CN114929248A - 血小板聚集剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有无定形多磷酸作为活性成分的血小板聚集剂，其中所述多磷酸是多磷酸的Ca盐。所述血小板聚集剂作用于炎性肠病中的受损胃肠粘膜，并且可以通过发挥血小板聚集作用而引起所述炎性肠病的缓解/改善。

Description

血小板聚集剂

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求(于2020年1月8日提交的)日本专利申请号2020-001319的优先权，所述日本专利申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及一种具有多磷酸的Ca盐作为活性成分的血小板聚集剂。更具体地，本发明涉及一种作用于炎性肠病中的受损胃肠粘膜并且发挥血小板聚集作用的药物，由此允许炎性肠病的缓解/改善。

背景技术

尽管抗炎剂被用作用于如以溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)为代表的炎性肠病(IBD)的标准治疗剂，但尚无直接诱导粘膜愈合的药物。虽然常规抗炎剂已经被用来对症地治疗IBD，但最近，治疗IBD的真正目标被认为是“粘膜愈合”。如以乳酸菌为代表的益生菌由于其作为食物使用的较长历史而具有高度安全性，并且已知具有一定的调节肠等的作用。然而，益生菌对肠病症的作用机制在许多方面仍不清楚。为了对此进行解释，对由益生菌产生的生物活性分子进行鉴定和分析。

诸位发明人已经鉴定出衍生自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的长链多磷酸盐是加强肠屏障功能的分子。然后，诸位发明人证实了，长链多磷酸盐会改善由DSS处理引起的肠道屏障功能受损和肠道损伤(专利文献1)。另外，诸位发明人证实了，长链多磷酸盐会在患有难治性溃疡性结肠炎的患者体内产生粘膜愈合(非专利文献1)。

已知多磷酸盐具有创伤愈合和抗炎特性，并且预期可开发使用无定形物质或由多磷酸钙盐构成的纳米颗粒的创伤敷料和牙科材料(专利文献2)。

已知多磷酸盐还是血液凝固的活化剂。多磷酸盐在从血小板释放时活化血液中的因子XII蛋白酶，引发凝血反应。已经推测出天然多磷酸盐的各种盐类，如Ca盐、Mg盐、Na盐和K盐，并且已知还存在无定形纳米颗粒(非专利文献2和3)。Donovan等人由不同链长度的多磷酸盐制备了纳米颗粒，并且报告了所述纳米颗粒对多磷酸盐的大小和血液凝固的影响(非专利文献4)。然而，尚无关于无定形多磷酸盐或多磷酸盐纳米颗粒、特别是关于其盐类的差异对血小板聚集和炎性肠病的影响的报告。

引用列表

专利文献

专利文献1：国际公开号WO 2011/125619

专利文献2：国际公开号WO 2016/079006

非专利文献

非专利文献1：Fujita et al.,"Long-Chain Polyphosphate Is a PotentialAgent for Inducing Mucosal Healing of the Colon in Ulcerative Colitis."ClinPharmacol Ther.2019Sep.

非专利文献2：Feng et al.,"Biogenic Polyphosphate Nanoparticles from aMarine Cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002:Production,Characterization,and Anti-Inflammatory Properties In Vitro."Mar Drugs.2018Sep 10；16(9).

非专利文献3：Feng et al.,"Biogenic Polyphosphate Nanoparticles fromSynechococcus sp.PCC 7002 Exhibit Intestinal Protective Potential in HumanIntestinal Epithelial Cells In Vitro and Murine Small Intestine Ex Vivo."JAgric Food Chem.2018 Aug 1；66(30):8026-8035.

非专利文献4：Donovan et al.,"Size-controlled synthesis of granularpolyphosphate nanoparticles at physiologic salt concentrations for bloodclotting."Biomacromolecules.2014 Nov 10；15(11):3976-84

发明内容

技术问题

本发明解决了阐明多磷酸盐的生物活性和优化分子设计以使所述多磷酸盐的活性最大化的问题。

问题的解决方案

诸位发明人已经发现，多磷酸盐(盐)的血小板聚集作用对钙(Ca)盐具有选择性并且没有观察到对如钠(Na)盐等其他金属盐具有选择性，并且多磷酸盐Ca盐对炎性肠病中的受损胃肠粘膜发挥这种作用以促进粘膜的愈合。

本发明基于上述发现，并且涉及以下(1)至(9)：

(1)一种血小板聚集剂，所述血小板聚集剂包括无定形多磷酸盐作为活性成分，其中所述多磷酸盐是多磷酸的Ca盐。

(2)根据(1)所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂促进受损胃肠粘膜中的血小板聚集。

(3)根据(1)或(2)所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂被施用于患有炎性肠病的患者。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂是口服施用。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂促进受损胃肠粘膜的愈合。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的血小板聚集剂，其中所述无定形多磷酸盐呈纳米颗粒形式。

