CN114929873A

CN114929873A - 使用靶向核酸酶调节微生物群的组成

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Publication number: CN114929873A
Application number: CN202080083063.1A
Authority: CN
Inventors: E·伊斯特伦德; Z·张; G·D·戴维斯; Z·W·贝勒; J·I·戈登
Original assignee: University of Washington; Sigma Aldrich Co LLC
Current assignee: University of Washington; Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-08-19
Also published as: AU2020357816A1; WO2021067291A1; CA3152931A1; KR20220051259A; JP2022549519A; IL291509A; BR112022005831A2; US20210095273A1; EP4038185A1

Abstract

本文提供了用于重塑复杂的微生物群体的组合物和方法。RNA引导的核酸酶***被改造为靶向所靶向的原核生物的染色体DNA中的位点，其中可以在混合的原核生物群体中调节所靶向的原核生物的水平。

Description

使用靶向核酸酶调节微生物群的组成

相关申请

本申请要求于2019年9月30日提交的美国临时申请号62/908,130、以及于2019年10月1日提交的美国临时申请号62/909,078、以及于2020年7月16日提交的美国临时申请号63/052,825的优先权权益，所述美国临时申请各自的整体内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，所述序列表已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此通过引用以其整体并入。于2020年9月29日创建的ASCII副本命名为P19-171_WO-PCT_SL.txt且大小为51,634字节。

技术领域

本公开内容涉及用于重塑微生物群的组成的组合物和方法。

背景技术

控制微生物群体的组成和表达的功能是医学、生物技术和环境循环的关键方面。虽然经典的抗微生物策略提供了一些控制，但仍然难以捉摸的是通用且可编程的策略，其可以区分甚至密切相关的微生物，并且允许对微生物群体的组成的精细控制。最近的进展指示了，可以设计RNA引导的核酸酶***以靶向微生物群体中的特定DNA序列。采用类似的策略从多物种细菌群体中靶向且去除特定物种将是有益的。

附图说明

专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。本专利或专利申请公开的带有彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1A-1B示出了使用整合的、诱导型CRISPR***的靶向微生物群调节。CRISPR***(Cas9核酸内切酶和引导RNA)的表达导致细菌中的染色体断裂以及最终的细胞死亡。因此，在脱水四环素(aTc)诱导后，可以从混合群体中原位消除包含具有靶向引导RNA的整合CRISPR盒的特定拟杆菌属菌株。

图2呈现了CRISPR整合载体的示意图。Cas9蛋白由脱水四环素(aTc)诱导型启动子表达。单引导RNA (N20-sgRNA支架)由P1启动子组成型表达，其中20个核苷酸的前间隔序列(N20)指定当存在PAM (在化脓链球菌(Streptococcus pyogenes) CRISPR/Cas9的情况下，NGG)时，基因组中的靶向DNA切割。

图3A-3C示出了CRISPR***在人肠道衍生的细菌多形拟杆菌(Bt)中的染色体整合。图3A图解了NBU2整合机制。图3B显示了CRISPR经由接合与Bt的整合。图3C呈现了CRISPR整合体的菌落PCR筛选。PCR A：attBT2-1基因座，外部引物；PCR B：attBT2-2基因座，外部引物；PCR C：attBT2-1基因座，左连接点；PCR D：attBT2-2基因座，左连接点。M1–M4：具有非靶向、对照gRNA的四个Bt菌落；T1–T4：具有tdk靶向gRNA的四个Bt菌落；S1–S4：具有susC靶向gRNA的四个Bt菌落。

图4A-4B示出了使用整合的CRISPR***，各个拟杆菌属菌株的诱导的CRISPR杀死。图4A呈现了在血琼脂平板上的结果。对于选择的CRISPR整合体(M1和T1)，将TYG + Gm 200、Em25中的管培养物稀释，并且涂抹(24小时管培养物、10-6稀释、100μl涂抹)在BHI血琼脂平板(Gm 200、Em 25)上，所述BHI血琼脂平板分别补充有浓度为0和100 ng/ml的脱水四环素(aTc)。细胞在37°C下厌氧温育40小时。图4B显示了在TYG液体培养基中的结果。选择的CRISPR整合体(M1、M2、T1、T3、S1、S2)在TYG培养基中在37°C下从新鲜菌落厌氧生长6小时至OD_600nm ~0.6，1:100稀释至分别补充有终浓度为0、10和100 ng/ml的aTc的新鲜TYG液体培养基(Gm 200、Em 25)。在37°C下在厌氧条件下培养24小时的过程中评价生长。

图5A-5C呈现了在体外混合群体中的特定拟杆菌属菌株的靶向诱导性CRISPR杀死。选择的CRISPR整合体(M1、T1、S1)在TYG培养基中在37℃下从新鲜菌落厌氧生长6小时至OD_600nm ~0.6。将等体积的细胞培养物(1:100稀释度)混合，并且加入新鲜的TYG液体培养基(Gm 200、Em 25)中，所述TYG液体培养基分别补充有终浓度为0、10和100 ng/ml的aTc。这些培养物在37℃下厌氧温育24小时。图5A：OD_600nm测量。图5B：对于用浓度为100 ng/ml、10 ng/ml和0 ng/ml的aTc处理的培养物，执行扩增引导RNA区域的PCR (与Cas9和NBU2编码序列结合的引物，1.5 kb的扩增子大小)，随后为桑格DNA测序。用aTc处理的培养物仅具有非靶向对照gRNA。图5C：将M1+S1_aTc100的培养物稀释(10^-6)，并且涂抹到BHI血琼脂平板(Gm 200、Em 25)上，并且在37℃下厌氧温育40小时，以获得单个菌落。对于5个选择的单个菌落和来自琼脂平板的刮取混合物执行扩增引导RNA区域的菌落PCR，随后为桑格DNA测序，显示了所有生长的克隆仅包含非靶向、对照gRNA。

图6示出了在普通拟杆菌(Bv)的染色体上的CRISPR整合。挑选来自每次接合的菌落Bv.M (标记为VM1、VM2、VM3、VM4、VM5、VM6和VM7)和susC_Bv (标记为V1、V2、V3、V4、V5)，用于菌落PCR筛选。0，Bv野生型菌株；M，DNA梯。PCR A (外部引物，0.5或0 kb)用于筛选在attBv.3-1基因座的整合；PCR B (外部引物，0.5或0 kb)用于筛选在attBv.3-2基因座的整合，并且PCR C (外部引物，0.6或0 kb)用于筛选在attBv.3-3基因座的整合。PCR D (与ermG编码序列结合的外部引物和内部引物，0.6或0 kb：attBv.3-1基因座整合的左连接点)用于确认所选克隆的整合染色体和整合质粒序列的连接。左图：具有非靶向、对照引导RNA(M)的整合菌株；右图：具有靶向susC_Bv引导RNA的整合菌株。

图7A-7C示出了多形拟杆菌CRISPR-突变体生长的表征。图7A：用于改造多形拟杆菌VPI-5482 CRISPR突变体的质粒设计。图7B：在血琼脂平板± 200 ng/mL aTc上培养的Bt突变体，其含有乱序gRNA或tdk靶向gRNA。图7C：当在含有9 ng/mL aTc的LYBHI培养基中生长时，Bt CRISPR突变体达到OD600=0.2所需时间的箱线图。

图8A-8D示出了多形拟杆菌敲减。图8A：实验设计。箭头指定了联合体管饲到成年雄性无菌C57Bl/6J小鼠内的时间；当未施用aTc时，每只受体小鼠在第1-8天时接受0.5%乙醇媒介物。图8B、8C：通过水平条显示了对于每种治疗条件和aTc暴露，Bt或解纤维素拟杆菌跨越时间的相对丰度。图8D：热图展示了相对于媒介物对照臂，在四天治疗臂中的每个时间点(行)，每个联合体成员(列)的中值相对丰度(%)的差异。

图9A-B示出了多形拟杆菌省略。图9A：实验设计。箭头指定了13或12个成员的联合体的引入时间。图9B：热图展示了相对于13个成员(12种菌株 + Bt)的群落臂，在12个成员的群落治疗臂中的每个时间点(行)，每个联合体成员(列)的中值相对丰度(%)的差异。

图10示出了使用稳定维持的、诱导型CRISPR***的靶向微生物群调节。CRISPR***(Cas9核酸内切酶和引导RNA)的表达导致细菌中的染色体断裂以及最终的细胞死亡。因此，在脱水四环素(aTc)诱导后，可以从混合群体中原位消除包含具有靶向引导RNA的稳定维持的CRISPR盒的特定拟杆菌属菌株。

图11A-D是血琼脂平板的照片。图11A示出了在血BHI平板上，伴随和不伴随aTc诱导(在左侧上没有aTc，而在右侧上100 ng/ml aTc)，多形拟杆菌中靶向susC的pRepA-CRISPR的10^-4稀释度。图11B示出了在血BHI平板上，伴随和不伴随aTc诱导(在左侧上没有aTc，而在右侧上100 ng/ml aTC)，多形拟杆菌中靶向susC的pRepA-CRISPR的10^-6稀释度。图11C示出了在血BHI平板上，伴随和不伴随aTc诱导(在左侧上没有aTc，而在右侧上100 ng/ml aTC)，多形拟杆菌中的非靶向pRepA-CRISPR的10^-4稀释度。图11D示出了在血BHI平板上，伴随和不伴随aTc诱导(在左侧上没有aTc，而在右侧上100 ng/ml aTC)，多形拟杆菌中的非靶向pRepA-CRISPR的10^-6稀释度。

图12示出了使用整合的、诱导型CRISPR***的靶向微生物群调节。CRISPR***(Cas9核酸内切酶和引导RNA)的表达导致细菌中的染色体断裂以及最终的细胞死亡。因此，在脱水四环素(aTc)诱导后，可以从混合群体中原位消除包含具有靶向引导RNA的整合CRISPR盒的特定拟杆菌属菌株。

图13A-13B示出了质粒pNBU2-CRISPR.susC_BWH2-19仅整合到t-RNA-Ser基因BcellWH2_RS22795中的attBWH2位点处。质粒整合位点的5'端显示于图13A中，而质粒整合位点的3'端显示于图13B中。

图14示出了如实施例13中所述，在生长24小时后获取的OD_600nm读数。

具体实施方式

本公开内容提供了改造的RNA引导的核酸酶***，其可以用于通过选择性敲减靶向菌株的丰度来重塑复杂的微生物群体。特别地，RNA引导的核酸酶***被改造为靶向所靶向的原核物种的染色体DNA中的位点，其中术语“原核”指细菌和古细菌界的成员。本文公开的组合物和方法可以用于操纵离体以及活动物内的微生物群落组成。

