CN114941004A

CN114941004A - 一种高效降解pet塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114941004A
Application number: CN202210400007.7A
Authority: CN
Inventors: 金延铭; 霍玉亮; 陈思哲; 顾沛航; 李喜明; 孜力汗; 徐丽; 孔凡涛; 李宗奇; 周文婧; 杨君; 薛闯; 迟占有
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2022-04-15
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2022-08-26

Abstract

本发明公开了一种高效降解PET塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用，属于生物技术领域。所述工程酶复合物由RIAD和RIDD、IsPETase、MHETase和hydrophobin4组成，通过RIAD与RIDD的体外特异性高强度结合，使IsPETase、MHETase和hydrophobin4在空间距离上拉近，其中MHETase可以降解导致IsPETase底物抑制的MHET，hydrophobin4将复合物牵引向PET塑料表面，从而显著改善了IsPETase的降解环境。本发明提供的工程酶复合物可以高效常温地降解PET塑料，其降解效率比目前经过定向进化的降解速率最高的IsPETase高5倍左右。

Description

一种高效降解PET塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效降解PET塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用。

背景技术

2016年，吉田等人报道了细菌Ideonella sakaiensis 201-F6，该细菌进化了一种双酶***，可将PET塑料解构为TPA和EG分子，这些分子可以被有效地分解为细胞的碳和能源，对该双酶***的进一步研究表明，IsPETase酶是一种类似角质酶的丝氨酸水解酶，在所有先前发现的PET降解酶中，它在温和温度下攻击PET塑料聚合物的效率最高，宏基因组衍生的叶枝堆肥角质酶(LCC)对低结晶度PET薄膜降解表现出更高的活性。然而，LCC由于成本高，应用最适温度在72℃左右，仍然不能普遍适用，这极大地限制了其在工程菌生物降解***中的进一步应用。此外，通过LCC 产生的PET降解中间体MHET的百分比接近60％，由于在LCC应用温度下可能丧失 MHETase酶活性，无法有效去除。与LCC相比，IsPETase和MHETase共存***中的 MHET去除效率接近100％。与IsPETase相比，LCC在30℃下对PET薄膜和高结晶度PET底物的酶活性降低了近5.5倍和4倍。IsPETase在低温下对PET薄膜的活性明显高于其他PET降解酶，包括TfH、LCC和FsC。并且在IsPETase蛋白的合理进化方面做出了更多努力，这些工作大大提高了酶IsPETase的热稳定性，其Tm值增加了8.81℃，在40℃时反应活性增加了约14倍，其活性比从细菌HR29中分离的LCC 和BhrPETase更高。在后来的研究中发现IsPETase和MHETase在将无定形PET薄膜转化为单体的过程中具有高度协同关系，从而有效地加速了PET的降解。然而，由于蛋白质融合、抑制作用和中间体扩散引起的酶损失对双酶***降解PET塑料的效率提升仍然有非常大的限制。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效降解PET塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用，本发明提供的工程酶复合物同时具有PET水解酶和 MHET水解酶活性，IsPETase酶可将PET塑料从高聚物状态降解到寡聚物或低聚物状态，MHETase酶可将寡聚物或低聚物状态降解为对苯二甲酸和乙二醇单体，从而实现对PET塑料的完全降解。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于降解PET塑料的工程酶复合物的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的RIDD-IsPETase的编码基因片段、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的RIDD-MHETase的编码基因片段和氨基酸序列如 SEQ ID NO.3所示的RIAD-hydrophobin4的编码基因片段依次连接到质粒载体中，得到重组载体；

(2)将步骤(1)得到的重组载体转化E.coli BL21菌株，筛选并测序验证得到阳性菌株；

(3)挑取步骤(2)得到的阳性菌株接种培养基中培养后，添加IPTG诱导蛋白表达；

(4)裂解步骤(3)得到的菌体，获得用于降解PET塑料的工程酶复合物。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中RIDD-IsPETase的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，RIDD-MHETase的编码基因片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示，RIAD-hydrophobin4的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中质粒载体包括pET28a。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中RIDD-IsPETase的编码基因片段、 RIDD-MHETase的编码基因片段、RIAD-hydrophobin4的编码基因片段通过无缝克隆试剂盒连接到质粒载体中。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述筛选的具体过程为，将转化后的E.coli BL21菌株涂布到同时添加氨苄青霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体培养基中，挑选单菌落。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中接种量为培养基体积的1～10％。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述培养基为LB液体培养基。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中培养条件为30～38℃恒温摇床中培养18～48h。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中培养8～15h后添加IPTG诱导蛋白表达，IPTG的终浓度为1mM。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中所述裂解的方法包括高压均质破碎法、超声波破碎法、球磨破碎法、反复冻融破碎法和酶溶破碎法。

本发明另一方面提供上述制备方法制得的用于降解PET塑料的工程酶复合物。

本发明还提供上述的用于降解PET塑料的工程酶复合物在降解PET塑料和PET 塑料回收方面的应用。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

