CN114957082B - 一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用，为一种活细胞内酸性细胞器染料。目前市售的大部分溶酶体探针，其发射峰的位置普遍处于蓝光、黄光范围内，而荧光抗体或其他功能性荧光染料通常也出现在此波段，通常细胞内自发荧光位于蓝绿区，若荧光指示剂位于该波段或附近的紫外区波段会相互重叠，影响成像，为解决这一困境，本发明开发红光谱区的溶酶体染料，尤其能在较低的纳摩尔浓度下特异性的标记和追踪活细胞中的酸性细胞器。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用，为一种活细胞内酸性细胞器染料。
背景技术
溶酶体作为真核细胞中的一种细胞器，内含多种水解酶，不仅可以分解外源大分子物质，也可消化细胞自身的局部细胞质或细胞器。衰老的细胞中，程序性破裂的溶酶体释放出水解酶，使细胞被消化而死亡。
溶酶体的pH值低，并且溶酶体内的酶大多仅在这种酸性环境中发挥作用。溶酶体参与细胞中的物质代谢、生物体内循环、凋亡等多种生命活动。溶酶体具有高度动态的特性，其数量和形态的变化直接代表细胞所处的生命活动状态，溶酶体异常通常会引发多种疾病，如痛风、溶酶体贮积症、矽肺等。因此，着力溶酶体的研究分析，了解溶酶体参与生物活动的分子机制，对相关疾病的治疗具有重要的指导作用。为了实现其上述功能，所研发的探针首要要求就是对溶酶体特异性高、且对其生理功能干扰小。
商业化的溶酶体探针通过标记溶酶体膜来实现溶酶体定位分析，例如经典的LysoTracker系列，毫摩尔浓度下特异性标记酸性细胞器，实现了在荧光成像中进行溶酶体定位的功能。但是目前市售的大部分溶酶体探针，其发射峰的位置普遍处于蓝光、黄光范围内，而荧光抗体或其他功能性荧光染料通常也出现在此波段，这就给多色成像中需要染色溶酶体的实验人员在染料的波段选择上带来了较大难度。通常细胞内自发荧光位于蓝绿区，若荧光指示剂位于该波段或附近的紫外区波段会相互重叠，影响成像，因此为解决这一困境，需要开发新的发光溶酶体染料，可满足多通道荧光成像的需求。基于上述原因，开发红光谱区的溶酶体染料是比较理想的选择，但是现有技术未见此类探针的报道。
发明内容
本发明是一种红色荧光染料，其激发和发射波长在630-640/655-665nm处，可自由透过细胞膜，标记活细胞，且能在较低的纳摩尔浓度下特异性的标记和追踪活细胞中的酸性细胞器。本发明的另一特点是不需要像其他探针如二硝基苯（DNP）一样采用二抗检测，可以实现一步法染色，并特异性的标记活细胞内的酸性细胞器溶酶体，且在纳摩尔浓度水平快速导入的同时对细胞进行检测。同时，相较于其他溶酶体染料，本发明的染色效果更明显，且不易淬灭光学稳定性较好，可以在细胞中保留很长时间。由于本发明的激发发射波长更接近于近红外光谱，也可满足多色染色的需求。
本发明采用如下技术方案：
一种溶酶体靶向荧光探针，其具有以下化学结构式：
本发明公开了上述溶酶体靶向荧光探针的制备方法，将吲哚化合物与羟基环丁烯化合物反应，得到所述溶酶体靶向荧光探针；吲哚化合物的化学结构式如下结构式中的一种或两种：
、/>、/>
其中的取代基与溶酶体靶向荧光探针一致。
本发明中，羟基环丁烯化合物的化学结构式如下：
或者/>
本发明中，R1、R2独立的选自氢、烷基、醚基等；R3、R4独立的选自氢、烷基、烷基磺酸、烷基磺酸离子等。
上述技术方案中，烷基为直链烷基或者环烷基，烷基的碳原子数为1～20，优选2～15，进一步优选的，R1、R2中的烷基的碳原子数为2～6，R3、R4中的烷基的碳原子数为2～12。
上述技术方案中，醚基中的烷基的碳原子数为2～6，优选2～5，比如甲醚基、***基、甲***基等。
上述技术方案中，烷基磺酸为(CH2)nSO3H，n为1～10，优选2～8，进一步优选3～5。
上述技术方案中，烷基磺酸离子为(CH2)mSO3 -，m为1～10，优选2～8，进一步优选3～5。
上述技术方案中，溶酶体靶向荧光探针电价平衡，当其具有正电荷且不含烷基磺酸离子时，具有阴离子配位，具体阴离子配位为常规技术，比如卤素离子；如果含有烷基磺酸离子造成分子主体带有负电荷时，具有阳离子配位，具体阳离子配位为常规技术，比如钠离子。
上述技术方案中，吲哚化合物与羟基环丁烯化合物反应的温度为120～200℃，优选150～180℃，时间为2～6小时，优选3～5小时。
本发明公开了上述溶酶体靶向荧光探针作为溶酶体探针的应用，或者在制备溶酶体探针中的应用，或者在细胞显影中的应用，或者在制备细胞显影剂中的应用。
本发明公开了一种细胞显影方法，将细胞与上述溶酶体靶向荧光探针共培养，然后进行显影，完成细胞显影；优选的，共培养的时间为5～30分钟，优选10～25分钟，显影的操作为常规技术；溶酶体靶向荧光探针的浓度可低至纳摩尔，甚至低于0.05μM。作为示例，将生物细胞与本发明溶酶体靶向荧光探针共同培养15分钟，利用激光共聚焦显微镜或普通的荧光显微镜下即可进行显影，该方法操作简单快捷，便于观察，能较快得出结果。
本发明开发了一款新型红光溶酶体染料，这款产品具有靶向性能稳定、荧光强度高的优点，满足客户的多样化选择的需求。其激发和发射波长在630-640/655-665nm处，可自由透过细胞膜，标记活细胞，且能在较低的纳摩尔浓度下特异性的标记和追踪活细胞中的酸性细胞器。本发明的另一特点是不需要像其他探针如二硝基苯（DNP）一样采用二抗检测，可以实现一步法染色，并特异性的标记活细胞内的酸性细胞器溶酶体，且在纳摩尔浓度水平快速导入的同时对细胞内进行检测。同时，相较于其他溶酶体染料，本发明的染色效果更明显，且不易淬灭光学稳定性较好，可以在细胞中保留很长时间。
附图说明
图1为化合物1的质谱；
图2为化合物2的质谱；
图3为化合物3的质谱；
图4为化合物4的质谱；
图5为化合物5的质谱；
图6为化合物1的光谱数据，激发634nm，发射661nm；
图7为化合物1细胞显影图；
图8为化合物2细胞显影图；
图9为化合物3细胞显影图；
图10为化合物1和对照品共染图；
图11为化合物3细胞显影图；
图12为现有染料细胞显影图。
具体实施方式
本发明的原料为常规化合物，具体制备操作以及测试为常规技术。
实施例一
500 mL 反应瓶中加入9 g 4-二丙基氨甲基-苯胺，70 ml浓盐酸，搅拌，冷却至-10℃，滴加6.1 g亚硝酸钠溶于30 ml水的溶液，内温不高于-5℃，滴加完毕，搅拌30分钟，滴加预冷至5℃的32.6 g氯化亚锡二水合物的25 ml 浓盐酸（37wt%）溶液。滴加完毕后反应液-10℃ 搅拌1.5小时后升温至5℃反应18小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入异丙醇120ml，搅拌2小时，过滤，滤饼再用异丙醇洗涤一次，过滤，滤饼真空干燥得到产品11.2 g 中间体I。
在250 mL反应瓶中加入11.2 g 中间体I，11.3 g甲基异丙基甲酮 ，110 mL 乙酸，加热至120℃ ，反应2 小时，反应结束后冷却至室温，旋蒸除去溶剂，加入乙酸乙酯160 ml，纯水160 ml，搅拌30分钟后过滤，滤液分层，水相用120 ml乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸至干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷∶甲醇=96∶4（质量比），收集旋干，真空干燥得10.7g 中间体II 。
250 mL 反应瓶中加入10.7 g 中间体II，2.2 g 3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮，55 mL 甲苯，55 ml正丁醇，搅拌，加热至160℃ 反应4小时，反应结束后，停止加热，冷却至室温，析出固体，过滤，滤饼用***洗涤2次，收集滤饼，真空干燥得到最终产品6.1 g化合物1，质谱见图1。
实施例二
