CN114958888A - 一种缬氨酸生产菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建缬氨酸生产菌的方法，包括以下步骤：以产L‑缬氨酸的微生物为底盘菌，敲减或者失活丙氨酸合成相关基因avtA、alaA、alaC；增强缬氨酸合成相关基因ilvBN、ilvC、leuDH、ilvE、ilvD、ygaZH、Lrp表达；敲减或者失活支路代谢醇/醛/酸合成相关基因ackA、ldhA、mgsA、frd、pflB、adhE。本发明构建的菌株CCTCC NO:M2022134能够采用厌氧发酵或者好氧‑厌氧两阶段发酵方式生产L‑缬氨酸，发酵50h后缬氨酸产量达到94.8g/L，糖酸转化率达到57.8％。

Description

一种缬氨酸生产菌及其构建方法
技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种缬氨酸生产菌及其构建方法。
背景技术
L-缬氨酸是一种天然的人体必需氨基酸，别名2-氨基-3-甲基丁酸、L-穿心排草氨基、 L-异戊氨酸、α-胺异戊酸、2-氨基异戊酸，CAS号：72-18-4。L-缬氨酸具有多种生理功能，在人体及其他动物的代谢过程中有显著的功能，应用于制药工业、食品行业及饲料行业等。
L-缬氨酸的生产方法有提取法、合成法、发酵法等。动物血粉、蚕蛹及毛发水解液中 L-缬氨酸的含量较高，应用离子交换技术从混合氨基酸中分离缬氨酸，分离效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高，不适于现代工业生产；化学合成法是以异丁醛为原料，与氨及氢氰酸作用生成胺腈，再水解得DL-缬氨酸，经拆分得L-缬氨酸。化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物；发酵法是利用微生物发酵法生产L- 缬氨酸，具有原料成本低，反应条件温和及可大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。
目前，国内外多采用微生物发酵法生产L-缬氨酸。例如专利文献CN113278655A、CN113278641A、CN113278568A等分别报道了采用重组大肠杆菌工程菌发酵来制备L-缬氨酸。但是，经实验验证发现，这些重组大肠杆菌工程菌的糖酸转化率普遍较低，缬氨酸产量有待于提高，而且存在菌种遗传稳定性低、传代会发生退化的缺陷，难以应用于工业化生产。
发明内容
为了构建适合于使用吨级发酵罐进行工业化生产L-缬氨酸的工程菌，我们对于产L-缬氨酸的微生物中的L-缬氨酸代谢途径进行了比较，并构思出多种新的代谢工程方案。通过实验筛选，获得了遗传性状稳定、糖酸转化率、高产L-缬氨酸的基因工程菌。具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种构建缬氨酸生产菌的方法，包括以下步骤：
A.以大肠杆菌、优选产L-缬氨酸的大肠杆菌为底盘菌，底盘菌中敲除乙醇脱氢酶基因adhE并且/或者增强乙酰羟酸合酶基因ilvBN，使其产缬氨酸；敲减或者失活选自下组中一个以上、优选两种、优选三种的基因：缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙氨酸合成转氨酶基因alaA、丙氨酸合成转氨酶基因alaC，获得丙氨酸合成相关基因下调/失活菌株A；
B.增强选自下组中一个以上、优选两种以上、优选三种以上、优选四种以上、更优选五种以上的基因：乙酰羟酸合酶基因ilvBN、乙酰羟酸还原异构酶基因ilvC、亮氨酸脱氢酶基因leuDH、支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE、二羟酸脱水酶基因ilvD、L-缬氨酸外运体基因ygaZH、亮氨酸反应蛋白基因Lrp；敲减或者失活选自下组中一个以上、优选两种以上、优选三种以上、优选四种以上的基因：乙酸激酶基因ackA、D-乳酸脱氢酶基因ldhA、甲基乙二醛合酶基因mgsA、富马酸还原酶基因frd、甲酸C-乙酰转移酶基因pflB，获得支路代谢醇/醛/酸(包括乙醇、乙酸、丙氨酸、乳酸、琥珀酸和甲酸)合成相关基因下调/失活、缬氨酸合成相关基因上调菌株B。
优选地，上述方法还可以进一步包括以下步骤：
C.增强选自下组中一个以上、优选两种的基因：NAD激酶基因nadK、质子转运烟酰胺核苷酸转氢酶基因pntAB，获得质子转运相关基因上调菌株C。
上述的基因敲减尤其是指基因敲除。
在一种实施方式中，上述的基因敲减可以通过基因编辑技术实施，所述基因编辑采用 CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cas12***、CRISPR-Cpf1***、CRISPR-Cas相关的转座***INTEGRATE***或者CAST***。其中INTEGRATE***是指Sam Sternberg 研究组开发的基因编辑工具(Insertion of transposable elements by guide RNA-assistedtargeting，引导RNA辅助靶向的转座元件***)；CAST***是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associated transposase，CRISPR相关转座酶)。
可选地，上述的基因敲减或者失活可以通过CRISPRi即CRISPR干扰或者抑制技术(CRISPR interference or inhibition))实施。
优选地，上述方法的步骤B和/或步骤C中所述的基因增强可以选自下述方式：
在宿主菌基因组中整合单拷贝或多拷贝目标基因；
以质粒形式表达目标基因；或者
用强启动子tac或ldhA启动子调控目标基因表达。
进一步优选地，上述方法还包括以下步骤：
D：通过在发酵罐中不通氧连续传代培养，得到缬氨酸生产能力比底盘菌提高10倍以上、优选20倍以上、更优选30倍以上的工程菌D。
上述的底盘菌优选是大肠杆菌ATCC8739。
本发明的第二个方面提供了一种缬氨酸生产菌，其通过上述的方法得到。
上述缬氨酸生产菌优选是大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022134。
本发明的第三个方面提供了上述缬氨酸生产菌在发酵法生产L-缬氨酸中的应用。
具体地，上述发酵法通过下述步骤进行：
采用厌氧培养方式发酵；或者
采用好氧-厌氧两阶段方式发酵。
本发明构建的高产L-缬氨酸的基因工程菌遗传稳定性好，即便传30代后，菌株表型未发生退化，发酵生产L-缬氨酸的能力也不会下降；而且发酵50h后，发酵液中缬氨酸浓度达94.8g/L，糖酸转化率为57.8％。
本发明构建的L-缬氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是Escherichia coli，中文名称是大肠埃希氏菌，即，大肠杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2022 年02月18日，保藏地址为中国武汉武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022134。
附图说明
图1为本发明构建微生物的L-缬氨酸合成的代谢路线图。
具体实施方式
为了构建出遗传形状稳定的L-缬氨酸高产工程菌，发明人改变了现有技术在L-缬氨酸代谢途径中个别步骤、或者针对个别酶/蛋白进行改变的思路，从整体上优化了L-缬氨酸的生物合成，参见图1。对采用不同方式代谢路线的多种工程菌的摇瓶发酵实验对比，构建出基本符合应用于吨级发酵罐要求的L-缬氨酸生产菌株。通过弱化或阻断分支代谢比如丙氨酸等代谢，强化L-缬氨酸代谢，使得大肠杆菌可通过发酵将葡萄糖经过一系列生化反应合成L-缬氨酸并排出体外；辅以持续多代的连续传代驯化，得到传代稳定性高、适合工业发酵应用的缬氨酸生产菌。
为简要起见，本文中有时将“L-缬氨酸高产菌”简称为“(基因)工程菌”或者“生产菌”，它们表示相同的意义，可以互换使用。
为简要起见，本文中有时将“L-缬氨酸”简称为“缬氨酸”或者“L-Val”，它们表示相同的意义，可以互换使用。
应理解，在构建本发明的基因工程菌的具体操作中，步骤A、步骤B、步骤C和步骤 D的排序并非完全根据英文字母顺序由前到后地固定不变，它们可以交叉、颠倒地操作，只要每个步骤能实现各自的功能、完成宿主细胞基因型的定向改变即可。
在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如avtA(缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶) 与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。
下面以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金瑞斯生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
