CN114921550A

CN114921550A - circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂

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Publication number: CN114921550A
Application number: CN202210636988.5A
Authority: CN
Inventors: 熊炜; 邓湘赢; 范春梅; 曾朝阳; 王忆安; 晏其佳; 石磊; 范松青; 张姗姗; 龚朝建; 李夏雨; 李桂源
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2022-08-19

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂。首次发现circSTX6在鼻咽癌中差异表达，可以作为诊断或预后分子标记物，还可能成为鼻咽癌治疗的潜在靶点。本发明采用反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)针对环状RNA头尾相接处的拼接位点设计序列对circSTX6进行干扰，在鼻咽癌细胞系HNE2、CNE2和HONE1中进行基质胶侵袭实验、划痕愈合实验，相对于NC组，ASO组细胞的侵袭和迁移能力明显减弱，即沉默circSTX6抑制了鼻咽癌细胞的侵袭转移,即抑制circSTX6能治疗鼻咽癌，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂。

背景技术

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤，有明显的区域聚集性和人种好发性。鼻咽癌的发病因素主要包括遗传因素、EB病毒感染和环境因素等。鼻咽癌多为非角化型鳞癌，恶性程度较高，早期即可出现颈部***转移。目前，鼻咽癌的治疗方法主要是放疗、联合化疗和手术治疗等，虽然早期NPC患者的5年总生存率高达95％，但鼻咽和颈***复发率为8.6％～23.7％。这是由于NPC的发生和发展涉及复杂的基因调控和多阶段过程，其分子机制尚不清楚，加之肿瘤异质性和放疗抵抗引起的个体差异，传统放疗的治疗效果不是非常的理想。因此，研究治疗鼻咽癌的治疗靶标和诊断分子标记物至关重要。

环状RNA(Circular RNA,circRNA)主要来源于蛋白质编码基因的外显子区，也可以由内含子区、UTR区、基因间区、非编码RNA位点及已知转录物的反义位点形成。CircRNA是由前体(mRNA precursor messenger RNA,pre-mRNA)反向拼接而形成的一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴并以共价键形成环状套索结构的非编码RNA分子。

CircRNA形成过程可以分为两大类，即外显子环化(exon circularization)和内含子环化(intron circularization)两大机制。Jeck等提出外显子来源的circRNA(exoniccircRNA,ecircRNA)可以分为套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种形成方式，套索驱动环化是外显子3'端作为剪接供体(splice donor)攻击5'端剪接受体(splice receptor)，Alu区共价结合而形成套索结构，套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circRNA；内含子配对驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后，剪除内含子形成circRNA。其实内含子本身也可以环化，可以形成内含子来源circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)。CircRNA是由前体mRNA反向拼接而形成的一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴并以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码RNA分子。有着高度的稳定性、保守性、特异性，并且含量高的特点。

CircRNA最早在1976年于RNA病毒中首次发现，随后Hsu MT等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circRNA的存在。近年来越来越多的circRNA被发现，目前为止已知的circRNA数目已经达到三万多个。CircRNA也不再被认为是错误的RNA转录本，而是作为非编码RNA研究中的耀眼之星冉冉升起。发现更多的新型circRNA作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。

本发明检测到一个长度为391bp的环状RNA circSTX6。通过实验发现该环状RNA在鼻咽癌中高表达且能促进鼻咽癌的侵袭转移，有可能作为鼻咽癌诊断或预后标记物及治疗靶点。

发明内容

本发明发现了一个大小391bp的环状RNAcircSTX6，并发现了它与鼻咽癌之间存在的关系，有可能作为鼻咽癌诊断或预后标记物和治疗靶点。

本发明的第一个目的是提供circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后制剂中的应用，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的鼻咽癌诊断和/或预后制剂包括PCR或者原位杂交检测circSTX6表达量的试剂。

更进一步地，所述的PCR或原位杂交检测circSTX6表达量的试剂中包含：

环状RNA circSTX6实时定量PCR引物

上游引物：5'-GGCTGGACAATGTGATGAAG-3'，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物：5'-AGTTCTGGCTGCCACTGTCT-3'，如SEQ ID NO.3所示；