(7)根据(6)所述的血小板聚集剂，其中所述多磷酸盐纳米颗粒的ζ电位为0mV或更小。多磷酸盐的ζ电位优选地为-20mV或更小、并且更优选地为-30mV或更小。

(8)根据(6)或(7)所述的血小板聚集剂，其中所述多磷酸盐纳米颗粒的平均粒度为10nm至3000nm。

(9)根据(1)至(8)中任一项所述的血小板聚集剂，其中所述多磷酸盐的平均链长度为5个或更多个磷酸盐单元、优选100个或更多个磷酸盐单元、并且甚至更优选300个或更多个磷酸盐单元。

发明的有益效果

本发明的多磷酸盐由无定形物质或纳米颗粒构成，所述无定形物质或纳米颗粒由多磷酸盐Ca盐构成，所述多磷酸盐Ca盐是血小板聚集作用的主体。因此，与天然多磷酸盐相比，可以预期产生更强的血小板聚集作用。通过口服施用，本发明的多磷酸盐作用于受损胃肠粘膜并且发挥优异的血小板聚集作用，由此允许炎性肠病的改善/缓解。

附图说明

[图1]图1示出了小鼠肠道的长度(每组n＝8)。正常小鼠(对照)、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钙处理(1μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，1μgPPA-Ca)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Ca)和他克莫司(tacrolimus)处理(60μg/小鼠)的组(DSS，60μg TAC)。

[图2]图2示出了组织学严重程度(每组n＝8)。正常小鼠(PBS)、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钙处理(1μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，1μgPPA-Ca)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Ca)和他克莫司处理(60μg/小鼠)的组(DSS，60μg TAC)。

[图3]图3示出了小鼠肠道的长度(正常小鼠；n＝6、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组；n＝9、多磷酸钠处理的急性小肠结肠炎小鼠组；n＝7、多磷酸钙处理的急性小肠结肠炎小鼠组；n＝8、以及他克莫司处理的组；n＝5)。正常小鼠(对照)、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钠处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PPA-Na)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PPA-Ca)和他克莫司处理(60μg/小鼠)的组(DSS，TAC)。

[图4]图4示出了通过RT-PCR进行的炎性细胞因子(TNFα、IL-1β、IFNγ和IL6)的表达分析的结果(n＝6至8)。所述图从左边开始为：正常小鼠(对照)、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钙处理(1μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，1μg PPA-Ca)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Ca)和他克莫司处理(60μg/小鼠)的组(DSS，60μg TAC)。

[图5]图5示出了通过RT-PCR进行的炎性细胞因子(TNFα、IL-1β、IFNγ和IL6)的表达分析的结果(n＝5至9)。正常小鼠(对照)、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钠处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠(DSS，PPA-Na)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PPA-Ca)、他克莫司处理(60μg/小鼠)的组(DSS，TAC)。

[图6]图6示出了CD61阳性区域(像素)(n＝7)。所述图从左边开始为：正常小鼠(对照)、PBS处理的急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)和多磷酸钙处理的(5μg/小鼠)急性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PPA-Ca)。

[图7]图7示出了溶液的浊度的时间历程(n＝5)。多磷酸钠(PPA-Na)显示出与无添加(阴性对照)的结果的差异较小。另一方面，虽然浊度在添加后立即暂时提高，但多磷酸钙(PPA-Ca)显示出浊度降低，与二磷酸腺苷(ADP)的浊度降低相似。

[图8]图8示出了创伤宽度的时间历程(n＝3)。所述图从顶部开始为：无添加(阴性对照)、多磷酸钠(PPA-Na)和多磷酸钙(PPA-Ca)。

[图9]图9示出了小鼠肠道的长度(正常小鼠；n＝5、PBS处理的慢性小肠结肠炎小鼠组、多磷酸钙处理的慢性小肠结肠炎小鼠组、以及多磷酸钠处理的慢性小肠结肠炎小鼠组；n＝7)。正常小鼠(对照)、PBS处理的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Ca)和多磷酸钠处理(5μg/小鼠)的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Na)。

[图10]图10示出了组织学严重程度(正常小鼠；n＝5、PBS处理的慢性小肠结肠炎小鼠组、多磷酸钙处理的慢性小肠结肠炎小鼠组、以及多磷酸钠处理的慢性小肠结肠炎小鼠组；n＝7)。正常小鼠(对照)、PBS处理的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Ca)和多磷酸钠处理(5μg/小鼠)的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Na)。

[图11]图11示出了通过RT-PCR得出的炎性细胞因子(IL-1β、TNFα和IFNγ)的表达分析的结果(正常小鼠；n＝5、PBS处理的慢性小肠结肠炎小鼠组、多磷酸钙处理的慢性小肠结肠炎小鼠组、以及多磷酸钠处理的慢性小肠结肠炎小鼠组；n＝7)。所述图从左边开始为：正常小鼠(对照)、PBS处理的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，PBS)、多磷酸钙处理(5μg/小鼠)的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Ca)和多磷酸钠处理(5μg/小鼠)的慢性小肠结肠炎小鼠组(DSS，5μg PPA-Na)。