部分培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L 琼脂粉。)
工程菌一级种子培养基
A组分：葡萄糖20-80g/L、MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L，121℃湿热灭菌25分钟。
B组分：酵母粉(安琪)5-10g/L、蛋白胨(Oxoid)5-10g/L、(NH4)2SO4 2.0-13.2g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、K2HPO4·3H2O 1.0-5.0g/L，灭菌前用5mol/L KOH调pH7.2-7.4，121℃湿热灭菌25分钟。
将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为一级种子培养基。
二级种子培养基
A组分：葡萄糖20-30g/L、MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L，121℃湿热灭菌25分钟。
B组分：酵母粉(安琪)0.5-2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0-5.0g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/L、L-丙氨酸0.1-0.5g/L、VB1 0.1-1.0mg/L、FeSO4·7H2O 1.0-2.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.1-0.5mg/L、CuSO4 0.1-0.5mg/L、ZnSO4·7H2O 0.1-0.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.1-0.5mg/L、H3BO3 0.01-0.1mg/L，121℃灭菌25分钟。
将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为二级种子培养基。
发酵罐培养基
A组分：葡萄糖20-50g/L、MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L，121℃湿热灭菌25分钟。
B组分：酵母粉(安琪)0.5-2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0-5.0g/L、KH2PO4 1.0-3.5g/L、甜菜碱盐酸盐0.5-2g/L、L-丙氨酸0.1-0.5g/L、FeSO4·7H2O 1.0-2.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.1-0.5mg/L、 CuSO4 0.1-0.5mg/L、ZnSO4·7H2O 0.1-1.0mg/L、Na2MoO4.2H2O 0.1-0.5mg/L、H3BO3 0.01-0.1mg/L、MnSO4·H2O 0.1-1.0mg/L，121℃灭菌25分钟。
将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为发酵罐培养基。
缬氨酸的液相色谱法(HPLC)检测
L-缬氨酸利用HPLC进行测定，以乙腈/水(50:50，v/v)混合物和50mM乙酸钠作为流动相，流速为1mL/min，紫外检测波长为360nm。
CRISPR-Cas质粒的获取方式为pTargetF(Molecular Cloud:MC_0000012)、pEcgRNA (Molecular Cloud:MC_0101209)、pEcCas(Molecular Cloud:MC_0101208)；质粒pTargetT-Ptac-stlA(exo)参照专利文献CN112662607A公开的方法构建，以参考方式引入本文中。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1、实施例中使用的引物列表
Figure BDA0003545987250000051
Figure BDA0003545987250000061
Figure BDA0003545987250000071
Figure BDA0003545987250000081
Figure BDA0003545987250000091
Figure BDA0003545987250000101
Figure BDA0003545987250000111
Figure BDA0003545987250000121
Figure BDA0003545987250000131
表1中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。
实施例1：产缬氨酸大肠杆菌中丙氨酸代谢路线的消除
以大肠杆菌ATCC8739为底盘菌，利用CRISPR-Cas9技术(参照文献A modifiedpCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assisted genome editing in Escherichiacoli,Li Q,et al., Acta Biochim Biophys Sin,2021.)将含抗反馈抑制突变的乙酰羟酸合酶基因 ilvBNmut(G20D/V21D/M22F)引入ATCC8739基因组，由tac启动子进行调控。同时敲除底盘菌基因组中的乙醇脱氢酶基因adhE，获得的菌株命名为 ATCC8739△adhE::Ptac-ilvBNmut，在此基础上继续敲减或者失活缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA，获得的菌株命名为ATCC8739△adhE::Ptac-ilvBNmut△avtA，在该菌株的基础上敲除或失活丙氨酸合成转氨酶基因alaA、丙氨酸合成转氨酶基因alaC，获得的菌株命名为ATCC8739△adhE::Ptac-ilvBNmut△avtA△alaA△alaC。
1.1在adhE位点***Ptac-ilvBNmut
(1)pEcgRNA-adhE质粒构建：
合成的两条寡糖核酸adhE-F/adhE-R进行退火自搭形成双链序列。反应体系为：T4ligase buffer 5μl，引物adhE-F 5μl(20μM)，引物adhE-R 5μl(20μM)，ddH2O 35μl。反应条件为：95℃保温5min，每分钟降低5～10℃，16℃保温10min，备用。自搭形成的双链序列稀释200倍，取1μl与pEcgRNA(MC_0101209)的BsaI酶切线性化片段利用T4连接酶进行连接，连接产物转化入DH5α化学感受态细胞，复苏菌液涂布于含壮观霉素(终浓度50μg/mL)LB固体平板，获得含pEcgRNA-adhE质粒转化子。
(2)电转片段制备：
参照专利文献CN112662607A的方法，构建质粒pTargetT-Ptac-stlA(exo)，步骤如下：
以大肠杆菌E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以exo-F1/exo-R1、exo-F2/exo-R2 为引物，PCR扩增分别获得exo-UP和exo-DN片段，分别约600bp；以p57-tac质粒为模板，tac(exo)-F/tac-R为引物，PCR扩增tac(exo)片段，约2.1kb；以pTargetT-Ptac-stlA(rhtC) 质粒为模板，以stlA(rhtC)-F/stlA(exo)-R为引物，PCR扩增获得stlA(exo)片段，约1.6kb；将exo-UP、tac(exo)、stlA(exo)和exo-DN片段利用DNA assembly方法(DNAassembly Kit 购自全式金)克隆入pTargetF-exo的EcoRI/HindIII位点，获得pTargetT-Ptac-stlA(exo)质粒。
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以adhE-F1(KO)/adhE-R1(KO)、 adhE-F2(KO)/adhE-R2(KO)、ilvBNm-F1/ilvBNm-R1、ilvBNm-F2/ilvBNm-R2为引物，PCR 扩增分别获得adhE-UP、adhE-DN、ilvBNm-1和ilvBNm-2片段，分别约530bp、550bp、 1.8kb和400bp；以pTargetT-Ptac-stlA(exo)(CN112662607A)质粒为模板，以 Ptac-F(TY)/Ptac-R为引物，PCR扩增获得Ptac片段，约200bp；以adhE-UP、adhE-DN、 ilvBNm-1、ilvBNm-2、Ptac片段为模板，adhE-F1(KO)/adhE-R2(KO)为引物，Overlap PCR 扩增获得Ptac-ilvBNm(adhE)片段，约3.4kb。
(3)感受态细胞制备：