或者扩增circSTX6全长引物

上游引物：5'-CCATCGATGACATGAAAGATCAGATGTCAACTTCAT-3'，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物：5'-TCCCCGCGGCACTGGTCATATGAGATACTTTTGCAAG-3'，如SEQ ID NO.5所示。

circSTX6原位杂交探针序列：5'-TGATCTTTCATGTCCACTGGTCATATGAG-3'，如SEQ IDNO.6所示。

本发明诊断和/或预后试剂包括但不限于上述引物和探针序列。

本发明第二个目的是提供一种鼻咽癌诊断和/或预后制剂，包含PCR或者原位杂交检测circSTX6表达量的试剂，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的鼻咽癌诊断制剂，包含上述的引物或者原位杂交探针。

本发明通过qRT-RCR检测鼻咽癌临床组织中circSTX6的表达水平，发现其在鼻咽癌组织中相较于非肿瘤鼻咽上皮组织显著上调，且与患者预后生存期相关，结果具有统计学意义，可见circSTX6可以作为鼻咽癌辅助诊断或者预后的标记物，为鼻咽癌诊断、预后提供了新的检测途径。

本发明的第三个目的是提供抑制circSTX6表达的试剂在制备治疗鼻咽癌制剂中的应用，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的抑制circSTX6表达的试剂包括反义寡核苷酸。

更进一步地，所述的反义寡核苷酸ASO(antisense oligonucleotide)：

正义链(5'-3')CAUAUGACCAGUGGACAUGATT，如SEQ ID NO.7所示；

反义链(5'-3')UCAUGUCCACUGGUCAUAUGTT，如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第四个目的是提供一种治疗鼻咽癌的制剂，包括抑制circSTX6表达的试剂，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的抑制circSTX6表达的试剂包括反义寡核苷酸，优选所述的反义寡核苷酸：

正义链(5'-3')CAUAUGACCAGUGGACAUGATT

反义链(5'-3')UCAUGUCCACUGGUCAUAUGTT。

本发明不限于上述具体的ASO。

进一步的，所述的抑制circSTX6表达的试剂还包括阴性对照：

正义链(5'-3')GAGAACGGGAUAGCAUCGACTT，如SEQ ID NO.9所示；

反义链(5'-3')GUCGAUGCUAUCCCGUUCUCTT，如SEQ ID NO.10所示；

但不限于上述具体的阴性对照。

目前，ASO已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circSTX6在肿瘤发生发展中的作用，本发明根据circSTX6的拼接位点设计了一对ASO，利用Hiperfect试剂将ASO和siNC(对照)瞬时转染到HNE2、CNE2和HONE1细胞系中沉默circSTX6的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circSTX6的表达水平以检测ASO的转染效率，发现设计的ASO能显著抑制circSTX6的表达水平。

本发明通过大量的试验证实上述结论：即抑制circSTX6表达的试剂能够用于制备鼻咽癌治疗制剂。这些试验包括：体外过表达circSTX6试验发现能促进鼻咽癌细胞侵袭和迁移，体外沉默circSTX6则抑制鼻咽癌细胞的侵袭和迁移。

由于ASO具有良好的沉默效果，本发明采用针对环状RNA头尾相接处的拼接位点设计ASO对circSTX6进行干扰(只沉默circRNA，对线性的RNA无影响)，在鼻咽癌细胞系HNE2、CNE2和HONE1中进行划痕愈合实验、基质胶侵袭实验，相对于NC(对照)组，ASO组细胞的侵袭和迁移能力明显减弱，即沉默circSTX6抑制了鼻咽癌细胞的侵袭转移。即抑制circSTX6能治疗鼻咽癌，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1.circSTX6的筛选鉴定及qRT-RCR检测鼻咽癌临床组织中circSTX6的表达水平；A.生信分析GEO数据库中GSE68799的鼻咽癌组织测序数据发现circSTX6在鼻咽癌组织中的表达显著上调；B.N为非肿瘤鼻咽上皮组织，样本数为16例；T为鼻咽癌组织，样本数为26例，n为样本数量，均采用t检验，p<0.05具有统计学意义。

图2.通过数据库比对和Sanger测序法验证circSTX6是由STX6基因第4-7号外显子反向拼接形成，大小391nt；a.circSTX6由STX6的4-7号外显子首尾拼接形成，E表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circSTX6形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接；