具体实施方式

1.多磷酸盐

在本说明书中，“多磷酸盐”意指其中磷酸(H₃PO₄)通过脱水而缩合的缩合磷酸盐化合物，并且可以是链状、环状或具有分支。

在本说明书中，多磷酸盐的线性部分中所包含的“磷酸盐单元”的数量(n)用于指示多磷酸盐的平均链长度。例如，10个(n＝10)或更多个磷酸盐单元的平均链长度意指多磷酸盐的线性部分中所包含的重复磷酸盐单元的数量为10或更多。

本发明的多磷酸盐的平均链长度优选地为5个或更多个磷酸盐单元、更优选为100个或更多个磷酸盐单元、并且甚至更优选为300个或更多个磷酸盐单元。使用较长链多磷酸盐允许不仅改善血小板聚集作用、而且改善屏障功能加强作用，并且允许更有效地预防或改善(治愈、减轻)炎性肠病。

优选地，多磷酸盐是在进行超滤时不会渗透截留分子量为10kDa的超滤膜的高分子量多磷酸盐。超滤意指通过以下方式过滤出要过滤的样品中的分子：使用配备有由PES(聚醚砜)组成的超滤膜的离心柱，将要过滤的样品添加到此离心柱，并且然后经受离心。

多磷酸盐可以是化学合成、使用如酶等生物分子体外合成、或使用产生多磷酸盐的微生物等合成。在合成线性多磷酸盐时，优选的是，使用如酶等生物分子体外合成线性多磷酸盐，或通过使用微生物等合成线性多磷酸盐，因为这样可以高效率地获得线性多磷酸盐。

用于化学合成多磷酸盐的方法的例子包括其中对包含ATP作为原材料的反应溶液进行加热、然后通过脱水而缩合的方法。加热温度可以为例如150℃至350℃。

用于使用如酶等生物分子体外合成多磷酸盐的方法的例子包括其中使用多磷酸盐激酶(PPK)(一种合成多磷酸盐的酶)作为“如酶等生物分子”并且使用ATP作为原材料通过PPK的酶促作用来合成多磷酸盐的方法。已经报告，PPK由许多益生菌(如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG菌株和属于短乳杆菌的菌株)携带，并且已经在DB中公布了所述酶的基因序列。

PPK可以从表达PPK的任何菌株获得或可商购获得，只要它能够使用ATP作为底物合成多磷酸盐即可。PPK可以是例如衍生自谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)的PPK。

PPK的酶促反应是可逆的，但如果与ATP相比，在反应溶液中存在大量的ADP，则多磷酸盐的降解反应将变得占主导地位，使得ADP/ATP比率达到平衡。因此，为了有效地合成多磷酸盐，优选的是，不向反应溶液添加ADP。可以视情况设置如反应溶液的组成、反应温度和反应时间等其他条件，以针对PPK活性以及根据合成规模等优化反应。作为例子，下文示出了对于使用衍生自谢氏丙酸杆菌的PPK合成多磷酸盐的情况的反应条件。首先，反应溶液的组成可以为50mM Tris-HCl(pH 7.4)、40mM硫酸铵、4mM MgCl₂、40mM磷酸肌酸、20ng/ml肌酸激酶、1mM ATP(pH 7.2)和1U/ml PKK，反应温度可以为37℃，并且反应时间可以为0.5小时至10小时。根据目标多磷酸盐的分子量和产率视情况设置反应时间。例如，为了以良好产率获得高分子量多磷酸盐，反应时间优选地为1小时至5小时。

用于通过使用微生物而合成的方法的例子包括其中在适当的培养条件下培养产生多磷酸盐的微生物并使其产生多磷酸盐的方法。产生多磷酸盐的微生物的例子包括鼠李糖乳杆菌GG菌株、短乳杆菌SBC8803菌株、属于乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株、属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)的菌株、属于肠球菌属(Enterococcus)的菌株、属于乳球菌属(Lactococcus)的菌株、属于片球菌属(Pediococcus)的菌株、属于明串珠菌属(Leuconostoc)的菌株、属于链球菌属(Streptococcus)的菌株、属于拟杆菌属(Bacteroides)的菌株、属于真杆菌属(Eubacterium)的菌株和属于梭菌属(Clostridium)的菌株。

可以通过在能够维持所使用的微生物的生长的适当培养基中以及在适当的培养温度条件下培养微生物来合成多磷酸盐。可以在培养之后从培养基回收合成的多磷酸盐，或者可以在培养之后通过破碎微生物来回收合成的多磷酸盐。

在合成的多磷酸盐的纯化步骤中，可以视情况组合地使用本领域中广泛使用的纯化方法，如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、透析、盐析、硫酸铵沉淀、沉淀和结晶。可以根据多磷酸盐合成步骤中所使用的方法、目标纯化程度、目标产率等视情况确定要使用的纯化方法。

在本发明中，多磷酸盐是由多磷酸的Ca盐构成的无定形物质。因为无定形多磷酸盐Ca盐不溶于水，并且因此以固体形式到达肠粘膜(作用部位)并且通过内吞作用被上皮细胞所吸收，所以可以预期产生强效果。不溶于水的无定形多磷酸盐Ca盐简化了API制造过程(包括如回收、洗涤和干燥)，并且因此在制造成本方面也是有利的。

