CN114921501A - 用于生产发酵产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中一种α‑淀粉酶以及任选地一种热稳定性蛋白酶、支链淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是在液化过程中存在的和/或添加的，其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。本发明还涉及一种适于在本发明的方法中使用的组合物。
Description
本申请是申请日为2013年11月26日、申请号为201380061608.9、发明名称为“用于生产发酵产物的方法”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法。本发明还涉及一种适于在本发明的方法中使用的组合物。
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明背景
从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇，是本领域中熟知的。目前在工业上使用两种不同种类的方法。最常使用的方法通常被称作“传统方法”，并且包括在高温下典型地使用一种细菌α-淀粉酶液化糊化淀粉，随后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化发酵。另一种众所周知的方法通常被称作“生淀粉水解”-方法(RSH法)，包括典型地在至少一种葡糖淀粉酶的存在下在低于初始糊化温度进行颗粒淀粉的同时糖化和发酵。
尽管在过去几十年中发酵产物生产发生了显著改善，但是显著量的残余淀粉材料未被转化为所希望的发酵产物，例如乙醇。这些未转化的残余淀粉材料中的至少一部分，例如，糖和糊精，处于未发酵的美拉德(Maillard)产物的形式。
因此，仍然存在对于提供用于从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法的希望和需求，这些方法可以提供更高的发酵产物得率，或与传统方法相比的其他优点。
发明概述
本发明涉及使用一种发酵生物，从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法。
在第一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法，该方法包括以下步骤
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；并且
-任选地一种产碳水化合物源的酶；
ii)使用一种产碳水化合物源的酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
下文描述了适合的纤维素分解组合物。在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉。
在一个优选的实施例中，在从70-100℃之间，例如在75-95℃之间，例如在75-90℃之间，优选在80-90℃之间，例如82-88℃，例如约85℃的温度下进行液化。
在一个实施例中，液化过程中的pH是从4.5-5.0，例如在4.5-4.8之间。在另一个实施例中，在高于5.0-6.5，例如在高于5.0-6.0，例如在高于5.0-5.5，例如在5.2-6.2之间，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8的pH下进行液化。
在一个第二方面，本发明涉及一种酶组合物，包括：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种产碳水化合物源的酶。
所存在的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶，优选一种细菌α-淀粉酶，特别是来自嗜热脂肪芽孢杆菌，尤其是其热稳定性变体。下文给出了热稳定性变体的实例。优选的实例包括α-淀粉酶，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
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-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
本发明的组合物任选地包括一种支链淀粉酶。该支链淀粉酶可以是GH57家族支链淀粉酶，例如包括如WO 2011/087836中披露的X47结构域的一种支链淀粉酶。更多的实例在下文的“液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶”-部分中给出。
在本发明的实施例中，任选地存在热稳定性蛋白酶和/或产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶。
热稳定性蛋白酶的实例可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶”-部分中。在一个优选的实施例中，该热稳定性蛋白酶是如在此的SEQ ID NO:3所示的金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的，或来源于激烈热球菌的一种菌株的蛋白酶的，特别是如在此的SEQ ID NO:13的、在此的SEQ ID NO:29所示的或披露于美国专利号6,358,726-B1中的蛋白酶的一种变体。
适合的任选的产碳水化合物源的酶的实例，优选热稳定性产碳水化合物源的酶，特别是一种热稳定性葡糖淀粉酶，可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶，特别是一种葡糖淀粉酶，是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，或其变体。
还可以存在其他酶活性。
定义
酶：
纤维素分解组合物、纤维素分解酶或纤维素酶是指一种制剂，该制剂包括一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或它们的组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selectionstrategies)，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC))(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(PureAppl.Chem.)59:257-68)确立的。
可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，由一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于预处理的玉米秸秆(“PCS”)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过
HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行糖分析。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特B.和贝洛赫(Bairoch)A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指促进具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，纤维素分解增强活性通过测量来自由纤维素分解酶在以下条件下水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定：1-50mg总蛋白质/g于预处理的PCS中的纤维素，其中总蛋白质由50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白以及0.5-50％w/w GH61多肽(具有纤维素分解增强活性)的蛋白质构成，在合适的温度(例如，50℃、55℃或60℃)以及pH(例如，5.0或5.5)下持续1-7天，与用相等的总蛋白质负载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)的对照水解相比较。在一个方面，使用在总蛋白质重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下
1.5L(诺维信A/S)，丹麦巴格斯瓦尔德(
Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。
出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties)，基础微生物学杂志(J.BasicMicrobiol.)42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％
20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识(Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，里氏木霉纤维二糖水解酶：对结晶纤维素为何如此有效？(Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficienton crystalline cellulose？)，生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。
根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
内切葡聚糖酶：术语“葡聚糖内切酶”是指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β-1,4键，以及含有纤维素组分的其他植物材料的内切水解。
可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。为了本发明的目的，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，根据在Ghose，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59：257-268中所述的过程，在pH 5、40℃下，确定内切葡聚糖酶的活性。
发明详细说明
本发明涉及使用一种发酵生物，从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法。
在第一方面，本发明涉及用于生产发酵产物，优选乙醇的方法，该方法包括以下步骤
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种产碳水化合物源的酶；
ii)使用一种产碳水化合物源的酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
步骤ii)和iii)可以依序或同时进行。在一个优选的实施例中，步骤ii)和iii)同时进行。该α-淀粉酶，任选的热稳定性蛋白酶，任选的产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶，和/或，任选的一种支链淀粉酶可以在液化步骤i)之前和/或过程中添加。本发明的组合物可以适当地用于本发明的方法中。然而，也可以分开添加这些酶。α-淀粉酶的实例可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。热稳定性蛋白酶的实例可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶”-部分中。适合的任选的产碳水化合物源的酶的实例，优选热稳定性产碳水化合物源的酶，特别是一种热稳定性葡糖淀粉酶，可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中。适合的任选的支链淀粉酶可以发现于下文的“液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶”-部分中。
液化过程中的pH可以在4-7之间。在一个实施例中，液化过程中的pH是从4.5-5.0，例如在4.5-4.8之间。在另一个实施例中，在高于5.0-6.5，例如在高于5.0-6.0，例如在高于5.0-5.5，例如在5.2-6.2之间，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8的pH下进行液化。
根据本发明，温度可以高于初始糊化温度。术语“初始糊化温度”指典型地通过加热，淀粉开始溶解的最低温度。针对不同淀粉，该温度可以变化。
在一个实施例中，液化步骤i)过程中的温度范围是从70-100℃，例如在75-95℃之间，例如在75-90℃之间，优选在80-90℃之间，例如在82-88℃之间，例如约85℃。
在一个实施例中，本发明的方法在步骤i)之前进一步包括以下步骤：
a)优选地通过干式碾磨来减小含淀粉材料的粒度；
b)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆体。