(I) 蛋白质-核酸复合物

本公开内容的一个方面提供了蛋白质-核酸复合物，其包含与原核生物的染色体缔合的改造的RNA引导的核酸酶***，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***靶向染色体中的位点，所述细菌染色体编码HU家族DNA结合蛋白，其包含与SEQ ID NO: 1 (MNKADLISAVAAEAGLSKVDAKKAVEAFVSTVTKALQEGDKVSLIGFGTFSVAERSARTGINPSTKATITIPAKKVTKFKPGAELADAIK)的氨基酸序列具有至少50%序列同一性的氨基酸序列，并且与HU家族DNA结合蛋白相关的细菌物种的染色体与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少50%的序列同一性。一般而言，靶向细菌物种的染色体DNA的RNA引导的核酸酶***不同于对于目的生物体内源性的天然存在的RNA-引导核酸酶(例如，CRISPR)***。

RNA引导的核酸酶***包含DNA核酸内切酶(例如，CRISPR核酸酶)，其切割活性由RNA (例如，引导RNA)指导。原核生物表达与原核生物的染色体DNA结合的HU家族蛋白。因此，本文公开的蛋白质-核酸复合物包含与DNA/蛋白质复合物(原核染色体DNA和相关的HU家族蛋白)结合的核糖核蛋白复合物(CRISPR核酸酶/gRNA)。

(a) RNA引导的核酸酶***

本文公开的蛋白质-核酸复合物包含RNA引导的核酸酶***，其包含切割活性由引导RNA (gRNA)指导的DNA核酸内切酶。如下文详述的，gRNA可以被改造以识别且靶向目的核酸(例如，原核染色体)中的特定序列。

一般而言，RNA引导的核酸内切酶是成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)核酸酶。CRISPR核酸酶可以是细菌或古细菌的。在一些情形下，CRISPR核酸酶可以来自I型CRISPR***、II型CRISPR***、III型CRISPR***、IV型CRISPR***、V型CRISPR***或VI型CRISPR***。在具体实施方案中，CRISPR核酸酶可以来自单亚基效应***，例如II型、V型或VI型***。在各个实施方案中，CRISPR核酸酶可以是II型Cas9核酸酶、V型Cas12 (以前称为Cpf1)核酸酶、VI型Cas13 (以前称为C2cd)核酸酶、CasX核酸酶或CasY核酸酶。

CRISPR核酸酶可以来自单细胞蓝藻菌属物种(Acaryochloris spp.)、醋卤菌属物种(Acetohalobium spp.)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus spp.)、酸硫杆菌属物种(Acidithiobacillus spp.)、热酸菌属物种(Acidothermus spp.)、艾克曼氏菌属物种(Akkermansia spp.)、脂环酸芽孢杆菌属物种(Alicyclobacillus spp.)、异色菌属物种(Allochromatium spp.)、制氨菌属物种(Ammonifex spp.)、鱼腥藻属物种(Anabaena spp.)、节旋藻属物种(Arthrospira spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、伯克氏菌目物种(Burkholderiales spp.)、热解纤维素菌属物种(Caldicelulosiruptor spp.)、弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp.)、韧皮杆菌属物种(Candidatus spp.)、梭菌属物种(Clostridium spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、鳄球藻属物种(Crocosphaera spp.)、蓝杆藻属物种(Cyanothece spp.)、δ变形杆菌属物种(Deltaproteobacterium spp.)、微小杆菌属物种(Exiguobacterium spp.)、大芬戈尔德菌属物种(Finegoldia spp.)、弗朗西斯氏菌属物种(Francisella spp.)、纤线杆菌属物种(Ktedonobacter spp.)、毛螺菌科物种(Lachnospiraceae spp.)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、纤毛菌属物种(Leptotrichia spp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya spp.)、海杆菌属物种(Marinobacter spp.)、甲烷盐菌属物种(Methanohalobium spp.)、微颤菌属物种(Microscilla spp.)、微鞘藻属物种(Microcoleus spp.)、微囊藻属物种(Microcystis spp.)、支原体属物种(Mycoplasma spp.)、盐碱厌氧菌属物种(Natranaerobius spp.)、奈瑟球菌属物种(Neisseria spp.)、硝酸盐裂解菌属物种(Nitratifractor spp.)、亚硝化球菌属物种(Nitrosococcus spp.)、拟诺卡氏菌属物种(Nocardiopsis spp.)、节球藻属物种(Nodularia spp.)、念珠藻属物种(Nostoc spp.)、酒球菌属物种(Oenococcus spp.)、颤藻属物种(Oscillatoria spp.)、副萨特氏菌属物种(Parasutterella spp.)、Pelotomaculum属物种(Pelotomaculum spp.)、热袍菌属物种(Petrotoga spp.)、浮霉菌属物种(Planctomyces spp.)、极地单胞菌属物种(Polaromonas spp.)、普雷沃菌属物种(Prevotella spp.)、假交替单胞菌属物种(Pseudoalteromonas spp.)、雷尔氏菌属物种(Ralstonia spp.)、瘤胃球菌属物种(Ruminococcus spp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)、链孢囊菌属物种(Streptosporangium spp.)、聚球藻属物种(Synechococcus spp.)、栖热腔菌属物种(Thermosipho spp.)、疣微菌门物种(Verrucomicrobia spp.)或沃林氏菌属物种(Wolinella spp.)。

在一些方面，CRISPR核酸酶可以是化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9、新泽西弗朗西斯菌(Francisella novicida) Cas9、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cas9、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) Cas9、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus) Cas9、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)Cas9、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitis) Cas9、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea) Cas9、新泽西弗朗西斯菌Cas12、氨基酸球菌属物种Cas12、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 Cas12a、瓦氏纤毛菌(Leptotrichia wadeii)Cas13a、沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii) Cas13a、普雷沃菌属物种P5-125 Cas13、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens) Cas13d、δ变形杆菌属CasX、浮霉菌属CasX或韧皮杆菌属CasY。

CRISPR核酸酶可以是野生型或天然存在的蛋白质。野生型CRISPR核酸酶一般包含两个核酸酶结构域，例如，Cas9核酸酶包含RuvC和HNH结构域，其各自切割双链序列的一条链。CRISPR核酸酶还包含与引导RNA (例如，REC1、REC2)或RNA/DNA异源双链体(例如，REC3)相互作用的结构域，以及与前间隔序列邻近基序(PAM)相互作用的结构域(即PAM相互作用结构域)。

可替代地，CRISPR核酸酶可以进行修饰，以具有改善的靶向特异性、改善的保真度、改变的PAM特异性、减少的脱靶效应和/或增加的稳定性。例如，CRISPR核酸酶可以进行修饰，以包含一种或多种突变(即，至少一个氨基酸的取代、缺失和/或***)。改善靶向特异性、改善保真度和/或减少脱靶效应的一种或多种突变的非限制性实例包括N497A、R661A、Q695A、K810A、K848A、K855A、Q926A、K1003A、R1060A和/或D1135E (参考SpyCas9的编号***)。

在各个实施方案中，CRISPR核酸酶可以是核酸酶(即，切割双链核苷酸序列的两条链或切割单链核苷酸序列)。在其它实施方案中，CRISPR核酸酶可以是切口酶，其切割双链序列的一条链。可以经由CRISPR核酸酶的核酸酶结构域之一的失活来改造切口酶。例如，Cas9蛋白的RuvC结构域可以通过突变例如D10A、D8A、E762A和/或D986A而失活，或者Cas9蛋白的HNH结构域可以通过突变例如H840A、H559A、N854A、N856A和/或N863A而失活(参考化脓性链球菌Cas9，SpyCas9的编号***)，以生成Cas9切口酶(例如nCas9)。其它CRISPR核酸酶中的可比较突变可以生成切口酶(例如nCas12)。

CRISPR***还包含引导RNA。引导RNA与CRISPR核酸酶和目的核酸中的靶序列相互作用，并且将CRISPR核酸酶引导至靶序列。靶序列没有序列限制，除了序列与前间隔序列邻近基序(PAM)序列相邻之外。不同的CRISPR核酸酶识别不同的PAM序列。例如，Cas9蛋白的PAM序列包括5'-NGG、5'-NGGNG、5'-NNAGAAW、5'-NNNNGATT和5-NNNNRYAC，并且Cas12蛋白的PAM序列包括5'-TTN和5'-TTTV，其中N定义为任何核苷酸，R定义为G或A，W定义为A或T，Y定义为C或T，而V定义为A、C或G。一般而言，Cas9 PAM定位于靶序列的3'，而Cas12 PAM定位于靶序列的5'。

引导RNA被改造为与特定的CRISPR核酸酶复合。一般而言，引导RNA包含(i)CRISPR RNA (crRNA)，其含有在5'端处的在靶位点处杂交的引导或间隔区序列，以及(ii)与CRISPR核酸酶相互作用的反式作用crRNA (tracrRNA)序列。每种引导RNA的引导或间隔区序列是不同的(即，是序列特异性的)。引导RNA序列的剩余部分在设计为与特定CRISPR核酸酶复合的引导RNA中一般是相同的。

crRNA包含在5'端处的引导序列，以及在3'端处的另外序列，其与在tracrRNA的5'端处的序列碱基配对以形成双链体结构，并且tracrRNA包含形成与CRISP核酸酶相互作用的至少一个茎环结构的另外序列。引导RNA可以是单个分子(例如，单引导RNA (sgRNA)或1片sgRNA)，其中所述crRNA序列与tracrRNA序列连接。可替代地，引导RNA可以是包含crRNA和tracrRNA的两个分开的分子(例如，2片gRNA)。

crRNA引导序列被设计为与目的核酸中的靶序列(即前间隔序列)的互补体杂交。一般而言，引导序列和靶序列之间的互补性为至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。在具体实施方案中，互补性是完全的(即，100%)。在各个实施方案中，crRNA引导序列的长度范围可以为约15个核苷酸至约25个核苷酸。例如，crRNA引导序列的长度可以为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在具体实施方案中，引导的长度是约19、20或21个核苷酸。在一个实施方案中，crRNA引导序列具有20个核苷酸的长度。在某些实施方案中，crRNA可以包含与tracrRNA相互作用的另外的3'序列。另外序列可以包含约10至约40个核苷酸。在其中引导RNA包含单个分子的实施方案中，gRNA的crRNA和tracrRNA部分可以通过形成环的序列连接。形成环的序列的长度范围可以为约4个核苷酸至约10个或更多个核苷酸。