在本发明中，无定形多磷酸盐Ca盐优选地呈纳米颗粒形式。在本说明书中，“纳米颗粒”意指大小为纳米量级的颗粒。本发明的多磷酸盐纳米颗粒是平均粒度为10nm至3000nm并且带电荷的ζ电位的值为0mV或更小、优选-20mV或更小、并且更优选-30mV或更小的颗粒。平均粒度和ζ电位意指通过动态光散射/光子相关(粒度分布测量)获得的平均粒度和通过激光多普勒多点检测电泳(ζ电位测量)获得的ζ电位。纳米颗粒具有光滑球状形状，粒度相对均匀，并且因此具有在配制方面优选的物理特性。

例如，可以如下产生由多磷酸的Ca盐构成的纳米颗粒。将多磷酸钠盐溶解于水或缓冲溶液(例如，Tris-HCl缓冲液或碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液)中，并对pH进行调节(例如，pH10)。为此，添加CaCl₂并搅拌，同时用NaOH维持pH，以多磷酸的Ca盐形式絮凝，并将沉淀物干燥，然后通过适当大小的筛子。

如以下实施例中所示出的，诸位发明人已经发现，多磷酸的Ca盐促进炎性肠病的受损肠粘膜中的血小板聚集，并且允许促进受损粘膜的改善、缓解和愈合。没有观察到多磷酸盐的其他金属盐(如多磷酸Na盐)具有这种促进血小板聚集的作用，因此这种促进血小板聚集的作用可以被认为是Ca盐独特的作用。

2.血小板聚集剂

根据本发明的“血小板聚集剂”意指具有使血小板聚集的作用的物质。本发明的血小板聚集剂的特征在于，所述血小板聚集剂含有上文所描述的无定形多磷酸Ca盐作为活性成分并且能够使受到损伤的胃肠粘膜中的血小板聚集。

在活生物体中，已知多磷酸盐还是血液凝固的活化剂。多磷酸盐储存在血小板致密颗粒中，并且在响应于刺激而释放时活化血液中的因子XII蛋白酶，引发凝血反应。天然多磷酸盐由如Ca盐、Mg盐、Na盐和K盐等各种盐类构成，并且每种盐的作用和它们之间的差异是未知的。

通过使用人工产生的多磷酸盐，诸位发明人已经发现，Ca盐具有血小板聚集作用，而如Na盐等其他金属盐不产生血小板聚集。此外，诸位发明人已经发现，通过口服施用，由多磷酸的Ca盐构成的无定形物质引起受损胃肠粘膜中的血小板聚集，由此促进受损胃肠粘膜的愈合。

可以如以下实施例中所描述的评价多磷酸盐的血小板聚集作用。例如，可以通过以下方式体外评价血小板聚集作用：向富血小板血浆(PRP)中添加多磷酸盐(多磷酸盐纳米颗粒等)，并测量浊度变化。还可以通过以下方式体内评价血小板聚集作用：制备疾病模型动物，口服施用多磷酸盐，并观察CD61(其存在于血小板表面上)在受累部位处的定位。

本发明的血小板聚集剂可以含有药学上可接受的载体和添加剂。此类载体和添加剂的例子包括赋形剂、粘合剂、润滑剂、溶剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、缓冲液和流动性促进剂，但不限于此，并且可以视情况使用其他常规使用的载体和添加剂。

具体地，赋形剂的例子包括有机赋形剂，如糖类(包括乳糖、葡萄糖和D-甘露糖醇)、淀粉和纤维素(包括结晶纤维素)；以及无机赋形剂，如碳酸钙和高岭土。

粘合剂的例子包括预胶化淀粉、明胶、***胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、D-甘露糖醇、海藻糖、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。

润滑剂的例子包括硬脂酸、脂肪酸盐(如硬脂酸盐)、滑石和硅酸盐。

溶剂的例子包括纯化水、生理盐水和磷酸盐缓冲溶液。

崩解剂的例子包括低取代羟丙基纤维素、化学修饰的纤维素和淀粉。

增溶剂的例子包括聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠和乙酸钠。

助悬剂或乳化剂的例子包括月桂基硫酸钠、***胶、明胶、卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素(如羧甲基纤维素钠)、聚山梨醇酯和聚氧乙烯氢化蓖麻油。

等渗剂的例子包括氯化钠、氯化钾、糖类、甘油和尿素。

稳定剂的例子包括聚乙二醇、葡聚糖硫酸钠和其他氨基酸。

防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸和山梨酸。

抗氧化剂的例子包括水溶性抗氧化剂(抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠)、油溶性抗氧化剂(抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯和α-生育酚)和金属螯合剂(柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸)。