图3.检测circSTX6在鼻咽癌细胞系中的表达。NP69是永生化的正常鼻咽上皮细胞，作为参照，其余均为鼻咽癌细胞系。

图4.检测circSTX6对RNase R的耐受性。RNase R处理后，利用qRT-PCR检测鼻咽癌细胞内circSTX6和STX6的相对RNA水平。

图5.检测circSTX6的稳定性。放线菌素D处理后，利用qRT-PCR检测鼻咽癌细胞内circSTX6和STX6在不同时间点的相对RNA水平。

图6.RNA-fish实验检测circSTX6的亚细胞定位。circSTX6大部分定位在细胞质中。

图7.circSTX6过表达载体的重组质粒图谱。

图8.qRT-PCR技术检测鼻咽癌细胞系中circSTX6过表达质粒的过表达效率和circSTX6 ASO的沉默效率。A.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中circSTX6质粒的过表达效率,circSTX6表达水平分析以β-actin作为参照；B.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中circSTX6 ASO的沉默效率,circSTX6表达水平分析以β-actin作为参照。C.在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中转染ASO后，检测线性RNA STX6的表达，ns代表无意义，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图9.体外过表达/沉默circSTX6对鼻咽癌细胞增殖的影响。A.在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2用Neofect瞬时转染pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、circSTX6过表达质粒，继续培养24小时后进行MTT实验检测细胞增殖能力，将pcDNA3.1(+)CircRNA MiniVector组标准化为1，ns代表没有意义，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。B.在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2用Hiperfect瞬时转染siNC、circSTX6 ASO，继续培养24小时后进行MTT实验检测细胞增殖能力，将siNC组标准化为1，ns代表没有意义，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图10.过表达/沉默circSTX6对鼻咽癌细胞侵袭的影响。A.用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障，在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、circSTX6过表达质粒24小时后，用基质胶侵袭实验检测过表达circSTX6对鼻咽癌细胞侵袭的影响，其中下图为细胞个数的统计图(B)，将pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector标化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。C.用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障，在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染siNC、circSTX6 ASO 24小时后，用基质胶侵袭实验检测沉默circSTX6对鼻咽癌细胞侵袭的影响，其中右图为细胞个数的统计图(D)，将siNC标化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图11.过表达/沉默circSTX6对鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2划痕愈合能力的影响。A.在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、circSTX6后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图(B)，将pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector标化为1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。A.在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染siNC、circSTX6 ASO后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图(C)，将siNC标化为1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图12.circSTX6在鼻咽癌组织中高表达并与患者的不良预后相关。A-B.circSTX6表达在来自95名NPC患者和25例正常组织(鼻咽上皮，NPE)的石蜡包埋组织切片中通过原位杂交实验得到验证。B.circSTX6高表达与鼻咽癌患者的总体生存期缩短相关。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明所用HNE2、CNE2和HONE1等鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素、链霉素)的RPMI1640液体培养基，37℃、95％湿度、5％CO₂浓度的恒温培养箱内贴壁生长。

本发明环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，Primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，委托擎科生物公司长沙合成部合成。

(1)β-actin

上游引物：5'-TCACCAACTGGGACGACATG-3'；如SEQ ID NO.11所示；

下游引物：5'-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3'；如SEQ ID NO.12所示；

(2)环状RNA circSTX6实时定量PCR引物

上游引物：5'-GGCTGGACAATGTGATGAAG-3'

下游引物：5'-AGTTCTGGCTGCCACTGTCT-3'

(3)扩增circSTX6全长引物

上游引物：5'-CCATCGATGACATGAAAGATCAGATGTCAACTTCAT-3'

下游引物：5'-TCCCCGCGGCACTGGTCATATGAGATACTTTTGCAAG-3'

本发明为了特定的敲低环状RNA而不影响它的线性基因表达，根据拼接位点设计ASO，靶向沉默circSTX6。

circSTX6 ASO序列：

正义链(5'-3')CAUAUGACCAGUGGACAUGATT

反义链(5'-3')UCAUGUCCACUGGUCAUAUGTT。

阴性对照：

正义链(5'-3')GAGAACGGGAUAGCAUCGACTT

反义链(5'-3')GUCGAUGCUAUCCCGUUCUCTT。

本发明试验结果均采用统计学分析：t检验用来评价两组之间的差异。卡方检验用来评估基因表达或不表达在性别、年龄、肿瘤阶段、临床分期和转移情况等临床参数方面的差异。p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用SPSS 13.0和Graphpad 7.0软件进行。

实施例1：circSTX6的筛选鉴定

本发明从GEO数据库中，下载了一套包含4个正常鼻咽组织样本和41个鼻咽癌组织样本，共计45个临床样本的RNA-seq数据，编号为GSE68799。通过对这套鼻咽癌组织RNA-seq数据分析，鉴定出了8884个circRNA，随后使用SAM软件对数据进行差异分析，得到178个在正常鼻咽组织和鼻咽癌组织间存在显著差异的circRNA分子，其中在鼻咽癌组织中上调的环状RNA分子中发现了hsa_circ_23135(circSTX6)(图1)。

实施例2：sanger测序证明形成的是环状RNA

为了证明circSTX6形成的是环状RNA而非线性的，将图1B中的qRT-PCR产物回收，送公司进行sanger测序(擎科公司)。将公司返回的序列用DNASTAR软件进行比对，chromas软件看峰图，判断测序的质量。结果显示，circSTX6确实是由母基因STX6的4-7号外显子头尾相接环化形成。a.circSTX6由STX6的4-7号外显子首尾拼接形成，E表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circRNA形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接(见图2)。

实施例3：circSTX6在鼻咽癌细胞中的表达

1、细胞总RNA提取

准备工作：灭菌后的无RNase水、75％乙醇(无RNase配制)、氯仿、异丙醇、1×PBS、无酶tip头和EP管，高速低温离心机预冷至4℃，实验开始前先将实验台面及移液枪用75％酒精擦拭。

1)取待提取RNA的细胞，用1×PBS或D-hanks清洗两次；

2)12孔板中每孔加500μL Trizol裂解液，室温裂解1-2分钟，用移液枪轻轻吹下细胞，上下轻柔颠倒10次，室温静置5分钟；

3)加入100μL的氯仿(按1mLTrizol:0.2mL氯仿:0.5mL异丙醇)，用力震荡15-30s，冰上放置5分钟；

4)4℃，12000rpm/20min；

5)取上层水相于预冷的Tube管中，加入250μL异丙醇，用漩涡混合器或移液枪混匀(-20℃>1h)；

6)4℃，12000rpm/30min，弃上清；

7)加入75％乙醇(预冷)1mL，混匀；

8)4℃，7600rpm/5min；弃上清，重复步骤8,9；

9)闪离10s，尽量吸尽上清，倒置干燥10分钟；

10)加入20-30μL DEPC，测RNA浓度和OD值。

2、circRNA逆转录PCR反应

(依据abm公司5×All-In-OneRTMasterMix(withAccuRTGenomicDNARemovalKit)(#G492)的实验说明手册操作)

配置如下反应体系：

逆转录PCR上机反应程序如下：

25℃ 10min，

42℃ 15min，

85℃ 5min。

待反应结束后，-20℃保存产物备用。

3、实时荧光定量PCR

先将逆转录反应产物稀释5倍，然后依据abm公司EvaGreen qPCR MasterMix(MasterMix-R)的实验说明手册操作，配置如下反应体系：

实时荧光定量PCR机上反应程序如下：(Cycle×39)

Bio-RadIQ5实时荧光定量PCR仪进行上述反应完成后，与内参基因β-actin标化，以2-△△CT值显示目标基因的相对表达量，判定基因的表达差异。采用unpaired t-test检验计算p值。

结果：鼻咽癌细胞中circSTX6的表达明显高于正常鼻咽上皮细胞NP69(图3)。因此，circSTX6在鼻咽癌细胞系中高表达，circSTX6对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能，可以据此使用反义寡核苷酸对进行鼻咽癌治疗。

实施例4：RNase R消化实验

1反应体系

RNase R消化反应体系

2反应条件

37℃，10-30min。

注：1)可随RNA增加适当延长消化时间，一般10-30min即可消化掉大部分的线性RNA，PCR检测线性RNA丰度有几百倍的降低。消化1h以上是非必要的，因为时间过长可能导致少数耐受力弱的circRNA被消化。2)孵育后可先纯化回收，或者70℃10min使酶灭活后直接进行下游实验。

3纯化回收

消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,V:V)溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA纯化柱和磁珠进行纯化回收。qRT-PCR检测circSTX6和线性mRNA STX6(见图4)。

注：苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,V:V)溶液最好现配现用，没有试剂也可以TrizolReagent代替。

实施例5：放线菌素D处理实验

为了检测circRNA与线性RNA的稳定性，将鼻咽癌细胞以50％左右密度接种至12孔板中，待细胞贴壁后加入终浓度为1μg/mL的放线菌素D，分别处理0，8，16，24小时，抽提细胞的RNA，逆转录成cDNA，并用qRT-PCR检测circSTX6和STX6 mRNA的表达，以18s为内参(图5)。

实施例6：RNA-fish实验检测circSTX6在细胞内的定位

由于ASO发挥作用主要是在细胞质中，因此检测circSTX6的定位可判断能否很好地干扰circSTX6的表达。利用RNA-FISH检测circSTX6在核、质中表达所占的比重，发现circSTX6主要定位于细胞质。(见图6)。

RNA-fish步骤：

1)爬片：按1000个细胞/孔将贴壁细胞接种于24孔板(孔内提前防置玻片)，放置于培养箱中培养过夜；

2)吸弃培养基，37℃预热PBS洗两次，每次5min；

3)固定：每孔加入200μL 4％多聚甲醛，室温固定15min；

4)破膜：吸弃固定液，每孔加入200μL 0.25％TritonX-100(现配现用，溶于PBS)，室温处理15min；

5)PBS洗两次，每次5min；

6)预杂交：湿盒准备，杂交盒底部加20％甘油20mL以保持温度，按每张切片20μL加入预杂交液，恒温箱37℃孵育2-4h，吸取多余液体，不洗；

7)用杂交液稀释地高辛标记的circSTX6 RNA探针，按每张切片20μL加入杂交液(浓度一般为4μM/8μM，体积15-20μL)，恒温箱37℃孵育过夜(大于16h)；

8)杂交片洗涤：30-37℃左右水温的2xSSC洗涤两次，每次5min；0.5xSSC洗涤一次，5min；0.2xSSC洗涤一次，5min，必要时可用0.2xSSC复洗一次，5min；

9)滴加封闭液:37℃30min，吸取多余液体，不洗；

10)滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃60min或室温2h，0.5Mx PBS洗四次，每次5min；

11)滴加荧光二抗(1:200),37℃60min，0.5M x PBS洗三次，每次5min；

12)加入DAPI工作液，避光染色10min；

13)0.5M x PBS洗三次，每次5min；

14)封片，拍摄。

实施例7：在鼻咽癌细胞系中circSTX6过表达效果检测

首先我们选择酶切位点，将circSTX6全长序列放入NEB cutter 2.0在线网站分析，显示ClaI和SacII酶切位点为circSTX6全长序列中不存在的位点，同时在pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒载体(购于生工生物工程公司)中单一存在的DNA限制性内切酶。将circSTX6全长序列克隆进pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒空载，图7为绘制的过表达载体图谱。

为了检测circSTX6的成环效率，首先我们将构建的pcDNA3.1(+)CircRNA MiniVector/circSTX6真核过表达载体在鼻咽癌细胞中进行过表达。把生长状况良好的第三、四代鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2种到12孔板中，待细胞融合度达到60％-80％时，用Neofect把无内毒素质粒pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector空载体和circSTX6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养至36h收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circSTX6的表达水平及成环效率。qPCR结果显示，与pcDNA3.1(+)CircRNA MiniVector空质粒组细胞相比，转染circSTX6过表达质粒组的细胞中circSTX6的表达水平显著升高，结果具有统计学意义(见图8A)。