本发明的工程酶复合物由RIAD和RIDD、IsPETase、MHETase和hydrophobin4 组成，通过RIAD与RIDD的体外特异性高强度结合，使IsPETase、MHETase和 hydrophobin4在空间距离上拉近，其中MHETase可以降解导致IsPETase底物抑制的 MHET，hydrophobin4将复合物牵引向PET塑料表面，而非分散在水中，通过随机碰撞引发反应，因此显著改善了IsPETase的降解环境。通过TPA产量检测的定量测试，本发明提供的工程酶复合物可以高效常温地降解PET塑料，其降解效率比目前经过定向进化的降解速率最高的IsPETase高5倍左右，本发明为后续的酶复合物高效降解 PET塑料和PET塑料生物回收产业化带来希望。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为本发明的用于降解PET塑料的工程酶复合物的质粒pET28a-PD-MD-hA构建过程。

图2为本发明用于降解PET塑料的工程酶复合物对PET塑料板的降解效果的扫描电子显微镜图，其中，(a)：在E.coli BL21中处理的PET塑料片，(b)：在E.coli BL21/pET28a-MD制备的酶液中处理的PET塑料片，(c)：在E.coli BL21/pET28a-PD 制备的酶液中处理的PET塑料片，(d)：在E.coli BL21/pET28a-PD-MD-hA制备的酶液中处理的PET塑料片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1

本发明设计了一种高效降解PET塑料的工程酶复合物，是一个复杂的多域蛋白质，由A激酶锚定蛋白锚定结构域的两亲性螺旋(RIAD)和蛋白激酶N端的44个氨基酸(RIDD)短肽标签、IsPETase酶和MHETase酶以及疏水蛋白组成，其中，IsPETase 酶具有将聚合物PET塑料解构为MHET分子的功能，MHETase酶具有将MHET解构为TPA分子的功能，IsPETase酶和MHETase酶在靠近位置具有高度协同的关系，疏水蛋白是一种小型真菌蛋白，与IsPETase酶融合后，具有粘附PET聚合物和改变 PET的物理化学性质以改善降解的功能；RIDD肽来源于cAMP依赖性蛋白激酶 (PKA)，RIAD肽来源于A激酶锚定蛋白(AKAP)，RIAD肽能够以强亲和力特异性结合RIDD二聚体(RIDD二聚体和RIAD肽之间的KD为1.2nM)。使用RIAD肽和 RIDD肽作为我们高效降解PET塑料的工程酶复合物组装的理想蛋白质结合模块，具有如下优势：(1)微小的尺寸(RIDD肽为44个氨基酸，RIAD肽为18个氨基酸)，当与这些肽融合时，最大限度地减少对酶结构和活性的干扰，(2)RIDD二聚体和 RIAD肽的强结合亲和力以确保整个酶复合物在环境中的稳定性。

实施例2

本发明提供实施例1中的用于降解PET塑料的工程酶复合物的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)设计核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RIDD-IsPETase基因片段(PD)，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RIDD-MHETase的基因片段(MD)，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的RIAD-hydrophobin4的基因片段(hA)，交给金斯瑞集团合成 pET28a-PD,pET28a-MD,pET28a-hA三个质粒，将所获得的质粒进行PCR扩增，分别得到PD片段、MD片段、hA片段；

(2)使用北京全式金无缝克隆试剂盒，将所述PD片段、MD片段和hA片段加入2xAssembly Mix和经过PCR得到的线性化载体pET28a(***位点为NcoⅠ和Xho Ⅰ)进行无缝克隆连接，得到可以同时表达三种蛋白的质粒pET28a-PD-MD-hA(图1)，这些酶合成的基因片段PD、MD和hA整合到一个质粒中，并使用相同的启动子、乳糖操纵子、RBS和终止子来调节这三个目标基因；

(3)将质粒pET28a-PD-MD-hA转化至E.coli DH5α表达菌株中，培养后提取质粒，得到纯净的pET28a-PD-MD-hA质粒，将得到的重组表达载体pET28a-PD-MD-hA 转化至E.coli BL21表达菌株中，涂布到同时添加氨苄青霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体培养基中，挑选单菌落，测序验证正确后，将所得重组表达菌株接种于LB 液体培养基中，于摇床37℃恒温培养12小时后，添加终浓度为1mM IPTG诱导蛋白表达16h，收集重组菌；

(4)用超声波裂解步骤(3)收集的重组菌后在4℃，12000rpm下离心30min，取上清液即获得用于降解PET塑料的工程酶复合物的粗酶液。

其中，RIDD-IsPETase的氨基酸序列(SEQ ID NO.1所示)具体为： GGGGSGGGGSGGGGCGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREY FERLEKEEAKMSHMRGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAG GTVGAIAIVPGYTARQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPESRSSQQMAALR QVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWHS STNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSN QALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTAVSDFRTANCSLHHHHHH。

RIDD-MHETase的氨基酸序列(SEQ ID NO.2所示)具体为： MPVPLASRAACEALKDGNGDMVWPNAATVVEVAAWRDAAPATASAAALPEHCEV SGAIAKRTGIDGYPYEIKFRLRMPAEWNGRFFMEGGSGTNGSLSAATGSIGGGQIAS ALSRNFATIATDGGHDNAVNDNPDALGTVAFGLDPQARLDMGYNSYDQVTQAGK AAVARFYGRAADKSYFIGCSEGGREGMMLSQRFPSHYDGIVAGAPGYQLPKAGISG AWTTQSLAPAAVGLDAQGVPLINKSFSDADLHLLSQAILGTCDALDGLADGIVDNY RACQAAFDPATAANPANGQALQCVGAKTADCLSPVQVTAIKRAMAGPVNSAGTPL YNRWAWDAGMSGLSGTTYNQGWRSWWLGSFNSSANNAQRVSGFSARSWLVDFA TPPEPMPMTQVAARMMKFDFDIDPLKIWATSGQFTQSSMDWHGATSTDLAAFRDR GGKMILYHGMSDAAFSALDTADYYERLGAAMPGAAGFARLFLVPGMNHCSGGPG TDRFDMLTPLVAWVERGEAPDQISAWSGTPGYFGVAARTRPLCPYPQIARYKGSGD INTEANFACAAPPGGGGSGGGGSGGGGSSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTAR PERPMAFLREYFERLEKEEALEHHHHHHGGGGSGGGGSGGGGCGSLRECELYVQK HNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK。

RIAD-hydrophobin4的氨基酸序列(SEQ ID NO.3所示)具体为： GGGGSGGGGSGGGGCGLEQYANQLADQIIKEATEGCMGMKYLLPTAAAGLLLLAA QPTMAGLEQYANQLADQIIKEATEGCSGGGSGGGSGGGMQYSAIVALFATLAVAAP AQEAAADIAILDGPCTAGVTNNIPMCCGSGILDLLYLDCETPTQATSVLNPLSAVCG RVGLQAKCCTLGIADLGVLCQDALPEAEAAAKEAAAKEAAAKA。

RIDD-IsPETase基因片段(SEQ ID NO.4所示)的核苷酸序列具体为： ggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtagcctgcgtgaatgtgaactgtatgttcagaaacataata ttcaggccctgctgaaagatagcattgttcagctgtgtaccgcacgtccggaacgtccgatggcatttctgcgcgaatattttgaacg tctggaaaaagaagaagccaaaatgtctcatatgcgtggcccgaaccccactgccgcatctctggaagcgtctgcgggccccttta ctgtacgcagttttactgtgagccggccgagcgggtatggcgcgggaaccgtctactatccgacaaatgcaggcggtacagtagg agctatcgcgatcgttccgggatatacagcacgtcagtcaagcatcaaatggtggggccctcgtctggcgagtcatggctttgtcgt tataactattgatactaatagtacgctggaccagccagaaagcagaagctcacaacagatggccgcgctccgtcaggttgcctccc ttaatggaaccagtagcagcccgatttatggcaaggtcgacaccgcccggatgggcgttatgggttggagtatgggtgggggcg gctctctgataagtgcagctaataatccttctctcaaagcagccgctccacaggcaccatggcactcgtccacgaatttcagctcagt gaccgtgccgaccctgatcttcgcgtgcgaaaatgactctatcgcaccagtaaattcctccgcattgcctatttatgattcaatgagca gaaatgccaagcaattcctcgagatcaatgggggttcgcactcatgtgcaaacagcggaaattctaatcaagctcttatcggtaaga aaggtgtggcatggatgaagcgttttatggacaacgacacgcgttattccacctttgcttgtgagaatcccaattcaacagcagttag cgattttagaaccgctaattgcagcttgcaccaccaccaccaccactga。

RIDD-MHETase基因片段(SEQ ID NO.5所示)的核苷酸序列具体为：

atgccggtaccgcttgcgagccgtgccgcgtgcgaggccttgaaggacggtaatggcgatatggtttggccgaatgcggc gaccgtcgtggaagtagcagcctggcgtgatgcggcgccggcaaccgcttctgcggctgctctgcctgagcactgcgaggtgtc cggcgcaatcgccaaacggacaggtatcgacggctacccgtatgagatcaagttccgtttgcgcatgccagcggaatggaatggt cgtttctttatggaaggtggttccggcaccaatggttccttatccgccgcaactggttctattggtggcggtcagatcgcaagcgcctt gtctcgcaactttgcgacgattgcgaccgacggcggtcatgataatgctgtcaacgacaacccggatgcgctgggtacggttgcat tcggcctcgacccccaggcgcgtttagacatgggttataacagctacgaccaggtgacccaagcgggcaaggccgcggttgccc gtttctatggtcgtgcagcggataaatcctatttcatcggctgctcggaaggtggtcgtgagggcatgatgctctctcagcgttttccg agccattatgatggcatcgtggcaggcgcgccaggttaccagctgccgaaagcaggtattagcggggcctggaccacccaatcc ctggctccggcagcggtgggcttggacgcgcaaggcgttccgcttatcaacaagagcttctccgatgcggacctccacctgctgt cgcaagccattctgggcacctgtgatgcgttggacggcttggcggacggcatcgtggataactatcgtgcctgccaggcggcgtt cgacccggcgacggctgcgaacccggcgaacggccaagcgctgcagtgtgttggtgctaagaccgcagactgtctgtcaccgg tgcaagtcaccgcaattaagcgcgctatggcaggtccggtgaacagcgcaggtaccccgctgtacaatcgttgggcttgggatgc aggcatgtccggcctgtctggcacgacgtacaaccagggttggcgtagctggtggctgggtagctttaacagcagtgcgaacaac gcgcaacgtgttagcggtttcagcgcacgtagctggctggtggacttcgccactccgcctgagccgatgccgatgacccaggttg ccgcccgcatgatgaaattcgactttgacatcgatccgctcaagatctgggcaacgagcggccaatttacccagtcgagcatggat tggcacggtgcgaccagcaccgacctggcggcgttccgcgatcgtggtggtaaaatgattctgtaccacggcatgagtgatgctg cgtttagcgctctggacaccgccgactattacgagcgcctgggtgccgctatgccaggcgctgcgggctttgcgcgtttgtttctgg ttccgggtatgaatcattgtagcggcggaccgggtactgaccgtttcgacatgctgaccccgttggtcgcgtgggttgaacgcggt gaagcgccagatcagatcagcgcgtggtcaggcacgccgggttactttggtgttgcagcccgcacccgtccgttgtgcccgtacc cgcaaatcgcgcgttataaaggttctggtgatattaacaccgaagcgaacttcgcgtgcgcagcgccaccgggcggcggcggttc tggtgggggtggttcgggtggaggcggcagcagcctgagagagtgcgagctgtacgtgcagaaacacaatattcaggcacttct gaaggatagcattgttcagttatgcaccgctcgtcccgagcgcccgatggcgttcctgcgcgagtattttgaacgtctggaaaaaga agaagccctcgagcaccaccaccaccaccactgaggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtagc ctgcgtgaatgtgaactgtatgttcagaaacataatattcaggccctgctgaaagatagcattgttcagctgtgtaccgcacgtccgg aacgtccgatggcatttctgcgcgaatattttgaacgtctggaaaaagaagaagccaaa。