将pEcCas(MC_0101208)质粒转化至大肠杆菌ATCC 8739化学感受态细胞中，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得ATCC8739/pEcCas转化子(化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版))。挑取ATCC8739/pEcCas单菌落于4mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB试管中，37℃220rpm培养，在菌浓OD600为0.4 时，添加终浓度为10mM***糖进行诱导，继续培养1小时，制备电转感受态细胞(电转感受态细胞制备方法参考文献Li,2021,Acta Biochim Biophys Sin.ibid.)。
(4)电转：
将Ptac-ilvBNm(adhE)片段及pEcgRNA-adhE质粒电转入ATCC8739/pEcCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml) 的LB平板上，37℃培养过夜；长出单菌落利用adhE-V-F/ilvBN-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb。
(5)pEcgRNA-adhE质粒丢失：
挑取菌落PCR验证为阳性单菌落，接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB试管中，同时加入终浓度为10mM鼠李糖，37℃过夜培养；次日试管中菌液直接划线于含卡那霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含壮观霉素(终浓度为50μg/ml)LB平板上，若不能生长，表明pEcgRNA-avtA质粒已丢失，得到 ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut)/pEcCas菌株。
(6)pEcCas质粒丢失：
挑取ATCC 8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut)/pEcCas阳性克隆子，直接在LB无抗液体培养基中37℃过夜摇床培养，吸取少量菌液于10g/L蔗糖LB固体平板上划线分单菌。单菌落在含卡那霉素(50μg/mL)抗性LB平板上进行鉴定，验证pEcCas质粒消除。获得 ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut)。
1.2 avtA基因敲除
(1)pEcgRNA-avtA质粒构建：
合成的两条寡糖核酸avtA-F/avtA-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得含pEcgRNA-avtA质粒转化子。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC 8739基因组为模板，分别以avtA-F1(KO)/avtA-R(UP)、 avtA-F(DN)/avtA-R2(KO)为引物，PCR扩增分别获得avtA-UP(KO)、avtA-DN(KO)片段，分别约500bp；以avtA-UP(KO)、avtA-DN(KO)片段为模板，avtA-F1(KO)/avtA-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得avtA(KO)片段，约1kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将avtA(KO)片段及pEcgRNA-avtA质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用avtA-F1(KO)/alaA-R2(KO)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb。
(4)pEcgRNA-avtA质粒丢失
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA)/pEcCas 菌株。
1.3 alaA基因敲除
(1)pEcgRNA-alaA质粒构建：
合成的两条寡糖核酸alaA-F/alaA-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-alaA质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以alaA-F1(KO)/alaA-R1(KO)、 alaA-F2(KO)/alaA-R2(KO)为引物，PCR扩增分别获得alaA-UP、alaA-DN片段，分别约500bp 和400bp；以alaA-UP、alaA-DN、片段为模板，alaA-F1(KO)/alaA-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得alaA(KO)片段，约900bp。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将alaA(KO)片段及pEcgRNA-alaA质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用alaA-V-F/alaA-R2(KO)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.1kb。
(4)pEcgRNA-alaA质粒丢失
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA, △alaA)/pEcCas菌株。
1.4alaC基因敲除
(1)pEcgRNA-alaC质粒构建：
合成的两条寡糖核酸alaC-F/alaC-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-alaC质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以alaC-F1(KO)/alaC-R1(KO)、 alaC-F2(KO)/alaC-R2(KO)为引物，PCR扩增分别获得alaC-UP、alaC-DN片段，分别约600bp 和500bp；以alaC-UP、alaC-DN、片段为模板，alaC-F1(KO)/alaC-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得alaC(KO)片段，约1.1kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将alaC(KO)片段及pEcgRNA-alaC质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA,△alaA)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用alaC-V-F/alaA-R2(KO)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.3kb。
(4)pEcgRAN-alaC质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA,△alaA, △alaC)/pEcCas菌株。
(5)pEcCas质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(6)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA,△alaA, △alaC)。
1.5发酵实验
摇瓶培养基组成：葡萄糖20-80g/L，(NH4)2SO4 13.2g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO45.0g/L， (NH4)2HPO4 3.5g/L，MgSO4·7H2O 1mM，CaCl2·2H2O 0.1mM，VB1 50μg/L，甜菜碱1mM，L-丙氨酸0.1g/L，微量无机盐1ml/L培养基，pH7.2。
微量无机盐母液组成：FeCl3·6H2O 1.6g，CoCl2·6H2O 0.2g，CuCl2·2H2O 0.1g，ZnCl2 0.2g， Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO3 0.05g，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
摇瓶发酵工艺：
(1)菌液划线LB，放于培养箱静止培养24-48h；
(2)取平板上单菌落接LB培养基的4ml普通试管，37℃，240rpm摇床培养24h；
(3)按照1v/v％转接250毫升无菌密封摇瓶培养基100ml，37℃，120rpm培养24h。
(4)发酵液取样测定丙氨酸，缬氨酸等氨基酸含量。
四种菌株摇瓶发酵生产缬氨酸的实验结果列于表2中。
表2、四种菌株摇瓶发酵生产缬氨酸对比实验结果(培养基中葡萄糖添加量为20g/L。)
菌种 缬氨酸(g/L) 丙氨酸(g/L)
