CN114957445B - 一种nmdar nr1亚基、nmdar的突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种nmdar nr1亚基、nmdar的突变体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种NMDARNR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明所述NMDARNR1亚基突变体不识别抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体，但当其与NMDAR的NR2亚基共转时，表现出了与野生型NR1相同的钙内流功能，从而为NMDAR相关疾病在基因水平上的诊断治疗提供了重要的方向，包括用于替换障碍型NMDAR离子通道、治疗致病性抗体导致的突出后膜表面NMDAR减少导致的疾病等相关性疾病。

Description

一种NMDAR NR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种NMDAR NR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用。
背景技术
NMDAR是一种分布在神经细胞突触后膜表面的离子通道蛋白，是离子型谷氨酸受体的亚型之一，由NR1、NR2和NR3亚单位构成。在有功能活性的NMDAR中，其4个亚基至少应有1个NR1及1个NR2，而绝大多数的NMDAR由2个NR1及2个NR2组成，也有少部分由3种亚基共同组成。NMDA受体有复杂的分子结构和独特的药理学特性，它对钙离子具有高通透性，这使得NMDA受体在突触可塑性及兴奋毒性方面具有重要作用。当神经递质与NMDAR结合后，功能性NMDAR离子通道打开，Ca2+内流，继而触发一系列的生化反应，可促进学习和记忆的功能；但过量的Ca2+内流会导致神经元坏死，引起学习记忆障碍。人类各种神经退行性和神经精神疾病的发病机制和病理生理过程可能与NMDAR通道故障相关，因此，对NMDAR通道的研究可为治疗性药物的开发提供靶点。
抗NMDAR脑炎是最主要的一种自身免疫性脑炎，占自身免疫性脑炎患者的70％～80％。NMDAR脑炎患者中主要存在的是针对NMDAR的NR1亚基的特异性IgG抗体。这些抗体具有致病性，可诱导NMDA受体的交联和内化，并阻断NMDAR依赖的突触电活动，引起癫痫、精神行为异常和意识障碍等临床表现。有研究表明，抗NMDAR脑炎患者的抗体会抑制NMDAR依赖性的细胞内Ca2+流入(Ignacio R A,Josep D,Teresa S,et al.Isolated hemidystoniaassociated with NMDA receptor antibodies[J].Movement disorders:officialjournal of the Movement Disorder Society,2011,26(2):351)。因此，维持NMDAR依赖性的细胞内Ca2+流入，对Ca2+介导的生理生化反应极为重要。
另有研究表明，在激活NMDAR通道而不是其他Ca2+通道(包括红藻氨酸受体和电压敏感Ca2+通道)后，钙很容易进入线粒体。Ca2+向线粒体转运的抑制保护神经元免受谷氨酸(Glu)介导的细胞死亡。Fukumori等人通过人胚胎肾(HEK)-293细胞制备获得性NMDAR通道，证明线粒体解偶联蛋白-2(UCP2)可能在一定程度上参与了细胞功能和/或功能障碍，其机制与激活功能性NMDAR通道后调节线粒体游离Ca2+水平有关(Fukumori R,Takarada T,Kambe Y,et al.Possible involvement of mitochondrial uncoupling protein-2incytotoxicity mediated by acquired N-methyl-D-aspartate receptor channels[J].Neurochemistry international,2012,61(4):498-505)。因此，NMDAR通道钙内流功能的研究对NMDAR相关疾病的诊断治疗具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NMDAR NR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用，所述NMDAR NR1亚基突变体不识别抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体，但当其与NMDAR的NR2亚基共转时，表现出了与野生型NR1相同的钙内流功能，从而为NMDAR相关疾病在基因水平上的诊断治疗提供了重要的方向。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种NMDAR NR1亚基的突变体，所述突变体不识别抗NMDAR脑炎患者的自身抗体；
所述突变体包括缺失NMDAR NR1亚基编码氨基酸序列的837-838位和864-937位。
优选的，所述NMDAR NR1亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种构建上述突变体的引物对，包括837-838-F、837-838-R、864-937-F和864-937-R，所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供了一种构建上述突变体的方法，包括以下步骤：(1)以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，利用864-937-F和864-937-R进行PCR扩增，得缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)以所述缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体为模板，利用837-838-F和837-838-R进行PCR扩增，得缺失837-838位和864-937位氨基酸的NMDAR NR1亚基的突变体；所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的体系均以50μL计，包括：模板50ng、引物F 2μL、引物R 2μL、FastPfu DNA Polymerase 1μL、5×Fast Pfubuffer 10μL、2.5mM dNTP4μL、DMSO 1μL和余量的无核酸酶水；
步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的程序，均包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸8min。
本发明还提供了一种构建NMDAR突变体的方法，包括以下步骤：
(1)将上述突变体***真核表达载体上，得NR1重组载体；
(2)将NMDAR的NR2亚基***真核表达载体上，得NR2重组载体；