RIAD-hydrophobin4的基因片段(SEQ ID NO.6所示)的核苷酸序列具体为 ggtggtggtggttcaggtggtggtggttcaggtggtggtggttgtggtctggaacagtatgcaaatcagctggcagatcagattatc aaagaagcaaccgaaggttgcatgggcatgaaatatttactacccacagcagctgcgggcttgctcttgttggctgctcaaccgac gatggcaggcctggaacagtacgcaaatcagctggcggaccagattatcaaagaggcgacggaaggttgcagcggtggcggct ccggcggcggttctggcggtggtatgcagtatagcgcgatcgtggccctgtttgcaaccctggcggtggcggccccagcgcaag aagcggctgctgacatcgcaattctggatggtccgtgtaccgcaggtgttaccaacaacattccgatgtgctgcggtagcgggatc ttagatttgctgtatctggactgtgaaaccccgacccaggccacttcagttttgaatccgctgtcggcggtctgtggtcgtgttggtct gcaagcgaagtgctgcaccctgggtattgcagacctgggcgtgctttgccaggatgcactgccggaagccgaggctgcggcga aagaggcggcggctaaagaggcggctgccaaggcg。

对比例1

为了更好的比较工程酶复合物对塑料的降解速率，本发明还单独构建了用于降解PET塑料的工程酶单酶(IsPETase)。IsPETase基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.7 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)，并按照与实施例2类似的方法构建了 pET28a-PD质粒，转化到E.coli DH5α菌株中，得到纯净的pET28a-PD质粒。再按照实施例2同样的步骤将质粒导入E.coli BL21菌株中得到重组菌。同理，用超声波裂解重组菌后在4℃，12000rpm下离心30min，取上清液即获得用于降解PET塑料的工程酶单酶(IsPETase)的粗酶液。

IsPETase的基因片段(SEQ ID NO.7所示)的核苷酸序列具体为： Tctcacatgcgtggtccgaacccgacagccgcgtccttggaggcaagcgctggcccatttacggtgcgtagcttcaccgtaagcc gcccatccggttacggcgccggcactgtctattacccgaccaacgcaggcggcacggtgggtgcaattgcgattgttccgggtta caccgcgcgtcaaagcagcatcaagtggtggggtccgcgtctggcaagccacggttttgttgtcattaccatcgataccaactcca cccttgatcagccggaaagccgctcttctcaacagatggcagcgctgcgccaggttgcgtctttgaatggtacttctagttctccgat ctatggtaaggtggacaccgcgcgtatgggcgttatgggttggtcaatgggtggcggtggctctttgatcagcgctgcgaacaacc cgagcctgaaggctgccgctccgcaggcgccttggcatagctccacgaacttcagctcagttaccgtgccgaccctgatcttcgc gtgcgagaacgacagcatcgcaccggttaattcgtctgctttaccgatttacgactccatgagccgcaacgccaaacaatttctgga gatcaacggtggcagccacagctgtgcgaacagcggaaacagcaatcaagcgctgattggtaagaaaggtgttgcatggatgaa acgttttatggataatgacacccgttacagcaccttcgcctgcgaaaatccgaatagcacggctgtgtcggattttcgtaccgcgaac tgcagcctcctcgagcaccaccaccaccaccactga。

IsPETase的氨基酸序列(SEQ ID NO.8所示)具体为：

SHMRGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGY TARQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPESRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPI YGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWHSSTNFSSVTVPTLI FACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAW MKRFMDNDTRYSTFACENPNSTAVSDFRTANCSLLEHHHHHH。