ATCC 8739 0.1 0.05
ATCC8739△adhE::Ptac-ilvBN<sup>mut</sup> 1.1 0.5
ATCC8739△adhE::Ptac-ilvBN<sup>mut</sup>△avtA 1.4 0.3
ATCC8739△adhE::Ptac-ilvBN<sup>mut</sup>△avtA△alaA△alaC 1.8 0
实施例2：TYS8975菌株的构建
以大肠杆菌ATCC8739为底盘菌，利用CRISPR-Cas9技术(参照文献A modifiedpCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assisted genome editing in Escherichiacoli,Li Q,et al., Acta Biochim Biophys Sin,2021.)将含抗反馈抑制突变的乙酰羟酸合酶基因 ilvBNmut(G20D/V21D/M22F)、谷氨酸棒杆菌来源并进行了大肠杆菌密码子优化的乙酰羟酸还原异构酶基因ilvCcg、赖氨酸芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶基因leuDH引入ATCC8739 基因组，由tac启动子进行调控；并将大肠杆菌内源的支链氨基酸氨基转移酶/二羟酸脱水酶基因ilvED增加了一拷贝，同样由tac启动子负责调控，以强化L-缬氨酸合成途径。同时敲除了adhE、ackA、avtA、ldhA、mgsA、frd和pflB基因，对支链途径的阻断，减少乙醇、乙酸、丙氨酸、乳酸、琥珀酸和甲酸的生成。另外，将编码支链氨基酸外运蛋白的ygaZH和全局调控因子Lrp利用tac启动子进行增强(参见Park J H,Lee K H,Kim T Y,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-valinebased on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2007,104(19):7797-7802.)，得到菌株TYS8975。操作步骤具体如下。
1.1 avtA位点***Ptac-leuDH
(1)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以avtA-F1(KO)/avtA-R1(KO)、 avtA-F2(KO)/avtA-R2(KO)为引物，PCR扩增分别获得avtA-UP和avtA-DN片段，分别约 500bp；以pTargetT-Ptac-stlA(exo)质粒为模板，以Ptac-F(avtA)/Ptac-R为引物，PCR扩增获得Ptac(avtA)片段，约200bp；以pUC-leuDH质粒(金斯瑞合成)为模板，leuDH-F/leuDH-R 为引物，PCR扩增leuDH片段，约1.1kb；以avtA-UP、avtA-DN、Ptac(avtA)、leuDH片段为模板，avtA-F1(KO)/avtA-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得Ptac-leuDH(avtA)片段，约2.3kb。
(2)电转：
将Ptac-leuDH(avtA)片段及pEcgRNA-avtA质粒电转入ATCC 8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut)感受态细胞中，长出单菌落利用leuDH-V-F/avtA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.3kb。
(5)pEcgRNA-avtA质粒丢失
方法同实施例1中1.1(5)，得到ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut, △avtA::Ptac-leuDH)/pEcCas菌株。
1.2 ldhA位点***Ptac-ilvCcg
(1)pEcgRNA-ldhA质粒构建：
合成的两条寡糖核酸ldhA-F/ldhA-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-ldhA质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以ldhA-F1(KO)/ldhA-R1(KO)、 ldhA-F2(KO)/ldhA-R2(KO)为引物，PCR扩增分别获得ldhA-UP和ldhA-DN片段，分别约 500bp；以pTargetT-Ptac-stlA(exo)(CN112662607A)质粒为模板，以Ptac-F(ldhA)/Ptac-R 为引物，PCR扩增获得Ptac(ldhA)片段，约200bp；以pUC-ilvCcg质粒(金斯瑞合成)为模板，ilvCcg-F/ilvCcg-R为引物，PCR扩增ilvCcg片段，约1kb；以ldhA-UP、ldhA-DN、Ptac(ldhA)、ilvCcg片段为模板，ldhA-F1(KO)/ldhA-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得 Ptac-ilvCcg(ldhA)片段，约2.3kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将Ptac-ilvCcg(ldhA)片段及pEcgRNA-ldhA质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用ldhA-V-F/ilvCcg-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.2kb。
(4)pEcgRNA-ldhA质粒丢失:
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg)/pEcCas菌株。
1.3 mgsA位点***Ptac-lrp
(1)pEcgRNA-mgsA质粒构建：
合成的两条寡糖核酸mgsA-F/mgsA-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中1.1(1)，获得pEcgRNA-mgsA质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以mgsA-F1(KO)/mgsA-R1(KO)、 mgsA-F2(KO)/mgsA-R2(KO)、lrp-F/lrp-R为引物，PCR扩增分别获得mgsA-UP、mgsA-DN 和lrp片段，分别约450bp、400bp和600bp；以pTargetT-Ptac-stlA(exo)(CN112662607A) 质粒为模板，以Ptac-F(TY)/Ptac-R为引物，PCR扩增获得Ptac片段，约200bp；以mgsA-UP、 mgsA-DN、lrp、Ptac片段为模板，mgsA-F1(KO)/mgsA-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得Ptac-lrp(mgsA)片段，约1.7kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将Ptac-lrp(mgsA)片段及pEcgRNA-mgsA质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用mgsA-V-F/lrp-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb。
(4)pEcgRAN-mgsA质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg,△mgsA::Ptac-lrp)/pEcCas菌株。
1.4 frd位点***Ptac-ygaZH
(1)pEcgRNA-frd质粒构建：
合成的两条寡糖核酸frd-F/frd-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中1.1 (1)，获得pEcgRNA-frd质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC 8739基因组为模板，分别以frd-F1(KO)/frd-R1(KO)、 frd-F2(KO)/frd-R2(KO)、ygaZH-F/ygaZH-R为引物，PCR扩增分别获得frd-UP、frd-DN和 ygaZH片段，分别约500bp、450bp和1.1kb；以frd-UP、frd-DN、ygaZH、Ptac片段为模板，frd-F1(KO)/frd-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得Ptac-ygaZH(frd)片段，约2.3kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将Ptac-ygaZH(frd)片段及pEcgRNA-frd质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH,△ldhA::Ptac-ilvCcg, △mgsA::Ptac-lrp)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用frd-V-F/ygaZH-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.2kb。
