CN114957367B - 一种生物法制备睾酮的精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物法制备的睾酮粗品的精制方法，其包括以下步骤：(1)将干燥的睾酮粗品与醇混匀，升温至60℃以上，使所述睾酮粗品完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀；(2)加入包含活性炭的助滤剂以吸附所述絮状变性蛋白沉淀；过滤收集滤液，滤饼用甲醇淋洗；(3)滴加纯水，混匀后升温至60℃以上，浓缩并回收85wt％的醇溶液；搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，过滤收集滤饼；依次用乙醇和纯水淋洗，滤饼干燥后得睾酮精品。本发明的精制方法对生物法制备的睾酮粗品中K杂及A杂精制效果明显，成品睾酮中K杂含量＜0.15％，A杂含量＜0.05％，符合最新EP10.1标准；成品收率能够达到93％及以上。
Description
技术领域
本发明涉及甾体药物制备技术领域，具体涉及一种用于生物法制备睾酮的精制方法。
背景技术
睾酮(如下式III所示)是一种激素类药物，属于甾体化合物，临床上作为性激素药物治疗原发性和继发性男性性腺功能减退，维持男性第二特征、性功能等。传统合成睾酮的方法是将双烯醇酮醋酸酯肟化、贝式反应、水解等步骤得到雄烯二酮，再以雄烯二酮为原料，经过两步反应得到睾酮粗品，由于从雄烯二酮合成睾酮需要先将3-酮基进行保护，再进行17-酮基还原，该方法步骤较多且粗品中杂质较多，精制成本较高。
随着生物催化以及酶催化技术的发展，细胞转化以及酶催化法制备睾酮逐渐替代了化学合成的方法，利用细胞转化或者酶催化的方法，以雄烯二酮为底物，选择性还原17-酮基成β-羟基，一步转化雄烯二酮到睾酮(路线a)，简化了生产工艺以及节省了生产成本。
但是在该反应中，原料中的K杂前体物质(式IV)也会被转化成K杂(式I)，I杂前体物质(式V)也会被转化成I杂(式VI)。由于K杂(式I)结构与睾酮(式III)极度相似，导致生物法制备的睾酮(式III)中K杂(式I)和A杂(式II)较难除去，需要采用大量乙酸乙酯和正己烷析晶进行精制，工艺复杂且溶剂难以回收，成本较高。
且该方法精制获得的睾酮不符合EP10.1的标准：K杂＜0.15％，A杂＜0.1％，其他单杂＜0.1％。
发明内容
为解决现有技术中生物法制备的睾酮精制产物不符合EP10.1的标准的技术问题，本发明提供了一种用生物法制备睾酮的精制方法。所述精制方法特别是对睾酮中难以精制的K杂以及A杂具有较好的精制效果，成品睾酮中K杂含量＜0.15％，A杂含量＜0.05％，符合睾酮最新EP10.1标准：K杂＜0.15％，A杂＜0.1％。且所用工艺精制工艺较为简单，易于溶剂回收，降低了成本，在优选的技术方案中最后成品收率能够达到96％及以上。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
(1)将干燥的睾酮粗品与醇混匀，升温至60℃以上，使所述睾酮粗品完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀；
(2)加入包含活性炭的助滤剂，吸附(1)的溶液中的絮状变性蛋白沉淀；过滤收集滤液，滤饼上少量残留的睾酮用甲醇淋洗；
(3)向上述溶液中滴加纯水，混匀后升温至60℃以上，浓缩并回收85wt％的醇溶液；搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，过滤收集滤饼；依次用乙醇和纯水淋洗，将滤饼干燥后得睾酮精品。
在一些具体的实施例中，所述醇包括甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇或正丁醇或由它们组成的混合溶剂。
在一些具体的实施例中，所述包含活性炭的助滤剂中还包括石棉、石墨粉、锯屑、酸性白土、珍珠岩、泥浆、淀粉、硅藻土、造纸、氧化镁、石膏、纤维素和氢氧化铝中的一种或多种。
在一些具体的实施例中，所述精制方法的条件选自以下组：
i)步骤(1)中，所述醇为甲醇或乙醇；
ii)步骤(2)中，所述包含活性炭的助滤剂为活性炭和硅藻土，或活性炭和纤维素。
在一些具体的实施例中，步骤(1)中，所述睾酮粗品由细胞转化方法或酶催化方法制得。
在一些具体的实施例中，步骤(1)中，所述睾酮粗品通过过滤收集。
在一些具体的实施例中，步骤(1)中，所述升温的同时进行搅拌和回流的处理。
在一些具体的实施例中，所述过滤为抽滤。例如步骤(1)、(2)和(3)中的过滤均采用抽滤进行。
在一些具体的实施例中，所述干燥为真空干燥。例如步骤(1)和(3)中均采用真空干燥的方法。
在一些具体的实施例中，步骤(1)中，所述醇与睾酮粗品的体积质量比为：(4～12):1，优选采用(5～8):1。
在一些具体的实施例中，步骤(1)中，当所述醇为甲醇时，升温至70℃以上。
在一些具体的实施例中，步骤(2)中，所述吸附在搅拌下进行。
在一些具体的实施例中，步骤(2)中，包含活性炭的助滤剂与睾酮粗品的用量比为(4～5):15。
在一些具体的实施例中，步骤(2)中，所述硅藻土和活性炭的用量比为1:1，或，所述纤维素和活性炭的用量比为3:5。
在一些具体的实施例中，步骤(2)中，所述甲醇与睾酮粗品的体积质量比为：(1～3):3，优选为2:3。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，纯水与睾酮粗品的体积质量比为(5～10):6，优选为5:6。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，纯水的加入速度为2～10ml/min；例如为5ml/min。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，用于淋洗的纯水与睾酮的体积质量比为(5～10):1；优选为(6～7):1。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，所述混匀在搅拌下进行。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，所述浓缩为减压浓缩。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，所述降温在搅拌下进行。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，所述乙醇为冷冻的乙醇；例如5～8℃的乙醇。
在一些具体的实施例中，步骤(3)中，所述乙醇与睾酮的体积质量比为(0.5～2):3；优选为1:3。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的精制方法对生物法制备的睾酮粗品中K杂及A杂精制效果明显，成品睾酮中K杂含量＜0.15％，A杂含量＜0.05％，精制成品符合最新EP10.1标准。成品收率能够达到93％及以上，在优选的技术方案中，成品收率能够达到96％及以上。
附图说明
图1为细胞转化方法得到的睾酮的HPLC图谱；其中A为睾酮粗品；B为活性炭和硅藻土助滤精制的睾酮精品。
图2为酶催化方法得到的睾酮的HPLC图谱；其中A为睾酮粗品；B为活性炭和硅藻土助滤精制的睾酮精品。
图3为乙醇精制的睾酮的HPLC图谱；其中A为睾酮粗品；B为乙醇精制的睾酮精品。
图4为活性炭和纤维素助滤精制的睾酮的HPLC图谱；其中A为睾酮粗品；B为活性炭和纤维素助滤精制的睾酮精品。
图5为用于化学法精制的睾酮粗品的HPLC图谱。
图6为乙酸乙酯和正己烷析晶精制的睾酮精品HPLC图谱。
图7为乙酸乙酯析晶精制的睾酮精品HPLC图谱。
图8为丙酮精制的睾酮精品HPLC图谱。
图9为异丙醇精制的睾酮精品HPLC图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1细胞转化方法得到的睾酮粗品的精制
第一步：将含有睾酮的1L细胞发酵液通过过滤收集睾酮粗品，粗品大约30g，将睾酮粗品进行真空干燥后，加入240mL甲醇，搅拌下升温至70℃回流1h，直至物料完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀。
第二步：向上述溶液中添加5g硅藻土和5g活性炭，维持恒温状态搅拌使不溶物(即絮状变性蛋白沉淀)被助滤剂吸附，过滤收集滤液。滤饼上少量残留的睾酮用20mL甲醇淋洗。
