagaatcca aatcaggcct tctt 24
<210> 258
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 258
gctatttcct tgatactgga ctgtca 26
<210> 259
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 259
gctgggagtc cgcctatcat ta 22
<210> 260
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 260
gttctgtttc aaacttgcat gtgga 25
<210> 261
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 261
ggcagagaag acttctgagg cta 23
<210> 262
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 262
cttcatccgg agagtgtagg gta 23
Claims (8)
1.一种超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,所述超高通量多重PCR扩增子捕获方法包括以下步骤:
1)利用包含可消化复合修饰的扩增引物池和第一酶混液对待检测的样本进行多重PCR扩增,得到扩增子产物;所述扩增引物池中的扩增引物至少有一条包含复合修饰碱基核苷酸,且修饰方式存在下列中的一种或几种情况:T碱基替换为尿嘧啶修饰碱基,T碱基替换为锁核苷酸胸腺嘧啶修饰碱基,T碱基替换为5甲基胞嘧啶修饰碱基,T碱基替换为锁核苷酸腺嘌呤修饰碱基,G碱基替换为8-羟基脱氧鸟苷修饰碱基,和T碱基替换为次黄嘌呤修饰碱基;所述第一酶混液为QuarTaq HotStart混合液;
2)利用包含引物消化酶、错配纠错酶和末端修复酶的第二酶混液对扩增子产物进行酶切反应,包括用引物消化酶去除扩增产物上多余引物部分,利用错配纠错酶去除非特异扩增产物;所述第二酶混液包括引物消化酶、错配纠错酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq聚合酶和QuarPrep末端修复加尾缓冲液;所述引物消化酶选自UDG酶和FPG酶中的一种或两种;所述错配纠错酶选自T7核酸内切酶I、T4核酸内切酶VII、E coli核酸内切酶V、Surveror核酸内切酶和CEL I核酸内切酶中的一种或几种;
3)利用包含Index的全长接头和第三酶液进行连接反应,直接得到测序用的文库或者扩增后得到测序用文库;所述第三酶液为DNA连接酶。
2.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,对于任一条包含复合修饰碱基核苷酸的扩增引物,其被修饰的碱基数量为0到n之间的任一整数,n代表该条扩增引物总长度。
3.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,利用包含Index的全长接头和第三酶液进行连接反应后直接得到测序用文库。
4.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,所述错配纠错酶用于降低PCR扩增产生的非特异。
5.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,所述包含Index的全长接头替代通用短接头进行连接反应构建测序用文库。
6.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,所述待检测的样本选自原核或真核微生物基因组、动物或植物基因组或人基因组。
7.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法,其特征在于,所述扩增引物池包含如SEQ ID NO:1-262所示的引物。
8.根据权利要求1所述的超高通量多重PCR扩增子捕获方法在如下任一方面的应用:病原体检测,遗传病检测,肿瘤早筛检测,肿瘤伴随诊断检测,易感基因检测等。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2022106310472 | 2022-06-06 | ||
CN202210631047 | 2022-06-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114958991A true CN114958991A (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=82963337
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210687838.7A Pending CN114958991A (zh) | 2022-06-06 | 2022-06-17 | 一种超高通量多重pcr扩增子捕获方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114958991A (zh) |
-
2022
- 2022-06-17 CN CN202210687838.7A patent/CN114958991A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108300716B (zh) | 接头元件、其应用和基于不对称多重pcr进行靶向测序文库构建的方法 | |
CN106906211B (zh) | 一种分子接头及其应用 | |
CN110628880B (zh) | 一种同步使用信使rna与基因组dna模板检测基因变异的方法 | |
CN108251504A (zh) | 一种超快速构建基因组dna测序文库的方法和试剂盒 | |
CA2439098A1 (en) | Mutation detection using muts and reca | |
AU2002311761A1 (en) | Mutation detection using MutS and RecA | |
CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
CN113308519B (zh) | 用于检测单碱基突变位点的引物和探针及检测方法 | |
CN112941635A (zh) | 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 | |
CN109295500B (zh) | 一种单细胞甲基化测序技术及其应用 | |
CN115011672A (zh) | 一种超低频基因突变检测方法 | |
CN107083442B (zh) | 一种brca1/2基因变异联合检测试剂盒及其应用 | |
CN108060213A (zh) | 基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点用探针和试剂盒 | |
CN104726604B (zh) | 一种腐败检材降解dna的检测方法及其应用 | |
CN116083423B (zh) | 一种靶向富集核酸的探针 | |
CN114277114B (zh) | 一种扩增子测序添加唯一性标识符的方法及应用 | |
CN116463408A (zh) | 一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法 | |
WO2022007863A1 (zh) | 一种靶基因区域快速富集方法 | |
CN114958991A (zh) | 一种超高通量多重pcr扩增子捕获方法 | |
TWI771847B (zh) | 擴增和確定目標核苷酸序列的方法 | |
CN109750098B (zh) | Atp7b基因大片段缺失检测试剂盒及检测方法 | |
CN111926394B (zh) | 基于宏基因组学的建库方法和检测试剂盒 | |
CN114196740A (zh) | 用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒 | |
CN105603052B (zh) | 探针及其用途 | |
CN112063690A (zh) | 单分子探针多重靶向捕获文库的构建方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |