CN114934130B - 白绢病菌特异性ssr标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了白绢病菌特异性SSR标记及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明在测定白绢病菌菌丝亲和群的基础上，基于白绢病菌转录组测序结果，进行SSR位点搜索和SSR引物设计，筛选出9对适用于白绢病菌的SSR引物，并利用SSR分子标记对白绢病菌的遗传多样性和群体结构进行研究，能够从分子水平上确定植物白绢病菌的传播途径，对指导植物白绢病防治有重要意义。

Description

白绢病菌特异性SSR标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种白绢病菌特异性SSR标记及其应用。
背景技术
白绢病是一种毁灭性的土传病害，目前报道其寄主超过500种植物，主要危害双子叶植物，同时也危害部分单子叶植物，包括粮食作物和经济作物，白绢病菌主要侵染植物的根茎，造成根腐或者茎腐。白绢病菌无性态为齐整小核菌，属无性孢子类，丝孢纲，无孢目，小核菌属；有性态为罗氏阿太菌，属担子菌门，多孔菌目，膏药菌科。白绢病菌侵染初期，染病部位黑褐色，温湿度适宜，染病部位扩大，可见白色菌丝。随着侵染加重，根茎部皮层腐烂，影响营养物质及水分等传输，最终导致植株枯死。侵染末期，在侵染部位及土壤表层出现大量褐色菜籽样菌核。
遗传多样性可以反映一个物种的适应性。目前比较普遍的遗传多样性研究方法包括形态学标记、细胞学标记、生物化学标记、免疫学标记、生物化学标记和分子标记等。分子标记更能从微观反映生物群体的遗传多样性，其中SSR分子标记技术具有多态性高、结果精准、单碱基分辨率高、信息量高、呈共显性、重复性好、样本DNA使用量低的特点，被认为是目前比较精准的标记方式，已被广泛的应用于植物病原菌群体间遗传距离、进化和多样性分析等研究。
SSR分子标记主要包括基因组SSR和表达序列标签SSR。前者从基因组开发SSR引物，其分析数据量大、步骤复杂、开发成本高，需要较强的数据分析能力。后者基于转录组等测序得到SSR引物进行相关研究，具有步骤简单、成本较低等诸多优点。因此，利用病原菌的转录组数据开发SSR标记是较为经济、有效的DNA分子标记方法。然而，目前国内外无白绢病菌SSR分子标记的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供植物白绢病菌SSR标记，具体包括9对引物对，可用于植物白绢病菌的检测、遗传多样性和群体结构分析、菌源中心和传播途径的确定以及植物白绢病的防治。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了植物白绢病菌SSR标记，所述SSR标记由以下任意一个或几个引物对扩增得到，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14、SEQ ID NO：15～16、SEQ ID NO：17～18所示。
本发明还提供了植物白绢病菌的SSR标记引物对，包括以下任意一个或几个引物对：所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14、SEQ ID NO：15～16、SEQ IDNO：17～18所示。
本发明还提供了一种植物白绢病菌检测试剂盒，包括上述SSR标记引物对。
优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和基因组提取试剂。
优选的，所述试剂盒还包括毛细电泳中的试剂。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在植物白绢病菌检测中的应用。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在植物白绢病菌遗传多样性和群体结构分析中的应用。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在植物白绢病菌源中心确定中的应用。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在确定植物白绢病菌传播途径中的应用。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在植物白绢病防治中的应用。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果如下：
本发明在测定白绢病菌菌丝亲和群的基础上，基于白绢病菌转录组测序结果，进行SSR位点搜索和SSR引物设计，筛选出适用于白绢病菌的9对SSR引物，利用SSR分子标记从分子层面进行遗传多样性分析，可用于分析白绢病菌的遗传多样性和群体结构，确定植物白绢病菌的菌源中心和传播途径，对指导植物白绢病防治、减少农药使用量有重要意义。
附图说明
图1：SSR引物扩增8个白绢病菌株的凝胶电泳图，A为引物BJ071，B为引物BJ082，C为引物BJ112；