实施例3

将结晶度为12％的PET塑料片(仅作科学研究)切割成5mm*5mm的碎片(每个碎片0.07g)分别与实施例2和对比例1获得的用于降解PET塑料的工程酶复合物和用于降解PET塑料的工程酶单酶(IsPETase)加入到1.5mL EP管中混匀(采用考马斯亮蓝R250测定蛋白浓度，并分别将两种酶液稀释浓度至0.1mg/mL)，将反应混合物在37℃下培养7天。7天后，通过紫外分光光度法检测降解产物对苯二甲酸 (TPA)，确定PET降解效率。

7天后在1.5mL(0.1mg/mL)工程酶复合物酶液中降解结晶度为12％的5mm*5mm 的PET塑料片得到了0.00135mmol对苯二甲酸(TPA)，较工程酶单酶(IsPETase) 粗酶液降解效率提高到大约5倍。

采用扫描电子显微镜观察上述PET降解实验结束后工程酶复合物和工程酶单酶(IsPETase)对PET塑料板的降解效果，并同时考察相同条件下在E.coli BL21中、在E.coliBL21/pET28a-MD制备的酶液中处理的PET塑料片的降解效果，结果如图2 所示。本发明用于PET塑料降解的工程酶复合物在PET塑料板上的效果明显优于单独使用IsPETase，单独使用IsPETase只会在塑料板表面造成划痕，然而，本发明的工程酶复合物造成了更严重的划痕，甚至产生了许多深孔，说明本发明的工程酶复合物具有比单独的IsPETase更优异的活性。

综上所述，本发明提供的用于PET塑料降解的工程酶复合物同时具有PET水解酶和MHET水解酶活性，IsPETase酶可将PET塑料从高聚物状态降解到寡聚物或低聚物状态，MHETase酶可将寡聚物或低聚物状态降解为苯二甲酸和乙二醇单体，从而实现对PET塑料的完全降解。本发明为PET塑料的完全降解提供了有效的生物降解途径，其具有影响深远的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 一种高效降解PET塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用

<130> 20220413

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Glu Cys Glu Leu Tyr Val Gln Lys His Asn Ile Gln Ala

20 25 30

Leu Leu Lys Asp Ser Ile Val Gln Leu Cys Thr Ala Arg Pro Glu Arg

35 40 45

Pro Met Ala Phe Leu Arg Glu Tyr Phe Glu Arg Leu Glu Lys Glu Glu

50 55 60

Ala Lys Met Ser His Met Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Ala Gly Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg

85 90 95

Pro Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly

100 105 110

Gly Thr Val Gly Ala Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln

115 120 125

Ser Ser Ile Lys Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val

130 135 140

Val Ile Thr Ile Asp Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Glu Ser Arg

145 150 155 160

Ser Ser Gln Gln Met Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly

165 170 175

Thr Ser Ser Ser Pro Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly

180 185 190

Val Met Gly Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala

195 200 205

Asn Asn Pro Ser Leu Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp His Ser

210 215 220

Ser Thr Asn Phe Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys

225 230 235 240

Glu Asn Asp Ser Ile Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr

245 250 255

Asp Ser Met Ser Arg Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly

260 265 270

Ser His Ser Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly

275 280 285

Lys Lys Gly Val Ala Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg

290 295 300

Tyr Ser Thr Phe Ala Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Ala Val Ser Asp

305 310 315 320

Phe Arg Thr Ala Asn Cys Ser Leu His His His His His His

325 330

<210> 2

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Val Pro Leu Ala Ser Arg Ala Ala Cys Glu Ala Leu Lys Asp

1 5 10 15

Gly Asn Gly Asp Met Val Trp Pro Asn Ala Ala Thr Val Val Glu Val

20 25 30

Ala Ala Trp Arg Asp Ala Ala Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Leu

35 40 45

Pro Glu His Cys Glu Val Ser Gly Ala Ile Ala Lys Arg Thr Gly Ile

50 55 60

Asp Gly Tyr Pro Tyr Glu Ile Lys Phe Arg Leu Arg Met Pro Ala Glu

65 70 75 80

Trp Asn Gly Arg Phe Phe Met Glu Gly Gly Ser Gly Thr Asn Gly Ser

85 90 95

Leu Ser Ala Ala Thr Gly Ser Ile Gly Gly Gly Gln Ile Ala Ser Ala

100 105 110

Leu Ser Arg Asn Phe Ala Thr Ile Ala Thr Asp Gly Gly His Asp Asn

115 120 125

Ala Val Asn Asp Asn Pro Asp Ala Leu Gly Thr Val Ala Phe Gly Leu

130 135 140

Asp Pro Gln Ala Arg Leu Asp Met Gly Tyr Asn Ser Tyr Asp Gln Val

145 150 155 160

Thr Gln Ala Gly Lys Ala Ala Val Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Ala Ala

165 170 175

Asp Lys Ser Tyr Phe Ile Gly Cys Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly Met

180 185 190

Met Leu Ser Gln Arg Phe Pro Ser His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Gly

195 200 205

Ala Pro Gly Tyr Gln Leu Pro Lys Ala Gly Ile Ser Gly Ala Trp Thr

210 215 220

Thr Gln Ser Leu Ala Pro Ala Ala Val Gly Leu Asp Ala Gln Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ile Asn Lys Ser Phe Ser Asp Ala Asp Leu His Leu Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Ile Leu Gly Thr Cys Asp Ala Leu Asp Gly Leu Ala Asp Gly