该含淀粉起始材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常，存在以下两种类型的方法：湿式和干式碾磨。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿式碾磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿式碾磨时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解产物的，场所。干式和湿式碾磨两者都是淀粉领域所熟知的。根据本发明，优选干式碾磨。在一个实施例中，该粒度被减少至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有#6筛网的筛子。
该水性浆体可以包含含淀粉材料的从10-55w/w-％干固体(DS)，优选25-45w/w-％干固体(DS)，更优选30-40w/w-％干固体(DS)。
该浆体可以加热至超过初始糊化温度，优选至80-90℃之间，pH 4-7之间，优选在4.5-5.0之间或5.0和6.0之间，持续30分钟至5小时，例如约2小时。
该α-淀粉酶，任选的热稳定性蛋白酶，任选的产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的支链淀粉酶可以初时添加到该水性浆体中以开始液化(稀释)。在一个实施例中，这些酶中仅有一部分被添加到该水性浆体中，而这些酶中的剩余部分在液化步骤i)过程中添加。
根据本发明，液化步骤i)进行0.5-5小时，例如1-3小时，例如典型地约2小时。
在一个实施例中，该水性浆体在经受步骤i)中的液化之前可以喷射蒸煮以进一步使该浆体糊化。该喷射蒸煮可以在110-145℃之间，优选120-140℃，例如125-135℃，优选约130℃的温度下进行约1-15分钟，优选进行约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。
糖化与发酵
一种或多种产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，可以是在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中存在的和/或添加的。该产碳水化合物源的酶优选地可以是葡糖淀粉酶，但还可以是选自下组的一种酶，该组由以下各项组成：β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、和α-葡糖苷酶。在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中添加的产碳水化合物源的酶典型地与任选地在液化步骤i)过程中添加的任选的产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶不同。在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶一起添加的。
产碳水化合物源的酶(包括葡糖淀粉酶)的实例可以发现于下文的“糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中。
当依序进行糖化和发酵时，糖化步骤ii)可以在本领域中熟知的条件下进行。例如，糖化步骤ii)可以持续达从约24至约72小时。在一个实施例中，进行预糖化。预糖化在30-65℃之间，典型地是约60℃的温度下典型地持续40-90分钟。在一个实施例中，在同时糖化发酵(“SSF)中，预糖化之后是发酵过程中的糖化。糖化典型地在从20-75℃、优选地从40-70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。
同时糖化发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤ii)和发酵步骤iii)。不存在针对糖化的保持阶段，意指一起添加发酵生物(例如酵母)以及一种或多种酶。然而，还考虑了分开添加发酵生物以及一种或多种酶。根据本发明，SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的一个温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。在一个实施例中，pH是在3.5-5之间，特别是在3.8和4.3之间。
发酵培养基
“发酵培养基”(Fermentation media或fermentation medium)是指其中进行发酵的环境。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包括针对一种或多种发酵生物的营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂被广泛地用于发酵领域中并且包括氮源，例如氨；尿素、维生素以及矿物质或其组合。
发酵生物
术语“发酵生物”是指适合用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成、即转化成所希望的发酵产物，例如乙醇。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌株，特别是酿酒酵母。
在发酵过程中，例如SSF，适合的活发酵生物的浓度是本领域中熟知的，或可以由本领域的普通技术人员容易地确定。在一个实施例中，将该发酵生物，例如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母)添加至发酵培养基中，这样使得每mL的发酵培养基的活发酵生物(如酵母)计数范围是从105至1012，优选从107至1010，尤其是约5×107个。
可商购的酵母的实例包括，例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’sYeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(EthanolTechnology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERTSTRAND(可获得自格特·斯特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。
含淀粉材料
根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适合在本发明的方法中使用的含淀粉材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍(sago)、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆类、或甜薯、或其混合物、或者由其衍生的淀粉、或谷类。还考虑了糯与非糯类型的玉米与大麦。在一个优选的实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意思指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇；多元醇例如甘油、山梨糖醇和肌醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸类(例如谷氨酸)；气体类(例如H2和CO2)；抗生素类(例如青霉素和四环素)；酶类；维生素类(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；及激素类。在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，可饮用的酒精；或工业乙醇，或用于可消费醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、奶制品工业(例如发酵的奶制品)、皮革工业及烟草工业中所使用的产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。本发明的优选方法用于生产一种醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物，例如，乙醇，可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下它还可以用作饮用乙醇。
回收
发酵、或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可蒸馏该浆体以提取所希望的发酵产物(乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收该发酵产物。
液化过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶
根据本发明，α-淀粉酶连同任选的热稳定性蛋白酶、任选的产碳水化合物源的酶，特别是一种热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的支链淀粉酶在液化过程中是存在的和/或添加的。
在液化步骤i)过程中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选地是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度下典型地是稳定的。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可以是，例如，来源于芽孢杆菌属的菌株，芽孢杆菌属有时也称作土芽孢杆菌属。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以来源于其他芽孢杆菌属物种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/1946中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都特此通过引用结合)。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是一种与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是一种与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或在此的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。
在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸(与WO99/19467中的SEQ ID NO:3相比较)。
该芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体。这样一种变体的实例可以发现于以下任一项中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文献都通过引用而特此结合)。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中(通过引用而特此结合)并且包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(通常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO96/23873中的一种双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用而特此结合)，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用而特此结合)中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO99/19467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的一种双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或在此的SEQ ID NO:1中的S239的位置处具有取代。
在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
在一个实施例中，细菌α-淀粉酶可以是截短的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。尤其地，截短是这样的以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，例如从480至495个氨基酸长。
细菌杂合α-淀粉酶
该细菌α-淀粉酶可以是一种杂合细菌α-淀粉酶，例如一种包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，该杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ IDNO:5进行位置编号)。
在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，披露于理查森(Richardson)等人(2002)，生化杂志(The Journal of Biological Chemistry)，277卷，29期，7月19日发表，267501-26507页中，称作BD5088或其变体。这种α-淀粉酶与WO2007134207的SEQ ID NO:2所述的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。
热稳定性α-淀粉酶
根据本发明，α-淀粉酶可以是一种热稳定性α-淀粉酶，例如一种热稳定性细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在一个实施例中，根据本发明使用的α-淀粉酶在pH4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少15的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少20的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少25的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少30的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少40的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少50的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少60的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在10-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在15-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在20-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在25-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在30-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在40-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在50-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在60-70之间的T1/2(min)。
在本发明的一个实施例中，α-淀粉酶是一种细菌α-淀粉酶，优选来源于芽胞杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的一种菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌，如在WO 99/019467中披露为SEQ ID NO:3(在此的SEQ ID NO:1)，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，具有如下突变列表中的突变。
在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变：
| -V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F； |
| -V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S； |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T； |
| -A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -E129V+K177L+R179E； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S； |
| -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T； |
| -E129V+K177L+R179E+S242Q； |
| -E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -K220P+N224L+S242Q+Q254S； |
| -M284V； |
| -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V。 |
| -V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V； |
在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
应理解当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们是以截短形式正常地生产的。特别地，截短是这样的以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，例如从480至-495个氨基酸长。
在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体可以是一种与WO 99/19467中的SEQ IDNO:3、或在此的SEQ ID NO:1所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％一致性程度的酶。
液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶
根据本发明，热稳定性蛋白酶，连同α-淀粉酶，以及任选的产碳水化合物源的酶，特别是一种热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的支链淀粉酶是任选地在液化过程中存在的和/或添加的。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见催化酶手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)，巴雷特(A.J.Barrett)，罗林斯(N.D.Rawlings)，沃森纳(J.F.Woessner)(编)，学术出版社(1998)，尤其是概述部分。
在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定性蛋白酶是“金属蛋白酶”，其被定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“催化酶手册”以及其中指定的原则。可对所有蛋白酶类型进行测定，而不论其是天然或野生型蛋白酶；还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。测定PH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、或80℃。
蛋白酶底物的例子为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(AZCL-酪蛋白)。在下文的“材料与方法”-部分中描述了两种蛋白酶测定法，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定法”是优选的测定法。
在一个实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定法确定的，该热稳定性蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的蛋白酶活性。
对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的起源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，该蛋白酶是真菌起源。
该蛋白酶可以是，例如，野生型蛋白酶的一种变体，只要该蛋白酶具有在此定义的热稳定性特性。在一个优选的实施例中，该热稳定性蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的一种变体。在一个实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定性蛋白酶是真菌起源，例如真菌金属蛋白酶，例如来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)。
在一个实施例中，该热稳定性蛋白酶是披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分的或WO 2010/008841的SEQ ID NO:1以及在此的SEQ ID NO:3所示的成熟部分的变体，进一步具有选自以下列表的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
在一个优选的实施例中，热稳定性蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施例中，该蛋白酶变体与WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。
该热稳定性蛋白酶还可以来源于任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，该热稳定性蛋白酶来源于热球菌属的一种细菌菌株，例如激烈热球菌的一种菌株(pfu蛋白酶)。
在一个实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29所示的。
在另一个实施例中，该热稳定性蛋白酶是披露于此的SEQ ID NO:13或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或在此的SEQ ID NO:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一种蛋白酶。激烈热球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。
激烈热球菌蛋白酶是一种根据本发明的热稳定性蛋白酶。发现商用产品激烈热球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5下具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性，如在此的实例2中所述的进行测定。
在一个实施例中，在本发明方法中使用的热稳定性蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％与30％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的、超过10％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％C的测定为在80℃下的残余活性；和/或
在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％C的测定为在84℃下的残余活性。
“相对活性”以及“残余活性”的测定是如在实例2中描述的进行的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下可以具有高于90，例如高于100的热稳定性，如使用实例3中披露的Zein-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有在60-120之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，通过AZCL-酪蛋白测定法确定的，该热稳定性蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的活性。
液化过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶
根据本发明，产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，优选一种热稳定性葡糖淀粉酶，连同α-淀粉酶以及任选的热稳定性蛋白酶，可以是任选地在液化过程中存在的和/或添加的。如上所述，支链淀粉酶任选地还可以是液化步骤i)过程中存在的和/或添加的。
术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产物(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。
在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是热稳定的。该产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起或分开添加。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶，优选一种热稳定性葡糖淀粉酶在85℃下具有至少20％、至少30％，优选至少35％的相对活性热稳定性，如实例4(热稳定性)中描述的进行测定。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％，例如100％的相对活性，如实例4(pH最佳值)中描述的进行测定。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，在pH 5.0下具有至少至少80％，至少85％、至少90％的pH稳定性，如实例4(pH稳定性)中描述的进行测定。
在一个具体并优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是一种热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌起源，优选丝状真菌，例如来自青霉属的一种菌株，尤其是草酸青霉菌的一种菌株，特别是在作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753(特此将其通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该热稳定性葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽或在此的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。