图2：多态性好的SSR引物(BJ112)扩增白绢病菌株的毛细管电泳图；
图3：多态性差的SSR引物(BJ020)扩增白绢病菌株的毛细管电泳图；
图4：9对SSR引物对魔芋白绢病菌的检测结果；
图5：K值水平上Delta K的大小；
图6：K＝3时120个菌株的Structure结果；
图7：120个白绢病菌的UPGMA聚类结果。
具体实施方式
本发明提供了植物白绢病菌SSR标记，所述SSR标记由以下任意一个或几个引物对扩增得到，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14、SEQ ID NO：15～16、SEQ ID NO：17～18所示。
本发明还提供了植物白绢病菌的SSR标记引物对，包括以下任意一个或几个引物对：所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14、SEQ ID NO：15～16、SEQ IDNO：17～18所示。
本发明将引物对分别记为BJ015、BJ071、BJ082、BJ112、BJ130、BJ152、BJ156、BJ157、BJ184。
BJ015引物对重复基元为TGG，具体序列为：
F：5’-AGAAGACGGGAATAAGCCGT-3’(SEQ ID NO：1)；
R：5’-AGTTGATTGGGCAAACTTGG-3’(SEQ ID NO：2)。
BJ071引物对重复基元为GAT，具体序列为：
F：5’-GTCACGCAATTGGAACACAC-3’(SEQ ID NO：3)；
R：5’-GAGAGCGGACACTCTCCAAG-3’(SEQ ID NO：4)。
BJ082引物对重复基元为CYG，具体序列为：
F：5’-ATCCAAATCAAGCATCTGGC-3’(SEQ ID NO：5)；
R：5’-GATGTACGGGTCGTATTCGG-3’(SEQ ID NO：6)。
BJ112引物对重复基元为GT，具体序列为：
F：5’-GGGAGGATGCAAGAACTGAA-3’(SEQ ID NO：7)；
R：5’-ATTTATACCCGCTCACACCG-3’(SEQ ID NO：8)。
BJ130引物对重复基元为CT，具体序列为：
F：5’-TGGCTCTCTACGGACGAACT-3’(SEQ ID NO：9)；
R：5’-TATCATCGCCTTCCTTGGAC-3’(SEQ ID NO：10)。
BJ152引物对重复基元为GGAG，具体序列为：
F：5’-CCGAGAGAGCAAGAGAATGG-3’(SEQ ID NO：11)；
R：5’-AAAGGCCTGCTCGACTTGTA-3’(SEQ ID NO：12)。
BJ156引物对重复基元为GAT，具体序列为：
F：5’-TGATCGGGTAGGTGAGGTTC-3’(SEQ ID NO：13)；
R：5’-CGTTACATACGGCCAGTCCT-3’(SEQ ID NO：14)。
BJ157引物对重复基元为GT，具体序列为：
F：5’-TGCTCTTGTCCAGTGGAGTG-3’(SEQ ID NO：15)；
R：5’-GGTTGCCTTTCCCTTCTCTC-3’(SEQ ID NO：16)。
BJ184引物对重复基元为AAT，具体序列为：
F：5’-CACACAAGGGAGCACAGAGA-3’(SEQ ID NO：17)；
R：5’-GGCAACAACGCTCATCAGTA-3’(SEQ ID NO：18)。
本发明提供的植物白绢病菌SSR标记，是基于微卫星DNA序列重复标记(Simplesequence repeat)的标记，其特异性SSR标记的引物选自BJ015、BJ071、BJ082、BJ112、BJ130、BJ152、BJ156、BJ157、BJ184中的一个或几个，扩增获得的片段即为SSR标记。
优选的，本发明所述植物包括博落回、魔芋、白前、石斛、黄连、花生、半夏、车前草、水稻、菊芋、白术、玄参和黄精。
本发明还提供了用于检测植物白绢病菌的试剂盒，包括SSR标记引物对BJ015、BJ071、BJ082、BJ112、BJ130、BJ152、BJ156、BJ157、BJ184中的一个或多个。
优选的，本发明所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和基因组提取试剂。
更优选的，所述试剂盒还包括毛细电泳中的试剂。本发明将SSR标记引物对扩增得到的产物采用毛细电泳仪器进行检测，根据毛细电泳检测结果可对白绢病菌遗传分化和多样性进行分析。
本发明采用上述扩增引物对，对待测植物白绢病菌的基因组DNA进行PCR扩增和毛细电泳检测。作为一种可选的实施方式，本发明采用荧光修饰的接头引物和对应的反向引物进行荧光引物PCR(所述荧光修饰采用毛细电泳检测常用的修饰方式即可)。所述扩增条件如下：94℃5min；94℃30s，TM℃30s 30个循环；72℃30s；72℃5min；4℃--。所述PCR反应体系以20μL计为：10μLMastermix、1μL引物F(10μM)、1μL引物R(10μM)、1μL模板DNA、7μLddH2O。然后用获得的荧光PCR产物使用3730xl测序仪进行毛细管电泳检测。
