CN114958965A - 一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法及*** - Google Patents

一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法及*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法及***，该检测方法包括：利用光学图谱技术对待测样本基因组范围内的DNA分子进行荧光标记，荧光标记后进行荧光检测，获得全基因组光学图谱；与正常对照样本数据库进行比对，寻找在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，若在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，则确定待测样本存在染色体隐匿性相互易位；所述衍生互补的DNA分子表示为在待测样本中检测出存在两条不同衍生的DNA分子，每条衍生的DNA分子中均同时包含了某两条染色体的序列，且序列信息在染色***置上存在先后互补关系。本发明染色体隐匿性相互易位核型的检测方法简便高效、全面通用、准确。

Description

一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法及***
技术领域
本发明属于染色体遗传诊断和人类辅助生殖领域，具体涉及一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法及***。
背景技术
染色体相互易位是指两条染色体同时发生一处断裂，并发生错误拼接交换而引起的染色体结构变化，一般没有明显的遗传物质的缺失或增加。染色体相互易位可以根据易位片段大小和易位片段的区带特点，分为肉眼可见的相互易位和隐匿性的相互易位。肉眼可见的相互易位一般易位片段较大且条带特点有一定差异，或者其中一条片段比较大一条比较小，通过普通的细胞染色体核型分析既可明确诊断；但隐匿性的相互易位一般易位片段均较小，或者易位片段的大小和区带特点均很接近，通过常规的细胞染色体核型分析无法明确诊断。染色体相互易位远端部分称为易位片段，剩余包括着丝粒的染色体部分称为中心片段。
染色体相互易位是一种遗传病，可以遗传给后代，肉眼可见的平衡易位在人群中总的发病率约为0.27％，隐匿性的相互易位在人群中的发病率目前不详，但其在反复自然流产夫妇中发病率约在0.73％。染色体相互易位携带者在生育年龄前通常无明显的临床症状，到生育年龄则通常会表现为反复流产、***不育或生育发育严重异常的子代。原因在于携带者产生大量不平衡的染色体异常配子，当这些不平衡配子受精后形成的胚胎因为存在染色体异常进而出现种植失败、自然流产及新生儿出生缺陷等，此外女性出现卵巢早衰的风险增加，男性通常会表现出少弱***症。相比之下，隐匿性的相互易位更容易导致生育发育严重异常的子代，严重威胁人群的生殖健康，是造成新生儿出生缺陷的重要原因。
目前能够检测隐匿性相互易位的技术主要是荧光原位杂交(Fluorescence insitu hybridization，FISH)技术，FISH的原理是依据需检测的目的区域设计出特异寡核苷酸探针，在荧光标记后与胚胎细胞核杂交，在荧光显微镜下观察荧光信号的有无、数量等来定量检测，但应用FISH技术检测隐匿性相互易位需要三个重要的前提：1)夫妇之前生育过染色体不平衡相互易位的异常胎儿的诊断提示，或发生过流产且流产组织为染色体不平衡相互易位的诊断提示；2)需要将患者的外周血细胞预先进性体外培养，获得染色体***中期的细胞，然后再进行FISH试验；3)需要有适合病人染色体相互易位的FISH荧光探针，且检测每种不同相互易位需要的探针不同，均需要根据1)中的结果提示个性化定制，不具有通用性；三个条件缺一不可。此外，FISH探针本身也有一定的局限性，如荧光信号容易重叠、信号易***等，也可能影响结果的准确性，出现误诊或漏诊的现象。因此，目前FISH技术在诊断隐匿性的相互易位中具有明显的局限性。
此外，近年有研究报道，通过低深度的全基因组测序(Low-pass GenomeSequencing,Low–pass GS)及特定的生物信息学分析也可以检测出隐匿性的染色体平衡易位，由于测序技术本身的局限性导致该方法有一定的漏诊率，当易位断裂点所在位置的碱基序列是高度重复或十分复杂的情况时，则相互易位无法检测出。