在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是WO 2011/127802中披露为SEQID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一种变体，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。如披露于共同未决的美国申请号61/531,189或PCT/US12/053779(将其特此通过引用结合)中的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶来源于草酸青霉菌。
在一个实施例中，该热稳定性葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一种变体。在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶是WO2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的，在位置79处具有Val(V)(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
考虑的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体披露于共同未决的PCT申请号PCT/EP12/070127(特此将其通过引用结合)中。
在一个实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。
在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。
更具体地，在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步包括至少一种以下取代或取代的组合：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*；
E501V+Y504T；或
T65A+K161S；或
T65A+Q405T；或
T65A+Q327W；或
T65A+Q327F；或
T65A+Q327Y；或
P11F+T65A+Q327F；或
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
P11F+T65A+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+S105P+Q327W；或
T65A+S105P+Q327F；或
T65A+Q327W+S364P；或
T65A+Q327F+S364P；或
T65A+S103N+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体具有对应于PE001变体的K79V取代(使用SEQ ID NO:14进行编号)，并且进一步包括以下突变中的一种：
P11F+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
具体地，产碳水化合物源的酶能以从0.1-100微克EP/g，例如0.5-50微克EP/g，例如1-25微克EP/g，例如2-12微克EP/g DS的量添加。
液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶
任选地支链淀粉酶，连同α-淀粉酶以及任选地一种热稳定性蛋白酶和/或产碳水化合物源的酶可以是液化步骤i)过程中存在的和/或添加的。如上所述，产碳水化合物源的酶，优选一种热稳定性葡糖淀粉酶，也可以是在液化步骤i)过程中存在的和/或添加的。
支链淀粉酶可以是在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化发酵过程中存在的和/或添加的。
支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在例如分枝淀粉和支链淀粉中水解α-1,6-糖苷键的能力。
根据本发明考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(特此通过引用结合)中披露的Bacillus amyloderamificans的支链淀粉酶、WO 01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQID NO:4的Bacillus deramificans的支链淀粉酶，以及来自WO 01/151620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的支链淀粉酶，以及还有还描述于FEMS微生物学通讯(FEMS Mic.Let.)(1994)115,97-106中的支链淀粉酶。
根据本发明考虑的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏热球菌、特别是来自WO92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM No.3773的支链淀粉酶。
在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶包括X47结构域，如披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(将其特此通过引用结合)中。更具体地该支链淀粉酶可以来源于热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和Thermococcus hydrothermalis，例如Thermococcushydrothermalis支链淀粉酶，示于SEQ ID NO:11中，刚好在X47结构域之后的X4位点截短(即，在此的SEQ ID NO:11和12中的氨基酸1-782)。该支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和Thermococcus hydrothermalis支链淀粉酶杂合体或具有截短位点X4的、披露于作为WO2011/087836公开的US 61/289,040(特此将其通过引用结合)中的以及披露于在此的SEQID NO:12中的T.hydrothermalis/嗜热高温球菌杂合酶。
在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。
根据本发明，该支链淀粉酶能以有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于下文的“材料与方法”-部分中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETMD2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-300(杜邦-杰能科公司，美国)、以及AMANO 8安能满公司，日本)。
糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶
根据本发明，产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶可以是糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的。
在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属，优选里氏木霉的菌株；或篮状菌属，优选埃默森篮状菌的菌株，
葡糖淀粉酶
根据本发明，糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，例如，来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌起源的，选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，(1996)，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，(1995)，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，(1994)，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，(1996)，生物化学35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，(1997)，蛋白质工程(Protein Eng.)10:1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，(1998)，“来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性”(“Purification and properties of the raw-starch-degradingglucoamylases from Corticium rolfsii”)应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)、Talaromycesduponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
考虑到的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属，特别是嗜热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
考虑到的真菌葡糖淀粉酶包括瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部披露于WO2006/069289中；或披露于WO2007/124285中的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。根据本发明还考虑了杂合体葡糖淀粉酶。实例包括披露于WO2005/045018中的杂合体葡糖淀粉酶。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用而特此结合)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源于密孔菌属(Pycnoporus)的一种菌株，特别是来源于如描述于WO 2011/066576中的密孔菌属的一种菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，例如在此的SEQ ID NO:28，或来自粘褶菌属(Gloeophyllum)的一种菌株，例如篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)的菌株，特别是来源于如描述于WO2011/068803中的粘褶菌属的一种菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ IDNO:26。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在此的SEQ ID NO:27。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源于黑层孔属(Nigrofomes)的菌株，特别是披露于WO 2012/064351中的黑层孔属的菌株(SEQ ID NO:2)(全部参考文献特此通过引用结合)。还考虑了如下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶中的任一种的高一致性，即，与上述酶序列的成熟部分中的任一个，例如在此的SEQ ID NO:26、27、28或29中的任一个，优选在此的SEQ ID NO:26具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是一种真菌α-淀粉酶，尤其是一种酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地是副活性的。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括WO 99/28448中披露为SEQ IDNO:7的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和披露于WO 06/069289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO 06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO 06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括如在WO2011/068803中的SEQID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及WO2013/006756的SEQ ID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉(具有以下取代：G128D+D143N)。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是来源于根毛霉属的一种菌株，优选微小根毛霉的一种菌株，例如WO2013/006756的SEQ ID NO:3中所示的，或是来源于亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的一种菌株。