(3)将NR1重组载体和NR2重组载体共同转染真核细胞，得NMDAR突变体；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后顺序。
优选的，步骤(1)和步骤(2)所述真核表达载体相同。
优选的，步骤(2)所述NR2亚基包括NR2a或NR2b，所述NR2a的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述NR2b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，步骤(3)所述共同转染时，所述NR1重组载体和NR2重组载体的质量比为(1:1)～(1:4)。
本发明还提供了上述突变体或利用上述方法制备得到的NMDAR突变体在制备NMDAR相关疾病的诊断和/或治疗的试剂中的应用。
有益效果：本发明提供了一种NMDAR NR1亚基突变体，所述NMDAR NR1亚基突变体不识别抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体，但当其与NMDAR的NR2亚基共转时，表现出了与野生型NR1相同的钙内流功能，从而为NMDAR相关疾病在基因水平上的诊断治疗提供了重要的方向，包括用于替换障碍型NMDAR离子通道、治疗致病性抗体导致的突出后膜表面NMDAR减少导致的疾病等相关性疾病。
附图说明
图1为NR1亚基的突变体分别与NR2a亚基共转后细胞结果图；
图2为NR1亚基的突变体分别与NR2b亚基共转后细胞结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种NMDAR NR1亚基的突变体，所述突变体不识别抗NMDAR脑炎患者的自身抗体；
所述突变体包括缺失NMDAR NR1亚基编码氨基酸序列的837-838位和864-937位。
本发明所述NMDAR NR1亚基的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，且在本发明中，所述NMDAR NR1亚基的突变体被称为NR1△837-838。本发明实施例中，NR1亚基突变体即NR1△837-838，与NMDAR NR2a或NR2b亚基共转后，在明场下观察，细胞大量死亡，表现出与野生型NR1亚基近似的情况，可形成具有Ca2+内流功能的离子通道；同时该突变体不结合NMDAR脑炎患者中的自身抗体，具有较好的应用前景。
本发明提供了一种构建上述突变体的引物对，包括837-838-F、837-838-R、864-937-F和864-937-R，所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供了一种构建上述突变体的方法，包括以下步骤：(1)以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，利用864-937-F和864-937-R进行PCR扩增，得缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)以所述缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体为模板，利用837-838-F和837-838-R进行PCR扩增，得缺失837-838位和864-937位氨基酸的NMDAR NR1亚基的突变体；所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明在构建NR1△837-838时，首先以野生型NR1为模板，构建缺失864-937位氨基酸的NR1亚基突变体，并以缺失864-937位氨基酸的NR1亚基突变体为模板，构建得到NR1△837-838。
本发明在进行上述两步骤的PCR扩增时，除所用的模板和引物序列不同外，所用的体系和程序均相同。本发明所述PCR扩增的体系以50μL计，优选包括：模板50ng、引物F(0.2μM)2μL、引物R(0.2μM)2μL、Fast Pfu DNA Polymerase(2.5units)1μL、5×Fast Pfubuffer10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL和余量的无核酸酶水。本发明所述PCR扩增的程序，优选包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸8min。
本发明还提供了一种构建NMDAR突变体的方法，包括以下步骤：
(1)将上述突变体***真核表达载体上，得NR1重组载体；
(2)将NMDAR的NR2亚基***真核表达载体上，得NR2重组载体；
(3)将NR1重组载体和NR2重组载体共同转染真核细胞，得NMDAR突变体；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后顺序。
本发明将上述突变体***真核表达载体上，得NR1重组载体。本发明所述真核表达载体优选包括pCDNA3.1、PIRESpuro3、pCMV-Myc、p3xFLAG-CMV-10或其他替换了部分载体元件但可以过表达蛋白的真核载体，实施例中以pCDNA3.1为例进行说明，并将突变体的基因***pCDNA3.1的NheI和NotI酶切位点之间，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明将NMDAR的NR2亚基***真核表达载体上，得NR2重组载体。本发明所述真核表达载体优选与上述相同，在此不再赘述。在本发明中，NR1突变体和NR2的***位点在相同的真核表达载体上，可以相同，也可以不同，实施例中以相同***位点为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述NR2亚基优选包括NR2a或NR2b，所述NR2a的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，所述NR2b的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。
得NR1重组载体和NR2重组载体后，本发明将NR1重组载体和NR2重组载体共同转染真核细胞，得NMDAR突变体。
本发明在进行所述共同转染时，优选还包括真核细胞的培养(细胞铺板)，更优选包括：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待孔板中真核细胞铺满时按1:5～1:6传代至新的孔板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞密度为30％～40％时，进行下一步转染。本发明所述孔板可以是96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板及不同直径的细胞培养皿，还可以是含有合适大小细胞爬片的孔板。本发明所述真核细胞优选包括293T细胞、CHO或其他可以过表达真核表达载体的细胞，实施例中以293T细胞为例进行说明，但是仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明在进行所述共同转染时，所述NR1重组载体和NR2重组载体的质量比优选为(1:1)～(1:4)，更优选为1:1。本发明将所述NR1重组载体与NR2重组载体混合均匀后，利用转染试剂PEI共同转染至上述培养获得的细胞中。