本发明还提供了上述引物对或试剂盒在植物白绢病中的应用，所述应用包括在植物白绢病菌检测中的应用、在植物白绢病菌遗传多样性和群体结构分析中的应用、在植物白绢病菌源中心确定中的应用、在植物白绢病菌传播途径确定中的应用以及在植物白绢病防治中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、白绢病菌转录组分析
选择黄连白绢病菌LC1菌株用于转录组数据分析，分别取白绢病菌LC1的菌丝期(S1)、菌核初期(S2)和菌核后期(S3)3个时期的样品，每个时期收集500mg样品，液氮冷冻，-80℃保存。采用Trizol法提取RNA，具体步骤如下：取等量各时期的菌丝体，在液氮环境中充分研磨后再转移至1.5mL离心管中，加入1mL Trizol(生产公司：Life technologies)，立即充分混匀；将混匀的菌丝体在室温放置10min，使其充***解；加入200μL氯仿，充分震荡混匀，4℃、12000r/min离心10min；取上层水相400μL，加入400μL异丙醇，混匀后室温静置10min。4℃，12000rpm，离心10min，管底可见白色的RNA沉淀；弃上清，加入无RNase的75％乙醇1mL，涡旋混匀后，4℃，10000r/min，离心5min；重复上一步；弃上清，室温干燥，将沉淀溶于20μL DEPC水中；-80℃保存。
对提取的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，确保样品的完整性，检验是否发生降解，是否有蛋白等污染。使用微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定样品的OD值，进行纯度验证。委托广州基迪奥生物科技有限公司完成白绢病菌LC1菌株的转录组文库构建及测序。
采用微卫星(MISA，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件对整个转录组进行微卫星挖掘，如果两个SSR之间的距离小于100bp，则视为一个SSR。分析SSR类型、数量、分布及出现的频率等，根据MISA结果，采用Primer 3(http://www.broadinstitute.org/genome_software/other/primer3.html)设计SSRs侧翼区域的引物对。
2、白绢病菌菌株筛选
选择120株白绢病菌中生物学特性差异较大的8株白绢病菌(HS8、QB2、ZB6、LC5、CB2、XH1、NS5、EM1)用于SSR引物PCR扩增筛选，选择不同地理来源不同寄主的16株白绢病菌(EM1、HG2、LC5、QJ2、HS3、LB4、LY2、NB3、XH3、YH4、ZH5、LH1、NH5、NC4、NS6、NY1)用于毛细管电泳筛选。使用TSINGKE DNA提取试剂盒(通用型)提取白绢病菌的基因组DNA。白绢病菌信息见表1。
表1白绢病菌菌株编号及来源
Figure BDA0003699085010000061
Figure BDA0003699085010000071
3、SSR引物初筛
SSR引物初步筛选的原则为：(1)选择重复单位为2、3、4、5个碱基的位点，且仅有一种重复类型；(2)选择片段长度大于150bp，小于300bp；(3)基因所在位置不宜太集中、已经有多态的位点优先选、不同组合的重复单元均衡选择；(4)选择长度在20～23bp之间、TM值在60℃左右的引物；(5)选择碱基重复数小于等于4的引物；(6)选择5’和3’端不含有2个连续A/T碱基；(7)引物内不能有重复序列。基于引物初步筛选原则，从设计的引物对中筛选出200对引物进行PCR扩增检测。
分别以8株白绢病菌的基因组DNA为模板，选取不同的引物进行PCR扩增。PCR反应体系(20μL)如下：10μL Master mix、1μL引物F(加接头“CAG”，10μM)、1μL引物R(10μM)、1μL模板DNA、7μL ddH2O。扩增条件为：在94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
取2μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在Bio-Red紫外光凝胶成像***中检测并拍照。筛选出扩增条带清晰的引物。PCR产物电泳结果显示各引物对的扩增条带，筛选出以8个供试菌株基因组为模板，均可扩增出清晰、明亮条带的引物，获得36对SSR引物对。
凝胶电泳扩增条带结果见图1。图1中A为引物BJ071，B为引物BJ082，C为引物BJ112，1～8依次为HS8、QB2、ZB6、LC5、CB2、XH1、NS5、EM1。(由于电泳图结果较多，仅提供部分结果用于佐证)
4、毛细电泳筛选
选择不同地理来源不同寄主的16株白绢病菌，以湖北省(魔芋EM1、白前HG2、黄连LC5、半夏QJ2)、安徽省(石斛HS3)、湖南省(博落回LB4、LY2、NB3、黄精XH3、YH4、ZH5)、河南省(花生LH1、NH5)、四川省(半夏NC4)、广西壮族自治区(水稻NS6、菊芋NY1)的16株白绢病菌基因组DNA为模板，对步骤2筛选得到的36对引物进行再次筛选。