综上所述，临床上急需研发探索一种简便高效、全面通用、且能够准确检测染色体隐匿性相互易位的技术方法，用于临床诊断。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法及***。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA分子；所述待测样本的染色体核型分析结果为正常；
(2)利用光学图谱技术对待测样本基因组范围内的DNA分子进行荧光标记，荧光标记后进行荧光检测，获得全基因组光学图谱；
(3)与正常对照样本数据库进行比对，寻找在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，若在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，则确定待测样本存在染色体隐匿性相互易位；
所述衍生互补的DNA分子表示：在待测样本中检测出存在两条不同衍生的DNA分子，每条衍生的DNA分子中均同时包含了某两条染色体的序列，且序列信息在染色***置上存在先后互补关系。
进一步地，所述检测方法还包括，根据衍生互补的DNA分子所包含的两条染色体及序列信息，确定发生隐匿性相互易位的两条染色体、易位断裂点的粗略位置区域、易位方向及易位区带，进而明确隐匿性相互易位染色体的核型。
进一步地，上述的检测方法中，所述待测样本选自患者的组织或血液；
优选地，所述待测样本选自患者的外周血。
进一步地，所述DNA分子使用Bionano Prep SP Blood and Cell Culture DNAIsolation Kit进行抽提。
进一步地，所述检测方法还包括：通过下述方法1或者方法2进行验证：
方法1：使用长片段聚合酶链式反应和测序技术对所获得的易位断裂点的粗略位置区域进行扩增和测序，获得精确到单个碱基水平断裂点位置，验证发生染色体隐匿性相互易位的染色体及染色体断裂点所在的易位区带。
方法2：使用FISH技术对患者的有丝***中期细胞样本进行检测，验证发生染色体隐匿性相互易位的染色体及染色体断裂点所在的易位区带。
进一步地，上述的检测方法中，所述长片段聚合酶链式反应的引物以标记点为界确保断裂点在扩增范围内，所述引物的方向为5’到3’；
优选地，所述引物TM值范围为64-68℃，GC％在48-58％，长度在23-28bp；
优选地，所述引物的3’端为G或C；
优选地，所述引物的序列不能有4个以上连续一样的碱基。
本发明第二方面提供一种染色体隐匿性相互易位的检测***，所述***包含能够处理样本数据的软件和用于承载上述软件的硬件，
1)所述检测***还包括储存有待测样本和正常对照样本的全基因组光学图谱的硬件；
2)所述软件根据下述规则确定待测样本是否存在染色体隐匿性相互易位：
与正常对照样本数据库进行比对，寻找在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，若在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，则确定待测样本存在染色体隐匿性相互易位；
所述衍生互补的DNA分子表示：在待测样本中检测出存在两条不同衍生的DNA分子，每条衍生的DNA分子中均同时包含了某两条染色体的序列，且序列信息在染色***置上存在先后互补关系。
进一步地，上述的检测***中，所述软件还包括根据下述规则明确隐匿性相互易位染色体的核型：根据确定的衍生互补的DNA分子所包含的两条染色体及序列信息，确定发生隐匿性相互易位的两条染色体、易位断裂点的粗略位置区域、易位方向及易位区带，明确隐匿性相互易位染色体的核型。
进一步地，上述的检测***中，所述待测样本的染色体核型分析结果为正常。
进一步地，上述的检测***中，所述待测样本选自患者的组织或血液；
优选地，所述待测样本选自患者的外周血。
本发明的有益效果为：
(1)本发明检测方法可直接对病人进行检测，不需要提前知道患者是否有生育过染色体不平衡相互易位胎儿或流产的病史。
(2)本发明检测方法不需要对样本进行预实验处理，直接提取DNA就可以用于后续的检测实验，而且实验过程相对简单方便。
(3)本发明检测方法是通用的，具有普遍的适用性，适用于所有类型的染色体隐匿性相互易位检测，不需要个体化设计，简单方便，适合临床推广应用。
附图说明
图1为本发明染色体隐匿性相互易位的检测方法的流程图。
图2为衍生互补的DNA分子的示意图。
图3为病例1夫妇双方的染色体核型分析结果。