本发明实施例中还对共同转染后得到的细胞进行验证，所述验证包括钙离子荧光探针染色和免疫荧光染色，证实利用本发明所述方法，得到与野生型NR1α亚基具有相近的钙内流功能且不识别自身抗体的突变体，为NMDAR相关疾病的诊断治疗提供了重要的方向，包括用于替换障碍型NMDAR离子通道、治疗致病性抗体导致的突出后膜表面NMDAR减少导致的疾病等相关性疾病。
本发明还提供了上述突变体或利用上述方法制备得到的NMDAR突变体在制备NMDAR相关疾病的诊断和/或治疗的试剂中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种NMDAR NR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 NMDAR亚基重组载体的构建
1、通过人工合成的方法，将NMDAR的NR1亚基DNA序列(SEQ ID NO.1)合成至pCDNA3.1上，***酶切位点为NheI和NotI；将NMDAR的NR2a亚基DNA序列(SEQ ID NO.2)合成至pCDNA3.1上，***酶切位点为NheI和NotI；将NMDAR的NR2b亚基DNA序列(SEQ ID NO.3)合成至pCDNA3.1上，***酶切位点为NheI和NotI。
2、根据突变位点设计引物，各引物的具体序列如表1所示。
表1 突变体的构建引物
3、分别使用步骤2的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
使用编号为1的引物对进行PCR扩增时，以缺失了864-937位氨基酸的NMDAR NR1亚基的DNA序列为模板；
使用编号为2～11的引物对进行PCR扩增时，以NMDAR NR1亚基的DNA序列为模板；
PCR扩增体系为：模板50ng、引物F(0.2μM)2μL、引物R(0.2μM)2μL、Fast Pfu DNAPolymerase(2.5units)1μL、5×Fast Pfu buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL，最后用Nuclease-free Water将体系补足50μL；
PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，变性到延伸33个循环；72℃再延伸8min。
4、将步骤3得到的PCR产物进一步处理，转化，测序，测序正确的质粒大提后备用。
使用编号为1、4～11的引物扩增得到的各PCR产物，分别用DMT酶于37℃处理1h，去除模板质粒，进行胶回收。将胶回收的产物使用T4Polynucleotide Kinase进行处理(按照NEB说明书进行操作)，处理后的产物加入T4连接酶室温连接2小时，然后将连接产物转化至感受态细胞(DMT Chemically Competent Cell)中；
使用编号为2～3的引物扩增得到的各PCR产物，分别使用DMT酶于37℃处理1h，去除模板质粒，然后将处理后的PCR产物转化至感受态细胞(DMT Chemically CompetentCell)中；
将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序。测序正确的质粒大提保存。
实施例2 制备过表达各突变体的细胞并进行钙离子荧光探针染色
(1)细胞铺板：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待24孔板中293T细胞铺满时按1:5～1:6传代至新的24孔板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞密度为30％～40％时，进行下一步转染；
(2)PEI转染：将3μgNR1亚基的突变体分别与3μg NR2a亚基或3μgNR2b亚基按照1:1的比例进行混合，并将混匀后的质粒与转染试剂PEI按照1:2的比例转染至步骤(1)培养获得的细胞；
(3)钙离子荧光探针染色步骤2获得的细胞
细胞转染后24h-48h，弃培养基，使用PBS洗2次，加入4μM rhod钙离子荧光探针溶液孵育10分钟，PBS清洗2次；
(4)荧光显微镜下观察明场下及红色荧光通道观察细胞钙内流情况；
(5)NR1亚基的突变体分别与NR2a亚基共转后细胞死亡情况、钙离子荧光探针染色情况及与NMDAR患者自身抗体的结合情况，如表2和图1所示。
表2 NR1亚基的突变体分别与NR2a亚基共转后细胞情况
(6)NR1亚基的突变体分别NR2b亚基共转，在显微镜明场下及红色荧光通道的结果如表3和图2所示。
表3 NR1亚基的突变体分别与NR2b亚基共转后细胞情况
综上可知，缺失了837-838位及864-937位氨基酸的NR1亚基，即NR1△837-838，分别与NMDAR NR2a和NR2b亚基共转后，在明场下观察，细胞大量死亡，表现出与野生型NR1亚基近似的情况，可形成具有Ca2+内流功能的离子通道；同时该突变体不结合NMDAR脑炎患者中的自身抗体，具有较好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 陕西脉元生物科技有限公司
<120> 一种NMDAR NR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2817
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcacca tgcgcctgct gacgctcgcc ctgctgttct cctgctccgt cgcccgtgcc 60
gcgtgcgacc ccaagatcgt caacattggc gcggtgctga gcacgcggaa gcacgagcag 120
atgttccgcg aggccgtgaa ccaggccaac aagcggcacg gctcctggaa gattcagctc 180
aatgccacct ccgtcacgca caagcccaac gccatccaga tggctctgtc ggtgtgcgag 240
gacctcatct ccagccaggt ctacgccatc ctagttagcc atccacctac ccccaacgac 300
cacttcactc ccacccctgt ctcctacaca gccggcttct accgcatacc cgtgctgggg 360
ctgaccaccc gcatgtccat ctactcggac aagagcatcc acctgagctt cctgcgcacc 420
gtgccgccct actcccacca gtccagcgtg tggtttgaga tgatgcgtgt ctacagctgg 480
aaccacatca tcctgctggt cagcgacgac cacgagggcc gggcggctca gaaacgcctg 540