(4)pEcgRNA-frd质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg,△mgsA::Ptac-lrp,△frd::Ptac-ygaZH)/pEcCas菌株。
1.5 pflB基因敲除
(1)pEcgRNA-pflB质粒构建：
合成的两条寡糖核酸pflB-F/pflB-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中1.1 (1)，获得pEcgRNA-pflB质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以pflB-F1(KO)/pflB-R1(KO)、 pflB-F2(KO)/pflB-R2(KO)为引物，PCR扩增分别获得pflB-UP、pflB-DN片段，分别约400bp；以pflB-UP、pflB-DN、片段为模板，pflB-F1(KO)/pflB-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得pflB(KO)片段，约800bp。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将pflB(KO)片段及pEcgRNA-pflB质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH,△ldhA::Ptac-ilvCcg,△mgsA::Ptac-lrp, △frd::Ptac-ygaZH)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用pflB-V-F/pflB-R2(KO)引物进行菌落 PCR验证，阳性片段约1kb。
(4)pEcgRNA-pflB质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg,△mgsA::Ptac-lrp,△frd::Ptac-ygaZH,△pflB)/pEcCas菌株。
1.6 ackA位点***Ptac-ilvED
(1)pEcgRNA-ackA质粒构建：
合成的两条寡糖核酸ackA-F/ackA-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-ackA质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以ackA-F1(KO)/ackA-R1(KO)、ackA-F2(KO)/ackA-R2(KO)、ilvED-F/ilvED-R为引物，PCR扩增分别获得ackA-UP、ackA-DN 和ilvED片段，分别约550bp、500bp和2.8kb；以ackA-UP、ackA-DN、ilvED、Ptac片段为模板，ackA-F1(KO)/ackA-R2(KO)为引物，Overlap PCR扩增获得Ptac-ilvED(ackA)片段，约4.2kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将Ptac-ilvED(ackA)片段及pEcgRNA-ackA质粒电转入ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH,△ldhA::Ptac-ilvCcg, △mgsA::Ptac-lrp,△frd::Ptac-ygaZH,△pflB)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用 ackA-V-F/ilvED-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.6kb。
(4)pEcgRNA-ackA质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg,△mgsA::Ptac-lrp,△frd::Ptac-ygaZH,△pflB, △ackA::Ptac-ilvED)/pEcCas菌株。
(5)pEcCas质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(6)，获得ATCC8739(△adhE::Ptac-ilvBNmut,△avtA::Ptac-leuDH, △ldhA::Ptac-ilvCcg,△mgsA::Ptac-lrp,△frd::Ptac-ygaZH,△pflB,△ackA::Ptac-ilvED)，命名为TYS8975。
实施例3：丙氨酸合成相关基因敲除
TYS8975发酵液检测时发现仍有丙氨酸生成。进一步将丙氨酸合成相关的氨基转移酶 alaA和alaC敲除，获得丙氨酸产量下降的菌株TYS8976。操作步骤如下所述。
3.1 alaA基因敲除
方法同实施例1中1.3，获得TYS8975(△alaA)/pEcCas菌株。
3.2 alaC基因敲除
方法同实施例1中1.4，获得TYS8975(△alaA,△alaC)，命名为TYS8976。
3.3发酵实验
摇瓶培养基组成：葡萄糖20-80g/L，(NH4)2SO4 13.2g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO45.0g/L， (NH4)2HPO4 3.5g/L，MgSO4·7H2O 1mM，CaCl2·2H2O 0.1mM，VB1 50μg/L，甜菜碱1mM， L-丙氨酸0.1g/L，微量无机盐1ml/L培养基，pH7.2。
微量无机盐母液组成：FeCl3·6H2O 1.6g，CoCl2·6H2O 0.2g，CuCl2·2H2O 0.1g，ZnCl2 0.2g， Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO3 0.05g，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
摇瓶发酵工艺：
(1)菌液划线LB，放于培养箱静止培养24-48h；
(2)取平板上单菌落接LB培养基的4ml普通试管，37℃，240rpm摇床培养24h；
(3)按照1v/v％转接250毫升无菌密封摇瓶培养基100ml，37℃，120rpm培养24h。
(4)发酵液取样测定丙氨酸，缬氨酸等氨基酸含量。
三种菌株摇瓶发酵生产缬氨酸的实验结果列于表3中。
表3、三种菌株摇瓶发酵生产缬氨酸对比实验结果(培养基中葡萄糖添加量为20g/L。)
菌名 缬氨酸(g/L) 丙氨酸(g/L)
ATCC8739 0.1 0.05
TYS8975 2.5 0.8
TYS8976 3.1 0
表3的结果表明，基因工程菌TYS8975的代谢工程是符合本发明设计要求的，缬氨酸表达量比底盘菌提高了24倍。通过敲除丙氨酸合成相关的氨基转移酶alaA和alaC，获得的菌株TYS8976的丙氨酸产量明显下降以至于检测不出，而缬氨酸产量不降反升，表明丙氨酸合成途径的阻断或抑制成功，达到预期目的。
实施例4：缬氨酸相关基因改造
为了进一步提高菌株TYS8976的缬氨酸生产能力，尝试增强其缬氨酸代谢功能。
在TYS8976基础上，在基因组lacZ、lacI、yihF、ydjK和yjcS位点分别***PldhA-ilvCcg、 PldhA-leuDH、PldhA-ilvBNmut、PldhA-ilvD和Ptac-ilvC，其中ilvCcg、leuDH、ilvBNmut和 ilvD均由ldhA天然启动子调控，ilvC由tac启动子调控。分别在yaiT和ybaP位点分别对编码NAD激酶基因nadK和pntAB进行了增强，其中nadK由PldhA调控，pntAB由Ptac 调控，得到工程菌TYS8781。具体操作步骤如下。
4.1在lacZ位点***PldhA-ilvCcg
(1)pEcgRNA-ilvCcg(lacZ)质粒构建：
合成的两条寡糖核酸lacZ-F/lacZ-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中1.1 (1)，获得pEcgRNA-lacZ质粒。
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以lacZ-F1(ld)/lacZ-R1(ld)、 lacZ-F2(ld)/lacZ-R2(ld)、lacZ-F3(ld)/lacZ-R3(ld)、Pldh-F/Pldh-R、ilvCcg-F(ld)/ilvCcg-R(ld) 为引物，PCR扩增分别获得lacZ1(ld)、lacZ2(ld)、lacZ3(ld)、PldhA和ilvCcg(ld)片段，分别约730bp、500bp、470bp、830bp和1kb；lacZ1(ld)、lacZ2(ld)、lacZ3(ld)、PldhA和ilvCcg(ld) 片段利用DNA assembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pEcgRNA-lacZ的 EcoR I/Hind III位点，获得pEcgRNA-ilvCcg(lacZ)质粒。