调味剂的例子包括制药领域中常用的甜味剂和调味料，并且着色剂的例子包括制药领域中常用的色料。

本发明的血小板聚集剂可以通过将其制造成如以下的药物制剂而安全地口服施用或肠胃外施用(例如，在口腔、食道、胃、小肠、大肠和直肠中施用)：片剂(包括糖包衣片剂、薄膜包衣片剂、舌下片剂和口腔崩解片剂)、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂和微胶囊剂)、液体剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、注射剂(例如，皮下注射剂、肌肉内注射剂和腹腔内注射剂)、外用制剂(例如，经鼻施用配制品、经皮配制品和软膏剂)、栓剂(例如，直肠栓剂和***栓剂)、泡沫剂、小丸剂、经鼻用剂和经肺用剂(吸入剂)。优选地，本发明的血小板聚集剂是口服施用、通过栓剂施用或直肠施用的，其中口服施用是特别优选的。

本发明的血小板聚集剂可以是控释配制品，如速释配制品或缓释配制品。如果所述血小板聚集剂是口服剂，那么可以根据需要对所述血小板聚集剂进行包衣，以达到掩蔽、肠溶性或耐久性的目的。用于包衣的包衣材料的例子包括糖包衣材料、水溶性薄膜包衣材料、肠溶薄膜包衣材料和缓释薄膜包衣材料。

可以将本发明的血小板聚集剂施用于人或施用于非人哺乳动物。施用剂量和施用方法不受特别限制，并且可以根据要施用的个体的病症、年龄等视情况确定。

本发明的血小板聚集剂的剂量是根据所述血小板聚集剂的预期用途、施用途径等视情况确定的。例如，当施用于人时，可以在多磷酸盐的每日剂量0.05mg/kg至15mg/kg、优选0.05mg/kg至5mg/kg、并且更优选0.05mg/kg至2.5mg/kg的范围内选择剂量。替代性地，可以例如按每名患者在3毫克/天至900毫克/天、优选3毫克/天至300毫克/天、并且更优选3毫克/天至150毫克/天的范围内施用所述血小板聚集剂，分成每天一个剂量至每天若干个剂量施用。

本发明的多磷酸盐由无定形物质构成，所述无定形物质由多磷酸盐Ca盐构成，所述多磷酸盐Ca盐是血小板聚集作用的主体。因此，与天然多磷酸盐(其是其他金属盐等的混杂混合物)相比，可以预期产生更强的血小板聚集作用。

只要不破坏本发明的目的，本发明的血小板聚集剂可以与其他药剂组合地使用。可以与本发明的血小板聚集剂组合地使用的药物的例子包括如溃疡性结肠炎和克罗恩病等炎性肠病的治疗中常用的药剂，如5-氨基水杨酸(5ASA)制剂，包括美沙拉秦和柳氮磺胺吡啶；类固醇制剂，包括***龙和甲基***龙；抗TNF-α制剂，包括英夫利昔单抗和阿达木单抗；硫嘌呤制剂，包括巯基嘌呤和硫唑嘌呤；以及免疫抑制剂，包括环孢素和他克莫司。本发明的血小板聚集剂和伴随药物的施用时间不受限制，并且所述血小板聚集剂和所述伴随药物可以同时施用或在不同时间施用。

4.炎性肠病

如上文所描述的，通过口服施用，由多磷酸的Ca盐构成的无定形物质在受损胃肠粘膜中发挥血小板聚集作用，并且促进受损胃肠粘膜的愈合。因此，本发明的无定形多磷酸盐可用于预防或治疗炎性肠病(IBD)。

“炎性肠病”统称为肠道的慢性或缓解/复发性炎性疾病，并且通常指两种疾病：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。溃疡性结肠炎是一种病因不明的弥漫性非特异性炎症，其产生大肠的粘膜的糜烂或溃疡。克罗恩病是一种病因不明的慢性炎性疾病的总称，其引起大肠和小肠的粘膜的慢性炎症或溃疡。

诸位发明人已经报告，多磷酸盐具有恢复肠屏障功能和预防或改善炎性肠病的作用。本发明的无定形多磷酸盐将上述恢复肠屏障功能的作用与Ca盐独特的血小板聚集作用组合起来，并且因此更有效地治疗受损胃肠粘膜，这使得诱导和维持炎性肠病的缓解。本发明还提供了一种用于诱导/维持炎性肠病的缓解的药物，所述药物含有这种血小板聚集剂。

5.食物/饮品

本发明的无定形多磷酸盐可以安全地口服，并且因此可以作为用于特定健康用途的食物、用于特殊膳食用途的食物、膳食补充剂、健康食物、功能性食物、病人食物等中的成分使用。

实施例

在下文中，通过实施例具体描述本发明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1：多磷酸钙颗粒的制备

将1.2g的长链多磷酸钠(平均链长度450-700：Kamui Pharma)添加到60mL的纯化水中并溶解。在搅拌的同时使用pH计(HORIBA F-55，pH电极9680S-10D)测量长链多磷酸钠的溶解水溶液的pH时，逐滴添加1N氢氧化钠溶液(由Wako Pure Chemical Industries制造)，以将水溶液的pH调节至pH 10。