gagacgctgc tggaggagcg tgagtccaag gcagagaagg tgctgcagtt tgacccaggg 600
accaagaacg tgacggccct gctgatggag gcgaaagagc tggaggcccg ggtcatcatc 660
ctttctgcca gcgaggacga tgctgccact gtataccgcg cagccgcgat gctgaacatg 720
acgggctccg ggtacgtgtg gctggtcggc gagcgcgaga tctcggggaa cgccctgcgc 780
tacgccccag acggcatcct cgggctgcag ctcatcaacg gcaagaacga gtcggcccac 840
atcagcgacg ccgtgggcgt ggtggcccag gccgtgcacg agctcctcga gaaggagaac 900
atcaccgacc cgccgcgggg ctgcgtgggc aacaccaaca tctggaagac cgggccgctc 960
ttcaagagag tgctgatgtc ttccaagtat gcggatgggg tgactggtcg cgtggagttc 1020
aatgaggatg gggaccggaa gttcgccaac tacagcatca tgaacctgca gaaccgcaag 1080
ctggtgcaag tgggcatcta caatggcacc cacgtcatcc ctaatgacag gaagatcatc 1140
tggccaggcg gagagacaga gaagcctcga gggtaccaga tgtccaccag actgaagatt 1200
gtgacgatcc accaggagcc cttcgtgtac gtcaagccca cgctgagtga tgggacatgc 1260
aaggaggagt tcacagtcaa cggcgaccca gtcaagaagg tgatctgcac cgggcccaac 1320
gacacgtcgc cgggcagccc ccgccacacg gtgcctcagt gttgctacgg cttttgcatc 1380
gacctgctca tcaagctggc acggaccatg aacttcacct acgaggtgca cctggtggca 1440
gatggcaagt tcggcacaca ggagcgggtg aacaacagca acaagaagga gtggaatggg 1500
atgatgggcg agctgctcag cgggcaggca gacatgatcg tggcgccgct aaccataaac 1560
aacgagcgcg cgcagtacat cgagttttcc aagcccttca agtaccaggg cctgactatt 1620
ctggtcaaga aggagattcc ccggagcacg ctggactcgt tcatgcagcc gttccagagc 1680
acactgtggc tgctggtggg gctgtcggtg cacgtggtgg ccgtgatgct gtacctgctg 1740
gaccgcttca gccccttcgg ccggttcaag gtgaacagcg aggaggagga ggaggacgca 1800
ctgaccctgt cctcggccat gtggttctcc tggggcgtcc tgctcaactc cggcatcggg 1860
gaaggcgccc ccagaagctt ctcagcgcgc atcctgggca tggtgtgggc cggctttgcc 1920
atgatcatcg tggcctccta caccgccaac ctggcggcct tcctggtgct ggaccggccg 1980
gaggagcgca tcacgggcat caacgaccct cggctgagga acccctcgga caagtttatc 2040
tacgccacgg tgaagcagag ctccgtggat atctacttcc ggcgccaggt ggagctgagc 2100
accatgtacc ggcatatgga gaagcacaac tacgagagtg cggcggaggc catccaggcc 2160
gtgagagaca acaagctgca tgccttcatc tgggactcgg cggtgctgga gttcgaggcc 2220
tcgcagaagt gcgacctggt gacgactgga gagctgtttt tccgctcggg cttcggcata 2280
ggcatgcgca aagacagccc ctggaagcag aacgtctccc tgtccatcct caagtcccac 2340
gagaatggct tcatggaaga cctggacaag acgtgggttc ggtatcagga atgtgactcg 2400
cgcagcaacg cccctgcgac ccttactttt gagaacatgg ccggggtctt catgctggta 2460
gctgggggca tcgtggccgg gatcttcctg attttcatcg agattgccta caagcggcac 2520
aaggatgctc gccggaagca gatgcagctg gcctttgccg ccgttaacgt gtggcggaag 2580
aacctgcagg atagaaagag tggtagagca gagcctgacc ctaaaaagaa agccacattt 2640
agggctatca cctccaccct ggcttccagc ttcaagaggc gtaggtcctc caaagacacg 2700
agcaccgggg gtggacgcgg cgctttgcaa aaccaaaaag acacagtgct gccgcgacgc 2760
gctattgaga gggaggaggg ccagctgcag ctgtgttccc gtcataggga gagctga 2817
<210> 2
<211> 4395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcagag tgggctattg gaccctgctg gtgctgccgg cccttctggt ctggcgcggt 60
ccggcgccga gcgcggcggc ggagaagggt ccccccgcgc taaatattgc ggtgatgctg 120
ggtcacagcc acgacgtgac agagcgcgaa cttcgaacac tgtggggccc cgagcaggcg 180
gcggggctgc ccctggacgt gaacgtggta gctctgctga tgaaccgcac cgaccccaag 240
agcctcatca cgcacgtgtg cgacctcatg tccggggcac gcatccacgg cctcgtgttt 300
