CN114934039B - 一种延长保质期的非芽孢微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种延长保质期的非芽孢微生物菌剂及其制备方法，所述非芽孢微生物菌剂包括非芽孢微生物菌液和草炭土；所述非芽孢微生物菌液为骆驼刺泛菌、施氏假单胞菌及其他非芽孢菌中任意一种菌或多个菌的菌液。本发明所提供的粉末型非芽孢微生物菌剂，和一般商业化液体型芽孢菌剂相比，极大提高了非芽孢微生物菌剂的常温保藏稳定性及长效性、且绿色无污染、贮藏方便。其中，驼刺泛菌XK‑11菌剂的保藏效果最好，保质期为180d，有效提升了35倍；其次是施氏假单胞菌NRCB010菌剂，保质期为360d，有效提升了11倍。

Description

一种延长保质期的非芽孢微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物菌剂领域，具体涉及一种延长保质期的非芽孢微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
我国现已进入生态农业新时代，农业施肥技术越来越趋于绿色生态理念，而过量施用常见的化学肥料对维持生态平衡和保护环境十分不利。微生物菌剂具有长效无毒、无污染、节约能源、成本低等特点，按照菌剂的外观形态可分为液体菌剂和固体菌剂，液体菌剂具有生产效率高、培养周期短等优点，但也存在运输不方便、保藏时间短等缺点；相比液体菌剂，固体菌剂具有储藏运输方便、微生物活性高、保藏周期长等优点。目前商业化的微生物菌剂多为液体型芽孢菌类，非芽孢类的革兰氏阴性菌菌剂的制备与保藏仍存在许多障碍，主要在于菌剂的存活率低、保藏稳定性差，因此探索合适、低成本的菌剂制备方法很有现实意义。
目前非芽孢菌剂尚无非常成熟的保活方法，喷雾干燥技术一定程度上可以延长菌剂货架期，但干燥过程高温条件对细胞的存活率影响较大。因此，本发明提供了一种用于常温保藏的粉末型非芽孢微生物菌剂及其制备方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对商业化液体型芽孢菌剂的保藏稳定性不足的问题，提供草炭土在延长非芽孢微生物菌剂保质期中的应用，以解决液体型芽孢菌剂的存活率低、保藏稳定性差两大关键难题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述非芽孢微生物菌剂的制备方法。
发明思路：最大限度的减少菌剂干粉的水分含量的同时减少细胞死亡是解决该问题的核心突破口，廉价生物质载体具有促进细胞黏附、增殖和营养供应的作用，在非芽孢菌剂产品开发方面具有很好的应用前景。草炭土是沼泽发育过程中的产物，是一种纯天然、无公害、无污染的绿色物质，用途非常广泛。草炭土有机质含量高、生物降解性好、含有大量腐殖质以及一部分矿物质，作为一种可循环再生的生物质材料，为微生物菌剂的吸附及保藏提供了良好载体。草炭土质地松软，生产出的肥料具有疏松的外观，在生产、贮藏及使用过程中方便快捷；草炭土内含有的腐殖酸有吸附作用，能够增加土壤的团粒结构，可在水川和旱田地使用改良土壤，肥料强度得到明显提高，同时成本低廉，极大提高了微生物菌剂的利用率及长效性。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了草炭土在延长非芽孢微生物菌剂保质期中的应用。
其中，所述非芽孢微生物菌剂包括非芽孢微生物菌液和草炭土；所述非芽孢微生物菌液为骆驼刺泛菌、施氏假单胞菌及其他非芽孢菌中任意一种菌或多个菌的菌液。
在一些实施例中，所述骆驼刺泛菌、施氏假单胞菌分别为骆驼刺泛菌XK-11、施氏假单胞菌NRCB010，均为现有的菌。
其中，所述非芽孢微生物菌剂中，非芽孢微生物菌液和草炭土的质量含量分别为20％～50％和50％～80％。
其中，所述非芽孢微生物菌剂的活菌数为70～100亿/g。
其中，当所述非芽孢微生物菌液为骆驼刺泛菌的菌液时，在180天后，所述非芽孢微生物菌剂的活菌数为9.6亿/g以上。
其中，当所述非芽孢微生物菌液为施氏假单胞菌的菌液时，在180天后，所述非芽孢微生物菌剂的活菌数为8.4亿/g以上。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述非芽孢微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
S1：菌液培养：将骆驼刺泛菌、施氏假单胞菌及其他非芽孢菌中任意一种或多个菌分别进行好氧培养，得到非芽孢微生物菌液；
S2：菌液吸附：将步骤S1所得非芽孢微生物菌液与草炭土搅拌均匀，即用草炭土进行吸附，得到未干燥的润湿非芽孢微生物菌剂；
S3：菌剂干燥：将步骤S2所得未干燥的润湿非芽孢微生物菌剂干燥，即得非芽孢微生物菌剂。
步骤S1中，所述非芽孢微生物菌液和草炭土的质量比为(0.5～3):1，优选为(1～2):1，进一步优选为2:1、3:2、4:3。
步骤S1中，所述非芽孢微生物菌液中活菌数为20～40亿/mL。
步骤S3中，所述干燥为于温度为20～40℃的烘箱中干燥12～24h。