将0.865g的氯化钙水合物(日本药典“仅供制造用”，由Wako Pure ChemicalIndustries制造)添加到7.5mL的纯化水中并溶解，以制备氯化钙水溶液。使用蠕动泵以约0.2g/min的滴率将所制备的氯化钙水溶液全部逐滴添加到长链多磷酸钠水溶液中。在滴加氯化钙水溶液期间连续监测pH，并且每当pH偏移至酸性侧、低于pH 10时，逐滴添加1N氢氧化钠溶液，以将pH维持处于pH 10。在将氯化钙水溶液全部逐滴添加之后，继续在室温下搅拌4小时。

将所获得的悬浮液制备分离至离心超滤过滤器单元(Amicon Ultra-15，标称截留分子量：3kDa，样品体积：15mL)，并使用离心机(KUBOTA型号5911)在20℃下以4,000rpm(3,040x g)离心3小时，以浓缩固体含量并同时脱盐。向含有浓缩沉淀物的过滤器装置中添加2mL的乙醇(99.5％，由Wako Pure Chemical Industries制造)，以使所述浓缩沉淀物再分散，然后将混合物在20℃下以4,000rpm(3,040x g)离心1小时，以去除乙醇洗涤液体。重复两次用乙醇进行的此洗涤操作。

将用乙醇洗涤之后的具有沉淀物的过滤器装置放置在真空干燥器(DP-33，YamatoScientific)中，并在通过真空抽吸减压之后在50℃下干燥12小时。在干燥之后，将固体内容物通过筛子(孔径：500μm)，以获得1.187g的多磷酸钙颗粒粉末。假设多磷酸钠中的1摩尔当量的钠离子被1/2摩尔当量的钙离子100％替代，计算出多磷酸钙颗粒的产率为101.9％。

使用动态光散射(DLS)粒度分布分析仪(Zetasizer型号Nano-ZS，MarvernInstruments)测量所制备的多磷酸钙颗粒的平均粒度和ζ电位。平均粒度为1252nm，并且ζ电位为-36.2mV。

实施例2：急性小肠结肠炎小鼠模型

1.材料和方法

1.1急性小肠结肠炎小鼠模型的制备和治疗试验

将六周龄至8周龄的雄性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories Japan)通过自由获取饮水用2％葡聚糖硫酸钠(MP Biomedicals)处理5天。将多磷酸钠和多磷酸钙溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，并从第一天开始，每天一次，给小鼠口服施用，并在第7天时，对小鼠进行安乐死和采样。

1.2肠道长度的评价

将小鼠的腹部用镊子拾起并用解剖剪刀剪开，去除股关节和骨盆关节，并用剪刀剪下通往肛区的大肠下段。然后，通过用镊子拾起用剪刀剪下的大肠的尖端，小心地分离出大肠，并用剪刀剪下盲肠的顶部。将切离的大肠放置在Kim towel擦拭纸上，并用尺子测量大肠长度。

1.3 RT-PCR

将切离的肠道用剪刀剪开，并将大肠的粘膜用载玻片分离出，然后添加到500μL的TRIzol中。在4℃下以15,000rpm离心5分钟后，将上清液转移到1.5mL Eppendorf管。将0.1mL的氯仿添加到管中，然后将混合物用涡旋混合器混合，并在4℃下以15,000rpm离心5分钟。在离心之后，将250μL的水层转移到新的1.5mL Eppendorf管。添加250μL的异丙醇洗涤沉淀，然后添加0.5mL的70％乙醇洗涤沉淀。将沉淀溶解于200μL的无菌水中，并使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)纯化RNA。根据产品文档，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)进行逆转录反应。使用回收的cDNA作为模板，使用对各种炎症相关细胞因子具有特异性的引物进行Taqman RT-PCR，并通过Applied Biosystems 7300实时PCR***(Applied Biosystems)获得光谱数据。使用相同的cDNA作为模板获得18S rRNA的光谱并进行标准化。通过ΔΔCt方法，使用光谱数据，相对于设置为1的PBS处理组，对表达水平进行定量。

1.4组织学严重程度的评价

将切离的肠道用剪刀剪开以制备肠卷，并用10％***溶液固定组织。在将固定的组织用石蜡包埋之后，将固定的组织薄薄地切成4μm薄片，并用苏木精-伊红染色。基于Berg等人的评价项对组织学严重程度进行评价(Berg DJ.等人J Clin Invest,1998)。

[表1]

组织学严重程度的评价

0级：正常组织

1级：固有层中有一个或少许多病灶单核细胞浸润物，伴随有杯状细胞的粘液未耗尽。

2级：固有层中有轻度炎性细胞浸润，主要由单核细胞和少许嗜中性粒细胞构成。

3级：炎性细胞浸润常常涉及粘膜下层，并且可见粘蛋白耗尽。

4级：炎性细胞浸润涉及肌层，并且粘蛋白的产生几乎消失。存在隐窝脓肿和溃疡。

1.5 CD61免疫组织化学染色

将石蜡包埋的肠道切片薄薄地切成4μm薄片，以制备组织载玻片。进行脱蜡，然后通过在柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中在121℃下煮沸20分钟来进行抗原活化。这在抗CD61抗体(Cell Signaling Technologies)溶液中在4℃下反应过夜，同时用SuperBlock T20(PBS)(Thermo Fisher Scientific)阻断非特异性反应。将组织在PBS中洗涤3次，每次5分钟，用ImmPRESS通用试剂抗兔IgG(VECTOR Laboratories)处理，然后将组织在PBS中洗涤3次，每次5分钟。使用ImmPACT DAB过氧化物酶底物试剂盒(VECTOR Laboratories)产生颜色，然后在苏木精溶液中进行核染色，接着进行封装。使用Image J(免费的图像分析软件)提取CD61阳性区域，并通过测量阳性区域的面积进行定量。