在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于在WO 2006/069290中披露为V039的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉。
在一个实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉具有以下取代或取代的组合中的至少一种：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQID NO:3进行编号)。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包括篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2)和微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包括如在WO 2011/068803中的SEQID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及WO 2013/006756的SEQ ID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉(具有以下取代：G128D+D143N)。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL、SPIRIZYME ACHIEVE和AMGTME(来自诺维信公司(Novozymes A/S))；OPTIDEXTM300,GC480,GC417(来自杜邦-杰能科公司(DuPont-Genencor))；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM公司)；G-ZYMETMG900,G-ZYMETM和G990 ZR(来自杜邦-杰能科公司)。
麦芽糖淀粉酶
糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶还可以是麦芽糖α-淀粉酶。一种“麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成处于α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而特此结合。在一个优选的实施例中，能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加麦芽糖淀粉酶。
糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的纤维素分解组合物
根据本发明，在发酵或同时糖化发酵(SSF)过程中存在纤维素分解组合物。
该纤维素分解组合物可以是任何纤维素分解组合物，包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶。
适合的纤维素分解组合物的实例可以发现于WO 2008/151079和共同未决的专利申请PCT/US12/052163(公开为WO 2013/028928)中，将其通过引用结合。
在优选的实施例中，纤维素分解组合物来源于木霉属、腐质霉属、或金孢子菌属的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉、特异腐质霉、和/或卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属，例如米曲霉菌株，例如WO 2002/095014中披露的那种或具有β-葡糖苷酶活性的、披露于WO2008/057637中的融合蛋白，或来源于烟曲霉，例如披露于WO 2005/047499或在此的SEQ IDNO:22中的那种或WO2012/044915(诺维信公司)中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如具有以下取代的一种变体：F100D、S283G、N456E、F512Y；或来源于青霉属的菌株，如披露于WO2007/019442中的巴西青霉的菌株，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如来源于嗜热子囊菌属，如金黄色嗜热子囊菌菌株，例如，在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的GH61多肽；或来源于梭孢壳属，例如土生梭孢霉菌株，例如，在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的GH61多肽；或来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉菌株，例如，在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的GH61多肽；或来源于青霉属的菌株，例如埃默森青霉菌菌株，例如，在WO2011/041397或在此的SEQ ID NO:23中披露的GH61多肽。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如披露在WO2011/057140的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:24中的Cel7a CBHI，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株或在此的SEQ ID NO:25；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳菌属的菌株，例如土生梭孢霉的菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和一种β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、以及一种CBH I。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBH I、以及一种CBH II。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或此处的SEQ IDNO:22。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽(WO 2011/041397)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或此处的SEQ ID NO:22或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物包括一种或多种以下组分：
(i)一种烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)一种烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)一种烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及
(iv)一种具有纤维素分解增强活性的青霉属GH61多肽；或其同系物。
在一个优选的实施例中，纤维素分解组合物来源于里氏木霉，包括具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(该多肽来源于埃默森青霉菌菌株(WO2011/041397中的SEQ IDNO:2或在此的SEQ ID NO:23))、披露于WO2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2在此的SEQ ID NO:22)变体F100D、S283G、N456E、F512Y)；WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6(在此的SEQ ID NO:24)的烟曲霉Cel7A CBH1以及WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18(在此的SEQ ID NO:25)的烟曲霉CBH II。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物按以下量给予：从0.0001-3mg EP/g DS，优选地，0.0005-2mg EP/g DS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS。
本发明优选方法的实例
在一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的过程，该过程包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)；
-任选地一种蛋白酶，来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在另一个优选的实施例中，本发明的方法涉及一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-任选地一种蛋白酶，来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及任选地
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
在一个实施例中，本发明的方法包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182+N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所述的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中一种纤维素分解组合物，例如里氏木霉纤维素分解组合物，是在发酵或同时糖化发酵过程中存在的和/或添加的，特别是包括一种或多种选自下组的多肽的里氏木霉纤维素分解组合物，该组由以下各项组成：
-一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种、或四种的混合物。
在一个实施例中，本发明涉及多种方法，这些方法包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶,该淀粉酶具有双缺I181+G182+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所示的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V+P11F+T65A+Q327F
-K79V+P2N+P4F+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
ii)使用选自下组的葡糖淀粉酶进行糖化：埃默森篮状菌葡糖淀粉酶或篱边粘褶菌葡糖淀粉酶；
iii)使用酿酒酵母进行发酵
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种里氏木霉纤维素分解组合物。
在一个实施例中，在液化步骤i)过程中存在的和/或添加的该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶，其中该支链淀粉酶优选地包括如披露于WO2011/087836中的X47结构域。
在另一个实施例中，该支链淀粉酶来源于来自嗜热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌和Thermococcus hydrothermalis，或其杂合体。
在一个实施例中，该支链淀粉酶是在X4位点截短的Thermococcushydrothermalis支链淀粉酶或具有截短位点X4的、披露于WO 2011/087836中的或示于在此的SEQ ID NO:12中的T.hydrothermalis/嗜热高温球菌杂合酶。
在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(在此的SEQ ID NO:1)是成熟α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟α-淀粉酶。
在一个实施例中，该激烈热球菌蛋白酶(在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29)和/或金黄色嗜热子囊菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)是成熟蛋白酶或与SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29、或SEQ ID NO:3分别具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟蛋白酶。