第三步：向上述溶液中以5ml/min的速率滴加纯净水25mL，搅拌均匀后升温至60℃，减压浓缩出85wt％的甲醇溶液并回收，搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，抽滤收集滤饼，用10ml冷冻乙醇淋洗后，再用200mL纯净水淋洗，将滤饼真空干燥后得睾酮精品。
收率大于96％，HPLC送检纯度高于99.8％，K杂及A杂限度符合EP10.1标准。睾酮粗品HPLC图谱见图1的A和表1，睾酮精品HPLC图谱见图1的B和表2。
表1细胞转化睾酮粗品HPLC
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 面积 | 面积％ | 杂质种类 | 杂质含量 |
| 1 | 2.685 | 0.290 | 26269 | 0.528 | 溶剂峰 | / |
| 2 | 7.953 | 0.858 | 20785 | 0.418 | K杂 | 0.418％ |
| 3 | 8.400 | 0.906 | 4952 | 0.100 | 未知杂 | 0.1％ |
| 4 | 9.269 | 1.000 | 4872808 | 97.997 | 睾酮 | |
| 5 | 13.402 | 1.446 | 47569 | 0.957 | A杂 | 0.857％ |
表2细胞转化睾酮精品HPLC
实施例2酶催化方法得到的睾酮粗品的精制
第一步：将含有30g睾酮粗品的酶催化转化液300mL过滤，收集睾酮粗品，将睾酮粗品进行真空干燥后，加入240mL甲醇，搅拌下升温至70℃回流1h，直至物料完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀。
第二步：向上述溶液中添加5g硅藻土和5g活性炭，维持恒温状态搅拌使不溶物被助滤剂吸附，过滤收率滤液，滤饼上少量残留的睾酮用20mL甲醇淋洗。
第三步：向上述溶液中以5ml/min的速率滴加纯净水25mL，搅拌均匀后升温至60℃，减压浓缩出85wt％的甲醇溶液并回收，搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，抽滤收集滤饼，用10ml冷冻乙醇淋洗后，再用200mL纯净水淋洗，将滤饼真空干燥后得睾酮精品，收率大于96％，HPLC送检纯度高于99.8％，K杂及A杂限度符合EP10.1标准。睾酮粗品HPLC图谱见附图2的A和表3，睾酮精品HPLC图谱见图2的B和表4。
表3酶催化睾酮粗品HPLC
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 面积 | 面积％ | 杂质种类 | 杂质含量 |
| 1 | 2.693 | 0.290 | 3201 | 0.030 | 溶剂杂 | / |
| 2 | 7.965 | 0.857 | 25489 | 0.242 | K杂 | 0.242％ |
| 3 | 8.412 | 0.906 | 6911 | 0.066 | 未知杂 | 0.066％ |
| 4 | 9.289 | 1.000 | 10407259 | 98.991 | 睾酮 | |
| 5 | 13.438 | 1.447 | 70500 | 0.671 | A杂 | 0.671％ |
表4酶催化睾酮精品HPLC
实施例3睾酮粗品乙醇的精制
第一步：将含有30g睾酮粗品的酶催化转化液300mL过滤，收集睾酮粗品，将睾酮粗品进行真空干燥后，加入240mL乙醇溶液(乙醇>95％)，搅拌下升温至60℃回流1h，直至物料完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀。
第二步：向上述溶液中添加5g硅藻土和5g活性炭，维持恒温状态搅拌使不溶物被助滤剂吸附，过滤收集滤液，滤饼上少量残留的睾酮用20mL甲醇淋洗。
第三步：向上述溶液中以5ml/min的速率滴加纯净水25mL，搅拌均匀后升温至60℃，减压浓缩出85wt％的乙醇溶液并回收，搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，抽滤收集滤饼，用10ml冷冻乙醇淋洗后，再用200mL纯净水淋洗，将滤饼真空干燥后得睾酮精品，收率大于93％，HPLC送检纯度高于99.8％，K杂及A杂限度符合EP10.1标准。睾酮粗品HPLC图谱见图3的A和表5，睾酮精品HPLC图谱见图3的B和表6。