260 265 270

Ile Val Asp Asn Tyr Arg Ala Cys Gln Ala Ala Phe Asp Pro Ala Thr

275 280 285

Ala Ala Asn Pro Ala Asn Gly Gln Ala Leu Gln Cys Val Gly Ala Lys

290 295 300

Thr Ala Asp Cys Leu Ser Pro Val Gln Val Thr Ala Ile Lys Arg Ala

305 310 315 320

Met Ala Gly Pro Val Asn Ser Ala Gly Thr Pro Leu Tyr Asn Arg Trp

325 330 335

Ala Trp Asp Ala Gly Met Ser Gly Leu Ser Gly Thr Thr Tyr Asn Gln

340 345 350

Gly Trp Arg Ser Trp Trp Leu Gly Ser Phe Asn Ser Ser Ala Asn Asn

355 360 365

Ala Gln Arg Val Ser Gly Phe Ser Ala Arg Ser Trp Leu Val Asp Phe

370 375 380

Ala Thr Pro Pro Glu Pro Met Pro Met Thr Gln Val Ala Ala Arg Met

385 390 395 400

Met Lys Phe Asp Phe Asp Ile Asp Pro Leu Lys Ile Trp Ala Thr Ser

405 410 415

Gly Gln Phe Thr Gln Ser Ser Met Asp Trp His Gly Ala Thr Ser Thr

420 425 430

Asp Leu Ala Ala Phe Arg Asp Arg Gly Gly Lys Met Ile Leu Tyr His

435 440 445

Gly Met Ser Asp Ala Ala Phe Ser Ala Leu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr

450 455 460

Glu Arg Leu Gly Ala Ala Met Pro Gly Ala Ala Gly Phe Ala Arg Leu

465 470 475 480

Phe Leu Val Pro Gly Met Asn His Cys Ser Gly Gly Pro Gly Thr Asp

485 490 495

Arg Phe Asp Met Leu Thr Pro Leu Val Ala Trp Val Glu Arg Gly Glu

500 505 510

Ala Pro Asp Gln Ile Ser Ala Trp Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Phe Gly

515 520 525

Val Ala Ala Arg Thr Arg Pro Leu Cys Pro Tyr Pro Gln Ile Ala Arg

530 535 540

Tyr Lys Gly Ser Gly Asp Ile Asn Thr Glu Ala Asn Phe Ala Cys Ala

545 550 555 560

Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

565 570 575

Gly Ser Ser Leu Arg Glu Cys Glu Leu Tyr Val Gln Lys His Asn Ile

580 585 590

Gln Ala Leu Leu Lys Asp Ser Ile Val Gln Leu Cys Thr Ala Arg Pro

595 600 605

Glu Arg Pro Met Ala Phe Leu Arg Glu Tyr Phe Glu Arg Leu Glu Lys

610 615 620

Glu Glu Ala Leu Glu His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser

625 630 635 640

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ser Leu Arg Glu Cys

645 650 655

Glu Leu Tyr Val Gln Lys His Asn Ile Gln Ala Leu Leu Lys Asp Ser

660 665 670

Ile Val Gln Leu Cys Thr Ala Arg Pro Glu Arg Pro Met Ala Phe Leu

675 680 685

Arg Glu Tyr Phe Glu Arg Leu Glu Lys Glu Glu Ala Lys

690 695 700

<210> 3

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly

1 5 10 15

Leu Glu Gln Tyr Ala Asn Gln Leu Ala Asp Gln Ile Ile Lys Glu Ala

20 25 30

Thr Glu Gly Cys Met Gly Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala

35 40 45

Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Thr Met Ala Gly Leu Glu Gln

50 55 60

Tyr Ala Asn Gln Leu Ala Asp Gln Ile Ile Lys Glu Ala Thr Glu Gly

65 70 75 80

Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Gln Tyr

85 90 95

Ser Ala Ile Val Ala Leu Phe Ala Thr Leu Ala Val Ala Ala Pro Ala

100 105 110

Gln Glu Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Leu Asp Gly Pro Cys Thr Ala