2.急性小肠结肠炎小鼠模型的结果

2.1肠道长度和组织学严重程度的评价(图1至图3)

图1示出了每个组的肠道长度：PBS处理组、多磷酸钙(PPA-Ca(1μg/小鼠))处理组、PPA-Ca(5μg/小鼠)处理组和他克莫司(TAC(60μg/小鼠))处理组。还在图2中示出了每组的组织学严重程度得分。与PBS处理组相比，PPA-Ca处理组(1μg和5μg/小鼠)的肠道显著更长。类似地，与PBS处理组中的组织学严重程度相比，PPA-Ca处理组中的组织学严重程度显著更低，这表明多磷酸钙在急性小肠结肠炎小鼠模型中的治疗作用。

将多磷酸钠(PPA-Na(5μg/小鼠))的作用与多磷酸钙(PPA-Ca(5μg/小鼠))的作用进行比较。与PBS处理组相比，PPA-Ca处理组的肠道显著更长，但没有发现PPA-Na处理组与PBS处理组有显著差异(图3)，这表明在急性小肠结肠炎小鼠模型中，多磷酸钙的治疗作用比多磷酸钠的治疗作用强。

2.2炎性细胞因子的表达(图4和图5)

图4示出了每个组中的炎性细胞因子(TNFα、IL-1β、IFNγ和IL6)的表达的RT-PCR分析的结果：PBS处理组、多磷酸钙(PPA-Ca(1μg/小鼠))处理组、PPA-Ca(5μg/小鼠)处理组和他克莫司(TAC(60μg/小鼠))处理组。在PPA-Ca处理组(1μg和5μg/小鼠)中，与PBS处理组相比，TNFα、IL-1β、IFNγ和IL6的表达全部显著更低。急性小肠结肠炎小鼠模型中显示出多磷酸钙对炎性细胞因子表达的抑制作用。

将多磷酸钠(PPA-Na(5μg/小鼠))的作用与多磷酸钙(PPA-Ca(5μg/小鼠))的作用进行比较(图5)。在PPA-Ca处理组中，与PBS处理组相比，IL-1β和TNFα的表达显著更低，并且IFNγ和IL6的表达水平也降低至与TAC处理组(60μg/小鼠)相同的水平。另一方面，在该剂量下，在PPA-Na处理组中没有观察到任何炎性细胞因子的表达降低，这表明在急性小肠结肠炎小鼠模型中，与多磷酸钠相比，多磷酸钙更强地抑制了炎性细胞因子的表达。

2.3 CD61阳性区域(图6)

图6示出了对急性小肠结肠炎小鼠模型的肠组织中的CD61阳性区域进行比较的图。与无处理组(对照)相比，施用DSS的组(DSS，PBS)中的CD61阳性区域显著更大，但与施用DSS的组(DSS，PBS)相比，PPA-Ca处理组(DSS，PPA-Ca：5μg/小鼠)中的CD61阳性区域显著更大。因为CD61在血小板表面上表达，所以当发生血小板聚集时，CD61阳性区域扩大。上述结果表明，口服施用PPA-Ca极大地促进发炎的肠粘膜上的血小板聚集。

实施例3：血小板聚集测定

1.材料和方法

在获得研究同意书之后，用3.2％柠檬酸钠缓冲液使用血液收集管收集血液，并通过以800g离心10分钟回收富血小板血浆(PRP)。然后，将所获得的PRP在96孔板上分别与多磷酸钠和多磷酸钙以100μg/100μL PRP的浓度进行反应，并且基于Chan MV等人的血小板聚集测定(Chan MV等人Platelets,2018)，使用EnSpire多模式读板仪(Perkinelmer)每10秒测量一次测量吸光度(405nm)，并对PRP浊度随时间的变化进行分析。对于分析，将开始时的吸光度设置为1，并计算相对值以分析随时间的变化。

2.结果(图7)

在添加多磷酸钠(PPA-Na)时的吸光度变化与阴性对照(无添加)的吸光度变化之间可能几乎观察不到差异。另一方面，添加多磷酸钙(PPA-Ca)时的吸光度变化表明浊度与阳性对照(二磷酸腺苷(ADP))是可比的。这表明PPA-Ca发挥了明显的血小板聚集作用，而未发现PPA-Na有血小板聚集作用。