(2)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将pEcgRNA-ilvCcg(lacZ)质粒电转入TYS8976/pEcCas 感受态细胞中，单菌落利用lacZ-V-F/ilvCcg-V-R2引物进行菌落PCR验证，阳性片段约 2.1kb。
(3)pEcgRNA-ilvCcg(lacZ)质粒丢失:
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg)/pEcCas菌株。
4.2在lacI位点***PldhA-leuDH
(1)pEcgRNA-leuDH(lacI)质粒构建：
合成的两条寡糖核酸lacI-F/lacI-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中1.1 (1)，获得pEcgRNA-lacI质粒。
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以lacI-F1(ld)/lacI-R1(ld)、 lacI-F2(ld)/lacI-R2(ld)、lacI-F3(ld)/lacI-R3(ld)、leuDH-F(ld)/leuDH-R(ld)为引物，PCR扩增分别获得lacI1(ld)、lacI2(ld)、lacI3(ld)和leuDH(ld)片段，分别约670bp、500bp、400bp和 1.1kb；lacI1(ld)、lacI2(ld)、lacI3(ld)、PldhA和leuDH(ld)片段利用DNAassembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pEcgRNA-lacI的EcoR I/Hind III位点，获得 pEcgRNA-leuDH(lacI)质粒。
(2)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将pEcgRNA-leuDH(lacI)质粒电转入 TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用leuDH-V-F/lacI-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约2.2kb。
(3)pEcgRNA-leuDH(lacI)质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg, △lacI::PldhA-leuDH)/pEcCas菌株。
4.3在ydjK位点***PldhA-ilvD
(1)pEcgRNA-ilvD(ydjK)质粒构建：
合成的两条寡糖核酸ydjK-F/ydjK-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-ydjK质粒。
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以ydjK-F1(ld)/ydjK-R1(ld)、 ydjK-F2(ld)/ydjK-R2(ld)、ydjK-F3(ld)/ydjK-R3(ld)、ilvD-F(ld)/ilvD-R(ld)为引物，PCR扩增分别获得ydjK1(ld)、ydjK2(ld)、ydjK3(ld)和ilvD(ld)片段，分别约650bp、460bp、350bp和1.9kb；ydjK1(ld)、ydjK2(ld)、ydjK3(ld)、PldhA和ilvD(ld)片段利用DNA assembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pEcgRNA-ydjK的EcoR I/Hind III位点，获得pEcgRNA-ilvD(ydjK)质粒。
(2)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将pEcgRNA-ilvD(ydjK)质粒电转入 TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用 ydjK-V-F/ilvD-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.8kb。
(3)pEcgRNA-ilvD(ydjK)质粒丢失:
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH, △ydjK::PldhA-ilvD)/pEcCas菌株。
4.4在yaiT位点***PldhA-nadK
(1)pEcgRNA-nadK(yaiT)质粒构建：
合成的两条寡糖核酸yaiT-F/yaiT-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-yaiT质粒。
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以yaiT-F1(ld)/yaiT-R1(ld)、 yaiT-F2(ld)/yaiT-R2(ld)、yaiT-F3(ld)/yaiT-R3(ld)、nadK-F(ld)/nadK-R(ld)为引物，PCR扩增分别获得yaiT1(ld)、yaiT2(ld)、yaiT3(ld)和nadK(ld)片段，分别约650bp、460bp、350bp和1.9kb；yaiT1(ld)、yaiT2(ld)、yaiT3(ld)、PldhA和nadK(ld)片段利用DNA assembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pEcgRNA-yaiT的EcoR I/Hind III位点，获得pEcgRNA-nadK(yaiT)质粒。
(2)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将pEcgRNA-nadK(yaiT)质粒电转入 TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH,△ydjK::PldhA-ilvD)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用yaiT-V-F/nadK-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约2.1kb。
(3)pEcgRNA-nadK(yaiT)质粒丢失:
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH, △ydjK::PldhA-ilvD,△yaiT::PldhA-nadK)/pEcCas菌株。
4.5在yihF位点***PldhA-ilvBNmut
(1)pEcgRNA-ilvBNmut(yihF)质粒构建：
合成的两条寡糖核酸yihF-F/yihF-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-yihF质粒。
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以yihF-F1(ld)/yihF-R1(ld)、 yihF-F2(ld)/yihF-R2(ld)、yihF-F3(ld)/yihF-R3(ld)为引物，PCR扩增分别获得yihF1(ld)、yihF2(ld)、yihF3(ld)片段，分别约730bp、510bp、490bp；以Ptac-ilvBNm(adhE)片段为模板，以ilvBN-F(ld)/ilvBN-R(ld)为引物，PCR扩增获得ilvBNmut(ld)片段，约2.1kb；yihF1(ld)、 yihF2(ld)、yihF3(ld)、PldhA和ilvBNmut(ld)片段利用DNA assembly方法(DNAassembly Kit 购自全式金)克隆入pEcgRNA-yihF的EcoR I/Hind III位点，获得pEcgRNA-ilvBNmut(yihF) 质粒。
(2)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将pEcgRNA-ilvBNmut(yihF)质粒电转入 TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH,△ydjK::PldhA-ilvD, △yaiT::PldhA-nadK)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用yihF-V-F/ilvBN-V-R引物进行菌落 PCR验证，阳性片段约1.9kb。