如上文提到的，tracrRNA包含形成至少一个茎环结构的重复序列，其与CRISPR核酸酶相互作用。每个环和茎的长度可以变化。例如，环的长度范围可以为约3至约10个核苷酸，而茎的长度范围可以为约6至约20个碱基对。茎可以包含1至约10个核苷酸的一个或多个凸起。引导RNA中的tracrRNA序列一般基于与野生型CRISPR核酸酶相互作用的野生型tracrRNA的序列。野生型序列可以进行修饰，以促进二级结构形成、增加二级结构稳定性等等。例如，可以将一种或多种核苷酸变化引入引导RNA序列内。tracrRNA序列的长度范围可以为约50个核苷酸至约300个核苷酸。在各个实施方案中，tracrRNA的长度范围可以为约50至约90个核苷酸、约90至约110个核苷酸、约110至约130个核苷酸、约130至约150个核苷酸、约150至约170个核苷酸，约170至约200个核苷酸、约200至约250个核苷酸或约250至约300个核苷酸。tracrRNA可以包含在tracrRNA的3'端处的任选延伸。

引导RNA可以包含标准核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，引导RNA可以包含标准或修饰的脱氧核糖核苷酸。在其中酶促合成(即，在体内或体外)引导RNA的实施方案中，引导RNA一般包含标准核糖核苷酸。在其中化学合成引导RNA的实施方案中，引导RNA可以包含标准或修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸包括碱基修饰(例如假尿苷、2-硫代尿苷、N6-甲基腺苷等等)和/或糖修饰(例如2'-O-甲基、2'-氟、2'-氨基、锁核酸(LNA)等等)。引导RNA的骨架也可以进行修饰，以包含硫代磷酸酯键合、硼烷磷酸酯键合或肽核酸。

CRISPR核酸酶***的引导RNA被改造为将CRISPR核酸酶***靶向原核染色体DNA中的特定位点，使得可以形成如上所述的蛋白质-核酸复合物。一般而言，蛋白质-核酸复合物在原核生物内形成。

在一些实施方案中，改造的CRISPR核酸酶***可以整合到原核生物的染色体内并由其表达。在其它实施方案中，改造的CRISPR核酸酶***可以在染色体外载体上携带并由其表达。可以调控改造的CRISPR核酸酶***的表达。例如，改造的CRISPR核酸酶***的表达可以由诱导型启动子调控。

(b) 原核染色体

本文公开的蛋白质-核酸复合物进一步包含原核染色体，其中所述原核染色体编码HU家族DNA结合蛋白，其包含与SEQ ID NO: 的氨基酸序列具有至少50%序列同一性的氨基酸序列，并且原核生物的染色体DNA与HU家族DNA结合蛋白缔合。DNA结合蛋白的HU家族包含小的(~ 90个氨基酸)碱性组蛋白样蛋白，其结合双链DNA而无序列特异性，并且结合DNA结构如叉、三/四向连接、切口、突出端和凸起。HU家族DNA结合蛋白的结合可以稳定DNA，并且保护其免于在极端环境条件下的变性。

染色体可以在细菌或古细菌界的成员内。在一些实施方案中，生物体是细菌物种或该物种的不同菌株。在一些实施方案中，HU家族DNA结合蛋白包含与SEQ ID NO: 1具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的序列同一性的氨基酸序列。

在具体实施方案中，原核生物是拟杆菌属的成员。拟杆菌属物种是哺乳动物肠道微生物群的占优势厌氧共生体。它们含有各种糖分解酶，并且是肠道中多糖的主要发酵剂。当保留在肠道中时，它们维持与宿主复杂且一般有益的关系，但如果它们逃离这个环境，则可以引起显著的病理状况。拟杆菌属物种的非限制性实例包括产酸拟杆菌(B. acidifaciens)、B. bacterium、巴恩斯氏拟杆菌(B. barnesiaes)、粪拟杆菌(B. caccae)、B. caecicola、B. caecigallinarum、多毛拟杆菌(B. capillosis)、解纤维素拟杆菌、溶纤维素拟杆菌(B. cellulosolvens)、B. clarus、凝固拟杆菌(B. coagulans)、粪居拟杆菌(B. coprocola)、B. coprophilus、猪粪拟杆菌(B. coprosuis)、吉氏拟杆菌(B. distasonis)、多氏拟杆菌(B. dorei)、埃氏拟杆菌(B. eggerthii)、B. gracilis、B. faecichinchillae、B. faecis、芬氏拟杆菌(B. finegoldii)、B. fluxus、脆弱拟杆菌、半乳糖醛酸拟杆菌(B. galacturonicus)、B. gallinaceum、B. gallinarum、金氏拟杆菌(B. goldsteinii)、B. graminisolvens、溃疡拟杆菌、解肝素拟杆菌(B. heparinolyticus)、肠拟杆菌(B. intestinalis)、B. johnsonii、B. luti、马赛拟杆菌(B. massiliensis)、产黑色素拟杆菌(B. melaninogenicus)、B. neonati、诺德氏拟杆菌(B. nordii)、B. oleiciplenus、口拟杆菌(B. oris)、卵形拟杆菌、B. paurosaccharolyticus、平常拟杆菌(B. plebeius)、B. polypragmatus、B. propionicifaciens、腐败拟杆菌(B. putredinis)、化脓拟杆菌(B. pyogenes)、B. reticulotermitis、B. rodentium、萨氏拟杆菌、B. salyersiae、B. sartorii、B. sediment、粪便拟杆菌(B. stercoris)、B. stercorirosoris、猪拟杆菌(B. suis)、隐蔽拟杆菌(B. tectus)、多形拟杆菌、B. timonensis、单形拟杆菌、普通拟杆菌、解木糖拟杆菌、解木聚糖拟杆菌(B. xylanolyticus)和B. zoogleoformans。

在一些实施方案中，原核染色体是选自多形拟杆菌、普通拟杆菌、解纤维素拟杆菌、脆弱拟杆菌、溃疡拟杆菌、卵形拟杆菌、萨氏拟杆菌、单形拟杆菌或解木糖拟杆菌的染色体。

在一些实施方案中，染色体选自巴恩斯氏菌属物种(Barnesiella sp.)、肠居巴恩斯氏菌(Barnesiella viscericola)、二氧化碳嗜纤维菌属物种(Capnocytphaga sp.)、内脏臭气杆菌(Odoribacter splanchnicus)、Paludibacter物种、副拟杆菌属物种(Parabacteroides sp.)、紫单胞菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)和Schleiferia物种。

(c) 特定的蛋白质-核酸复合物

在具体实施方案中，蛋白质-核酸复合物可以包含改造的CRISPR Cas9/gRNA***或改造的CRISPR Cas12/gRNA***，其与拟杆菌属染色体结合或缔合。

(II) 用于生成蛋白质-核酸复合物的方法

本公开内容的一个进一步方面提供了用于生成如上所述的复合物的方法，所述复合物包含改造的RNA引导的(CRISPR)核酸酶***和编码HU家族DNA结合蛋白的原核染色体。所述方法包括(a)改造CRISPR核酸酶***，以靶向原核生物染色体中的位点，并且(b)将改造的CRISPR核酸酶***引入原核生物内。

改造CRISPR核酸酶***包括设计引导RNA，其crRNA引导序列靶向原核染色体中的特定(~19-22 nt)序列，所述特定序列与PAM序列(其由目的CRISPR核酸酶识别)相邻，并且其tracrRNA序列由目的CRISPR核酸酶识别，如上文部分(I) (a)中所述。改造的CRISPR***可以作为编码核酸引入原核生物内。例如，编码核酸可以是载体的部分。用于递送或引入各种载体的手段是本领域众所周知的。

编码改造的CRISPR***(即CRISPR核酸酶和引导RNA)的载体可以是质粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、细菌噬菌体载体、细菌噬菌体-质粒杂合载体或其它合适的载体。载体可以是整合载体、接合载体、穿梭载体、表达载体、染色体外载体等等。

编码CRISPR核酸酶的核酸序列可以与启动子可操作地连接，用于在原核生物中表达。在具体实施方案中，与改造的CRISPR核酸酶可操作地连接的启动子可以是调控型启动子。在一些方面，调控型启动子可以由启动子诱导化学制品调控。在此类实施方案中，启动子可以是pTetO，其基于大肠杆菌Tn10衍生的tet调控***，并且由含有强tet操纵子(tetO)的分枝杆菌启动子和阻遏物(TetR)的表达盒组成，并且启动子诱导化学制品可以是脱水四环素(aTc)。在其它实施方案中，启动子可以是pBAD或araC-ParaBAD，并且启动子诱导化学制品可以是***糖。在进一步的实施方案中，启动子可以是pLac或tac (trp-lac)，并且启动子诱导化学制品可以是乳糖/IPTG。在其它实施方案中，启动子可以是pPrpB，并且启动子诱导化学制品可以是丙酸盐。

编码至少一种引导RNA的核酸序列可以与启动子可操作地连接，用于在目的原核生物中表达。在其中目的原核生物是拟杆菌属的实施方案中，组成型启动子可以是P1启动子，其位于多形拟杆菌16S rRNA基因BT_r09的上游(Wegmann等人，Applied Environ. Microbiol.，2013，79:1980-1989)。其它合适的拟杆菌属启动子包括P2、P1T_D、P1T_P、P1T_DP(Lim等人，Cell，2017，169:547-558)、P_AM、P_cfiA、P_cepA、P_BT1311 (Mimee等人，Cell Systems，2015，1:62-71)或前述启动子中任一种的变体。在其它实施方案中，组成型启动子可以是大肠杆菌σ⁷⁰启动子或其衍生物、枯草芽孢杆菌(B. subtilis) σ^A启动子或其衍生物、或沙门氏菌属(Salmonella) Pspv2启动子或其衍生物。本领域技术人员熟悉适合于目的原核生物的另外的组成型启动子。