在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶(在此的SEQ ID NO:14)是成熟葡糖淀粉酶或与在此的SEQ ID NO:14具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
包含α-淀粉酶和蛋白酶的组合物
本发明的一种组合物包括α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶。该组合物还可以进一步包括热稳定性产碳水化合物源的酶和/或任选地还包括一种支链淀粉酶。
因此，在这个方面，本发明涉及包含以下项的组合物：
i)一种α-淀粉酶；
ii)任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及任选地
iii)一种产碳水化合物源的酶。
α-淀粉酶：该α-淀粉酶可以是任意α-淀粉酶，例如细菌α-淀粉酶，例如来源于芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶。
该α-淀粉酶可以是一种热稳定性α-淀粉酶。该热稳定性α-淀粉酶在pH4.5、85℃、0.12mM CaCl2下可以具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之间，例如在15-70之间，例如在20-70之间，例如在25-70之间，例如在30-70之间，例如在40-70之间，例如在50-70之间，例如在60-70之间。
在一个实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，特别是截短为491个氨基酸长，例如从480至495个氨基酸长，具有选自下组的突变：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
应理解，这些α-淀粉酶仅是具体实例。在上文的“液化过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶”-部分中披露的任何α-淀粉酶可以用作在本发明的组合物中的α-淀粉酶组分。
蛋白酶：本发明的组合物包括一种热稳定性蛋白酶。
对该蛋白酶组分的起源没有限制，只要其满足在此定义的热稳定性特性。
在一个优选的实施例中，该蛋白酶是具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值(如实例2中所述的进行测定)的上述金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的一种变体。
在一个具体优选的实施例中，该蛋白酶是来源于以下各项的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，具有选自下组的突变：
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L；以及
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在另一个优选的实施例中，该蛋白酶来源于激烈热球菌菌株，例如示于US 6,358,726的SEQ ID NO:1、在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29中的蛋白酶。
应理解，这些蛋白酶仅是实例。在上文的“液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶”-部分中披露的任何蛋白酶可以用作在本发明的组合物中的蛋白酶组分。
产碳水化合物源的酶：本发明的组合物可以进一步包括一种产碳水化合物源的酶，特别是一种葡糖淀粉酶，其在85℃、pH 5.3下具有至少30％，优选至少35％的热稳定性。
所述产碳水化合物源的酶可以是一种热稳定性葡糖淀粉酶，在85℃下具有至少20％、至少30％，优选至少35％的相对活性热稳定性，如实例4(热稳定性)中描述的进行测定。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％，例如100％的相对活性，如实例4(pH最佳值)中描述的进行测定。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，在pH 5.0下具有至少至少80％，至少85％、至少90％的pH稳定性，如实例4(pH稳定性)中描述的进行测定。
在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌起源，优选丝状真菌，例如来自青霉属的一种菌株，尤其是作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753(特此将其通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌或其变体的菌株，以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌的菌株。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶、或其变体与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:9或14中所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。
在一个具体并优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是WO2011/127802中披露为SEQ ID NO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一种变体，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。如披露于共同未决的美国申请号61/531,189(作为WO 2013/036526公开)(将其特此通过引用结合)中的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
适合的热稳定性草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体的实例列于上文以及下文的实例15和16或WO 2013/053801(特此通过引用结合)的实例10和11中。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶具有支链淀粉酶副活性。
应理解，这些产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶仅是实例。在上文的“液化过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中披露的任何产碳水化合物源的酶可以用作在本发明的组合物中的组分。
支链淀粉酶：本发明的组合物可以进一步包括一种支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个优选的实施例中，该支链淀粉酶包括X47结构域，如披露于作为WO 2011/087836公开的US61/289,040(将其特此通过引用结合)中。
具体地，该支链淀粉酶可以来源于来自嗜热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌和Thermococcus hydrothermalis，或其杂合体。
该支链淀粉酶是在X4位点截短的Thermococcus hydrothermalis支链淀粉酶或具有截短位点X4的、披露于作为WO 2011/087836公开的US61/289,040中的Thermococcushydrothermalis/嗜热高温球菌杂合酶。
在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。
应理解，这些支链淀粉酶仅是具体实例。在上文的“液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶”-部分中披露的任何支链淀粉酶可以用作在本发明的组合物中的支链淀粉酶组分。
本发明的优选组合物
在一个优选的实施例中，本发明的组合物包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及任选地
-任选地来源于草酸青霉菌的一种葡糖淀粉酶。
该葡糖淀粉酶可任选地是经取代的或与优选地来源于嗜热高温球菌或Thermococcus hydrothermalis的支链淀粉酶组合的。
在一个优选的实施例中，该组合物包括
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地来源于草酸青霉菌的一种葡糖淀粉酶。
在一个优选的实施例中，该组合物包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种SEQ ID NO:14的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
在一个实施例中，该组合物包括：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182+N193F；以及另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所示的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
在一个实施例中，本发明涉及多种组合物，这些组合物包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶,具有双缺I181+G182+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所述的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V+P11F+T65A+Q327F
-K79V+P2N+P4F+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(在此的SEQ ID NO:1)或其变体是成熟α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟α-淀粉酶。
在一个实施例中，该激烈热球菌蛋白酶(在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:20)和/或金黄色嗜热子囊菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)或其变体是成熟蛋白酶或与在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29、或SEQ ID NO:3分别具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟蛋白酶。
在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶(在此的SEQ ID NO:14)或其变体是成熟葡糖淀粉酶或与在此的SEQ ID NO:14具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性，至少97％一致性，至少98％一致性，或至少99％一致性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，来源于青霉属的菌株，例如草酸青霉菌的菌株。
材料与方法
材料：
α-淀粉酶A(AAA)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，具有突变I181*+G182*+N193F,截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:1)
α-淀粉酶1407(AA1407)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S,截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:1)
α-淀粉酶369(AA369)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:1)；
蛋白酶196：来源于金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的、披露为在此的SEQ IDNO:3中的氨基酸1-177以及WO 2003/048353的SEQ ID NO:2中的氨基酸1至177的金属蛋白酶，具有以下突变：A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
蛋白酶Pfu：购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio(Japan))的、来源于激烈热球菌的蛋白酶，为Pfu蛋白酶S(活性10.5mg/mL)并且还示于在此的SEQ ID NO:13中。
蛋白酶Pfu2：来源于激烈热球菌的蛋白酶，示于在此的SEQ ID NO:29中
葡糖淀粉酶PO：在公开为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753中披露为SEQ IDNO:2以及显示于在此的SEQ ID NO:9中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的成熟部分。