(3)pEcgRNA-ilvBNmut(yihF)质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH, △ydjK::PldhA-ilvD,△yaiT::PldhA-nadK,△yihF::PldhA-ilvBNmut)/pEcCas菌株。
4.6在yjcS位点***Ptac-ilvC
(1)pEcgRNA-yjcS质粒构建：
合成的两条寡糖核酸yjcS-F/yjcS-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中1.1 (1)，获得pEcgRNA-yjcS质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以yjcS-F1/yjcS-R1、yjcS-F2/yjcS-R2、yjcS-F3/yjcS-R3和ilvC-F(yjcS)/ilvC-R(yjcS)为引物，PCR扩增分别获得yjcS-1、yjcS-2、yjcS-3 和ilvC(yjcS)片段，分别约650bp、450bp、530bp和1.6kb；以yjcS-1、yjcS-2、yjcS-3、Ptac 和ilvC(yjcS)片段为模板，以yjcS-F1/yjcS-R3为引物，Overlap PCR扩增获得Ptac-ilvC(yjcS) 片段，约3.5kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将Ptac-ilvC(yjcS)片段及pEcgRNA-yjcS质粒电转入TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH,△ydjK::PldhA-ilvD, △yaiT::PldhA-nadK,△yihF::PldhA-ilvBNmut)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用 yjcS-V-F/ilvC-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.4kb。
(4)pEcgRNA-yjcS质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH, △ydjK::PldhA-ilvD,△yaiT::PldhA-nadK,△yihF::PldhA-ilvBNmut,△yjcS::Ptac-ilvC)/pEcCas 菌株。
4.7在ybaP位点***Ptac-pntAB
(1)pEcgRNA-ybaP质粒构建：
合成的两条寡糖核酸ybaP-F/ybaP-R进行退火自搭形成双链序列。方法同实施例1中 1.1(1)，获得pEcgRNA-ybaP质粒。
(2)电转片段制备：
以E.coli ATCC8739基因组为模板，分别以ybaP-F1/ybaP-R1、ybaP-F2/ybaP-R2、ybaP-F3/ybaP-R3和pntAB-F(ybaP)/pntAB-R(ybaP)为引物，PCR扩增分别获得ybaP-1、ybaP-2、ybaP-3和pntAB(ybaP)片段，分别约670bp、520bp、560bp和3.0kb；以ybaP-1、 ybaP-2、ybaP-3、Ptac和pntAB(ybaP)片段为模板，以ybaP-F1/ybaP-R3为引物，Overlap PCR 扩增获得Ptac-pntAB(ybaP)片段，约5.0kb。
(3)电转：
方法同实施例1中1.1(3)(4)。将Ptac-pntAB(ybaP)片段及pEcgRNA-ybaP质粒电转入TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH,△ydjK::PldhA-ilvD, △yaiT::PldhA-nadK,△yihF::PldhA-ilvBNmut,△yjcS::Ptac-ilvC)/pEcCas感受态细胞中，单菌落利用ybaP-V-F/pntAB-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.5kb。
(4)pEcgRNA-ybaP质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(5)，获得TYS8976(△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH, △ydjK::PldhA-ilvD,△yaiT::PldhA-nadK,△yihF::PldhA-ilvBNmut,△yjcS::Ptac-ilvC, △ybaP::Ptac-pntAB)/pEcCas菌株。
(5)pEcCas质粒丢失：
方法同实施例1中1.1(6)，获得TYS8976△lacZ::PldhA-ilvCcg,△lacI::PldhA-leuDH, △ydjK::PldhA-ilvD,△yaiT::PldhA-nadK,△yihF::PldhA-ilvBNmut,△yjcS::Ptac-ilvC, △ybaP::Ptac-pntAB)，命名为TYS8781。
4.8菌株发酵实验
方法同实施例2中2.3。并且计算各个菌株发酵时的糖酸转化率。四种菌株摇瓶发酵生产缬氨酸的实验结果列于表4中。
表4、四种菌株摇瓶发酵生产缬氨酸对比实验结果
菌名 缬氨酸(g/L) 转化率(g缬氨酸/100g葡萄糖)
ATCC8739 0.1 0.5
TYS8975 2.5 12.5
TYS8976 3.1 15.5
TYS8781 4.5 22.3
表4的结果表明，基因工程菌TYS8781分泌缬氨酸的能力相比TYS8975有了进一步的提高，且摇瓶发酵时的糖酸转化率达到了22.3％，缬氨酸代谢途径得到了显著增强，比底盘菌高出了近44倍。
实施例5：工程菌TYS8781的连续传代驯化
为了提升缬氨酸菌种的厌氧产酸能力，本发明还对工程菌TYS8781在厌氧状态下进行驯化，使得发酵菌株适应于无氧发酵。方法如下。
发酵罐及摇瓶培养基：葡萄糖100g/L，(NH4)2SO4 13.2g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO45.0g/L，(NH4)2HPO4 3.5g/L，MgSO4·7H2O 1mM，CaCl2·2H2O 0.1mM，VB1 50μg/L，甜菜碱1mM，L-丙氨酸：0.1g/L，微量无机盐1ml/L培养基，pH7.0。
微量无机盐母液：FeCl3·6H2O 1.6g，CoCl2·6H2O 0.2g，CuCl2·2H2O 0.1g，ZnCl20.2g， Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO3 0.05g，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
2.4L发酵罐装液量1.5L。121℃灭菌15min，冷却后接入TYS8781或其传代菌，接种量为0.1v/v％，发酵温度37℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在7.0。在发酵罐中连续传代培养工程菌，每24h将发酵罐中的菌液按1∶100的体积比例转接到一个新的发酵罐中。经过180代转接，得到产酸量提升的驯化菌株，命名为TYS8789。
实施例6：工程菌TYS8789的发酵
6.1一级种子培养方法
一级种子培养基
A组分：葡萄糖20g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，121℃湿热灭菌25分钟。
B组分：酵母粉(安琪)10g/L、蛋白胨(Oxoid)10g/L、(NH4)2SO4 4g/L、KH2PO4 3.0g/L、 K2HPO4·3H2O 5.0g/L，灭菌前用5mol/L KOH调pH7.2，121℃湿热灭菌25分钟。
将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为一级种子培养基。
在无菌条件下，从工程菌TYS8789种子活化平板上取1环菌体接种至装有60mL一级种子培养基的500mL三角瓶中，放入往复摇床中200rpm，37℃震荡培养6-8h，OD600达到 4.0-5.5下摇床。
6.2二级种子培养方法
A组分：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，121℃湿热灭菌25分钟。
B组分：酵母粉(安琪)1g/L、(NH4)2SO4 3.0g/L、KH2PO4 2g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、VB1 0.5mg/L、FeSO4·7H2O 1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.25mg/L、CuSO40.2mg/L、ZnSO4·7H2O 0.4mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.3mg/L、H3BO3 0.05mg/L，121℃灭菌25 分钟。