在一些实施方案中，载体可以是整合载体，并且可以进一步包含编码重组酶的序列、以及一个或多个重组酶识别位点。一般而言，重组酶是不可逆的重组酶。合适重组酶的非限制性实例包括拟杆菌属intN2酪氨酸整合酶(由NBU2基因编码)、链霉菌属(Streptomyces)噬菌体phiC31 (φC31)重组酶、大肠杆菌噬菌体P4重组酶、大肠杆菌噬菌体λ整合酶、李斯特菌属(Listeria) A118噬菌体重组酶和放线菌噬菌体R4 Sre重组酶。重组酶/整合酶介导两个序列特异性识别(或附着)位点(例如attP位点和attB位点)之间的重组。在一些实施方案中，载体可以包含重组酶识别位点之一(例如，attP)，并且另一个重组酶识别位点(例如，attB)可以定位于原核生物的染色体中(例如，接近tRNA-ser基因)。在此类情形下，整个载体可以整合到原核生物的染色体内。在其它实施方案中，编码改造的CRISPR核酸酶***的序列的侧翼可以是两个重组酶识别位点，使得仅编码改造的CRISPR核酸酶***的序列整合到原核染色体内。

上述载体中的任一种都可以进一步包含至少一个转录终止序列，以及至少一个复制起点和/或至少一个可选择标记物序列(例如抗生素抗性基因)，用于在目的原核细胞中的繁殖和选择。

关于载体及其使用的另外信息可以在“Current Protocols in MolecularBiology” Ausubel等人，John Wiley & Sons，New York，2003，或“Molecular Cloning: ALaboratory Manual” Sambrook & Russell，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，第3版，2001中找到。

在其中编码改造的CRISPR核酸酶***的载体是整合载体的实施方案中，在载体递送至细菌(和重组酶/整合酶的表达)后，编码改造的CRISPR***的核酸(或整个载体)可以稳定地整合到细菌染色体内。在其中编码改造的CRISPR核酸酶***的载体并非整合载体的实施方案中，在载体递送至微生物后，载体可以保持在染色体外。

在其中编码CRISPR核酸酶的序列与诱导型启动子可操作连接的实施方案中，CRISPR核酸酶***的表达可以通过将启动子诱导化学制品引入原核生物内进行调控。在具体实施方案中，启动子诱导化学制品可以是脱水四环素。在诱导后，CRISPR核酸酶被合成并与至少一种引导RNA复合，所述引导RNA将CRISPR核酸酶***靶向细菌染色体中的靶位点，从而形成如本文公开的蛋白质-核酸复合物。

(III) 用于调节微生物群的组成的方法

本公开内容的一个进一步方面涵盖通过选择性地减缓混合微生物群体中的靶微生物(原核生物)生长，用于改变微生物群的群体和组成的方法。该方法包括在靶原核生物中表达改造的RNA引导的(CRISPR)核酸酶***，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***靶向靶原核生物的染色体中的位点，使得将至少一个双链断裂引入靶原核生物的染色体中，从而减缓靶原核生物的生长或繁殖。在染色体DNA中包含至少一个双链断裂的靶原核生物的生长减缓或停止，因为DNA断裂在原核生物中一般不被修复或修复效率低下。减缓靶原核生物的生长导致混合的原核生物群体中靶原核生物的水平降低或消除。

上文部分(I) (a)中所述的任何CRISPR核酸酶***都可以如上文部分(II)中所述进行改造，以靶向目的原核生物的染色体中的位点，其在上文部分(I) (b)中进行描述。改造的CRISPR核酸酶***可以作为载体的部分引入原核生物内，如上文部分(II)中所述。一般而言，CRISPR核酸酶是可诱导的(即，其编码序列可操作地连接至诱导型启动子)。因此，CRISPR核酸酶可以在限定的时间点表达。在不存在启动子诱导化学制品的情况下，无法生成CRISPR核酸酶***。CRISPR核酸酶可以通过将原核生物暴露于启动子诱导化学制品来产生，使得CRISPR核酸酶由如上文部分(II)中所述的染色体整合的编码序列或染色体外编码序列表达。CRISPR核酸酶与至少一种引导RNA复合，所述引导RNA由染色体整合的编码序列或染色体外编码序列组成型表达，从而形成活性CRISPR核酸酶***。CRISPR核酸酶***靶向原核染色体中的靶位点，在其中它将双链断裂引入染色体DNA中。双链断裂导致靶原核生物的生长减缓和/或死亡。结果，混合的原核生物群体具有降低或消除水平的靶原核生物。

在一些实施方案中，靶原核生物可以是拟杆菌属物种，如上文部分(I) (b)中详述的。

可以将改造的CRISPR***引入混合的原核生物群体内的靶原核生物内。可替代地，可以将改造的CRISPR***引入靶原核生物内，然后将所述靶原核生物与混合的原核生物群体混合。

在一些实施方案中，混合的原核生物群体可以包含在细胞培养物中，其中暴露于启动子诱导化学制品导致靶原核生物的水平降低或消除。

在其它实施方案中，混合的原核生物群体可以包含在哺乳动物的消化道(或肠道)中，其中启动子诱导化学制品的施用导致肠道微生物群中靶原核生物的水平降低或消除。启动子诱导化学制品可以经口(例如，经由食物、饮料或药物制剂)施用。哺乳动物可以是小鼠、大鼠或其它研究动物。在具体实施方案中，哺乳动物可以是人。靶原核生物(例如，拟杆菌属)的降低或消除可以导致改善的肠道健康。

混合的原核生物群体(在细胞培养物或消化道中)可以包含广泛多样的分类群。例如，人肠道微生物群可以包含数百个不同的细菌物种和这些物种的许多菌株水平的变体。

在某些实施方案中，哺乳动物(例如，人)可以经历癌症免疫疗法，其中与无应答者相比，免疫疗法应答者已显示在其肠道微生物群中具有较低水平的拟杆菌属物种(Gopalakrishnan等人，Science，2018，359:97-103)。因此，肠道微生物群中的拟杆菌属物种水平的降低可能导致更好的人癌症免疫治疗结果。

在某些实施方案中，哺乳动物(例如，人、犬科动物、猫科动物、猪科动物、马科动物或牛科动物)可以出于多种原因而经历肠道手术，所述原因包括但不限于炎性肠病、克罗恩氏病、憩室炎、肠阻塞、息肉切除、癌性组织切除、溃疡性结肠炎、肠切除术、直肠切除术、完全结肠切除术或部分结肠切除术，其中通过诱导型CRISPR***在术前减弱哺乳动物肠道内的脆弱拟杆菌物种，可以降低在肠道外但在哺乳动物体内的定位处的术后脆弱拟杆菌感染风险。肠道外的定位包括肠道的外表面。可以将脆弱拟杆菌内的诱导型CRISPR***靶向切割或修饰与致病岛、毒素(即脆弱拟杆菌毒素或BFT)、或者与脆弱拟杆菌的感染性菌株或已知引起术后感染的其它天然肠道原核生物相关的其它独特序列相似的定位，但不限于此。例如，非产毒脆弱拟杆菌(NTBF)和产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)的水平可以使用置于ETBF菌株而非NTBF菌株内的改造的诱导型CRISPR***进行选择性调节。在肠道手术后引起感染的其它细菌分类群可能包括多毛拟杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、溶血孪生球菌(Gamella haemolysan)和摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)。诱导型CRISPR***递送至肠道微生物群可以作为益生菌治疗的部分，在手术前、手术过程中或手术后发生。诱导型CRISPR***递送至靶原核生物可以在哺乳动物体外或哺乳动物体内发生。诱导型CRISPR***递送至靶原核生物可以经由核酸载体例如质粒或细菌噬菌体而发生。质粒的递送可以经由电穿孔、化学转化或细菌与细菌的接合而发生。

在各个实施方案中，相对于CRISPR核酸酶表达前的水平，靶原核生物的水平可以降低至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约99%。在某些实施方案中，在CRISPR核酸酶表达后，靶原核生物可以在混合的原核生物群体中降低到无法检测的水平。

(IV) 作为益生菌的CRISPR整合的原核生物

本公开内容的又一个方面涵盖用作益生菌的改造的原核生物。改造的原核生物包含在部分(I)中所述的任何改造的CRISPR核酸酶***，其整合到原核染色体内或作为附加型载体维持在原核细胞内。在一些实施方案中，改造的原核生物是改造的拟杆菌属，其包含诱导型CRISPR核酸酶***。向哺乳动物受试者施用改造的拟杆菌属，随后为CRISPR***的诱导，可以用于降低肠道微生物群中拟杆菌属菌株的相对丰度。在其它实施方案中，拟杆菌属菌株可以进行改造，以在与肠道微生物群中拟杆菌属的野生型菌株的竞争中胜出。在这些及其它实施方案中，然后可以通过诱导型CRISPR核酸酶***的诱导，从哺乳动物受试者中移出对于哺乳动物受试者提供治疗益处的改造的拟杆菌属菌株。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人(编辑)，Springer Verlag (1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文使用的，除非另有说明，否则下述术语具有归于其的含义。

当介绍本公开内容或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”预期意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”预期是包含性的，并且意指可以存在除所列要素外的另外要素。

当关于数值x使用时，术语“约”例如意指x ± 5%。

如本文使用的，术语“互补的”或“互补性”指通过特定氢键的碱基配对的双链核酸缔合。碱基配对可以是标准的沃森-克里克碱基配对(例如5’-A G T C-3’与互补序列3’-TC A G-5’配对)。碱基配对也可以是Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。互补性通常关于双链体区域进行测量，并且因此，例如排除突出端。如果仅一些(例如70%)碱基是互补的，则双链体区域的两条链之间的互补性可以是部分的，并且表示为百分比(例如70%)。并不互补的碱基是“错配的”。如果双链体区域中的所有碱基都是互补的，则互补性也可以是完全的(即，100%)。

关于基因或多核苷酸的术语“表达”指基因或多核苷酸的转录，以及适当时mRNA转录物翻译成蛋白质或多肽。因此，如根据上下文中将明确的，蛋白质或多肽的表达起因于开放读码框的转录和/或翻译。

如本文使用的，“基因”指编码基因产物的DNA区域(包括外显子和内含子)，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码序列和/或转录序列相邻。相应地，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。

术语“异源的”指对于目的细胞并非内源或天然的实体。例如，异源蛋白质指衍生自或最初衍生自外源来源(例如外源引入的核酸序列)的蛋白质。在一些情况下，异源蛋白质通常并非由目的细胞产生。

与术语“核酸内切酶”可互换使用的术语“核酸酶”指切割双链核酸序列的两条链或切割单链核酸序列的酶。

术语“核酸”和“多核苷酸”指呈线性或环状构象、以及以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开内容的目的，这些术语不应解释为关于聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯骨架)中修饰的核苷酸。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。