实施例8：在鼻咽癌细胞系中沉默circSTX6表达的效果检测

反义寡核苷酸(ASO)是一类通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制该基因表达的分子。ASO是单链DNA和RNA的杂合体，通过Rnase-H起作用，这个酶在核内也有，因此可以同时干扰核内和胞质中的基因。ASO针对拼接位点设计和靶序列互补的序列，从而避免干扰线性RNA的表达。目前，ASO已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circSTX6在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circSTX6的拼接位点设计了ASO，利用Hiperfect试剂将ASO和siNC(空白对照)瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circSTX6的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circSTX6的表达水平以检测ASO的转染效率，确认circSTX6敲低效果(见图8B)。然而以circSTX6的序列设计线性引物时，实时荧光定量PCR检测发现ASO并未敲低线性RNA的表达，说明ASO是特异性沉默circSTX6的表达(见图8C)。

本实施例中反义寡核苷酸：

正义链(5'-3')CAUAUGACCAGUGGACAUGATT

反义链(5'-3')UCAUGUCCACUGGUCAUAUGTT。

空白对照：

正义链(5'-3')GAGAACGGGAUAGCAUCGACTT

反义链(5'-3')GUCGAUGCUAUCCCGUUCUCTT。

实施例9：MTT实验检测细胞增殖

我们首先用Hiperfect转染siNC、ASO circSTX6，或相应的用Neofect把无内毒素质粒pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector和circSTX6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养24h后，进行MTT实验，验证其对细胞增殖的影响。结果发现ASOcircSTX6能显著抑制三株细胞系的增殖，而过表达circSTX6显著促进三株细胞系的增殖(图9)

1)准备：Tip头、高温高压灭菌的D-hanks；移液枪、marker笔、15mL离心管等酒精消毒后再放置在生物安全柜内紫外照射30min，通风10min。

2)种板和转染：前一天将25cm²细胞瓶中的状态良好的细胞消化下来种入6孔板，待细胞密度长至70％左右转染ASO circSTX6，或者待细胞长至80～90％左右转染过表达载体。

3)转染12小时后，吸弃细胞上清，D-hanks洗3遍，6孔板每孔加入100μL胰酶，消化细胞呈圆形后，将细胞吹打下来转移至15mL离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加入1～2mL培基，混匀，取10μL加入细胞计数板进行细胞计数。根据细胞计数结果，将细胞稀释至5000个细胞/mL。

4)将稀释好的细胞悬液加入96孔板，每孔加入细胞悬液200μL，96孔板最外一圈孔中加200μL Dank’s缓冲液，放入培养箱继续培养。

5)待6～8h左右细胞贴壁后，每孔加入20μL MTT，继续培养4小时，小心吸弃孔内的培养上清液，每孔加入200μL DMSO，置于摇床上摇晃10min，在酶联免疫检测仪上选择490nm波长检测DMSO加样孔的吸光值，记录结果。之后每天在相同的时间点加MTT和DMSO进行吸光值检测，连续检测6天后进行统计学分析。

实施例10：细胞transwell侵袭实验：

1)基质胶准备：提前一天把冻存于-20℃的BD Matrigel胶置于4℃冰箱融化成液态，把稀释胶用的tip头、EP管置于-20℃过夜，这样第二天操作时Matrigel胶在铺胶时不会过快凝固；

2)基质胶稀释：BD Matrigel胶：无血清培基＝1:8，即20μL基质胶加160μL 1640培基轻吹混匀；

3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100μL，再沿边吸出80μL，依次铺好放入37℃培养箱里孵育2-3小时，当看到铺胶层为白色时，表明液体Matrigel胶已呈固态；

4)消化转染24h后的细胞，用无血清培基洗2遍，然后使用无血清的培基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为每200μL中2万个细胞；

5)向下层小室添加800μL含有20％FBS的1640培养基，放入小室时将24孔板倾斜45°角，以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡；

6)每室加200μL计好数的细胞悬液到transwell上室内，将24孔板放回37℃培养箱中，根据细胞状态和细胞侵袭速度，孵育约24～48h。

7)取出24孔板，用PBS或者D-hanks洗两遍，4％多聚甲醛浸洗10min，用清水洗3遍。

8)染色：用0.1％的结晶紫滴加到transwell小室的底部，室温静置5-10min，用PBS清洗2-3遍，用棉签小心擦掉小室上面的基质胶；

9)在24孔板中加入蒸馏水800μL，transwell上室中加入蒸馏水约200μL，然后在倒置显微镜下，任选5个不同的视野拍照，用image J软件进行计数和统计学分析差异的显著性。