葡糖淀粉酶PE001：草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用SEQ IDNO:14中所示的成熟序列进行编号)。
葡糖淀粉酶493(GA493)：草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体PE001的变体，进一步具有以下取代：P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
葡糖淀粉酶498(GA498)：草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体PE001的变体，进一步具有以下取代：P2N+P4F+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
葡糖淀粉酶BL：WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:7的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和披露于WO 06/069289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶的处于约9:1比率的共混物。
葡糖淀粉酶BL2：披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的作为副活性的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶的共混物(比率约65:15:1)。
葡糖淀粉酶BL3：披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的作为副活性的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶的共混物(比率约21:5:1)。
葡糖淀粉酶BL4：披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有以下取代的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶的共混物：G128D+D143N(活性比率AGU:AGU:FAU(F)：约30:7:1)。
纤维素分解组合物A(CCA)：来自作为CELLUCLAST 1.5L(诺维信公司，丹麦)销售的、里氏木霉的纤维素酶组合物。
纤维素分解组合物B(CCB)：来源于里氏木霉的纤维素分解组合物，包括具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(该多肽来源于埃默森青霉菌菌株(WO 2011/041397中的SEQID NO:2或在此的SEQ ID NO:23))、披露于WO 2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499中的SEQ ID NO:2在此的SEQ ID NO:22)变体F100D、S283G、N456E、F512Y)；WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6(在此的SEQ ID NO:24)的烟曲霉Cel7A CBH1以及WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:18(在此的SEQ ID NO:25)的烟曲霉CBH II。
酵母：RED STAR ETHANOL REDTM，商购自美国红星/乐斯福公司(Red Star/Lesaffre,USA)。
实例18和19中的底物：玉米粉和回槽(backset)获得自美国的一种可商购植物。
方法
一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“一致性”描述。
出于本发明的目的，可以通过程序“比对”确定两个氨基酸序列之间的一致性程度以及两个核苷酸序列之间的一致性程度，所述程序是尼德尔曼-翁施比对(Needleman-Wunsch alignment)(即总体对比)。使用该程序进行多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BLOSUM50进行多肽比对，使用缺省一致性矩阵进行核苷酸比对。对多肽而言，缺口的第一个残基的罚分为12，对核苷酸而言该罚分为16。对多肽而言，缺口另外残基的罚分为2，对核苷酸而言该罚分为4。
“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见皮尔逊(W.R.Pearson)和利普曼(D.J.Lipman)(1988)，用于生物序列分析的改进的工具(“Improved Tools forBiological Sequence Analysis”)，PNAS 85:2444-2448，和皮尔逊(1990)使用FASTP和FASTA进行的快速且灵敏的序列比较(“Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP and FASTA”)酶学方法(Methods in Enzymology)183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)进行，对缺口大小没有限制(参见史密斯-沃特曼算法(“Smith-Waterman algorithm”)，史密斯(T.F.Smith)和沃特曼(M.S.Waterman)(1981)分子与生物学杂志(J.Mol.Biol.)147:195-197)。
蛋白酶测定法
AZCL-酪蛋白测定法
边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH9的Borax/NaH2PO4缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在艾本德热混器(Eppendorf Thermomixer)中在45℃和600rpm下孵育30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸20min)用作空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃下以3000rpm离心5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRad Microplate Reader)测量在595nm处的吸光度。
pNA-测定
将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升1mM pNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用pH 9.0的Borax/NaH2PO4缓冲液稀释至10mL)开始该测定。OD405在室温下的增加被监测为蛋白酶活性的一个量度。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
可以按葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析仪***。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，由此使存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
| <u>AMG孵育：</u> | |
| 底物： | 麦芽糖23.2mM |
| 缓冲液： | 乙酸盐0.1M |
| pH: | 4.30±0.05 |
| 孵育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 5分钟 |
| 酶工作范围： | 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL |
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0131.02/01可从丹麦的诺维信公司索取得到，在此将该文件夹通过引用特此结合。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。1AFAU被定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶是一种内-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，它水解在淀粉分子的内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度跟淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。
λ＝590nm
蓝色/紫色 t＝23秒 脱色
标准条件/反应条件：
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可从丹麦的诺维信公司索取得到，在此将该文件夹通过引用特此结合。
α-淀粉酶活性(KNU)
可釆用马铃薯淀粉作为底物来测定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶的样品溶液与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且然后逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
将一个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉(Merck Amylumsolubile)的酶量。
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可从丹麦的诺维信公司索取得到，在此将该文件夹通过引用特此结合。
FAU(F)确定
相对于具有声明强度的酶标准品测量FAU(F)真菌α-淀粉酶 单位(芬加密尔 (Fungamyl))。
更详细地描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可从丹麦的诺维信公司索取得到，在此将该文件夹通过引用特此结合。
支链淀粉酶活性(NPUN)的确定
相对于诺维信支链淀粉酶标准品测量NPUN中的内切-支链淀粉酶活性。一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。
将1mL稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸，pH 5并混合。将这些管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将这些管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm处测量上清液OD并且使用标准品曲线计算活性。
本发明将在以下实例中进行更详细的描述，这些实例被提供用以说明本发明而决不意图限制本发明要求的范围。在此引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引用具体结合。
实例
实例1
α-淀粉酶变体的稳定性
通过将参比α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*+N193F的、截短至491个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(以SEQ ID NO:1进行编号))及其α-淀粉酶变体在pH 4.5和5.5下以及在温度75℃和85℃下用0.12mM CaCl2进行孵育，随后使用
底物(
超级淀粉酶测定试剂盒(Ultra Amylase assay kit)，E33651，分子探针公司(Molecular Probes))进行残余活性测量来测量该参比α-淀粉酶及变体的稳定性。
使纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mMCaCl2，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/毫升)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP并且将180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐、150mM MES、0.01％TritonX100、0.12mM CaCl2，pH 4.5或5.5)添加至每个孔并且混合。测定使用两种浓度的酶来重复两次执行。在75℃或85℃孵育之前，取出20微升并且储存在冰上作为对照样品。在PCR仪(在75℃和85℃下)中进行孵育。孵育之后，将样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释至15ng/ml并且将25微升稀释酶转移至黑色384-MTP。使用EnzChek底物通过将25微升底物溶液(100微克/毫升)添加至每个孔来测量残余活性。使用485-P nm下的激发滤光器以及555nm下的发射滤光器(荧光读取器是Polarstar，BMG)每分钟测量荧光持续15分钟。对于每个设置，将残余活性相对于对照样品标准化。
假定对数式衰减，那么使用方程T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算半衰期时间(T1/2(min))，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。