图4为位病例1的两条衍生互补的DNA分子与参照序列比对的结果图。病例1的检测结果中存在两条衍生互补的DNA分子。图A表示一条DNA分子包含了11号和22号两条染色体的序列，11号的序列为靠近短臂的端粒端，20号染色体的序列为靠近短臂的着丝粒端。图B表示一条DNA分子包含了11号和22号两条染色体的序列，11号的序列为靠近短臂的着丝粒端，20号染色体的序列为靠近短臂的端粒端。
图5为病例1的易位断裂点LR-PCR后二代测序数据分析结果。病例1的检测结果中在11号和22号染色体存在隐匿性相互易位断裂点。图A表示11号染色体易位断裂点进行LR-PCR后二代测序的数据分析结果IGV比对图。图B表示20号染色体易位断裂点进行LR-PCR后二代测序的数据分析结果IGV比对图。
图6为病例1中的易位断裂点一代测序数据分析结果。病例1的检测结果中在11号和22号染色体存在隐匿性相互易位断裂点。图A表示11号染色体易位断裂点进行一代测序的数据分析结果，包含了11号染色体靠近短臂的端粒端和20号染色体靠近短臂的着丝粒端的序列。图B表示20号染色体易位断裂点进行一代测序的数据分析结果，断裂点包含了11号染色体靠近短臂的着丝粒端和20号染色体靠近短臂的端粒端的序列。
图7为病例3中男方的FISH检测结果为隐匿性的染色体相互易位。所选用FISH探针为Tel 4p,Tel 19q,CEP 4，4条含有信号的染色体，1条为正常的4号染色体，1条为正常的19号染色体，另两条为1和19号染色体发生隐匿性相互易位形成的衍生染色体。该患者的1号染色体短臂和19号染色体的长臂发生隐匿性的相互易位。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
本发明中断裂点指的是染色体上发生断裂的位置。
本发明中标记点指的是荧光检测到的离断裂点位置最近的荧光标记位点。
本发明提供一种染色体隐匿性相互易位的检测方法，如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)病例纳入，所述病例的外周血染色体核型分析未发现异常。
(2)收集患者的组织或血液样本，优选为外周血样本，提取样本高分子量长片段的DNA分子。
(3)使用光学图谱技术对基因组范围内的DNA分子通过蛋白酶进行荧光标记，蛋白酶能够特异性识别DNA分子上碱基序列，然后标记上荧光基团，荧光基团在仪器上能显示相应颜色的荧光，每一条DNA分子会形成特点的光学图谱。荧光标记后进行荧光检测，获得全基因组光学图谱。
(4)通过与正常对照人群数据库进行比对分析，寻找在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，进而获得两条互补的荧光序列信息。若在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，则确定待测样本存在染色体隐匿性相互易位。
如图2所示，衍生互补的DNA分子表示：在待测样本中检测出存在两条不同衍生的DNA分子，每条衍生的DNA分子中均同时包含了某两条染色体的序列，且序列信息在染色***置上存在先后互补关系。
(5)根据两条衍生互补的DNA分子所包含的两条染色体及序列信息，确定发生染色体隐匿性相互易位的染色体、易位断裂点的粗略位置区域、易位方向及易位区带。
(6)明确隐匿性相互易位染色体的核型。
为了确保本发明染色体隐匿性相互易位的检测方法的可行性，本发明通过下述方法1或者方法2进行验证：
方法1：使用长片段聚合酶链式反应(long rang polymerase chain reaction,LR-PCR)和测序技术对上述光学图谱技术检测获得的相互易位断裂点的粗略位置区域进行扩增和测序，获得精确到单个碱基水平断裂点位置，验证发生染色体隐匿性相互易位的染色体及染色体断裂点所在的易位区带。
方法2：使用FISH技术对患者的有丝***中期细胞样本进行检测，验证发生染色体隐匿性相互易位的染色体及染色体断裂点所在的易位区带。
实施例1：患者样本收集与实验前处理
(1)患者外周血样本收集，染色体核型分析检测：
募集了5对准备进行接受辅助生殖治疗的夫妇，入选者均来自复旦大学附属妇产科医院上海集爱遗传与不育诊疗中心。研究方案由复旦大学妇产科医院上海集爱遗传与不育诊疗中心人类受试者伦理委员会批准。