36对引物进行毛细电泳筛选，用荧光修饰的接头引物和对应的反向引物进行荧光引物PCR。扩增条件如下：94℃5min；94℃30s，TM℃30s 30个循环；72℃30s；72℃5min；4℃--。
获得的荧光PCR产物使用3730xl测序仪进行毛细管电泳检测，结合分析出来的位点峰图和数据信息来判断引物是否具有位点多态性。毛细管电泳后，若位点特异性高、多态性好的引物，则表现为多种片段大小(如图2)；若16个供试菌株的结果均只有一种片段大小(如图3)，则引物的多态性不理想。(由于结果较多，仅提供部分用于佐证，图2为引物对BJ112分别对EM1、HG2、HS3的扩增结果，图3为引物对BJ020分别对CB5、HS8、ZB6的扩增结果)筛选出位点特异性高、多态性好、重复性好的引物进行遗传多样性分析。
结合引物扩增效果及检测后是否有多态性，一共筛选出引物17对，其中引物对BJ112、BJ152、BJ156、BJ157的多态性最好；而引物对BJ015、BJ071、BJ082、BJ130、BJ184的多态性较好；引物对BJ066、BJ078、BJ080、BJ086、BJ106、BJ109、BJ138、BJ163的多态性一般。因此，选择BJ015、BJ071、BJ082、BJ112、BJ130、BJ152、BJ156、BJ157、BJ184共9对引物进行遗传多样性分析。筛选得到的9对引物信息见表2。
表2 9对SSR引物信息
Figure BDA0003699085010000081
Figure BDA0003699085010000091
实施例2
SSR引物多态性分析：
利用实施例1中9对SSR引物对120株白绢病菌基因组DNA进行分析，共检测出66个等位基因位点(Na，频率最高的等位基因为原始型)。等位基因数共分为6种，等位基因数最高的为引物BJ184，数量达到11；其次为引物BJ112，等位基因数均为10；等位基因数最少的为BJ015和BJ071，等位基因数均为4，平均每个位点等位基因数目为7.3333。有效等位基因(Ne，等位基因在群体中分布得越均匀，Ne越接近实际检测到的等位基因的个数)总数为30.3318，数值变化范围为1.9625(BJ184)-5.9925(BJ112)，平均每个位点有效等位基因数目为3.3702。香农指数(I)的数值范围为1.0435(BJ071)-1.9814(BJ112)，平均值1.4139。多态信息含量(PIC)的数值范围为0.4767(BJ184)-0.8140(BJ112)，平均值0.6303，其中9对引物具有较高的多态信息(PIC>0.25)，结果见表3。
表3 9对SSR引物的多态性
Figure BDA0003699085010000092
Figure BDA0003699085010000101
Na：观测等位基因；Ne：有效等位基因；I：香农指数；PIC：多态信息指数；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度。
由表3可知，所得9对SSR引物的多态性较高，可用于白绢病菌群的遗传多样性分析。
实施例3
以植物白绢病菌的基因组DNA为模板，分别以9对SSR引物进行毛细电泳检测，方法为：荧光修饰的接头引物和对应的反向引物进行荧光引物PCR。扩增条件如下：94℃5min；94℃30s，TM℃30s 30个循环；72℃30s；72℃5min；4℃--。用获得的荧光PCR产物使用3730xl测序仪进行毛细管电泳检测。(由于结果较多，仅提供部分用于佐证，图4为9对SSR引物对魔芋白绢病菌的检测结果)。
实施例4
以120株白绢病菌的基因组DNA为模板，分别以9对SSR引物进行毛细电泳检测，具体方法采用实施例3中的记载，对检测结果进行分析。
1、遗传多样性分析
利用GenAlEx version 6.501软件分析白绢病菌各群体的遗传多样性。
7个地理种群的有效等位基因(Ne)在1.231(Henan)-3.281(Hunan)之间，平均值为2.277；香农指数(I)在0.174(Henan)-1.290(Hunan)之间，平均值为0.813。结果见表4。
表4不同地理来源白绢病菌群体间遗传多样性
Figure BDA0003699085010000102
Figure BDA0003699085010000111
Na：观测等位基因；Ne：有效等位基因；I：香农指数；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度；F：固定指数。
由表4可知，河南省群体的遗传多样性指数最低，湖南省群体的遗传多样性指数最高。
13个寄主种群的有效等位基因(Ne)在1.222(MY)-2.989(SH)之间，平均值为1.949；香农指数(I)在0.154(MY)-1.115(SH)之间，平均值为0.651，结果见表5。
表5不同寄主来源白绢病菌群体间遗传多样性
Figure BDA0003699085010000112