实施例4：创伤愈合测定

1.材料和方法

通过上述相同方法回收富血小板血浆，向所述富血小板血浆中以1mg/ml分别添加多磷酸钠和多磷酸钙，并在室温下反应20分钟。然后，通过以2,000g离心10分钟，将血小板从PRP去除。将所回收的血浆添加到Vivaspin 3K离心柱(GE Healthcare)中并以3,040x g离心，以回收相对较低分子量的血浆组分，血小板和多磷酸盐颗粒从所述血浆组分中去除。使用P200尖端在12孔板中培养到汇合的人结肠上皮细胞系(HCEC-1CT细胞)上画出线性创伤，向所述人结肠上皮细胞系中添加上述所回收的相对较低分子量的血浆组分。通过随时间拍摄照片并测量线性创伤的宽度来评估创伤愈合的程度。

2.结果(图8)

图8示出了创伤宽度的时间历程。对于从向其中添加了多磷酸钠(PPA-Na)的PRP回收的血浆组分而言，与阴性对照(PRP无添加)相比，没有观察到创伤愈合的程度有显著差异。另一方面，对于从向其中添加了多磷酸钙(PPA-Ca)的PRP回收的血浆组分而言，创伤愈合的程度显著提高。

因为在测定中，已将血小板和多磷酸盐颗粒从添加到细胞的血浆组分中去除，所以这表明由于多磷酸钙使血小板聚集而产生的液体因子促进了创伤愈合。

3.讨论

结果显示出，多磷酸钙使小肠结肠炎小鼠模型(急性)的肠粘膜中的血小板聚集，并且此外，由于血小板聚集而产生的液体因子促进了肠上皮细胞修复。另一方面，没有观察到多磷酸钠具有血小板聚集作用或基于所述血小板聚集作用促进肠上皮细胞修复的作用。

实施例5：慢性小肠结肠炎小鼠模型

1.材料和方法

1.1慢性小肠结肠炎小鼠模型的制备和治疗试验

使六周龄至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠(Charles River Laboratories Japan)自由获取含有2％葡聚糖硫酸钠(MP Biomedicals)的饮水，持续5天。然后，允许小鼠自由获取蒸馏水，直至第35天。将多磷酸钠(1μg/小鼠)和多磷酸钙(1μg/小鼠)溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，并从第25天开始，每天一次，给小鼠口服施用，并在第35天时，对小鼠进行安乐死和采样。

1.2肠道长度的评价

根据实施例2中所描述的方法进行评价。

1.3 RT-PCR

根据实施例2中所描述的方法进行RT-PCR。

1.4组织学严重程度的评价

根据实施例2中所描述的方法进行评价。

2.结果

2.1肠道长度和组织学严重程度的评价(图9和图10)

图9示出了每个组中的肠道的长度：PBS处理组、多磷酸钙(PPA-Ca(5μg/小鼠))处理组和PPA-Na(5μg/小鼠)处理组。在慢性小肠结肠炎模型中，与PBS处理组相比，PPA-Ca处理组的肠道显著更长(p＜0.05)，并且在PPA-Na处理组中还显示出一定的提高(p＝0.07)。还在图10中示出了每组的组织学严重程度得分。在PPA-Ca处理组和PPA-Na处理组两者中均观察到组织学严重程度的显著改善(p＜0.05)。

2.2炎性细胞因子的表达(图11)

图11示出了炎性细胞因子(TNFα、IL-1β和IFNγ)的表达的RT-PCR分析的结果。在PPA-Ca处理组中，与PBS处理组相比，任何炎性细胞因子的表达水平显著更低(p＜0.05)。相比之下，虽然没有观察到PPA-Na处理组与PBS处理组有显著差异，但观察到IFNγ的表达有一定的降低(p＝0.06)。

3.讨论

发现了，多磷酸钙可用于慢性小肠结肠炎和急性小肠结肠炎两者。在与多磷酸钠相比时，即使是较小的剂量也足以发挥促进受损粘膜愈合的作用，并且多磷酸钙的优势在急性小肠结肠炎中特别明显。认为这些差异部分地是由于受损粘膜中的血小板聚集作用(没有观察到多磷酸钠具有这种血小板聚集作用)以及由液体因子产生的对粘膜愈合的促进。

实用性

本发明可以作用于受损胃肠粘膜并且促进血小板聚集，由此促进炎性肠病中的粘膜愈合。因此，本发明可用于预防或治疗炎性肠病。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体特此并入。

Claims (8)

1.一种血小板聚集剂，所述血小板聚集剂包括无定形多磷酸盐作为活性成分，其中所述多磷酸盐是多磷酸的Ca盐。

2.根据权利要求1所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂促进受损胃肠粘膜中的血小板聚集。

3.根据权利要求1或2所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂被施用于患有炎性肠病的患者。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂是口服施用。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的血小板聚集剂，所述血小板聚集剂促进受损胃肠粘膜的愈合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的血小板聚集剂，其中所述无定形多磷酸盐呈纳米颗粒形式。

7.根据权利要求6所述的血小板聚集剂，其中所述多磷酸盐纳米颗粒的ζ电位为0mV或更小。

8.根据权利要求6或7所述的血小板聚集剂，其中所述多磷酸盐纳米颗粒的平均粒度为10nm至3000nm。

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