ggggacgaca cggaccagga ggccgtagcc cagatgctgg attttatctc ctcccacacc 360
ttcgtcccca tcttgggcat tcatgggggc gcatctatga tcatggctga caaggatccg 420
acgtctacct tcttccagtt tggagcgtcc atccagcagc aagccacggt catgctgaag 480
atcatgcagg attatgactg gcatgtcttc tccctggtga ccactatctt ccctggctac 540
agggaattca tcagcttcgt caagaccaca gtggacaaca gctttgtggg ctgggacatg 600
cagaatgtga tcacactgga cacttccttt gaggatgcaa agacacaagt ccagctgaag 660
aagatccact cttctgtcat cttgctctac tgttccaaag acgaggctgt tctcattctg 720
agtgaggccc gctcccttgg cctcaccggg tatgatttct tctggattgt ccccagcttg 780
gtctctggga acacggagct catcccaaaa gagtttccat cgggactcat ttctgtctcc 840
tacgatgact gggactacag cctggaggcg agagtgaggg acggcattgg catcctaacc 900
accgctgcat cttctatgct ggagaagttc tcctacatcc ccgaggccaa ggccagctgc 960
tacgggcaga tggagaggcc agaggtcccg atgcacacct tgcacccatt tatggtcaat 1020
gttacatggg atggcaaaga cttatccttc actgaggaag gctaccaggt gcaccccagg 1080
ctggtggtga ttgtgctgaa caaagaccgg gaatgggaaa aggtgggcaa gtgggagaac 1140
catacgctga gcctgaggca cgccgtgtgg cccaggtaca agtccttctc cgactgtgag 1200
ccggatgaca accatctcag catcgtcacc ctggaggagg ccccattcgt catcgtggaa 1260
gacatagacc ccctgaccga gacgtgtgtg aggaacaccg tgccatgtcg gaagttcgtc 1320
aaaatcaaca attcaaccaa tgaggggatg aatgtgaaga aatgctgcaa ggggttctgc 1380
attgatattc tgaagaagct ttccagaact gtgaagttta cttacgacct ctatctggtg 1440
accaatggga agcatggcaa gaaagttaac aatgtgtgga atggaatgat cggtgaagtg 1500
gtctatcaac gggcagtcat ggcagttggc tcgctcacca tcaatgagga acgttctgaa 1560
gtggtggact tctctgtgcc ctttgtggaa acgggaatca gtgtcatggt ttcaagaagt 1620
aatggcaccg tctcaccttc tgcttttcta gaaccattca gcgcctctgt ctgggtgatg 1680
atgtttgtga tgctgctcat tgtttctgcc atagctgttt ttgtctttga atacttcagc 1740
cctgttggat acaacagaaa cttagccaaa gggaaagcac cccatgggcc ttcttttaca 1800
attggaaaag ctatatggct tctttggggc ctggtgttca ataactccgt gcctgtccag 1860
aatcctaaag ggaccaccag caagatcatg gtatctgtat gggccttctt cgctgtcata 1920
ttcctggcta gctacacagc caatctggct gccttcatga tccaagagga atttgtggac 1980
caagtgaccg gcctcagtga caaaaagttt cagagacctc atgactattc cccacctttt 2040
cgatttggga cagtgcctaa tggaagcacg gagagaaaca ttcggaataa ctatccctac 2100
atgcatcagt acatgaccaa atttaatcag aaaggagtag aggacgcctt ggtcagcctg 2160
aaaacgggga agctggacgc tttcatctac gatgccgcag tcttgaatta caaggctggg 2220
agggatgaag gctgcaagct ggtgaccatc gggagtgggt acatctttgc caccaccggt 2280
tatggaattg cccttcagaa aggctctcct tggaagaggc agatcgacct ggccttgctt 2340
cagtttgtgg gtgatggtga gatggaggag ctggagaccc tgtggctcac tgggatctgc 2400
cacaacgaga agaacgaggt gatgagcagc cagctggaca ttgacaacat ggcgggcgta 2460
ttctacatgc tggctgccgc catggccctt agcctcatca ccttcatctg ggagcacctc 2520
ttctactgga agctgcgctt ctgtttcacg ggcgtgtgct ccgaccggcc tgggttgctc 2580
ttctccatca gcaggggcat ctacagctgc attcatggag tgcacattga agaaaagaag 2640
aagtctccag acttcaatct gacgggatcc cagagcaaca tgttaaaact cctccggtca 2700
gccaaaaaca tttccagcat gtccaacatg aactcctcaa gaatggactc acccaaaaga 2760
gctgctgact tcatccaaag aggttccctc atcatggaca tggtttcaga taaggggaat 2820
ttgatgtact cagacaacag gtcctttcag gggaaagaga gcatttttgg agacaacatg 2880
aacgaactcc aaacatttgt ggccaaccgg cagaaggata acctcaataa ctatgtattc 2940