术语“核苷酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可以是标准核苷酸(即，腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)，核苷酸异构体或核苷酸类似物。核苷酸类似物指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如肌苷、假尿苷等)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基的添加(或去除)，以及碱基的碳和氮原子被其它原子的取代(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代寡核苷酸(morpholino)。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。

术语“靶序列”和“靶位点”可互换使用，以指CRISPR***所靶向的目的核酸(例如，染色体DNA或细胞RNA)中的特定序列，以及CRISPR***修饰核酸或与核酸缔合的蛋白质的位点。

用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。基因组序列也可以以这种方式来确定且比较。一般而言，同一性分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应关系。可以通过确定其同一性百分比来比较两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数目除以较短序列的长度，且乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman，Advancesin Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供。这种算法可以通过使用评分矩阵应用于氨基酸序列，所述评分矩阵由Dayhoff，Atlas of Protein Sequencesand Structure，M. O. Dayhoff编辑，5 suppl. 3：353-358，National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C.，USA开发，并且由Gribskov，Nucl. Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化。这种算法确定序列的同一性百分比的示例性实现由“BestFit”实用应用程序中的Genetics Computer Group(Madison，Wis.)提供。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其它合适程序是本领域一般已知的，例如，另一种比对程序是与缺省参数一起使用的BLAST。例如，可以使用下述缺省参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码=标准；过滤器=无；链=两条；截断=60；期望=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序方式=高得分；数据库=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在GenBank网站上找到。

由于可以在上述细胞和方法中作出各种变化，而不背离本发明的范围，因此预期上述说明和下文给出的实施例中包含的所有内容，都应该解释为示例性的而不是限制性的。

实施例

下述实施例示出了本公开内容的某些方面。

实施例1. 载体构建

使用来自pExchange-tdk的质粒骨架(RP4-oriT、R6K ori、bla、ermG)的Gibson克隆(NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix，New England Biolabs)、来自pNBU2-tetQb的NBU2整合酶、以及由合成DNA或化脓性链球菌菌株SF370的基因组DNA的PCR组装的脱水四环素(aTc)诱导型CRISPR盒(P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNA支架)，来构建CRISPR整合pNBU2-CRISPR质粒。图2示出了质粒设计。

质粒骨架包含用于在大肠杆菌中的氨苄青霉素选择的R6K复制起点和bla序列，用于接合的RP4-oriT序列和用于在拟杆菌属中的红霉素(Em)选择的ermG序列。NBU2编码intN2酪氨酸整合酶，其介导pNBU2-CRISPR质粒上的attN2位点与定位于拟杆菌属细胞的染色体上的attB位点之一之间的序列特异性重组。attN2和attB具有相同的13 bp识别核苷酸序列(5'-3')：CCTGTCTCTCCGC (SEQ ID NO: 2)。

诱导型CRISPR盒包括在TetR调节剂(P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9)的控制下的aTc诱导型SpCas9，以及在P1启动子(P1-N20 sgRNA支架)下组成型表达的引导RNA。如Lim等人，Cell，2017，169:547-558中所述，启动子和核糖体结合位点由多形拟杆菌16SrRNA基因的调控序列进行衍生且改造。引导RNA是与编码DNA序列、或非编码DNA序列、或非靶向乱序核苷酸序列同源的核苷酸序列。该序列可以是任何形式，只要它与不同的Cas9同源物的前间隔序列相邻基序(PAM)要求相容。引导RNA可以在tracrRNA和crRNA的分开的转录单元中，或融合成杂合的嵌合tracr/crRNA单引导(sgRNA)。

上述质粒的DNA序列呈现于SEQ ID NO: 3中：

实施例2. 在多形拟杆菌的染色体上的CRISPR整合

将pNBU2.CRISPR质粒转化到大肠杆菌S-17 λ-pir中，随后经由接合递送到拟杆菌属细胞。在该具体实例中，pNBU2-CRISPR质粒编码intN2酪氨酸整合酶，其介导在pNBU2-CRISPR质粒上的attN2位点与两个attBT位点之一之间的序列特异性重组，所述两个attBT位点定位于多形拟杆菌VPI-5482 (简称为Bt)的染色体上的两种tRNA-Ser基因BT_t70(attBT2-1)和BT_t71 (attBT2-2)的3'端中。pNBU2-CRISPR质粒的***使两种tRNA-Ser基因之一失活，并且由于tRNA-Ser的必要性，同时***BT_t70和BT_t71两者内是不太可能的。

在该具体实例中，构建了三种质粒，其表达非靶向对照引导RNA (称为“M”)、靶向Bt基因组中的tdk_Bt (BT_2275)和susC_Bt (BT_3702)编码序列的引导RNA。tdk基因编码胸苷激酶，而susC基因编码涉及多形拟杆菌中的淀粉结合的外膜蛋白。tdk_Bt的前间隔序列是5’-AATTGAGGCATCGGTCCGAA-3’ (SEQ ID NO: 4)，而susC_Bt的前间隔序列是5’-ATGACGGGAATGTACCCCAG-3’ (SEQ ID NO: 5)。针对拟杆菌属基因组的非靶向对照前间隔序列(5'-TGATGGAGAGGTGCAAGTAG-3'；SEQ ID NO: 6)的计算机分析并未导致任何显著的序列匹配，因此预计没有‘脱靶’活性。sgRNA支架序列是5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3” (SEQ ID NO:7)。所得到的质粒分别被称为pNBU2-CRISPR.M、pNBU2-CRISPR.tdk_Bt和pNBU2-CRISPR.susC_Bt。

用红霉素选择将pNBU2-CRISPR质粒与Bt细胞接合，每次接合导致500-1000个菌落(图3A、3B)。由于缺乏拟杆菌属的复制起点，这些质粒不能在拟杆菌属细胞中维持。红霉素抗性菌落很可能是染色体整合体。从每次接合中挑选四个菌落，其标记为M (M1、M2、M3、M4)、tdk_Bt (T1、T2、T3、T4)和susC_Bt (S1、S2、S3、S4)，用于在两个attBT基因座的任一处的CRISPR整合的菌落PCR筛选(图3C)。每个基因座的外部引物用于鉴定PCR扩增子大小：野生型或具有整合的质粒。由于整个质粒为约10 kb，因此使用菌落PCR获得关于其整合的PCR扩增子是不太可能的，而使用纯化的基因组DNA是可能的。对于每个基因座，进行使用外部引物的PCR。如果没有发生整合，则在凝胶上预计约0.5 kb (attBT2-1基因座)或0.65 kb(attBT2-2基因座)的PCR扩增子；否则，预计没有PCR产物。另外，使用与染色体序列结合的外部引物以及与来自整合质粒的ermG编码序列结合的内部引物，来执行扩增整合的左连接点的PCR。如果发生整合，则在凝胶上应该可见PCR产物；否则，预计没有PCR产物。PCR扩增用Q5 Hot-start 2X Master Mix (New England Biolabs)进行，使用下述循环条件：98℃ 30秒用于初始变性；98℃ 20秒，58℃ 20秒和72℃ 45秒的25个循环；以及在72℃下5分钟的最终延伸。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行分辨。如图3C中所示，基于使用外部引物的PCR A(attBT2-1基因座)和PCR B (attBT2-2基因座)的大小，推断克隆M1-M4、T1、T2、T4、S1、S3、S4全部包含在attBT2-1基因座处整合的CRISPR盒，而克隆T3和S2在Bt染色体上的attBT2-2基因座处整合。对于选择的克隆M1、M2、T1、T3、S1和S2，通过PCR (PCR C和D)和桑格DNA测序，进一步确认了染色体和质粒序列之间的连接是正确的。

实施例3. 各个多形拟杆菌菌株的诱导性CRISPR杀死

对于全部具有在attBT2-1基因座处整合的诱导型CRISPR盒的选择的多形拟杆菌CRISPR整合体M1、T1和S1，在BHI血琼脂平板或TYG液体培养基中调查了诱导型CRISPR/Cas9介导的细胞杀死(分别为图4A和图4B)。M1和T1菌株的单个菌落在含有5 ml TYG液体培养基的falcon管培养物中的coy室(Coy Laboratory Products Inc.)中厌氧生长过夜，所述TYG液体培养基补充有200 µg/ml庆大霉素(Gm)和25 µg/ml红霉素(Em)。将培养物稀释(10^-6)，并且将100µl涂抹到分别补充有浓度为0和100 ng/ml的脱水四环素(aTc)的BHI血琼脂平板(Gm 200 µg/ml和Em 25 µg/ml)上。使琼脂平板在37℃下厌氧温育2-3天。对于所有菌株，在不存在aTc (0 ng/ml)的血琼脂平板上获得了约10³-10⁴ CFU (菌落形成单位)。对于T1菌株，在存在aTc (100 ng/ml)的血琼脂平板上没有观察到CFU形成，而对于M1菌株仍获得10³-10⁴ CFU (图4A)。

类似地，除了M1之外，即使在37℃下厌氧温育4天后，在含有TYG培养基的液体管培养物中也没有观察到细胞生长，所述TYG培养基补充有以100 ng/ml的aTc。然而，在厌氧温育24小时后，在10 ng/ml的aTc浓度下，对于克隆T1和S2观察到轻微生长，提示了对于完全耗尽需要更高的aTc浓度(图4B)。数据显示了，染色体整合的CRISPR/Cas9***被外源提供的诱导剂aTc激活，以生成由靶向RNA (tdk_Bt或susC_Bt)引导的致命性基因组DNA切割，导致细胞活力的丧失。

实施例4. 在体外混合群体中多形拟杆菌细胞的靶向诱导性CRISPR杀死

采用表达非靶向(M)或靶向(tdk_Bt或susC_Bt)引导RNA的CRISPR整合的Bt菌株的混合培养物，以证实在体外混合群体中特定菌株的靶向CRISPR杀死。将等量的指数生长期培养物混合并在5 ml TYG液体培养基中厌氧温育，所述TYG液体培养基分别补充有终浓度为0、10或100 ng/ml的aTc。在24小时后，所有培养物都生长直到约1.3 OD_600nm(图5A)。对于一组aTc处理的培养物(分别补充有以0、10和100 ng/ml的aTc的M1 + T1)，在引导RNA (P1-N20 sgRNA支架)的区域上执行PCR和DNA测序。根据DNA测序层析图，aTc处理的培养物(aTc10和aTc 100)仅是包含非靶向、对照引导RNA (M)的那些细胞，而没有aTc处理的培养物(aTc 0)是包含非靶向引导RNA (M)和tdk_Bt靶向引导RNA两者的混合细胞群体(图5B)。