体外沉默circSTX6的表达抑制鼻咽癌的侵袭

为了探究沉默circSTX6后是否能够影响鼻咽癌的侵袭，我们又在三株细胞系中进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，利用Hiperfect试剂将circSTX6 ASO和siNC瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circSTX6的表达。在沉默了circSTX6的鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中进行Transwell小室基质胶侵袭实验，结果显示，ASO组可在Transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少于NC组，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄5张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，沉默鼻咽癌细胞系中circSTX6的表达，能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的侵袭能力(图10)。

体外过表达circSTX6促进鼻咽癌细胞的侵袭

我们在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，已观察沉默circSTX6对细胞侵袭能力的影响。我们同样利用Neofect把无内毒素质粒pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector和circSTX6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circSTX6的表达水平及成环效率。在确定了circSTX6过表达质粒的过表达良好效果后，我们将细胞接种到铺基质胶的Transwell小室中，发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的数目明显比空载组多，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄3张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义(结果见图10)。以上结果表明，过表达鼻咽癌细胞系中circSTX6促进鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的侵袭能力。通过正反两个方向证明，环状RNA circSTX6能够促进鼻咽癌细胞的侵袭(结果见图10)。

实施例11：细胞划痕愈合迁移实验

1)照细胞台：1000μL/10μL Tip头、高温高压灭菌的D-Hank’s，直尺、1000μL/10μL移液枪、marker笔等，用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟；

2)待细胞长至50％～70％左右分别转染ASO和NC组或者转染质粒；

3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕：将10μL枪头比着直尺垂直于6孔板底部干脆快速进行十字或井字划痕，不要倾斜，力度大小一致，以确保划痕宽度尽可能一致；

4)吸弃培养液，用D-hanks轻轻洗涤3次，尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细胞；

5)加入1％双抗2％胎牛血清的1640培养基；

6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度，记为0h；

7)将6孔板放回培养箱培养，间隔12h拍摄同一位置，记为12h；

8)间隔24h时再拍相同位置，直到划痕愈合，整理所有的图片，并进行统计分析。

体外沉默circSTX6抑制鼻咽癌细胞的迁移

利用Hiperfect试剂将ASO和siNC瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circSTX6的表达。在沉默了circSTX6的鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中进行划痕实验，验证其对细胞迁移的影响。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于NC组，ASO组细胞的迁移能力明显减弱。划痕宽度差异明显,且具有统计学意义。以上结果显示，沉默鼻咽癌细胞系中circSTX6的表达，能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的迁移能力(图11)。

体外过表达circSTX6促进鼻咽癌细胞的迁移

利用Neofect把无内毒素质粒pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector和circSTX6过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2。在确定了circSTX6过表达质粒的过表达良好效果后，我们在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2进行了细胞划痕愈合实验。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于空载pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector质粒组，circSTX6过表达质粒组细胞的迁移能力明显增强。划痕宽度差异较大，且具有统计学意义。以上结果显示，过表达鼻咽癌细胞系中circSTX6的表达，能够促进鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的迁移能力。通过正反两个方向验证证明，circSTX6可以促进鼻咽癌细胞的迁移(图11)。

实施例12：原位杂交实验

本发明中收集了95例鼻咽癌临床组织样本，NPE(癌旁组织)＝25，NPC(鼻咽癌组织)＝95。利用原位杂交试剂盒(BOSTER，武汉，中国)检测石蜡包埋的鼻咽癌组织和癌旁组织中circSTX6的表达。探针序列(5'-TGATCTTTCATGTCCACTGGTCATATGAG-3')设计为跨越circSTX6剪接位点(～30nt)。使用半定量评分标准评估染色密度和深度。双盲评分是由两位经验丰富的病理学家打分。(1)染色强度：0，未染色；1，浅褐色；2，棕色无底色或深棕色带光棕色背景(中度阳性)；3，深棕色无非特定背景(强阳性)。(2)基于比例的分数阳性信号占总细胞数：0，无阳性细胞；1,0–25％；2，阳性率25-50％；3，50-70％阳性率；4，阳性率70-100％。本发明用原位杂交的方法检测鼻咽癌组织和癌旁非肿瘤组织中circSTX6的表达，发现circSTX6在鼻咽癌组织中高表达(图12A)。在同时分析NPE(癌旁组织)和NPC(鼻咽癌组织)中circSTX6高低表达时，circSTX6的阳性率大于25％定义为高表达，得到circSTX6在NPE和NPC中的高低表达的分布情况(图12B)。此外，用Kaplan-Meier生存分析生成了总体生存(OS)曲线，发现鼻咽组织中circSTX6水平较高的患者总体生存期显著缩短(图12C)。在分析统计鼻咽癌患者总体生存率时，本发明中把鼻咽癌中circSTX6阳性率低于50％的定义为circSTX6低表达，大于50％的定义为circSTX6高表达。在circSTX6低表达组中，死亡41例，存活22例，鼻咽癌患者总体生存率为35％。在circSTX6高表达组中，死亡28例，存活4例，鼻咽癌患者的总体生存率为12.5％(图12C)。