该5对夫妇都经有自然流产或者生育染色体异常胎儿的不良孕产史，且经过染色体核型分析检测，结果均未发现明显异常，即可以理解为根据目前的技术水平染色体核型正常。染色体隐匿性平衡易位携带的夫妇一方在后文中简称为“患者”，另一方简称“患者配偶”。在募集患者夫妇的同时，抽取每对夫妇的外周血10ml。一部分外周血按照基因组光学图谱技术检测要求提取DNA，用于后续实验；此外，如果光学图谱技术检测到隐匿性的染色体相互易位，另一部分用于淋巴细胞中期***相的培养，进行染色体易位片段荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)检测，对光学图谱技术检测的结果进行复核确认。
图3展示了病例1中夫妇双方外周血染色体核型结果，显示均为正常，女方为46,XX，男方为46,XY。
(2)DNA分子提取与质控：
光学图谱技术一般对DNA分子要求较高，片段尽可能较长，尽可能保持DNA的完整性。本发明中通过使用Bionano Prep SPBlood and Cell Culture DNAIsolation Kit进行血液DNA抽提；通过Qubit3.0进行DNA定量，通过脉冲场凝胶电泳对DNA的完整性和大小进行验证。
实施例2：DNA分子荧光标记，检测发生隐匿性染色体相互易位的染色体、断裂点所在粗略位置区域、易位方向及易位区带，进而明确隐匿性相互易位核型
(1)DNA标记：通过Bionano Prep DLS Kit进行DNA标记，DLE-1酶特异性识别DNA上CTTAAG碱基序列，利用甲基转移酶对DNA进行识别并标记上DL-绿色荧光基团，DL-绿色荧光基团在Saphyr仪器上拍照时可以在蓝色DNA本底下显示绿色荧光。使用试剂盒荧光基团对DNA骨架过夜染色，上机前洗去多余荧光基团。
(2)Bionano Saphyr仪器上机：Saphyr芯片上有多个纳米通道，纳米级毛细管电泳可以将DNA分子拉直，将每个DNA单分子线性化展开，DNA的CTTAAG碱基序列上标记的DL-绿色荧光基团在Saphyr仪器上拍照时可以在蓝色DNA本底下显示绿色荧光，经高清CCD对所有纳米通道的DNA实时成像，超长高分辨率荧光成像即生成了一幅酶切位点分布图。分析软件自动将图片数据转换成分析数据，最终组装得到全基因组光学图谱。
(3)数据分析：本发明使用Bionano access V1.7软件对下机数据BionanoMolecules进行变异分析，可选择“de novo assembly”分析(通常针对VAF大于20％)和“rare variant analysis”(通常针对VAF大于5％)。
本发明在纳入的5对夫妇中均有一方检测出在光学图谱序列上存在两条衍生互补的DNA分子，可以明确发生隐匿性相互易位的两条染色体、易位断裂点的粗略位置区域、易位方向及易位区带，确诊为隐匿性的相互易位；另一方则为正常，未发现隐匿性的相互易位。表1罗列出了5对夫妇中发生隐匿性染色体易位的两条染色体、易位断裂点的粗略位置、易位方向、易位区带及隐匿性相互易位核型。图4为病例1的两条衍生互补的DNA分子与参照序列比对的结果图。
表1.1-5号病例隐匿性染色体平衡易位检测结果
Figure BDA0003682229870000081
a参考基因组序列为GRCh38
实施例3：LR-PCR、二代测序及一代测序检测断裂点精准位置，验证实施例2中的隐匿性相互易位核型结果
(1)LR-PCR对实施例2中检测到的断裂点进行扩增
LR-PCR引物的设计主要考虑到以下几点：1)以标记点为界确保断裂点在扩增范围内；2)确保引物方向只有5’到3’；3)若可能的断裂点区域过长，需要进行人工可能性比对或考虑区域多对引物覆盖设计。4)距离bionano给出的断裂点或预测的断裂点1kb左右设计引物，能够囊括断裂点，引物TM值范围64-68℃，GC％在48-58％，长度在23-28bp；引物的3’最好是G或C；引物的序列不能有4个以上连续一样的碱基。扩增体系采用专用长片段扩增酶进行长片段扩增，实验设置对照，确保扩增的是样本的特异性变异条带。
(2)扩增产物进行NGS建库与测序，初步分析确定断裂点位置
将扩增产物进行建库与NGS平台上机测序，将测序结果比对到参考基因组(通常为hg38版参考基因组)，根据扩增产物比对结果初步确定断裂点的位置。
二代测序实验流程是本领域常规操作流程，此处省略。
(3)一代测序验证确定精确断裂点
根据上述步骤获得的断裂点位置结果在断裂点附近设计PCR引物，设计的原则与本领域常规设计一致。PCR后进行一代测序及数据分析，最终确定精准的断裂点。一代测序实验流程如下：
1)PCR扩增与电泳
①配置PCR体系(25μl体系)
DNA浓度大于30ng/μl(DNA浓度需要测定)：
试剂名称 用量
H<sub>2</sub>O 15.2μl
10*PCR buffer 2.5μl
2.5Mm dNTPs 3μl