cagggacaac atcctcttac tctcaatgag tccaacccta acacggtgga ggtggccgtg 3000
agcacagaat ccaaagcgaa ctctagaccc cggcagctgt ggaagaaatc cgtggattcc 3060
atacgccagg attcactatc ccagaatcca gtctcccaga gggatgaggc aacagcagag 3120
aataggaccc actccctaaa gagccctagg tatcttccag aagagatggc ccactctgac 3180
atttcagaaa cgtcaaatcg ggccacgtgc cacagggaac ctgacaacag taagaaccac 3240
aaaaccaagg acaactttaa aaggtcagtg gcctccaaat accccaagga ctgtagtgag 3300
gtcgagcgca cctacctgaa aaccaaatca agctccccta gagacaagat ctacactata 3360
gatggtgaga aggagcctgg tttccactta gatccacccc agtttgttga aaatgtgacc 3420
ctgcccgaga acgtggactt cccggacccc taccaggatc ccagtgaaaa cttccgcaag 3480
ggggactcca cgctgccaat gaaccggaac cccttgcata atgaagaggg gctttccaac 3540
aacgaccagt ataaactcta ctccaagcac ttcaccttga aagacaaggg ttccccgcac 3600
agtgagacca gcgagcgata ccggcagaac tccacgcact gcagaagctg cctttccaac 3660
atgcccacct attcaggcca cttcaccatg aggtccccct tcaagtgcga tgcctgcctg 3720
cggatgggga acctctatga catcgatgaa gaccagatgc ttcaggagac aggtaaccca 3780
gccaccgggg agcaggtcta ccagcaggac tgggcacaga acaatgccct tcaattacaa 3840
aagaacaagc taaggattag ccgtcagcat tcctacgata acattgtcga caaacctagg 3900
gagctagacc ttagcaggcc ctcccggagc ataagcctca aggacaggga acggcttctg 3960
gagggaaatt tttacggcag cctgtttagt gtcccctcaa gcaaactctc ggggaaaaaa 4020
agctcccttt tcccccaagg tctggaggac agcaagagga gcaagtctct cttgccagac 4080
cacacctccg ataacccttt cctccactcc cacagggatg accaacgctt ggttattggg 4140
agatgcccct cggaccctta caaacactcg ttgccatccc aggcggtgaa tgacagctat 4200
cttcggtcgt ccttgaggtc aacggcatcg tactgttcca gggacagtcg gggccacaat 4260
gatgtgtata tttcggagca tgttatgcct tatgctgcaa ataagaataa tatgtactct 4320
acccccaggg ttttaaattc ctgcagcaat agacgcgtgt acaagaaaat gcctagtatc 4380
gaatctgatg tttaa 4395
<210> 3
<211> 4455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaagccca gagcggagtg ctgttctccc aagttctggt tggtgttggc cgtcctggcc 60
gtgtcaggca gcagagctcg ttctcagaag agccccccca gcattggcat tgctgtcatc 120
ctcgtgggca cttccgacga ggtggccatc aaggatgccc acgagaaaga tgatttccac 180
catctctccg tggtaccccg ggtggaactg gtagccatga atgagaccga cccaaagagc 240
atcatcaccc gcatctgtga tctcatgtct gaccggaaga tccagggggt ggtgtttgct 300
gatgacacag accaggaagc catcgcccag atcctcgatt tcatttcagc acagactctc 360
acccccatcc tgggcatcca cgggggctcc tctatgataa tggcagataa ggatgaatcc 420
tccatgttct tccagtttgg cccatcaatt gaacagcaag cttccgtaat gctcaacatc 480
atggaagaat atgactggta catcttttct atcgtcacca cctatttccc tggctaccag 540
gactttgtaa acaagatccg cagcaccatt gagaatagct ttgtgggctg ggagctagag 600
gaggtcctcc tactggacat gtccctggac gatggagatt ctaagatcca gaatcagctc 660
aagaaacttc aaagccccat cattcttctt tactgtacca aggaagaagc cacctacatc 720
tttgaagtgg ccaactcagt agggctgact ggctatggct acacgtggat cgtgcccagt 780
ctggtggcag gggatacaga cacagtgcct gcggagttcc ccactgggct catctctgta 840
tcatatgatg aatgggacta tggcctcccc gccagagtga gagatggaat tgccataatc 900
accactgctg cttctgacat gctgtctgag cacagcttca tccctgagcc caaaagcagt 960
tgttacaaca cccacgagaa gagaatctac cagtccaata tgctaaatag gtatctgatc 1020
aatgtcactt ttgaggggag gaatttgtcc ttcagtgaag atggctacca gatgcacccg 1080