Na：观测等位基因；Ne：有效等位基因；I：香农指数；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度；F：固定指数。
由表5可知，魔芋群(MY)的遗传多样性指数最低，石斛群(SH)的遗传多样性指数最高。地理种群和寄主种群的固定指数(F)都明显大于0或者小于0，说明均存在杂合体缺失或者纯合体缺失的现象。
2、分子方差分析
对不同地理来源种群进行分子方差分析(AMOVA)，结果见表6。
表6不同地理来源种群AMOVA分析
Figure BDA0003699085010000121
由表6可知，地理种群间遗传变异占比为28％，种群内遗传变异占比为72％，表明白绢病菌地理种群间和种群内均存在变异，且种群内变异是远种群间变异的2.5倍，遗传变异主要来自种群内。
进一步对两两群体间的基因流和遗传分化结果进行分析，表明基因流值在0.055(Sichuan/Henan)-10.254(Hunan/Anhui)之间，遗传分化值在0.024(Anhui/Hunan)-0.819(Henan/Sichuan)之间，结果见表7。
表7地理群体间的基因流(上三角)和遗传分化结果(下三角)
Figure BDA0003699085010000122
由表7可知，安徽省与湖南省的白绢病菌基因流动频繁，变异不明显，四川省与河南省的白绢病菌基因流动值小，遗传变异较大，这可能与地理位置差异相关。
对不同寄主种群进行分子方差分析(AMOVA)。结果见表8。
表8不同地理来源种群AMOVA分析
Figure BDA0003699085010000131
由表8可知，寄主种群间遗传变异占比为39％，种群内遗传变异占比为61％，表明白绢病菌地理种群间和种群内均存在变异，且种群内变异远大于种群间变异，遗传变异主要来自种群内。
进一步对两两群体间的基因流和遗传分化结果进行分析，除MY/HS、BX/BQ两组群体外，其基因流值在0.003(MY/BZ)-17.531(XS/BX)之间，遗传分化值在0.014(XS/BX)-0.990(MY/BZ)之间，结果见表9。
表9寄主群体间的基因流(上三角)和遗传分化结果(下三角)
Figure BDA0003699085010000132
Figure BDA0003699085010000141
(续)表9寄主群体间的基因流(上三角)和遗传分化结果(下三角)
Figure BDA0003699085010000142
由表9可知，魔芋与花生、半夏与白前的白绢病菌基因交流无障碍，无明显遗传分化，玄参与半夏的的白绢病菌遗传分化较低，魔芋与白术的白绢病菌遗传分化较为明显。
3、对120株白绢病菌种群遗传结构进行分析，利用PowerMarker version 3.25软件分析群体间的遗传同一性和遗传距离。
在地理种群中，遗传同一性在0.2084-0.9896之间，遗传距离在0.0105-1.5681之间，见表10。
表10理群体间的遗传同一性(上三角)和遗传距离(下三角)
Figure BDA0003699085010000143
Figure BDA0003699085010000151
由表10可知，山东(Shandong)与河南(Henan)的遗传距离最近，遗传同一性最高，山东(Shandong)与四川(Sichuan)的遗传距离最远，遗传同一性最低，该结论与地理位置实际差异较为相符。
在寄主种群中，遗传同一性在0.0547-0.9991之间，遗传距离在0.0009-2.9060之间，结果见表11。
表11寄主群体间的遗传同一性(上三角)和遗传距离(下三角)
Figure BDA0003699085010000152
(续)表11寄主群体间的遗传同一性(上三角)和遗传距离(下三角)
Figure BDA0003699085010000153
Figure BDA0003699085010000161
由表11可知，花生(HS)与魔芋(MY)的遗传距离最近，遗传同一性最高，白术(BZ)与水稻(SD)的遗传距离最远，遗传同一性最低。
4、对120株白绢病菌种基因组DNA进行分析，在Structure Harvester中根据Evanno(Evanno et al 2005)的方法计算得到的最适delta K值为3，表明22个群体的120株白绢病菌中存在3个基因库，结果见图5。
由图5可知，当K＝3时，湖南省的白术(QB)、黄精(XH、ZH)、安徽省的石斛(HS)、广西壮族自治区的车前草(NN)白绢病菌群体的基因组成主要来源于基因库1；湖南省的博落回(LB)、黄精(YH)、湖北省的黄连(LC)、四川省的半夏(NC)、广西壮族自治区的水稻(NS)、菊芋(NY)白绢病菌群体的基因组成主要来源于基因库2；湖南省的博落回(CB、LY、NB)、玄参(QX)、湖北省的魔芋(EM)、白前(HG)、半夏(QJ、ZB)、河南省的花生(LH、NH)、山东省的花生(RH)白绢病菌群体的基因组成主要来源于基因库3。说明这些居群非均质、具有明显的遗传结构。
基于Nei的遗传距离，构建120个菌株的UPGMA树，进行聚类分析，结果见图6。由图6可知，各群体的菌株存在较多的交叉混合，表明群体内存在较多的遗传变异，主要分为3个分支，与Structure分析一致。