将aTc处理的培养物(M1 + S1-aTc100)之一稀释并涂抹到不含aTc补充的BHI血琼脂上，以获得单个菌落。通过gRNA区域的PCR，随后为桑格DNA测序，来分析在琼脂平板上的各个菌落以及菌落的刮取物。发现所有个别菌落和菌落混合物仅包含非靶向、对照gRNA，提示了包含susC_Bt gRNA的整合体通过aTc诱导性CRISPR杀死，而不是由于管培养物中诱导的Cas9蛋白表达本身的生长抑制成功地耗尽(图5C)。

对于M1+T1的混合培养物执行类似的实验，导致相同的观察。这些数据证实了在体外混合群体中多形拟杆菌细胞的靶向、诱导性CRISPR杀死。

实施例5. 不含抗生素选择的多形拟杆菌菌株的长期生长和靶向CRISPR杀死

连续有限稀释用于测试液体培养物中的长期生长和靶向杀死，而无任何抗生素选择。将CRISPR整合的Bt菌株M1、T1和S1从甘油原种接种到TYG培养基中，并且在37℃下在coy室中厌氧生长24小时。将培养物以1:100的稀释度重新接种到新鲜的TYG培养基内，并且厌氧生长另外24小时。将同样的程序重复4次，导致在液体培养基中约5天、40代的生长。然后将培养物涂抹到BHI血琼脂平板上，形成单个菌落。在补充有Gm (200 µg/ml)或Em (25 µg/ml)的BHI血琼脂平板上，测试了约50个菌落各自的抗生素抗性。所有测试的菌落都对两种抗生素是抗性的，提示了整合的Bt菌株中的CRISPR盒的长期维持。

实施例6. 在普通拟杆菌的染色体上的CRISPR整合

诱导型CRISPR盒也在普通拟杆菌ATCC 8482菌株(简称为Bv)的染色体上整合。用于在Bv上的染色体整合的pNBU2.CRISPR质粒如实施例1所述进行构建，除了克隆靶向Bv基因组上的susC_Bv (BVU_RS05095)的引导RNA之外。用于表达susC_Bv引导RNA的20 bp前间隔序列是5’-ATTCGGCAGTGAATTCCAGA-3’ (SEQ ID NO: 8)。

将表达非靶向、对照引导RNA (M)或susC_Bv靶向引导RNA的pNBU2-CRISPR质粒转化到大肠杆菌S17 λ-pir中，并且与Bv细胞接合。对于每次接合获得约10,000个Em抗性菌落。分别地，从非靶向对照接合平板中挑选七个菌落(标记为VM1、VM2、VM3、VM4、VM5、VM6和VM7)，并且从susC_Bv靶向接合平板中挑选五个菌落(标记为V1、V2、V3、V4、V5)，用于通过菌落PCR的染色体CRISPR整合筛选。Bv染色体上存在3个潜在的NBU2整合酶识别基因座，attBv.3-1 (tRNA-Ser，BVU_RS10595)、attBv.3-2 (BVU_RS21625)和attBv.3-3 (基因间区域，从3,171,462到3,171,474的核苷酸坐标)。对于每个基因座，使用外部引物进行PCR。如果没有发生整合，则在凝胶上预计约0.5 kb的PCR扩增子；否则，预计没有PCR产物。对于attBv.3-1基因座，使用与染色体序列结合的外部引物以及与来自整合质粒的ermG编码序列结合的内部引物，来执行扩增整合的左连接点的PCR。如果在attBv.3-1基因座处发生整合，则在凝胶上应该可见约0.6 kb PCR产物；否则，预计没有PCR产物。如图6中所示，对于非靶向、对照引导RNA整合体(VM)，所有七个克隆都包含在attBv.3-1基因座处的CRISPR整合；对于susC_Bv靶向引导RNA整合体(V)，克隆V1可能包含在attBv.3-1和attBv.3-2基因座两者处的CRISPR整合；克隆V2可能包含在attBv.3-1和attBv.3-3基因座两者处的CRISPR整合，并且对于克隆V3、V4和V5，它们全部仅包含在attBv.3-1基因座处的CRISPR盒整合。该数据集显示了，基于NBU2的CRISPR整合***在普通拟杆菌菌株中良好起作用。

实施例7. 普通拟杆菌的靶向诱导性CRISPR杀死

如实施例3中，各个CRISPR整合的Bv菌株VM1 (表达非靶向引导RNA)和V1、V2、V3、V4、V5 (都表达susC_Bv引导RNA)在TYG液体培养基中厌氧生长过夜。然后将培养物重新接种(1:100稀释)到补充有100 ng/ml aTc的新鲜TYG培养基中，随后在37℃下厌氧生长24小时。仅VM1培养物生长至高浊度，而表达靶向引导RNA的其它培养物并未显示出生长。

如实施例4中，VM1 (非靶向引导RNA)和V3 (表达susC_Bv引导RNA)的混合培养物用以100 ng/ml的aTc进行处理，随后为在TYG液体培养基中的厌氧温育24小时。培养物生长直到高浊度。混合培养物的引导RNA区域的PCR和DNA测序指示了处理的培养物仅含有表达非靶向、对照引导RNA的细胞。这证实了在诱导剂添加后，混合细胞群体中的特定普通拟杆菌菌株的靶向CRISPR杀死。

实施例8. 在其它拟杆菌属菌株的染色体上的CRISPR整合

基于公开的基因组序列，NBU2整合酶重组tRNA-ser位点(13 bp)是保守的，并且也存在于许多其它拟杆菌属菌株中，包括解纤维素拟杆菌、脆弱拟杆菌、溃疡拟杆菌、卵形拟杆菌、萨氏拟杆菌、单形拟杆菌和解木糖拟杆菌。表达靶向引导RNA的诱导型CRISPR盒可以整合到这些拟杆菌属菌株的染色体上(如实施例3和6中所述)，并且可以通过用aTc诱导剂处理来实现表达靶向引导RNA的特定菌株的靶向CRISPR杀死(如实施例4、5和7中所述)。

在其中特定物种的染色体上不存在NBU2整合酶位点的情形下，这些13个碱基对的DNA序列可以如本领域中描述的经由重组(例如，Cre/loxP)或等位基因交换容易地***染色体上，以允许染色体CRISPR整合和靶向菌株杀死。

实施例9. 作为人益生菌递送的CRISPR整合的拟杆菌属菌株

CRISPR整合的拟杆菌属菌株可以用作降低人肠道中野生型拟杆菌属菌株的相对丰度的方法。人黑色素瘤患者中的抗PD-1免疫疗法已显示取决于肠道微生物群中存在的拟杆菌属菌株而不同(Gopalakrishnan等人，Science，2018，359:97-103)。当与免疫治疗应答者相比，无应答者具有在其微生物群中的拟杆菌属菌株的相对量增加。在免疫疗法起始之前，可以经由诱导的整合CRISPR***执行拟杆菌属菌株消除，以改善人癌症免疫治疗的结果。

实施例10. 模型人肠道微生物群的拟杆菌属成员的表现中的CRISPR靶向减少

肠道微生物群是人健康的许多方面以及各种疾病的重要决定因素。对于肠道微生物群对宿主生物学的众多作用的快速增长的认识已刺激了开发针对微生物群的疗法的努力。这些新兴疗法中的许多已显示了对肠道微生物群的初始配置的惊人依赖性。因此，用于描绘微生物群的成员之间的生态关系的工具(例如，生态位划分，包括营养素的竞争/合作的基础)，将在有效针对微生物群的疗法推进中发挥重要作用(例如Patnode等人，2019)。

为了研究肠道微生物群落成员中的相互作用，我们开发了遗传***，其具有独立地干扰在限定的模型人肠道微生物群中特定肠道细菌菌株的表现的能力。该***使用多形拟杆菌实现，所述多形拟杆菌是健康个体中的成人肠道微生物群的突出且常见的成员。

我们在多形拟杆菌菌株VPI-5482 (Bt)中生成了一组突变体。突变体含有(i)脱水四环素诱导型(aTc) spCas9基因，(ii)红霉素抗性盒，以及(iii)靶向随机、非基因组序列(阴性对照)或两种RNABt基因(tdk和SusC)之一的组成型活性的引导RNA。将这些盒整合到两个基因组定位之一处。使用这些突变体，我们在平板测定法和液体培养物中记录了有力的aTc诱导性杀死(图7A-7C)。

我们用13种培养的人肠道细菌菌株的联合体定殖无菌小鼠，所述菌株的基因组已进行测序(参见下文)；该联合体包括具有tdk靶向gRNA的Bt-CRISPR突变体。小鼠单独饲养，并且饲喂高饱和脂肪且低水果和蔬菜的人饲粮。低纤维‘HiSF/LoFV’饲粮补充有10% (w/w)豌豆纤维：该制剂先前显示将该群落/饲粮背景下的Bt相对丰度维持在15-20%下(Patnode等人，2019)。在治疗臂中，在管饲后1天或4天，饮用水补充有以10 µg/mL的aTc (图8A)；否则在管饲后的第一天后，小鼠接受含有单独的0.5%乙醇(即，用于维持aTc溶解度的媒介物)的饮用水。粪便DNA的短读鸟枪法测序用于限定群落成员在菌株水平分辨率下的相对丰度。另外，我们通过包括在哺乳动物肠道中未发现的两个‘掺料’细菌分类群来定量生物体的绝对丰度(关于细节参见下文)。

结果揭示了，在4天的治疗臂中，在aTc治疗开始后2天，实现了Bt的相对丰度和绝对丰度降低为1/35，并且在早期治疗条件下具有相似的效应(相对丰度降低为1/50)。尽管Bt丰度在达到这个最低点后开始增加，但它从未达到对照组中观察到的水平(图8B)。

Bt的耗尽伴随着几种其它拟杆菌属的相对丰度的显著变化：解纤维素拟杆菌、卵形拟杆菌和粪拟杆菌(图8C、D；线性混合模型边缘均值P<0.05)。Bt和这些其它拟杆菌属的绝对丰度的变化模式与相对丰度测量平行。