商业化微生物菌剂主要有液体菌剂和固体菌剂，相比液体菌剂，固体菌剂具有储藏运输方便、稳定性高、微生物活性高、保藏周期长等优点。本发明通过固定化微生物技术获得的粉末型微生物菌剂，应用于农业方面效果持久显著，绿色无污染等优点。草炭土是一种纯天然、无公害、无污染的绿色物质，它作为一种可循环再生的生物质材料，含有大量有机质和腐殖质，可为微生物菌剂的吸附及保藏提供良好载体。将草炭土用作吸附基质，制备出的粉末型非芽孢农用微生物菌剂，成本低廉，具有疏松的外观，在生产贮藏及使用过程中方便快捷，极大提高了非芽孢微生物菌剂的常温保藏稳定性及长效性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明将草炭土用作吸附基质，与非芽孢微生物菌液混合均匀后干燥，制备出一种用于常温保藏的粉末型非芽孢微生物菌剂，和一般商业化液体型芽孢菌剂相比，极大提高了非芽孢微生物菌剂的常温保藏稳定性及长效性、且绿色无污染、贮藏方便。其中，驼刺泛菌XK-11菌剂的保藏效果最好，保质期为180d，有效提升了35倍；其次是施氏假单胞菌NRCB010菌剂，保质期为360d，有效提升了11倍。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为制备的粉末型非芽孢微生物菌剂产品外观图。
图2为草炭土负载骆驼刺泛菌XK-11前后的扫描电镜图(实施例3)。
图3为草炭土负载施氏假单胞菌NRCB010的扫描电镜图(实施例5)。
图4为SEM-EDS分析得到的草炭土元素组成。
图5为25℃常温保藏条件下的骆驼刺泛菌XK-11菌剂中菌落随时间的变化图(实施例3)。
图6为25℃常温保藏条件下的施氏假单胞菌NRCB010菌剂中菌落随时间的变化图(实施例5)。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述骆驼刺泛菌XK-11的菌种保藏号为CGMCC NO.15525、施氏假单胞菌NRCB010的菌种保藏号为CGMCC NO.19067。
下述实施例中步骤(2)所述非芽孢微生物菌液与草炭土的用量比为质量比。
实施例1
(1)菌液培养：采用骆驼刺泛菌XK-11进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养12h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为20亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用草炭土进行吸附，按照2：1的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为20℃的烘箱中干燥12h，即得到初始有效活菌数为70亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
实施例2
(1)菌液培养：采用骆驼刺泛菌XK-11进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养18h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为30亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用草炭土进行吸附，按照3：2的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为30℃的烘箱中干燥18h，即得到初始有效活菌数为85亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
实施例3
(1)菌液培养：采用骆驼刺泛菌XK-11进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养24h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为40亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用草炭土进行吸附，按照4：3的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为40℃的烘箱中干燥24h，即得到初始有效活菌数为77亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
实施例4
(1)菌液培养：采用施氏假单胞菌NRCB010进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养12h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为20亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用草炭土进行吸附，按照2：1的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为20℃的烘箱中干燥12h，即得到初始有效活菌数为80亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
实施例5