250 mL 反应瓶中加入5 g 4-二甲氧基氨甲基-苯胺，55 ml浓盐酸（37%），然后于-10℃滴加3.8 g亚硝酸钠溶于20 ml水的溶液，内温不高于-5℃，滴加完毕，搅拌30分钟，再滴加预冷至5℃的20.5 g氯化亚锡二水合物的18 ml 浓盐酸（37wt%）溶液。滴加完毕后反应液-10℃ 搅拌1.5小时后升温至5℃反应18小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入异丙醇75ml，搅拌2小时，过滤，滤饼再用异丙醇洗涤一次，过滤，滤饼真空干燥得到产品4.6 g 中间体I。
在100 mL反应瓶中加入4.6 g 中间体I，5.1 g甲基异丙基甲酮 ，50 mL 乙酸，于120℃反应2 小时，反应结束后冷却至室温，旋蒸除去溶剂，加入乙酸乙酯80 ml，纯水80ml，搅拌30分钟后过滤，滤液分层，水相用60 ml乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸至干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷∶甲醇=95∶5（质量比），收集旋干，真空干燥得4.1g 中间体II 。
在100 mL反应瓶中加入4.1 g 中间体II， 9.0 g 1,4-丁磺酸内酯，然后于130℃反应12小时，反应结束后冷却至室温，加入乙酸乙酯60 ml，加热回流，搅拌1 小时后冷却至室温，过滤，滤饼再次加入乙酸乙酯60ml，搅拌2 小时后过滤，收集滤饼，真空干燥得4.7 g中间体 III。
100 mL 反应瓶中加入4.7 g 中间体III，0.7 g 3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮 ，25 mL 甲苯，25 ml正丁醇，然后于160℃ 反应3小时，反应结束后，停止加热，冷却至室温，滴加0.6 ml 氢氧化钠水溶液（0.85 g/ml），搅拌30 分钟，析出固体，过滤，收集滤饼，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷∶甲醇=90∶10（质量比），收集旋干，真空干燥得最终产品2.5g化合物2。
根据实施例一或者实施例二，改变原料，可得到表1的化合物，具体为常规技术；图2为化合物2的质谱；图3为化合物3的质谱；图4为化合物4的质谱；图5为化合物5的质谱。
实施例三
图6为化合物1的光谱数据，激发634nm，发射661nm，为红色染料。
1. 溶酶体染色储液配制：取带盖广口瓶，加入10 mg化合物1粉末，加入20 mLDMSO溶液，用灭菌水稀释至紫外测OD为65（OD标准），得到溶酶体染色储液。
2．溶酶体染液染色细胞
（1）细胞准备：实验前一天铺细胞，96孔板的每孔100 μL铺1.5×104个hela细胞，即细胞浓度为1.5×105/mL，置于培养箱中用基础培养基（DMEM高糖液体培养基）培养过夜（37℃，5% CO2）；
（2）染色工作液配制：将上述配制好的溶酶体染色储液用基础培养基按照1:20000的质量比例稀释得染色工作液，并37℃预热待用；此时化合物1的浓度为2.5X10-5 mg/mL（0.04μmol/L）；
（3）染色：去除细胞培养基，1×PBS 清两次后，每孔加入100 μL染色工作液，37℃避光孵育15分钟；完成后吸出染液，用1×PBS清洗三次，最后加50 μL1×PBS防止细胞干掉，荧光显微镜观察，见图7。
实施例四
1. 溶酶体染色储液配制：取带盖广口瓶，加入10 mg化合物2粉末，加入20 mLDMSO溶液，用灭菌水稀释至紫外测OD为65（OD标准），得到溶酶体染色储液。
2．溶酶体染液染色细胞
（1）细胞准备：实验前一天铺细胞，96孔板的每孔100 μL铺1.5×104个hela细胞，置于培养箱中用基础培养基（DMEM高糖液体培养基）培养过夜（37℃，5% CO2）；
（2）染色工作液配制：将上述配制好的溶酶体染色储液用基础培养基稀释得染色工作液，并37℃预热待用；此时化合物2的浓度为0.027μmol/L；