在相关实验中，小鼠由包括WT Bt菌株的13个成员的群落或排除Bt的12个成员的群落进行定植。这些小鼠单独饲养，并且在管饲后随意饲喂HiSF/LoFV+10%豌豆纤维饲粮20天。从连续收集的粪便样品中分离的DNA的COPRO-Seq分析公开了，在联合体建立之前省略WT Bt导致这些其它拟杆菌属的相对丰度/绝对丰度的变化，这在很大程度上与CRISPR-Bt敲减的效应一致(图9A-9B)。

A. 体外生长测定法

所有的生长测定法都在3%氢、20% CO₂和77% N₂的大气下，在软边厌氧生长室(CoyLaboratory Products)中执行。在乙醇中以2 mg/mL制备盐酸脱水四环素(37919，Millipore Sigma)的原液，并且过滤灭菌(Millipore Sigma SLGV033RS)。将Bt突变体的原种连续稀释，并且在血琼脂平板± 200 ng/mL脱水四环素上铺平板。在生长两天后，对平板进行成像。将Bt突变体的甘油原种进行菌落纯化，并且接种到含有25 µg/mL红霉素的5 mLLYBHI内。在过夜温育后，将培养物在含有9 ng/mL aTc的LYBHI培养基中1:50稀释，并且将200 µL等分试样移液到96孔全面积平板(Costar；目录号；CLS3925)的孔内。平板用光学透明膜(Axygen；目录号；UC500)进行密封，并且在37℃下每15分钟经由光密度(600 nm)监测生长(具有BioStack 4的Biotek Eon)。

B. 定菌小鼠

饲养- 涉及小鼠的所有实验都按照由St. Louis的Washington University的动物研究委员会(Animal Studies Committee)批准的方案进行。无菌雄性C57/B6小鼠(18-22周龄)单独饲养在定位于薄膜柔性塑料隔离器内的笼中，并且饲喂可高压灭菌的小鼠食物(Envigo；目录号：2018S)。笼含有纸屋用于环境丰富化。动物维持在严格的光照周期(在0600 h时打开，在1900 h时关闭)。

HiSF/LoFV+10%豌豆纤维使用人食物进行生产，基于来自美国国家健康与营养调查(National Health and Nutrition Examination Survey调查) (NHANES)数据库1的消费模式选择。将饲粮研磨成粉末(D90粒度，980 mm)，并且与以10% (w/w)纤维的豌豆纤维(Rattenmaier；目录号：Pea Fiber EF 100)混合。然后将该混合物挤出成丸粒。将丸粒包装，真空密封并通过γ照射(20-50千格雷)进行灭菌。通过在TYG培养基中在37℃下在需氧和厌氧条件(大气，75% N₂、20% CO₂、5%H₂)下培养饲粮，并且通过将饲粮饲喂给无菌小鼠，随后为其粪便DNA的短读鸟枪法测序(通过测序的群落概况分析，COPRO-Seq)分析，来确认无菌性。

在定菌隔离器中，每隔一天制备含有0.5%乙醇或10 µg/mL aTC的新鲜无菌饮用水。

定殖- 粪拟杆菌TSDC17.2-1.2、芬氏拟杆菌TSDC17.2-1.1、马赛拟杆菌TSDC17.2-1.1、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens) TSDC17.2-1.1、大肠杆菌TSDC17.2-1.2、内脏臭气杆菌TSDC17.2-1.2、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis) TSDC17.2-1.1、瘤胃菌属物种TSDC17.2-1.2和Subdoligranulum variabile TSDC17.2-1.1，从肥胖不一致的一对双胞胎中的瘦双胞胎中收集的粪便样品进行培养[Ridaura等人(2013)中的一对双胞胎1]。这些分离株和卵形拟杆菌ATCC 8483、普通拟杆菌ATCC 8482、多形拟杆菌VPI-5482和解纤维素拟杆菌WH2的注释基因组序列在Patnode等人2019中进行描述。根据上文限定的方案生成多形拟杆菌VPI-5482突变体。这13种菌株各自进行菌落纯化，在TYG或LYBHI培养基中生长至早期静止期(Goodman等人，2019年)。将单一培养物的等分试样贮存于-80℃下的15%甘油中。将等同数量的生物体合并(基于OD600测量)，并且将等分试样维持在80℃下的15%甘油中直至使用。在实验的第0天时，将等分试样解冻并引入定菌隔离器内。通过塑料尖端的经口管饲针(总体积，300 µL/小鼠)，将细菌联合体施用于无菌小鼠。

在定殖之前，将小鼠转换为随意的未补充的HiSF/LoFV饲粮共四天。在定殖后，小鼠起始补充有10%豌豆纤维的HiSF/LoFV。在管饲之后一天，所有小鼠都起始含有0.5%乙醇或脱水四环素(10 µg/mL)的饮用水。在定植后和aTc撤除后，更换垫料(AspenWoodchips；Northeastern Products)。在实验的第0-8天时，在产生后的几秒钟内，从每只动物中收集新鲜的粪便样品，并且立即在-80℃下冷冻。

C. 群落成员的相对丰度和绝对丰度的COPRO-Seq分析

冷冻的粪便样品和盲肠内容物(在安乐死时收集)在1.8 mL螺旋盖管中进行称重。在哺乳动物微生物群中未发现的两种细菌菌株以已知浓度‘掺料’到每个样品管中[30 µL的2.22x10⁸个细胞/mL嗜酸脂环杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus) DSM 14558和9.93x 10⁸个细胞/mL的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter) DSM 30147]。通过在500 µL 2x缓冲液A (200 mM Tris、200 mM NaCl、20 mM EDTA)、210 µL 20 % (wt:wt)十二烷基硫酸钠和500 µL苯酚:氯仿:戊醇(pH 7.9；25:24:1)中，用250 µL 0.1 mm氧化锆/二氧化硅珠和一个3.97 mm钢球，将样品珠磨4分钟(Biospec Minibeadbeater-96)，来开始DNA提取。在以3,220g离心4分钟后，取出420 µL水相，并且根据制造商的方案进行纯化(QIAquick 96 PCR纯化试剂盒；Qiagen)。

使用Nextera DNA Library Prep Kit (Illumina；目录号：15028211)和定制加条形码的引物(Adey)的组合，从纯化的DNA制备测序文库。使用Illumina NextSeq仪器，对文库进行测序[读取长度，75 nt；测序深度，1.02 x 106 ± 2.2 x 104个读数/样品(平均值± SD)]。用Bowtie II将读数映射到细菌基因组上，并且使用按信息基因组大小经比例调节的读数计数来计算相对丰度(Hibberd等人，2017)。从进一步分析中省略了少于100,000个读数的样品。我们使用以下关系定义了给定群落成员的绝对丰度：

(其中P _i是13个成员的群落1=

中的一些物种的分数丰度，小写字母指示细胞数量，P _α/r是总数1 = P _α + P _r + P _群落中的掺料细菌的分数丰度，α指示嗜酸脂环杆菌，r指示放射形土壤杆菌，ρ是细菌密度(细胞/mg粪便)，且W是粪便团块质量(mg))。

D. 线性建模

使用线性模型(R核心团队，2018)以下述形式，对来自管饲后4-7天的媒介物对照臂和四天治疗臂的相对丰度数据进行建模：

lm(log10(百分比)~条件*DPG，数据=数据)

使用估计的边缘均值(Lenth，2019)，按每天的条件效应针对应答量表上的显著性进行检验。

实施例11. 载体构建

使用来自pExchangetdk的质粒骨架(RP4-oriT、R6K ori、bla、ermG)的Gibson克隆(NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix，New England Biolabs)、来自pBI143的RepA(Smith等人，Plasmid，1995，34:211-222)、以及由合成DNA或化脓性链球菌菌株SF370的基因组DNA的PCR组装的脱水四环素(aTc)诱导型CRISPR盒(P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNA支架)，来构建稳定维持的RepA CRISPR质粒。图10示出了质粒设计。

质粒骨架包含用于在大肠杆菌中的氨苄青霉素选择的bla序列和R6K复制起点，用于在拟杆菌属中复制的repA序列，用于接合的RP4-oriT序列和用于在拟杆菌属中的红霉素(Em)选择的ermG序列。

上述质粒的DNA序列呈现于SEQ ID NO: 9中：

实施例12. 各个多形拟杆菌菌株的诱导性CRISPR杀死

两种稳定维持的质粒在脑心浸液(BHI)血琼脂平板上接合到多形拟杆菌内，而无抗生素选择。一种质粒是阴性对照(称为‘M’)，具有乱序的非靶向前间隔序列(5'-TGATGGAGAGGTGCAAGTAG-3'；SEQ ID NO 6)。针对拟杆菌属基因组的非靶向对照前间隔序列的计算机分析并未导致任何显著的序列匹配，因此预计没有‘脱靶’活性。另一种质粒具有靶向Bt基因组上的susC_Bt (BT_3702)编码序列的前间隔序列(5'-ATGACGGGAATGTACCCCAG-3'；SEQ ID NO: 5)。susC基因编码涉及多形拟杆菌中的淀粉结合的外膜蛋白。sgRNA支架序列是5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3’ (SEQ ID NO:7)。所得到的两种质粒被称为pRepA-CRISPR.M和pRepA-CRISPR.susC_Bt。挑选菌落，并且在具有200 µg/ml庆大霉素(Gm)和50 µg/ml红霉素(Em)的BHI血琼脂平板上重新划线培养，并且在coy室(Coy LaboratoryProducts Inc.)中厌氧生长。从这个重新划线培养的平板中，挑选单个菌落，并且在以200µg/ml Gm和50 µg/ml Em的10 ml TYG液体培养基中生长。获取OD_600nm读数，因此可以将浓度调整到OD 1。然后以1 ml体积制备1至10次稀释。将100微升的两种稀释物(10-4和10-6)涂抹到具有200 µg/ml庆大霉素(Gm)和50 µg/ml红霉素(Em)的BHI血琼脂平板上，所述BHI血琼脂平板分别补充有浓度为0和100 ng/ml的脱水四环素(aTc)。使琼脂平板在37℃下厌氧温育2-3天。对于所有菌株，在不存在aTc (0 ng/ml)的血琼脂平板上获得了菌落形成单位(CFU)。对于susC靶向质粒，在存在aTc (100 ng/ml)的血琼脂平板上没有观察到CFU形成，而对于M菌株仍获得CFU (图11A-D)。