115 120 125

Gly Val Thr Asn Asn Ile Pro Met Cys Cys Gly Ser Gly Ile Leu Asp

130 135 140

Leu Leu Tyr Leu Asp Cys Glu Thr Pro Thr Gln Ala Thr Ser Val Leu

145 150 155 160

Asn Pro Leu Ser Ala Val Cys Gly Arg Val Gly Leu Gln Ala Lys Cys

165 170 175

Cys Thr Leu Gly Ile Ala Asp Leu Gly Val Leu Cys Gln Asp Ala Leu

180 185 190

Pro Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

195 200 205

Ala Lys Ala

210

<210> 4

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttgtggtag cctgcgtgaa 60

tgtgaactgt atgttcagaa acataatatt caggccctgc tgaaagatag cattgttcag 120

ctgtgtaccg cacgtccgga acgtccgatg gcatttctgc gcgaatattt tgaacgtctg 180

gaaaaagaag aagccaaaat gtctcatatg cgtggcccga accccactgc cgcatctctg 240

gaagcgtctg cgggcccctt tactgtacgc agttttactg tgagccggcc gagcgggtat 300

ggcgcgggaa ccgtctacta tccgacaaat gcaggcggta cagtaggagc tatcgcgatc 360

gttccgggat atacagcacg tcagtcaagc atcaaatggt ggggccctcg tctggcgagt 420

catggctttg tcgttataac tattgatact aatagtacgc tggaccagcc agaaagcaga 480

agctcacaac agatggccgc gctccgtcag gttgcctccc ttaatggaac cagtagcagc 540

ccgatttatg gcaaggtcga caccgcccgg atgggcgtta tgggttggag tatgggtggg 600

ggcggctctc tgataagtgc agctaataat ccttctctca aagcagccgc tccacaggca 660

ccatggcact cgtccacgaa tttcagctca gtgaccgtgc cgaccctgat cttcgcgtgc 720

gaaaatgact ctatcgcacc agtaaattcc tccgcattgc ctatttatga ttcaatgagc 780

agaaatgcca agcaattcct cgagatcaat gggggttcgc actcatgtgc aaacagcgga 840

aattctaatc aagctcttat cggtaagaaa ggtgtggcat ggatgaagcg ttttatggac 900

aacgacacgc gttattccac ctttgcttgt gagaatccca attcaacagc agttagcgat 960

tttagaaccg ctaattgcag cttgcaccac caccaccacc actga 1005

<210> 5

<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgccggtac cgcttgcgag ccgtgccgcg tgcgaggcct tgaaggacgg taatggcgat 60

atggtttggc cgaatgcggc gaccgtcgtg gaagtagcag cctggcgtga tgcggcgccg 120

gcaaccgctt ctgcggctgc tctgcctgag cactgcgagg tgtccggcgc aatcgccaaa 180

cggacaggta tcgacggcta cccgtatgag atcaagttcc gtttgcgcat gccagcggaa 240

tggaatggtc gtttctttat ggaaggtggt tccggcacca atggttcctt atccgccgca 300

actggttcta ttggtggcgg tcagatcgca agcgccttgt ctcgcaactt tgcgacgatt 360

gcgaccgacg gcggtcatga taatgctgtc aacgacaacc cggatgcgct gggtacggtt 420

gcattcggcc tcgaccccca ggcgcgttta gacatgggtt ataacagcta cgaccaggtg 480

acccaagcgg gcaaggccgc ggttgcccgt ttctatggtc gtgcagcgga taaatcctat 540

ttcatcggct gctcggaagg tggtcgtgag ggcatgatgc tctctcagcg ttttccgagc 600

cattatgatg gcatcgtggc aggcgcgcca ggttaccagc tgccgaaagc aggtattagc 660

ggggcctgga ccacccaatc cctggctccg gcagcggtgg gcttggacgc gcaaggcgtt 720

ccgcttatca acaagagctt ctccgatgcg gacctccacc tgctgtcgca agccattctg 780

ggcacctgtg atgcgttgga cggcttggcg gacggcatcg tggataacta tcgtgcctgc 840

caggcggcgt tcgacccggc gacggctgcg aacccggcga acggccaagc gctgcagtgt 900

gttggtgcta agaccgcaga ctgtctgtca ccggtgcaag tcaccgcaat taagcgcgct 960

atggcaggtc cggtgaacag cgcaggtacc ccgctgtaca atcgttgggc ttgggatgca 1020

ggcatgtccg gcctgtctgg cacgacgtac aaccagggtt ggcgtagctg gtggctgggt 1080

agctttaaca gcagtgcgaa caacgcgcaa cgtgttagcg gtttcagcgc acgtagctgg 1140

ctggtggact tcgccactcc gcctgagccg atgccgatga cccaggttgc cgcccgcatg 1200

atgaaattcg actttgacat cgatccgctc aagatctggg caacgagcgg ccaatttacc 1260

cagtcgagca tggattggca cggtgcgacc agcaccgacc tggcggcgtt ccgcgatcgt 1320

ggtggtaaaa tgattctgta ccacggcatg agtgatgctg cgtttagcgc tctggacacc 1380

gccgactatt acgagcgcct gggtgccgct atgccaggcg ctgcgggctt tgcgcgtttg 1440

tttctggttc cgggtatgaa tcattgtagc ggcggaccgg gtactgaccg tttcgacatg 1500

ctgaccccgt tggtcgcgtg ggttgaacgc ggtgaagcgc cagatcagat cagcgcgtgg 1560

tcaggcacgc cgggttactt tggtgttgca gcccgcaccc gtccgttgtg cccgtacccg 1620

caaatcgcgc gttataaagg ttctggtgat attaacaccg aagcgaactt cgcgtgcgca 1680

gcgccaccgg gcggcggcgg ttctggtggg ggtggttcgg gtggaggcgg cagcagcctg 1740

agagagtgcg agctgtacgt gcagaaacac aatattcagg cacttctgaa ggatagcatt 1800

gttcagttat gcaccgctcg tcccgagcgc ccgatggcgt tcctgcgcga gtattttgaa 1860

cgtctggaaa aagaagaagc cctcgagcac caccaccacc accactgagg tggtggtggt 1920

tcaggtggtg gtggttcagg tggtggtggt tgtggtagcc tgcgtgaatg tgaactgtat 1980

gttcagaaac ataatattca ggccctgctg aaagatagca ttgttcagct gtgtaccgca 2040

cgtccggaac gtccgatggc atttctgcgc gaatattttg aacgtctgga aaaagaagaa 2100

gccaaa 2106

<210> 6

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggtggtg gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttgtggtct ggaacagtat 60