（3）染色：去除细胞培养基，1×PBS 清两次后，每孔加入100 μL染色工作液，37℃避光孵育10分钟；完成后吸出染液，用1×PBS清洗三次，最后加50 μL1×PBS防止细胞干掉，荧光显微镜观察，见图8。
实施例五
1. 溶酶体染色储液配制：取带盖广口瓶，加入10 mg化合物3粉末，加入20 mLDMSO溶液，用灭菌水稀释至紫外测OD为65（OD标准），得到溶酶体染色储液。
2．溶酶体染液染色细胞
（1）细胞准备：实验前一天铺细胞，96孔板的每孔100 μL铺1.5×104个hela细胞，置于培养箱中用基础培养基（DMEM高糖液体培养基）培养过夜（37℃，5% CO2）；
（2）染色工作液配制：将上述配制好的溶酶体染色储液用基础培养基稀释得染色工作液，并37℃预热待用；此时化合物3的浓度为0.046μmol/L；
（3）染色：去除细胞培养基，1×PBS 清两次后，每孔加入100 μL染色工作液，37℃避光孵育15分钟；完成后吸出染液，用1×PBS清洗三次，最后加50 μL1×PBS防止细胞干掉，荧光显微镜观察，见图9。
实施例六
按照实施案例三的方案，先行对目的细胞用化合物1进行染色，然后用PBS缓冲液进行清洗，再次用市售的LysoTracker™ Green DND-26 （InvitrogenTM Catalog number:L7526）按照其操作说明进行共定位染色，结果显示化合物1和购买的对照品是同一个功能（红色和绿色共染之后显示黄色），参见图10。
实施例七
按照实施例五的具体操作方案进行平行实验，染色工作液的浓度为50nM，化合物3和现有高性能染料LysoTracker™ Deep Red （Catalog number: L12492）的染色结果分别见图11以及图12，可以看出，同浓度染色液下，本发明化合物作为染料具有明显高的亮度。
现有技术公开的溶酶体探针都以蓝光、黄光为主，本发明是一种红色荧光染料，可自由透过细胞膜，标记活细胞，且能在较低的纳摩尔浓度下特异性的标记和追踪活细胞中的酸性细胞器，可以实现一步法染色，并特异性的标记活细胞内的酸性细胞器溶酶体，且在纳摩尔浓度水平快速导入，对细胞进行检测。同时，相较于其他溶酶体染料，本发明的染色效果更明显，且不易淬灭光学稳定性较好，可以在细胞中保留很长时间。由于本发明的激发发射波长更接近于近红外光谱，也可满足多色染色的需求。
Claims (7)
1.一种溶酶体靶向荧光探针，其为以下化学结构式中的一种：
；
其中，R1、R2独立的选自氢、烷基、醚基；R3、R4独立的选自氢、烷基、烷基磺酸、烷基磺酸离子；
R1、R2中的烷基的碳原子数为2～6，R3、R4中的烷基的碳原子数为2～12；醚基中的烷基的碳原子数为2～6；烷基磺酸为(CH2)nSO3H，n为2～8；烷基磺酸离子为(CH2)mSO3 -，m为2～8。
2.根据权利要求1所述溶酶体靶向荧光探针，其特征在于，所述溶酶体靶向荧光探针具有配位离子，或者不具有配位离子。
3.权利要求1所述溶酶体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于，将吲哚化合物与羟基环丁烯化合物反应，得到所述溶酶体靶向荧光探针；所述吲哚化合物的化学结构式如下结构式中的一种或两种：
、/>、/>。
4.根据权利要求3所述溶酶体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于，吲哚化合物与羟基环丁烯化合物反应的温度为120～200℃，时间为2～6小时。
5.权利要求1所述溶酶体靶向荧光探针在制备溶酶体探针中的应用。
6.权利要求1所述溶酶体靶向荧光探针在制备细胞显影剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，细胞显影为红光显影。
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