通过分析UPGMA聚类与120株白绢病菌的寄主、地理来源及菌丝亲和群关系，表明同一聚类与地理来源相关，同一地理来源菌株大多聚为一类。相同菌丝亲和群大致分布在统一聚类，结果见图7。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖北省农业科学院中药材研究所
<120> 白绢病菌特异性SSR标记及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaagacggg aataagccgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agttgattgg gcaaacttgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcacgcaat tggaacacac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagagcggac actctccaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccaaatca agcatctggc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatgtacggg tcgtattcgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggaggatgc aagaactgaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atttataccc gctcacaccg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggctctcta cggacgaact 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatcatcgcc ttccttggac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgagagagc aagagaatgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaggcctgc tcgacttgta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgatcgggta ggtgaggttc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgttacatac ggccagtcct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgctcttgtc cagtggagtg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggttgccttt cccttctctc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cacacaaggg agcacagaga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcaacaacg ctcatcagta 20

Claims (9)

1.一种用于检测植物白绢病菌的SSR标记引物组，其特征在于，由以下引物对组成：所述引物对的序列如SEQ ID NO：1~2、SEQ ID NO：3~4、SEQ ID NO：5~6、SEQ ID NO：7~8、SEQID NO：9~10、SEQ ID NO：11~12、SEQ ID NO：13~14、SEQ ID NO：15~16、SEQ ID NO：17~18所示。
2.一种植物白绢病菌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述SSR标记引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和基因组提取试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括毛细电泳中的试剂。
5.权利要求1所述引物组或权利要求2~4任意一项所述的试剂盒在植物白绢病菌检测中的应用。
6.权利要求1所述引物组或权利要求2~4任意一项所述的试剂盒在植物白绢病菌遗传多样性和群体结构分析中的应用。
7.权利要求1所述引物组或权利要求2~4任意一项所述的试剂盒在植物白绢病菌源中心确定中的应用。
8.权利要求1所述引物组或权利要求2~4任意一项所述的试剂盒在确定植物白绢病菌传播途径中的应用。
9.权利要求1所述引物组或权利要求2~4任意一项所述的试剂盒在植物白绢病防治中的应用。
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