gcaaatcagc tggcagatca gattatcaaa gaagcaaccg aaggttgcat gggcatgaaa 120

tatttactac ccacagcagc tgcgggcttg ctcttgttgg ctgctcaacc gacgatggca 180

ggcctggaac agtacgcaaa tcagctggcg gaccagatta tcaaagaggc gacggaaggt 240

tgcagcggtg gcggctccgg cggcggttct ggcggtggta tgcagtatag cgcgatcgtg 300

gccctgtttg caaccctggc ggtggcggcc ccagcgcaag aagcggctgc tgacatcgca 360

attctggatg gtccgtgtac cgcaggtgtt accaacaaca ttccgatgtg ctgcggtagc 420

gggatcttag atttgctgta tctggactgt gaaaccccga cccaggccac ttcagttttg 480

aatccgctgt cggcggtctg tggtcgtgtt ggtctgcaag cgaagtgctg caccctgggt 540

attgcagacc tgggcgtgct ttgccaggat gcactgccgg aagccgaggc tgcggcgaaa 600

gaggcggcgg ctaaagaggc ggctgccaag gcg 633

<210> 7

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctcacatgc gtggtccgaa cccgacagcc gcgtccttgg aggcaagcgc tggcccattt 60

acggtgcgta gcttcaccgt aagccgccca tccggttacg gcgccggcac tgtctattac 120

ccgaccaacg caggcggcac ggtgggtgca attgcgattg ttccgggtta caccgcgcgt 180

caaagcagca tcaagtggtg gggtccgcgt ctggcaagcc acggttttgt tgtcattacc 240

atcgatacca actccaccct tgatcagccg gaaagccgct cttctcaaca gatggcagcg 300

ctgcgccagg ttgcgtcttt gaatggtact tctagttctc cgatctatgg taaggtggac 360

accgcgcgta tgggcgttat gggttggtca atgggtggcg gtggctcttt gatcagcgct 420

gcgaacaacc cgagcctgaa ggctgccgct ccgcaggcgc cttggcatag ctccacgaac 480

ttcagctcag ttaccgtgcc gaccctgatc ttcgcgtgcg agaacgacag catcgcaccg 540

gttaattcgt ctgctttacc gatttacgac tccatgagcc gcaacgccaa acaatttctg 600

gagatcaacg gtggcagcca cagctgtgcg aacagcggaa acagcaatca agcgctgatt 660

ggtaagaaag gtgttgcatg gatgaaacgt tttatggata atgacacccg ttacagcacc 720

ttcgcctgcg aaaatccgaa tagcacggct gtgtcggatt ttcgtaccgc gaactgcagc 780

ctcctcgagc accaccacca ccaccactga 810

<210> 8

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ser His Met Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser

1 5 10 15

Ala Gly Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly

20 25 30

Tyr Gly Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val

35 40 45

Gly Ala Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile

50 55 60

Lys Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr

65 70 75 80

Ile Asp Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Glu Ser Arg Ser Ser Gln

85 90 95

Gln Met Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser

100 105 110

Ser Pro Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly

115 120 125

Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro

130 135 140

Ser Leu Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp His Ser Ser Thr Asn

145 150 155 160

Phe Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp

165 170 175

Ser Ile Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met

180 185 190

Ser Arg Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser

195 200 205

Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly

210 215 220

Val Ala Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr

225 230 235 240

Phe Ala Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Ala Val Ser Asp Phe Arg Thr

245 250 255

Ala Asn Cys Ser Leu Leu Glu His His His His His His

260 265

Claims

1.一种用于降解PET塑料的工程酶复合物的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的RIDD-IsPETase的编码基因片段、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的RIDD-MHETase的编码基因片段和氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的RIAD-hydrophobin4的编码基因片段连接到质粒载体中，得到重组载体；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中RIDD-IsPETase的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，RIDD-MHETase的编码基因片段的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，RIAD-hydrophobin4的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中质粒载体包括pET28a，RIDD-IsPETase的编码基因片段、RIDD-MHETase的编码基因片段、RIAD-hydrophobin4的编码基因片段通过无缝克隆试剂盒连接到质粒载体中。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述筛选的具体过程为，将转化后的E.coli BL21菌株涂布到同时添加氨苄青霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体培养基中，挑选单菌落。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中接种量为培养基体积的1～10％；所述培养基为LB液体培养基。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中培养条件为30～38℃恒温摇床中培养18～48h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中培养8～15h后添加IPTG诱导蛋白表达，IPTG的终浓度为1mM。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述裂解的方法包括高压均质破碎法、超声波破碎法、球磨破碎法、反复冻融破碎法和酶溶破碎法。

9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的用于降解PET塑料的工程酶复合物。

10.权利要求9所述的用于降解PET塑料的工程酶复合物在降解PET塑料和PET塑料回收方面的应用。