aaactggtga taattcttct gaacaaggag aggaagtggg aaagggtggg gaagtggaaa 1140
gacaagtccc tgcagatgaa gtactatgtg tggccccgaa tgtgtccaga gactgaagag 1200
caggaggatg accatctgag cattgtgacc ctggaggagg caccatttgt cattgtggaa 1260
agtgtggacc ctctgagtgg aacctgcatg aggaacacag tcccctgcca aaaacgcata 1320
gtcactgaga ataaaacaga cgaggagccg ggttacatca aaaaatgctg caaggggttc 1380
tgtattgaca tccttaagaa aatttctaaa tctgtgaagt tcacctatga cctttacctg 1440
gttaccaatg gcaagcatgg gaagaaaatc aatggaacct ggaatggtat gattggagag 1500
gtggtcatga agagggccta catggcagtg ggctcactca ccatcaatga ggaacgatcg 1560
gaggtggtcg acttctctgt gcccttcata gagacaggca tcagtgtcat ggtgtcacgc 1620
agcaatggga ctgtctcacc ttctgccttc ttagagccat tcagcgctga cgtatgggtg 1680
atgatgtttg tgatgctgct catcgtctca gccgtggctg tctttgtctt tgagtacttc 1740
agccctgtgg gttataacag gtgcctcgct gatggcagag agcctggtgg accctctttc 1800
accatcggca aagctatttg gttgctctgg ggtctggtgt ttaacaactc cgtacctgtg 1860
cagaacccaa aggggaccac ctccaagatc atggtgtcag tgtgggcctt ctttgctgtc 1920
atcttcctgg ccagctacac tgccaactta gctgccttca tgatccaaga ggaatatgtg 1980
gaccaggttt ctggcctgag cgacaaaaag ttccagagac ctaatgactt ctcaccccct 2040
ttccgctttg ggaccgtgcc caacggcagc acagagagaa atattcgcaa taactatgca 2100
gaaatgcatg cctacatggg aaagttcaac cagaggggtg tagatgatgc attgctctcc 2160
ctgaaaacag ggaaactgga tgccttcatc tatgatgcag cagtgctgaa ctatatggca 2220
ggcagagatg aaggctgcaa gctggtgacc attggcagtg ggaaggtctt tgcttccact 2280
ggctatggca ttgccatcca aaaagattct gggtggaagc gccaggtgga ccttgctatc 2340
ctgcagctct ttggagatgg ggagatggaa gaactggaag ctctctggct cactggcatt 2400
tgtcacaatg agaagaatga ggtcatgagc agccagctgg acattgacaa catggcaggg 2460
gtcttctaca tgttgggggc ggccatggct ctcagcctca tcaccttcat ctgcgaacac 2520
cttttctatt ggcagttccg acattgcttt atgggtgtct gttctggcaa gcctggcatg 2580
gtcttctcca tcagcagagg tatctacagc tgcatccatg gggtggcgat cgaggagcgc 2640
cagtctgtaa tgaactcccc caccgcaacc atgaacaaca cacactccaa catcctgcgc 2700
ctgctgcgca cggccaagaa catggctaac ctgtctggtg tgaatggctc accgcagagc 2760
gccctggact tcatccgacg ggagtcatcc gtctatgaca tctcagagca ccgccgcagc 2820
ttcacgcatt ctgactgcaa atcctacaac aacccgccct gtgaggagaa cctcttcagt 2880
gactacatca gtgaggtaga gagaacgttc gggaacctgc agctgaagga cagcaacgtg 2940
taccaagatc actaccacca tcaccaccgg ccccatagta ttggcagtgc cagctccatc 3000
gatgggctct acgactgtga caacccaccc ttcaccaccc agtccaggtc catcagcaag 3060
aagcccctgg acatcggcct cccctcctcc aagcacagcc agctcagtga cctgtacggc 3120
aaattctcct tcaagagcga ccgctacagt ggccacgacg acttgatccg ctccgatgtc 3180
tctgacatct caacccacac cgtcacctat gggaacatcg agggcaatgc cgccaagagg 3240
cgtaagcagc aatataagga cagcctgaag aagcggcctg cctcggccaa gtcccgcagg 3300
gagtttgacg agatcgagct ggcctaccgt cgccgaccgc cccgctcccc tgaccacaag 3360
cgctacttca gggacaagga agggctacgg gacttctacc tggaccagtt ccgaacaaag 3420
gagaactcac cccactggga gcacgtagac ctgaccgaca tctacaagga gcggagtgat 3480
gactttaagc gcgactccgt cagcggagga gggccctgta ccaacaggtc tcacatcaag 3540
cacgggacgg gcgacaaaca cggcgtggtc agcggggtac ctgcaccttg ggagaagaac 3600
ctgaccaacg tggagtggga ggaccggtcc gggggcaact tctgccgcag ctgtccctcc 3660
aagctgcaca actactccac gacggtgacg ggtcagaact cgggcaggca ggcgtgcatc 3720