primer(前后引物各1μl) 2μl
LA Taq酶 0.3μl
DNA模板 2μl
注意：对于引物GC含量高的将10*PCR buffer 2.5ul换为2*GC buffer 12.5ul,H2O为5.2ul。
②设置PCR反应程序
一般程序：96℃预变性2min,96℃30s,57℃30s,72℃2min,35cycles；72℃延伸5min；4℃/15℃∞。
③琼脂糖凝胶电泳
配置1.5％的琼脂糖凝胶，再分别取2μl loading buffer与4μl DNA扩增产物混合后进行电泳，160V 35min。
2)PCR产物纯化
①配制消化液
配置消化液，分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。PCR产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到PCR反应液中。
②纯化反应：上PCR仪进行程序反应。
程序为SAP：37℃60min，80℃15min，4℃/15℃∞。
3)测序反应
①SEQ MIX配置
试剂：ABI
Figure BDA0003682229870000101
Terminator v3、1cycle Sequencing Kit
根据PCR反应得数量按照下表配制MIX：
试剂名称 用量
BigDye 0.4μl
Sequencing Buffer 0.8μl
H<sub>2</sub>O 1.8μl
Primer(3.2pmol/μl) 1μl
模板 1μl
按照测序反应表在96孔板中加入3μl以上MIX，1μl对应引物，1μl对应PCR产物(注意封膜后要求压膜)，离心。(测序反应只有一个引物，为避免加样过程中得液体消耗，体系需要超量配置)。
②SEQ程序：96℃预变性2min,96℃10s,55℃5s,60℃90s,25cycles；4℃/15℃∞。
4)纯化
①试剂准备：
0.125mol/L EDTA-Na2溶液:称取2.325g EDTA-Na2·2H2O于50ml离心管中，加入40ml去离子水，65℃水浴加热，间歇振荡几次至完全溶解，用去离子水定容至50ml，振荡10秒混匀。
②将无水乙醇与蒸馏水混合配制成85％乙醇，70％乙醇，当天使用。
③测序反应板离心后，每个反应孔加入EDTA-Na2溶液2.5μl，85％乙醇40μl，充分震荡3min，离心3000g，4℃，30min(EDTA作为金属离子螯合剂，能与测序PCR反应体系中的离子结合从而去除离子)。
④离心结束后将测序反应板倒置于吸水纸上，倒离心至离心力达到185g(或900rpm)时立即停止。
⑤每孔加入70％乙醇50μl，充分震荡1min，离心3000g，4℃，15min(DNA片段在70％的乙醇中溶解度低，能通过离心沉淀下来)。
⑥重复4步骤。
⑦避光风干15～30min，每孔加入10μl HIDI(变性处理，生物安全柜中进行)，离心后在PCR仪中96℃反应2min，降温至4℃后取出。
5)上机测序
变性结束后，上测序仪(ABI 3730)进行测序。
①创建样品板程序：
a选择GAInstruments>ga3730>Plate Manager；
b点击New按钮，弹出得New Plate Dialog窗口中填写相应得内容。
c点击“OK”按钮，在弹出得Sequencing Analysis Plate Editor窗口中，填入相关得内容(在Sample Name中填入样品名，96孔板在A01行填写“1”，384孔板依次在A01、B01、A02、B02行写1、2、3、4；在Results Group 1栏中选择数据上传路径；在InstrumentProtocol 1栏中选择测序程序；在Analysis Protocol 1栏中选择数据分析程序)。
d然后全选A01行，点击Edit>Fill Down Special，选中Fill Down Special(96Cap)，将自动生成96行；如果就是384孔板，依次全选A01、A02、B01、B02行，重复4次操作，点击“OK”。
②载入样品板
a拉出样品栈，打开进样栈门；
b放入样品板(顺序自下到上排列待上机)，注意缺角方向；
c关上进样栈门，将载样栈推回原处。
③调用上机程序
a选择GAInstruments>GA 3730>Instrument Name>Run Scheduler。
b点击Search按钮，在弹出得AddPlate to In Stack窗口中输入样品板名，点击Search按钮，选中相应得样品板名，点击Add按钮将其调出，点击Done按钮关闭窗口。