序列表

<110> 中南大学

<120> circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后、治疗制剂中的应用和诊断、治疗制剂

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 391

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gacaugaaag aucagauguc aacuucaucu gugcaggcau uagcugaaag aaaaaauaga 60

caggcacugc ugggagacag uggcagccag aacuggagca cuggaacaac agauaaauau 120

gggcgucugg accgagagcu ccagagagcc aauucucauu ucauugagga gcagcaggca 180

cagcagcagu ugaucgugga acagcaggau gagcaguugg agcuggucuc uggcagcauc 240

ggggugcuga agaacauguc ccagcgcauc ggaggggagc uggaggaaca ggcaguuaug 300

uuggaagauu ucucucacga auuggagagc acucaguccc ggcuggacaa ugugaugaag 360

aaacuugcaa aaguaucuca uaugaccagu g 391

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggctggacaa tgtgatgaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agttctggct gccactgtct 20

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatcgatga catgaaagat cagatgtcaa cttcat 36

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccccgcggc actggtcata tgagatactt ttgcaag 37

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgatctttca tgtccactgg tcatatgag 29

<210> 7

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cauaugacca guggacauga tt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ucauguccac uggucauaug tt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagaacggga uagcaucgac tt 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gucgaugcua ucccguucuc tt 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcaccaactg ggacgacatg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcaccggag tccatcacga t 21

Claims

1.circSTX6在制备鼻咽癌诊断和/或预后制剂中的应用，所述的circSTX6序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的鼻咽癌诊断和/或预后制剂包括PCR或者原位杂交检测circSTX6表达量的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR或者原位杂交检测circSTX6表达量的试剂中包含：

环状RNA circSTX6实时定量PCR引物

上游引物：5'-GGCTGGACAATGTGATGAAG-3'

下游引物：5'-AGTTCTGGCTGCCACTGTCT-3'；

或者扩增circSTX6全长引物

上游引物：5'-CCATCGATGACATGAAAGATCAGATGTCAACTTCAT-3'

下游引物：5'-TCCCCGCGGCACTGGTCATATGAGATACTTTTGCAAG-3'；

circSTX6原位杂交探针序列：5'-TGATCTTTCATGTCCACTGGTCATATGAG-3'。

4.一种鼻咽癌诊断和/或预后制剂，其特征在于，包含PCR或者原位杂交检测circSTX6表达量的试剂，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的鼻咽癌诊断和/或预后制剂，其特征在于，包含权利要求3中所述的引物或者原位杂交探针。

6.抑制circSTX6表达的试剂在制备治疗鼻咽癌制剂中的应用，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抑制circSTX6表达的试剂包括反义寡核苷酸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的反义寡核苷酸：

正义链(5'-3')CAUAUGACCAGUGGACAUGATT

反义链(5'-3')UCAUGUCCACUGGUCAUAUGTT。

9.一种治疗鼻咽癌的制剂，其特征在于，包括抑制circSTX6表达的试剂，所述的circSTX6序列如SEQ ID NO.1所示。

10.根据权利要求9所述的治疗鼻咽癌的制剂，其特征在于，所述的抑制circSTX6表达的试剂包括反义寡核苷酸，优选所述的反义寡核苷酸：

正义链(5'-3')CAUAUGACCAGUGGACAUGATT

反义链(5'-3')UCAUGUCCACUGGUCAUAUGTT。