将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为二级种子培养基。
在无菌条件下，将60mL一级种子接入装有6L二级种子培养基的10L发酵罐中，罐压0.01-0.05Mpa，转速为250-350rpm，不通气，37℃厌氧培养15-16h，OD600达到4.0-5.5 下罐。
6.3发酵罐培养方法
A组分：葡萄糖30g/L、MgSO4·7H2O 2g/L，121℃湿热灭菌25分钟。
B组分：酵母粉(安琪)0.5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、KH2PO4 3g/L、甜菜碱盐酸盐0.5g/L、L-丙氨酸0.3g/L、FeSO4·7H2O 1.5mg/L、CoCl2·6H2O 0.2mg/L、CuSO4 0.2mg/L、ZnSO4·7H2O 0.6mg/L、Na2MoO4.2H2O 0.3mg/L、H3BO3 0.08mg/L、MnSO4·H2O 0.8mg/L，121℃灭菌25分钟。
将A组分与B组分在无菌条件下混合，即为发酵罐培养基。
在无菌条件下，将5L二级种子接入装有25L发酵罐培养基的50L发酵罐中，罐压0.01-0.05Mpa，转速为250-350rpm，不通气，37℃厌氧培养50h。发酵过程用浓度为25-28％的氨水控制pH 6.8-7.0。在葡萄糖用尽前补加浓度为60％(w/w)的葡萄糖直至发酵结束。
经HPLC检测，发酵液中缬氨酸浓度达94.8g/L，糖酸转化率为57.8％。这样的发酵水平已经达到工业化发酵生产L-缬氨酸的指标要求，基于此，对工程菌TYS8789提交保藏。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种缬氨酸生产菌及其构建方法
<130> SHPI2210031
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctaggtat aatactagtt ttattgatat atttacgtcg ttttagagct agaaatagc 59
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggcaccga gtcggtgctt tttttgaatt cgcttccaga ggaagctttg 50
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgtcatga tgatgcgtcg actggataac gtaaatgatt gc 42
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgaccgta ttgagttata atagcaatcc cccagatacc 40
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtagggataa cagggtaata gatctaagct ttgtccggct cagttaaccg g 51
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaatcattt acgttatcca gtcgacgcat catcatgacg tc 42
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtatctggg ggattgctat tataactcaa tacggtcgac 40
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgcactata ctgtagcttc 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tagttagagc tgctcggtcg taat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacattacg accgagcagc tcta 24
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagacgctac tgaccgacat gc 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgttatcaat caccagcgga atg 23
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaaaaaata ttttacacgg tcgctaactt cccagggctg gataaacc 48
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttgcattgg ctgtaaaagc tg 22
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cattccgctg gtgattgata acgttgacaa ttaatcatcg gctc 44
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgtatatct ccttcttaaa g 21
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctttaagaag gagatataca tatggaaaag tatgattatg aacaattg 48
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtttatcca gccctgggaa gttagcgacc gtgtaaaata tttttttc 48
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaagcatttg gttcagaatc 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtttatttc ccgtattcgt g 21

Claims (10)

1.一种构建缬氨酸生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.以大肠杆菌为底盘菌，在底盘菌中敲除乙醇脱氢酶基因adhE并且/或者增强乙酰羟酸合酶基因ilvBN；敲减或者失活选自下组中一个以上、优选两种、优选三种的基因：缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙氨酸合成转氨酶基因alaA、丙氨酸合成转氨酶基因alaC。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
B.增强选自下组中一个以上、优选两种以上、优选三种以上、优选四种以上、更优选五种以上的基因：乙酰羟酸还原异构酶基因ilvC、亮氨酸脱氢酶基因leuDH、支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE、二羟酸脱水酶基因ilvD、L-缬氨酸外运体基因ygaZH、亮氨酸反应蛋白基因Lrp；敲减或者失活选自下组中一个以上、优选两种以上、优选三种以上、优选四种以上的基因：乙酸激酶基因ackA、D-乳酸脱氢酶基因ldhA、甲基乙二醛合酶基因mgsA、富马酸还原酶基因frd、甲酸C-乙酰转移酶基因pflB。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
C.增强选自下组中一个以上、优选两种的基因：NAD激酶基因nadK、质子转运烟酰胺核苷酸转氢酶基因pntAB。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤B和/或步骤C中所述的基因的增强选自下述方式：
在宿主菌基因组中整合单拷贝或多拷贝目标基因；
以质粒形式表达目标基因；或者
用强启动子tac或ldhA启动子调控目标基因表达。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：
D：通过在发酵罐中不通氧连续传代培养，得到缬氨酸生产能力比底盘菌提高10倍以上的工程菌。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底盘菌是大肠杆菌ATCC 8739。
7.一种缬氨酸生产菌，其通过如权利要求1-6中任一项所述的方法得到。
8.如权利要求7所述的缬氨酸生产菌，其特征在于，是大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022134。
9.如权利要求7或8所述的缬氨酸生产菌在发酵法生产L-缬氨酸中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过下述步骤进行：
采用厌氧培养方式发酵；或者
采用好氧-厌氧两阶段方式发酵。
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