cggtgtgagg cttgcaagaa agcaggcaac ctgtatgaca tcagtgagga caactccctg 3780
caggaactgg accagccggc tgccccagtg gcggtgacgt caaacgcctc caccactaag 3840
taccctcaga gcccgactaa ttccaaggcc cagaagaaga accggaacaa actgcgccgg 3900
cagcactcct acgacacctt cgtggacctg cagaaggaag aagccgccct ggccccgcgc 3960
agcgtaagcc tgaaagacaa gggccgattc atggatggga gcccctacgc ccacatgttt 4020
gagatgtcag ctggcgagag cacctttgcc aacaacaagt cctcagtgcc cactgccgga 4080
catcaccacc acaacaaccc cggcggcggg tacatgctca gcaagtcgct ctaccctgac 4140
cgggtcacgc aaaacccttt catccccact tttggggacg accagtgctt gctccatggc 4200
agcaaatcct acttcttcag gcagcccacg gtggcggggg cgtcgaaagc caggccggac 4260
ttccgggccc ttgtcaccaa caagccggtg gtctcggccc ttcatggggc cgtgccagcc 4320
cgtttccaga aggacatctg tatagggaac cagtccaacc cctgtgtgcc taacaacaaa 4380
aaccccaggg ctttcaatgg ctccagcaat gggcatgttt atgagaaact ttctagtatt 4440
gagtctgatg tctga 4455
<210> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 6
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gagcgggccc gtgatatcag tgggatggta ctgctgcagg ttcttccgcc aca 53
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gtacctgctg agaagcttct cagcgcgcat cctgg 35
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tctgggggcg ccttccccga tgc 23
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agcacactgt ggctgctggt 20
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cacgaagggc tcctggtgga 20
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gaggcgaaag agctggaggc 20
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gtaggagaca ggggtgggag 20
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ttctcagcgc gcatcctggg 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggggcgcct tccccgatgc 20
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<212> DNA
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Claims (7)

1.一种NMDARNR1亚基的突变体，其特征在于，所述突变体不识别抗NMDAR脑炎患者的自身抗体；
所述突变体缺失NMDARNR1亚基编码氨基酸序列的837-838位和864-937位；
所述NMDARNR1亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种构建权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，利用864-937-F和864-937-R进行PCR扩增，得缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)以所述缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体为模板，利用837-838-F和837-838-R进行PCR扩增，得缺失837～838位和864-937位氨基酸的NMDARNR1亚基的突变体；所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的体系均以50μL计，包括：模板50ng、引物F2μL、引物R2μL、FastPfuDNAPolymerase1μL、5×FastPfubuffer10μL、2.5mMdNTP4μL、DMSO1μL和余量的无核酸酶水；
步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的程序，均包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸8min。
4.一种构建NMDAR突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述突变体***真核表达载体上，得NR1重组载体；
(2)将NMDAR的NR2亚基***真核表达载体上，得NR2重组载体；
(3)将NR1重组载体和NR2重组载体共同转染真核细胞，得NMDAR突变体；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后顺序。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述真核表达载体相同。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)所述NR2亚基包括NR2a或NR2b，所述NR2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述NR2b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(3)所述共同转染时，所述NR1重组载体和NR2重组载体的质量比为(1:1)～(1:4)。
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