④启动程序
点击软件左上角的绿色箭头按钮，再点击OK按钮，机器开始启动。
6)结果分析
获得峰图后对其进行分析。
本发明在纳入的5对夫妇中，通过LR-PCR、二代测序及一代测序均成功检测到了断裂点精准位置，表2展示了相关的断裂点、易位区带、隐匿性易位核型结果及与实施例2中结果一致性的比较。图5为病例2的易位断裂点LR-PCR后二代测序数据分析结果，图6为病例2的易位断裂点进一步一代测序数据分析结果。精准断裂点所确定的易位区带与实施例2中直接由光谱技术检测出的粗略断裂点所确定的易位区带完全一致，隐匿性相互易位核型也完全一致。表明本发明所建立的染色体隐匿性相互易位的检测方法是可靠的。
表2. 1-5号病例隐匿性染色体平衡易位精准断裂点位置检测结果
Figure BDA0003682229870000121
实施例4：使用FISH方法验证实施例2和3所检测出的隐匿性相互易位核型
1、外周血细胞培养
1)采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血，将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30-40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
2)培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
3)秋水仙素处理：终止培养前2-4小时，在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml)。
以上步骤均需无菌操作
2、有丝***中期染色体制备及FISH
1)收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8-10分钟，弃上清液。
2)低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟。
3)预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。
4)一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。
5)二固定、三固定：同一固定。
6)制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7)滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。
8)将玻片依次放入2xSSC溶液5分钟，70％乙醇5分钟，90％乙醇5分钟和100％乙醇5分钟。
9)杂交炉的使用：打开盖子，取下全部空白玻片，放好湿棉条，将空白玻片放回，盖上盖子，设置program-co-denature and short hybridization:72℃变性分2钟，37℃杂交24小时(注意：杂交炉在使用前一段时间打开，并放上空白玻片，让其温度升至37℃并维持一段时间，若临时打开，虽然显示温度37℃，但炉内温度肯定低于37℃，将影响杂交结果)。
10)从冰箱中取出探针和缓冲液，置暗处，让其在室温下回暖至少5分钟，离心。
11)去一个干净的eppendorf管，将探针做10：1稀释并离心。
12)每张玻片滴加探针混合液，盖上11X22盖玻片，封上封片胶，置于杂交炉中，启动已设置好的程序。
13)预先将0.4XSSC/0.3％Igepal置于75℃水浴锅内，使其预热约需1小时，在洗片前，应测定0.4XSSC/0.3％Igepal温度，保证其在73-75℃2分钟。
14)杂交结束后，取出玻片，小心移去封片胶及盖玻片，置于0.4XSSC/0.3％Igepal中73-75℃变形2分钟(注意：①应先等洗液温度达到预定温度且一切准备就绪后再移去封片胶和盖玻片，并立即浸入洗液，而不应让其干燥，否则将影响结果；②此次步骤每次只放4张刚从37℃杂交炉中取出的玻片，以保证实验条件稳定，若少于四张，可用空白玻片代替，若多于四张，等温度到达后再将洗其他玻片)。
15)将玻片从0.4XSSC/0.3％Igepal取出立即浸入室温的2XSSC/0.1％Igepal中，静置1分钟。
16)取出玻片室温干燥后加入DAPII染液。
17)将玻片置于荧光显微镜下观察。