表5酶催化睾酮粗品HPLC
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 面积 | 面积％ | 杂质种类 | 杂质含量 |
| 1 | 2.693 | 0.290 | 3201 | 0.030 | 溶剂杂 | / |
| 2 | 7.965 | 0.857 | 25489 | 0.242 | K杂 | 0.242％ |
| 3 | 8.412 | 0.906 | 6911 | 0.066 | 未知杂 | 0.066％ |
| 4 | 9.289 | 1.000 | 10407259 | 98.991 | 睾酮 | |
| 5 | 13.438 | 1.447 | 70500 | 0.671 | A杂 | 0.671％ |
表6酶催化睾酮精品HPLC
实施例4睾酮粗品活性炭和纤维素助滤精制
第一步：将含有30g睾酮粗品的酶催化转化液300mL过滤，收集睾酮粗品，将睾酮粗品进行真空干燥后，加入240mL甲醇，搅拌下升温至70℃回流1h，直至物料完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀。
第二步：向上述溶液中添加3g纤维素和5g活性炭，维持恒温状态搅拌使不溶物被助滤剂吸附，过滤收率滤液，滤饼上少量残留的睾酮用20mL甲醇淋洗。
第三步：向上述溶液中以5ml/min的速率滴加纯净水25mL，搅拌均匀后升温至60℃，减压浓缩出85wt％的甲醇溶液并回收，搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，抽滤收集滤饼，用10ml冷冻乙醇淋洗后，再用200mL纯净水淋洗，将滤饼真空干燥后得睾酮精品，收率大于93％，HPLC送检纯度高于99.8％，K杂及A杂限度符合EP10.1标准。睾酮粗品HPLC图谱见图4的A和表7，睾酮精品HPLC图谱见图4的B和表8。
表7酶催化睾酮粗品HPLC
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 面积 | 面积％ | 杂质种类 | 杂质含量 |
| 1 | 2.742 | 0.290 | 15654 | 0.030 | 溶剂杂 | / |
| 2 | 8.245 | 0.856 | 22231 | 0.242 | K杂 | 0.242％ |
| 3 | 8.713 | 0.905 | 7418 | 0.066 | 未知杂 | 0.066％ |
| 4 | 9.632 | 1.000 | 7145895 | 98.991 | 睾酮 | |
| 5 | 13.926 | 1.446 | 36157 | 0.671 | A杂 | 0.671％ |
表8酶催化睾酮精品HPLC
实施例5对比实验
如未特殊说明，以下的精制方法使用的睾酮粗品不限于化学法、细胞转化方法或酶催化方法得到的睾酮粗品。
5.1乙酸乙酯和正己烷析晶精制：
取睾酮粗品(图5)10g，添加5～8倍体积的乙酸乙酯(50～80mL)，搅拌下升温70℃直至物料完全溶解。
过滤除去变性蛋白收集滤液，保温1h后向溶液中缓慢滴加3～5倍体积的正己烷(30～50mL)，缓慢降温至10℃左右，有大量固体析出。
过滤收集睾酮精品，60℃烘干至恒重。
收率在80～85％之间，精制效果：K杂含量变化：0.223％→0.200％；A杂含量变化：0.534％→0.101％；其余单杂＞0.1％(图6)。该方法精制的睾酮不符合EP10.1要求，且收率较低。
5.2乙酸乙酯析晶精制：
取睾酮粗品(图5)10g，添加5～8倍体积的乙酸乙酯(50～80mL)，搅拌下升温至70℃直至物料完全溶解。
过滤除去变性蛋白收集滤液，将滤液真空浓缩溶剂至剩余1～2倍体积乙酸乙酯，有大量固体析出。
降温析晶后过滤收集睾酮精品，60℃烘干至恒重。
收率在80～85％之间，精制效果：K杂含量变化：0.212％→0.187％；A杂含量变化：0.534％→0.052％；其余单杂＞0.1％(图7)。该方法精制的睾酮不符合EP10.1要求，且收率较低。且经试验发现，该方法针对生物法合成的睾酮不具有精制效果，同样不满足EP0.1中K杂规定的限度。
5.3丙酮精制：