实施例13. 载体构建

使用来自pExchangetdk的质粒骨架(RP4-oriT、R6K ori、bla、ermG)的Gibson克隆(NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix，New England Biolabs)、来自pNBU2-tetQb的NBU2整合酶、以及由合成DNA或化脓性链球菌菌株SF370的基因组DNA的PCR组装的脱水四环素(aTc)诱导型CRISPR盒(P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNA支架)，来构建CRISPR整合pNBU2-CRISPR质粒。使用合成DNA和传统的限制性内切酶克隆，将红霉素(ermG)抗生素抗性基因替换为头孢西丁抗生素抗性基因(cfxA)。图12示出了质粒设计。

质粒骨架包含用于在大肠杆菌中的氨苄青霉素选择的bla序列和R6K复制起点，用于接合的RP4-oriT序列和用于在拟杆菌属中的头孢西丁(FOX)的cfxA序列(Parker和Smith，Antimicrobial agents and Chemotherapy，1993，37: 1028-1036)。NBU2编码intN2酪氨酸整合酶，其介导pNBU2-CRISPR质粒上的attN2位点与定位于拟杆菌属细胞的染色体上的attB位点之一之间的序列特异性重组。attN2和attB具有相同的13 bp识别核苷酸序列(5'-3')：CCTGTCTCTCCGC (SEQ ID NO: 2)。

上述质粒(图12)的DNA序列呈现于SEQ ID NO: 10中：

实施例14. 在解纤维素拟杆菌WH2的染色体上的CRISPR整合

将pNBU2-CRISPR质粒转化到大肠杆菌S-17 λ-pir中，随后经由接合递送到解纤维素拟杆菌WH2细胞。在该具体实例中，pNBU2-CRISPR质粒编码intN2酪氨酸整合酶，其介导在pNBU2-CRISPR质粒上的attN2位点与三个attBWH2位点之一之间的序列特异性重组，所述三个attBWH2位点定位于两种tRNA-Ser基因BcellWH2_RS22795或BcellWH2_RS23000的3'端、或解纤维素拟杆菌WH2 (简称为BWH2)的染色体上的非编码区(核苷酸坐标6,071,791-6,071,803)中。pNBU2-CRISPR质粒的***可能使两种tRNA-Ser基因之一失活(如果***非编码区中，则并不使tRNA-Ser基因失活)，并且由于tRNA-Ser的必要性，同时***两种tRNA-Ser基因内是不太可能的。

构建了五种质粒，其表达非靶向对照引导(称为‘M’)、靶向tdk_BWH2 (BcellWH2_RS17975)的两种引导RNA (称为‘T2’和‘T3’)、以及靶向susC_BWH2 (BcellWH2_RS26295)的两种引导RNA (称为‘S6’和‘S19’)。tdk基因编码胸苷激酶，而susC基因编码涉及解纤维素拟杆菌中的淀粉结合的SusC/RagA家族Ton-B连接的外膜蛋白。tdk_BWH2的两个前间隔序列是T2 (5'-ATACAGGAAACCAATCGTAG-3'；SEQ ID NO: 11)和T3 (5'-GGAAGAATCGAAGTTATATG-3'；SEQ ID NO: 12)，并且susC_BWH2的两个前间隔序列是S6 (5'-AATCCACTGGATGCCATCCG-3'；SEQ ID NO: 13)和S19 (5'-GCTTATGTCTATCTATCCGG-3'；SEQ ID NO: 14)。针对拟杆菌属基因组的非靶向对照前间隔序列M (5'-TGATGGAGAGGTGCAAGTAG-3'；SEQ ID NO 6)的计算机分析并未导致任何显著的序列匹配，因此预计没有“脱靶”活性。sgRNA支架序列是5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3’ (SEQ ID NO:7)。所得到的质粒被称为pNBU2-CRISPR.M_BWH2、pNBU2-CRISPR.tdk_BWH2-2、pNBU2-CRISPR.tdk_BWH2-3、pNBU2-CRISPR.susC_BWH2-6和pNBU2-CRISPR.susC_BWH2-19。

在具有头孢西丁抗性的pNBU2-CRISPR质粒上的attN2位点与解纤维素拟杆菌WH2基因组中的三个attBWH2位点之一之间的靶向***的实例显示于图13A-B中。质粒pNBU2-CRISPR.susC_BWH2-19仅整合到t-RNA-Ser基因BcellWH2_RS22795中的attBWH2位点中。质粒整合位点的5'端显示于图13A中，而质粒整合位点的3'端显示于图13B中。使用IlluminaNext Gen Sequencing技术执行测序，并且用Geneious比对/组装软件完成分析。

实施例15. 各个解纤维素拟杆菌WH2菌株的诱导性CRISPR杀死

对于选择的解纤维素拟杆菌WH2整合体(M1、M2、T2、T3、S6和S19)，在TYG液体培养基中调查了诱导型CRISPR Cas9介导的细胞杀死。M1、M2、T2、T3、S6和S19的单个菌落(M1和M2是来自同一M非靶向接合平板的分开菌落)在含有5 ml TYG液体培养基的falcon管培养物中的coy室(Coy Laboratory Products Inc.)中厌氧生长过夜，所述TYG液体培养基补充有200 µg/ml庆大霉素(Gm)和10 µg/ml头孢西丁(FOX)。然后用TYG培养基将过夜培养物针对OD_600nm1进行标准化。这些标准化的培养物以1:100的比率稀释(250µl加入24.75 ml TYG内)，以制备种子培养物。将该25 ml种子培养物等分到新鲜的15 ml falcon管中的5 ml培养物内。脱水四环素(aTc)以0 ng/ml、10 ng/ml或100 ng/ml加入5 ml培养物中，并且在37℃下厌氧温育24小时。在生长24小时后获取的OD_600nm读数显示于图14中。数据显示了，染色体整合的CRISPR/Cas9***被外源提供的诱导剂(aTc)激活，以生成由靶向RNA (tdk_BWH2或susC_BWH2)引导的致命性基因组DNA切割，导致细胞活力的丧失。

参考文献

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Lim等人Engineered Regulatory Systems Modulate Gene Expression ofHuman Commensals in the Gut. Cell，2017，169:547-558。

Claims

1.一种蛋白质-核酸复合物，其包含与细菌或古细菌物种的染色体缔合的改造的RNA引导的核酸酶***，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***靶向微生物的染色体中的位点，并且所述微生物的染色体编码HU家族DNA结合蛋白，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少50%序列同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1的蛋白质-核酸复合物，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***是选自I型CRISPR***、II型CRISPR***、III型CRISPR***、IV型CRISPR***、V型CRISPR***或VI型CRISPR***的CRISPR***。

3.权利要求2的蛋白质-核酸复合物，其中所述CRISPR***包含CRISPR核酸酶和引导RNA。

4.权利要求3的蛋白质-核酸复合物，其中所述CRISPR核酸酶是Cas9、Cas12、Cas13或CasX。

5.权利要求1至4中任一项的蛋白质-核酸复合物，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***由核酸表达，所述核酸编码改造的RNA引导的核酸酶***，并且整合到细菌或古细菌染色体内。

6.权利要求1至4中任一项的蛋白质-核酸复合物，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***由核酸表达，所述核酸编码改造的RNA引导的核酸酶***，并且在染色体外载体上携带。

7.权利要求1至6中任一项的蛋白质-核酸复合物，其中所述原核染色体在拟杆菌属(Bacteroides)物种内。

8.权利要求7的蛋白质-核酸复合物，其中所述拟杆菌属物种选自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、解纤维素拟杆菌(B.cellulosilyticus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、溃疡拟杆菌(B. helcogenes)、卵形拟杆菌(B. ovatus)、萨氏拟杆菌(B. salanitronis)、单形拟杆菌(B. uniformis)或解木糖拟杆菌(B. xylanisolvens)。

9.一种用于减缓混合的原核生物群体中的靶原核生物生长的方法，所述方法包括在靶原核生物中表达改造的RNA引导的核酸酶***，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***靶向靶原核生物的染色体中的位点，使得将至少一个双链断裂引入靶原核生物的染色体中，从而减缓所述靶原核生物的生长。

10.权利要求9的方法，其中减缓靶原核生物的生长导致所述混合的原核生物群体中所述靶原核生物的水平降低或消除。

11.权利要求9或10的方法，其中所述RNA引导的核酸酶***的表达是可诱导的。

12.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***是选自I型CRISPR***、II型CRISPR***、III型CRISPR***、IV型CRISPR***、V型CRISPR***或VI型CRISPR***的CRISPR***。

13.权利要求12的方法，其中所述CRISPR***包含CRISPR核酸酶和引导RNA。

14.权利要求13的方法，其中所述CRISPR核酸酶是Cas9、Cas12、Cas13或CasX核酸酶。

15.权利要求13的方法，其中所述CRISPR核酸酶和引导RNA由整合到靶原核生物的染色体内的至少一种核酸表达。

16.权利要求13的方法，其中所述CRISPR核酸酶和引导RNA由染色体外载体上携带的至少一种核酸表达。

17.权利要求15或16的方法，其中编码CRISPR核酸酶的核酸与诱导型启动子可操作地连接。

18.权利要求17的方法，其中所述表达步骤包括使所述混合的原核生物群体与启动子诱导化学制品接触。

19.权利要求9至18中任一项的方法，其中所述混合的原核生物群体包含在细胞培养物中。

20.权利要求9至18中任一项的方法，其中所述混合的原核生物群体包含在哺乳动物的消化道中。

21.权利要求20的方法，其中所述改造的RNA引导的核酸酶***是改造的CRISPR核酸酶***，将编码改造的CRISPR核酸酶***的至少一种核酸引入所述靶原核生物中，所述编码CRISPR核酸酶的核酸与诱导型启动子可操作连接，并且所述表达步骤包括向哺乳动物施用启动子诱导化学制品。

22.权利要求21的方法，其中所述施用包括经口施用所述启动子诱导化学制品。

23.权利要求18、21或22中任一项的方法，其中所述启动子诱导化学制品是脱水四环素。

24.权利要求20至23中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

25.权利要求24的方法，其中所述人正在经历癌症治疗，并且在所述人的胃肠道中从混合的原核生物群体中减少或消除靶原核生物改善了人对于癌症治疗的应答。

26.权利要求25的方法，其中所述癌症治疗包含免疫疗法。

27.权利要求9至26中任一项的方法，其中所述靶原核生物是拟杆菌属物种。

28.权利要求27的方法，其中所述拟杆菌属物种选自多形拟杆菌、普通拟杆菌、解纤维素拟杆菌、脆弱拟杆菌、溃疡拟杆菌、卵形拟杆菌、萨氏拟杆菌、单形拟杆菌或解木糖拟杆菌。