(1)菌液培养：采用施氏假单胞菌NRCB010进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养18h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为30亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用草炭土进行吸附，按照3：2的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为30℃的烘箱中干燥18h，即得到初始有效活菌数为87亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
实施例6
(1)菌液培养：采用施氏假单胞菌NRCB010进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养24h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为40亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用草炭土进行吸附，按照4：3的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为40℃的烘箱中干燥24h，即得到初始有效活菌数为100亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
为验证本发明的草炭土是一种较好的用作菌剂制备的载体材料，增加麦麸载体材料分别制备菌剂的两组对比试验。
对比例1
(1)菌液培养：采用骆驼刺泛菌XK-11进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养24h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，到初始有效活菌数为40亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用麦麸进行吸附，按照4：3的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为40℃的烘箱中干燥24h，即得到初始有效活菌数为65亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
对比例2
(1)菌液培养：采用施氏假单胞菌NRCB010进行菌液培养，培养条件为：取LB液体培养基于高温灭菌锅内121℃灭菌20min，提前将保存于-80℃的菌种取出待完全溶解，将菌种接种至无菌的LB液体培养基中，37℃摇床中培养18h，得到活化菌种备用。采用稀释涂布法计算活菌数，得到初始有效活菌数为30亿/ml的非芽孢微生物菌液；
(2)菌液吸附：将步骤(1)得到的非芽孢微生物菌液用麦麸进行吸附，按照3：2的比例搅拌，混合均匀，初步得到未干燥的湿润非芽孢微生物菌剂；
(3)菌剂干燥：将步骤(2)得到的非芽孢微生物菌剂放入温度为30℃的烘箱中干燥18h，即得到初始有效活菌数为70亿/g的粉末型非芽孢微生物菌剂。
实施例7检测试验
(1)图1所示的为实施例3中应用草炭土作为吸附基质，制备得骆驼刺泛菌XK-11菌剂的表观，另外一种菌剂(施氏假单胞菌NRCB010菌剂)的表观与其相同。
(2)如图2所示，应用扫描电子显微镜表征草炭土分别在负载菌株前后的表面形貌图，第一张负载菌株前的表面形貌图，可清晰观察到草炭土表面呈鳞片微孔状，为负载菌株提供有利条件，第二张为实施例3中草炭土负载骆驼刺泛菌XK-11后的表面形貌图，可清晰观察到草炭土表面负载较多菌株，呈生物膜态势发展。
(3)如图3所示为实施例5草炭土负载施氏假单胞菌NRCB010后的SEM表面形貌图。
(4)如图4所示，应用SEM-EDS表征草炭土的元素组成，对应表格中的元素质量分数组成，结果表明草炭土含有三种元素的含量关系为：C(50.29％)＞O(49.23％)＞K(0.49％)，草炭土在为菌株提供吸附有效吸附位点的同时，还可以提供一定的营养元素，有助于菌株吸附存活。
(5)将实施例1～6及对比例1～2分别制备得到的粉末型非芽孢微生物菌剂放入常温25℃条件下，定期取样，稀释涂布计算有效菌落数。以菌剂中活菌存活率为10％所需的时间为保质期指标。
实施例3、5分别对应的两种粉末型非芽孢菌剂常温保藏效果最好，其中，实施例3的空白组为，骆驼刺泛菌XK-11菌液和无菌的LB液体培养基按照4：3的比例混合均匀；实施例5的空白组为，施氏假单胞菌NRCB010菌液和无菌的LB液体培养基按照3：2的比例混合均匀。
如图5(A)所示，实验组粉末型骆驼刺泛菌XK-11菌剂的保质期为180d，活菌数为9.6亿/g；如图5(B)所示，骆驼刺泛菌XK-11菌剂的空白组保质期为5d，活菌数为2.7亿/ml；相比较空白组，实验组的保质期有效提升了35倍。如图6所示，施氏假单胞菌NRCB010菌剂的空白组保质期为30d，活菌数为2.8亿/ml；实验组粉末型施氏假单胞菌NRCB010菌剂的保质期为360d，活菌数为8.4亿/g，有效提升了11倍。
采用麦麸作为载体材料制备菌剂，对比例1制备的骆驼刺泛菌XK-11菌剂的保质期为90d，活菌数为17亿/g；对比例2制备的施氏假单胞菌NRCB010菌剂的保质期为180d，活菌数为19亿/g。将对比例1、2分别与实施例3、5对应比较菌剂的保质期，实施例3和实施例5的有效保质期均提升了1倍。结果表明与麦麸相比较，草炭土是一种能够有效延长骆驼刺泛菌XK-11、施氏假单胞菌NRCB010的常温保质期的优良载体材料，能够满足货架期要求，具备实际应用价值。