取睾酮粗品(图5)10g，添加6～9倍体积的丙酮(60～90mL)，搅拌下升温50℃至物料完全溶解。
过滤除去变性蛋白收集滤液，将滤液真空浓缩溶剂至剩余1倍体积丙酮，有大量固体析出。
降温析晶后过滤收集睾酮精品，60℃烘干至恒重。
收率为80％，精制效果：K杂含量变化：0.235％→0.112％，A杂含量变化：0.534％→0.252％(图8)。该方法精制的睾酮不符合EP10.1要求，且收率较低。
5.4异丙醇精制：
取酶催化方法合成的睾酮粗品(图5)10g，添加5～8倍体积的异丙醇(50～80mL)，搅拌下升温60℃至物料完全溶解。过滤除去变性蛋白收集滤液，按照睾酮质量向滤液中添加50～70％的纯净水(5～7mL)，减压浓缩溶剂至剩余2倍体积溶剂。
降温析晶直至大量固体析出，过滤收集睾酮精品，60℃烘干至恒重。
收率为90％，精制效果：K杂含量变化：0.235％→0.114％；A杂含量变化：0.534％→0.057％(图9)。该方法精制的睾酮符合EP10.1要求。
Claims (11)
1.一种生物法制备的睾酮粗品的精制方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）将干燥的睾酮粗品与醇混匀，升温至60℃以上，升温的同时进行搅拌和回流的处理，使所述睾酮粗品完全溶解并出现絮状变性蛋白沉淀；所述醇为甲醇或乙醇；所述睾酮粗品由细胞转化方法或酶催化方法制得，通过过滤收集；所述醇与睾酮粗品的体积质量比为：(5～8): 1；
（2）加入包含活性炭的助滤剂以吸附所述絮状变性蛋白沉淀；过滤收集滤液，滤饼上少量残留的睾酮用甲醇淋洗；所述包含活性炭的助滤剂为活性炭和硅藻土，或活性炭和纤维素；所述硅藻土和活性炭的用量比为1:1，所述纤维素和活性炭的用量比为3:5；所述包含活性炭的助滤剂与睾酮粗品的用量比为(4~5) : 15；
（3）滴加纯水，混匀后升温至60℃以上，浓缩并回收85wt%的醇溶液，所述纯水与睾酮粗品的体积质量比为 (5～10) : 6；搅拌降温至8℃以下析晶出大量固体，过滤收集滤饼；依次用乙醇和纯水淋洗，滤饼干燥后得睾酮精品；用于淋洗的纯水与睾酮粗品的体积质量比为(5～10) : 1。
2.如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述精制方法的条件选自以下的一种或多种：
i)步骤（1）~（3）中，所述过滤为抽滤；
ii)步骤（1）和（3）中，所述干燥为真空干燥。
3.如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（1）中，当所述醇为甲醇时，升温至70℃以上。
4.如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述吸附在恒温下搅拌进行。
5. 如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（2）中，所述甲醇与睾酮粗品的体积质量比为 (1～3) : 3。
6. 如权利要求5所述的精制方法，其特征在于，步骤（2）中，所述甲醇与睾酮粗品的体积质量比为2: 3。
7.如权利要求1~6任一项所述的精制方法，其特征在于，步骤（3）中，所述精制方法的条件选自以下组：
i)所述纯水与睾酮粗品的体积质量比为 5: 6；
ii)所述纯水的加入速度为2~10ml/min；
iii)用于淋洗的纯水与睾酮粗品的体积质量比为(6～7) : 1。
8.如权利要求7所述的精制方法，其特征在于，所述纯水的加入速度为5ml/min。
9.如权利要求8所述的精制方法，其特征在于，步骤（3）中，所述精制方法的条件选自以下组：
i)所述混匀在搅拌下进行；
ii)所述浓缩为减压浓缩；
iii)所述降温在搅拌下进行。
10.如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（3）中，所述精制方法的条件选自以下组：
i)所述乙醇为冷冻的乙醇；
ii)所述乙醇与睾酮的体积质量比为(0.5～2) : 3。
11.如权利要求10所述的精制方法，其特征在于，步骤（3）中，所述乙醇与睾酮的体积质量比为1:3。
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