经过对中期染色体细胞FISH检测，均检测到了实施例2和3中检测到的隐匿性染色体相互易位，图7为病例3中男方的FISH检测结果，提示4号染色体断臂和19号染色长臂体发生了隐匿性的染色体相互易位。结果表明，本发明染色体隐匿性相互易位的检测方法是可靠的。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种染色体隐匿性相互易位核型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA分子；所述待测样本的染色体核型分析结果为正常；
(2)利用光学图谱技术对待测样本基因组范围内的DNA分子进行荧光标记，荧光标记后进行荧光检测，获得全基因组光学图谱；
(3)与正常对照样本数据库进行比对，寻找在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，若在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，则确定待测样本存在染色体隐匿性相互易位；
所述衍生互补的DNA分子表示：在待测样本中检测出存在两条不同衍生的DNA分子，每条衍生的DNA分子中均同时包含了某两条染色体的序列，且序列信息在染色***置上存在先后互补关系。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括，根据衍生互补的DNA分子所包含的两条染色体及序列信息，确定发生隐匿性相互易位的两条染色体、易位断裂点的粗略位置区域、易位方向及易位区带，进而明确隐匿性相互易位染色体的核型。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本选自患者的组织或血液；
优选地，所述待测样本选自患者的外周血。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述DNA分子使用Bionano PrepSP Blood and Cell Culture DNA Isolation Kit进行抽提。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：通过下述方法1或者方法2进行验证：
方法1：使用长片段聚合酶链式反应和测序技术对权利要求2所获得的易位断裂点的粗略位置区域进行扩增和测序，获得精确到单个碱基水平断裂点位置，验证发生染色体隐匿性相互易位的染色体及染色体断裂点所在的易位区带。
方法2：使用FISH技术对患者的有丝***中期细胞样本进行检测，验证发生染色体隐匿性相互易位的染色体及染色体断裂点所在的易位区带。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述长片段聚合酶链式反应的引物以标记点为界确保断裂点在扩增范围内，所述引物的方向为5’到3’；
优选地，所述引物TM值范围为64-68℃，GC％在48-58％，长度在23-28bp；
优选地，所述引物的3’端为G或C；
优选地，所述引物的序列不能有4个以上连续一样的碱基。
7.一种染色体隐匿性相互易位的检测***，其特征在于，所述***包含能够处理样本数据的软件和用于承载上述软件的硬件，其特征在于，
1)所述检测***还包括储存有待测样本和正常对照样本的全基因组光学图谱的硬件；
2)所述软件根据下述规则确定待测样本是否存在染色体隐匿性相互易位：
与正常对照样本数据库进行比对，寻找在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，若在光学图谱序列上存在衍生互补的DNA分子，则确定待测样本存在染色体隐匿性相互易位；
所述衍生互补的DNA分子表示：在待测样本中检测出存在两条不同衍生的DNA分子，每条衍生的DNA分子中均同时包含了某两条染色体的序列，且序列信息在染色***置上存在先后互补关系。
8.根据权利要求7所述的检测***，其特征在于，所述软件还包括根据下述规则明确隐匿性相互易位染色体的核型：根据确定的衍生互补的DNA分子所包含的两条染色体及序列信息，确定发生隐匿性相互易位的两条染色体、易位断裂点的粗略位置区域、易位方向及易位区带，进而明确隐匿性相互易位染色体的核型。
9.根据权利要求7或8所述的检测***，其特征在于，所述待测样本的染色体核型分析结果为正常。
10.根据权利要求7或8所述的检测***，其特征在于，所述待测样本选自患者的组织或血液；
优选地，所述待测样本选自患者的外周血。
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