以上实验表明，25℃常温保藏下，与麦麸制备的两种菌剂(对比例1、2)相比较，草炭土制备的两种菌剂的保质期效果最好，其中，实施例3制备的骆驼刺泛菌XK-11菌剂的保质期效果最好为180d，比空白组有效提升了35倍，其次是实施例5制备的施氏假单胞菌NRCB010菌剂的保质期为360d，比空白组有效提升了11倍。
实施例8
将草炭土制备的骆驼刺泛菌XK-11菌剂(实施例3)、施氏假单胞菌NRCB010菌剂(实施例5)分别施用至水稻的盆栽试验中，研究菌剂对作物的促生效果。将水稻种子和番茄种子表面消毒，用2.5％次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗数次后，将种子放置在盖有无菌潮湿滤纸的培养皿上，在30℃的黑暗培养箱中发芽2天后，将萌发的种子播种在装有350g大田土壤的花盆中。实验前分别制备两种细菌悬浮液(骆驼刺泛菌XK-11、施氏假单胞菌NRCB010)，调整其浓度为108CFU/mL备用。挑选骆驼刺泛菌XK-11单菌落至新鲜的LB液体培养基中，置于37℃，200rpm培养24h，获得骆驼刺泛菌XK-11悬浮液。挑选施氏假单胞菌NRCB010单菌落至新鲜的LB液体培养基中，置于37℃，200rpm培养18h，获得施氏假单胞菌NRCB010悬浮液。两个实验组和空白对照CK组的实验设计如表1所示，每个处理组重复三次。盆栽实验的所有花盆均置于温室中，温度为25℃，光照时间为16:8h。待植株生长5周后收获，测定其生长参数，用米尺测量株高和根长，然后将烘箱调至105℃，放入植株杀青30min，在60℃烘箱中干燥植株的地上部分及地下部分至恒重后，称量并记录数据。
由表2可知，通过对比CK组及实施例3处理组的水稻幼苗生长参数，发现经过骆驼刺泛菌XK-11菌剂的处理，水稻幼苗的株高、根长、地上干重及地下干重皆显著提高，相比较CK，实施例3的株高显著增加了65.62％，根长显著增加了75.18％，地上干重显著增加了200％，地下干重显著增加了164％。说明骆驼刺泛菌XK-11菌剂能够较好的促进水稻生长。
由表3可知，通过对比CK组及实施例5处理组的番茄幼苗生长参数，发现经过施氏假单胞菌NRCB010菌剂的处理，番茄幼苗的株高、根长、地上干重及地下干重皆显著提高，相比较CK，实施例5的株高显著增加了27.40％，根长显著增加了85.24％，地上干重显著增加了300％，地下干重显著增加了171％。说明施氏假单胞菌NRCB010菌剂能够较好的促进番茄生长。
综上，由草炭土制备的三种常温保质期效果最好的菌剂为，骆驼刺泛菌XK-11菌剂(实施例3)、施氏假单胞菌NRCB010菌剂(实施例5)，将其施用于对应的作物盆栽实验中，结果表明这两种菌剂分别能够有效促进水稻及番茄的生长，具有广阔的实际应用价值。
表1水稻及番茄的盆栽实验设置
表2骆驼刺泛菌XK-11菌剂对水稻幼苗生长的影响
表3施氏假单胞菌NRCB010菌剂对番茄幼苗生长的影响
本发明提供了一种延长保质期的非芽孢微生物菌剂及其制备方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (8)

1.草炭土在延长非芽孢微生物菌剂保质期中的应用，其特征在于，所述非芽孢微生物菌剂包括非芽孢微生物菌液和草炭土；
所述非芽孢微生物菌液为骆驼刺泛菌、施氏假单胞菌中任意一种菌或多个菌的菌液；
所述非芽孢微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：
S1：将骆驼刺泛菌、施氏假单胞菌中任意一种或多个菌分别进行好氧培养，得到非芽孢微生物菌液；
S2：将步骤S1所得非芽孢微生物菌液与草炭土搅拌均匀，得到未干燥的润湿非芽孢微生物菌剂；
S3：将步骤S2所得未干燥的润湿非芽孢微生物菌剂干燥，即得非芽孢微生物菌剂；
步骤S3中，所述干燥为于温度为20～40℃的烘箱中干燥12～24h。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非芽孢微生物菌剂中，非芽孢微生物菌液和草炭土的质量含量分别为20％～50％和50％～80％。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非芽孢微生物菌剂的活菌数为70～100亿/g。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述非芽孢微生物菌液为骆驼刺泛菌的菌液时，在180天后，所述非芽孢微生物菌剂的活菌数为9.6亿/g以上。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述非芽孢微生物菌液为施氏假单胞菌的菌液时，在180天后，所述非芽孢微生物菌剂的活菌数为8.4亿/g以上。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述非芽孢微生物菌液和草炭土的质量比为(0.5～3):1。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述非芽孢微生物菌液和草炭土的质量比为2:1、3:2、4:3。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述非芽孢微生物菌液中活菌数为20～40亿/mL。
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