使用此测定设置，针对参比α-淀粉酶及其变体确定半衰期时间，如表1中所示。
表1
ND未检测到
这些结果证明α-淀粉酶变体比参比α-淀粉酶具有显著更高的半衰期和稳定性。
实例2
蛋白酶变体的制备以及热稳定性测试
菌株与质粒
使用大肠杆菌DH12S(可获得自吉博科公司(Gibco BRL))用于酵母质粒拯救。pJTP000是一种在TPI启动子的控制之下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，构建自描述于WO01/92502中的pJC039，在其中已经***了金黄色嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO03048353)。
将酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his 4-539用于蛋白酶变体表达。这被描述于生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272(15)，第9720-9727页，1997中。
培养基与底物
10X基础溶液：酵母氮基w/o氨基酸(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH 60g/l。
SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100ml)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径大小为0.20微米的过滤器将溶液灭菌。将琼脂(2％)和H2O(大约761ml)一起热压处理，并且向琼脂溶液中添加分开灭菌的SC-葡萄糖溶液。
YPD：细菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。
YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO4。
PEG/LiAc溶液：40％PEG4000 50ml，5M乙酸锂1ml。
96孔玉米素微滴度板：
每个孔包含200微升的0.05-0.1％的玉米素(西格玛公司(Sigma))，0.25mM ZnSO4以及1％的琼脂于20mM乙酸钠缓冲液中，pH 4.5。
DNA操纵
除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操纵和转化：萨拉布鲁克等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；奥苏贝尔·F·M(Ausubel,F.M.)等人(编辑)“分子生物学实验指南(Current protocols inMolecular Biology)”，约翰威立父子公司，1995；哈伍德·C·R(Harwood,C.R.)&卡廷·S·M(Cutting,S.M.)(编辑)。
酵母转化
使用乙酸锂法进行酵母转化。混合0.5微升载体(由限制性内切核酸酶消化)以及1微升的PCR片段。将DNA混合物、100微升的YNG318感受态细胞、以及10微升的酵母标记载体DNA(YEAST MAKER carrier DNA)(克罗泰克公司(Clontech))添加到12ml聚丙烯管(猎鹰(Falcon)2059)中。添加0.6ml PEG/LiAc溶液并温和混合。在30℃下并且200rpm孵育30min，并且随后在42℃下30min(热休克)。转移至艾本德管并离心5秒。去除上清液并溶解于3ml的YPD中。在30℃以200rpm孵育该细胞悬浮液45min。将悬浮液倾倒在SC-葡萄糖板上并在30℃孵育3天以生长菌落。通过Zymoprep酵母质粒小提试剂盒提取酵母总DNA(ZYMO研究公司(ZYMO research))。
DNA测序
通过电穿孔(伯乐基因脉冲发生器(BIO-RAD Gene Pulser))进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法(分子克隆，冷泉港)或使用
质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰(Qiagen)凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎(PTC-200DNA Engine)进行PCR。使用ABI PRISMTM 310基因分析器来测定所有的DNA序列。
蛋白酶表达载体的构建
使用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:5)扩增嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因。将所得PCR片段连同pJC039载体引入酿酒酵母YNG318(描述于WO 2001/92502中)，用限制性内切酶消化以去除特异腐质霉角质酶基因。
回收在SC-葡萄糖板上的酵母克隆中的质粒以确认内部序列并称作pJTP001。
酵母文库和定点变体的构建
通过SOE PCR法(重叠延伸剪接(Splicing by Overlap Extension)，参见“PCR：一种实用方法(PCR:A practical approach)”，第207-209页，牛津大学出版社(OxfordUniversity press)，编辑麦克弗森(McPherson)、夸克(Quirke)、泰勒(Taylor))构建酵母文库和定点变体，随后进行酵母体内重组。
用于扩增和测序的通用引物
使用引物AM34(SEQ ID NO:5)和AM35(SEQ ID NO:6)通过SOE法与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一起制备包含任何突变的片段的DNA片段或仅仅扩增整个蛋白酶基因(AM34+AM35)。
通过凯杰(Qiagen)凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将所得纯化的片段与载体消化物混合.将混合溶液引入进酿酒酵母中，以通过体内重组构建文库或定点变体。
相对活性测定
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进包含YPD+Zn培养基的96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将培养物上清液施加到96-孔玉米素微滴定板并在至少2个温度下孵育超过4小时或过夜(例如60℃与65℃、70℃与75℃、70℃与80℃)。玉米素在板中的浊度被测量为A630并且相对活性(较高/较低温度)被确定为热稳定性改进的一个指示。选择比亲本变体具有更高相对活性的克隆并确定这些序列。
残余活性测定
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将该培养物上清液在特定温度(80℃或84℃，4℃作为一个参考)下于20mM乙酸钠缓冲液、pH 4.5中孵育10min之后，使用偶氮-酪蛋白(麦格酶公司)在65℃下测定蛋白酶活性，从而确定残余活性。选择比亲本变体具有更高残余活性的克隆并确定这些序列。
偶氮-酪蛋白测定
将20微升样品与150微升底物溶液(4ml的12.5％偶氮-酪蛋白，在乙醇中在96ml的20mM乙酸钠、pH 4.5中，包含0.01％triton-100和0.25mM ZnSO4)混合并孵育4小时或更久。
添加20微升/孔的100％三氯乙酸(TCA)溶液，将该板离心并且吸取100微升的上清液以测定A440。
蛋白酶变体在米曲霉中的表达
使用包括蛋白酶变体基因的构建体来构建用于曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由一个表达盒组成，该表达盒是基于融合至构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的非翻译前导序列的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在使得可以在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的来自构巢曲霉的曲霉属选择性标记amdS。如描述于拉森(Lassen)等人(2001)，应用与环境微生物学(Applied and EnvironmentalMicorbiology)，67，4701-4707中，将蛋白酶变体的表达质粒转化进曲霉属中。用于每个构建体，分离、纯化并在摇瓶中孵育10-20个菌株。
所表达的变体的纯化
1.调节0.22μm经过滤的发酵样品的pH至4.0。
2.将该样品置于冰浴中，伴随磁力搅拌。以小量的等分部分添加(NH4)2SO4(对应于大约2.0-2.2M(NH4)2SO4，当添加该化合物时未考虑体积增加)。
3.(NH4)2SO4的最终添加之后，将该样品于冰浴中伴随轻柔的磁力搅拌孵育min.45min。
4.离心：日立(Hitachi)himac CR20G高速冷冻离心机，配备有R20A2转头，5℃，20,000rpm，30min。
5.将形成的沉淀溶解于200ml 50mM乙酸钠、pH 4.0中。
6.通过真空吸引器(易威奇公司(IWAKI))使用0.22μm PES PLUS膜过滤该样品。
7.在冷室中，使用超滤法(来自赛多利斯公司(Vivascience)的Vivacell250，配备有5kDa MWCO PES膜)将该样品脱盐/缓冲液-过夜交换到50mM乙酸钠、pH 4.0中。使用50mM乙酸钠、pH 4.0将残余样品稀释至200ml。样品的导电性优选地小于5mS/cm。
8.将该样品加载到用50mM乙酸钠、pH 4.0平衡的阳离子交换柱上。使用3倍柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠、pH 4.0)将未结合样品从该柱洗出，并且使用线性梯度(0-100％洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.0))、以10倍柱体积对该样品进行洗脱。
9.通过内切-蛋白酶测定(参见下文)测定所收集的级分，随后对所选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内切-蛋白酶测定和SDS-PAGE汇集多个级分。
内切-蛋白酶测定
1.通过磁力搅拌(底物：来自麦格酶公司的、目录号PRAK 11/08的内切-蛋白酶Protazyme AK片)溶解Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠pH5.0。
2.边搅拌边将250微升的底物溶液转移到1.5ml的艾本德管。
3.向每个管中添加25微升的样品(空白对照是样品缓冲液)。
4.将这些管在50℃下在热混器中振荡(1000rpm)孵育15分钟。
5.向每个管中添加250微升的1M NaOH，随后进行涡旋。
6.以16,100×G并且在25℃下离心3min。
7.将200微升的上清液转移到MTP，并且记录590nm处的吸光度。
结果
实例3
使用纯化的酶,所选择变体的温度特征曲线
纯化所选择的显示良好热稳定性的变体并且将经纯化的酶用于如下所述的玉米素-BCA测定中。将该酶在如所指出的升高的温度下孵育60min之后，在60℃确定残余蛋白酶活性。
Zein-BCA测定：
在不同温度下通过变体蛋白酶进行Zein-BCA测定以检测释放自玉米素的可溶性蛋白的定量。
方案：
1)混合10ul的10ug/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米素溶液于微滴定板(MTP)中。
2)在不同温度下孵育60min。
3)添加10ul的100％三氯乙酸(TCA)溶液。
4)以3500rpm离心MTP 5min。
5)取15ul至一个新的包含100ul BCA测定溶液的MTP中(皮尔斯公司(Pierce)目录号：23225，BCA蛋白测定试剂盒)。
6)在60℃孵育30min。
7)量度A562。
结果示于表6中。与野生型蛋白酶相比较，所有的经测试的变体均显示改进的热稳定性。
表6.Zein-BCA测定
实例4
草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表征
该草酸青霉菌葡糖淀粉酶披露于在此的SEQ ID NO:9中。
底物。底物：含1％可溶性淀粉(西格玛(Sigma)S-9765)于去离子水中
反应缓冲液：0.1M乙酸盐缓冲液，pH 5.3
葡萄糖浓度测定试剂盒：和光葡萄糖检验试剂盒(LabAssay葡萄糖，和光株式会社，目录号298-65701)。
反应条件。将20微升的可溶性淀粉与50微升的乙酸盐缓冲液(pH 5.3)混合。添加30微升的酶溶液(50μg酶蛋白质/ml)达到100微升最终体积，随后在37℃下孵育15分钟。
葡萄糖浓度是通过和光试剂盒(Wako kits)测定。
所有这些工作都平行进行。
最适温度为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的最适温度，以上描述的“反应条件”-测定是20、30、40、50、60、70、80、85、90以及95℃下进行的。结果示于表7中。
表7最适温度
从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在给定条件下的最适温度是在50℃与70℃之间并且该葡糖淀粉酶在95℃维持超过80％活性。
热稳定性。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定进行修改,其中将酶溶液和乙酸缓冲液在20、30、40、50、60、70、75、80、85、90和95℃下预孵育15min。孵育之后，向该溶液中添加20微升淀粉并且如上所述进行该测定。
结果示于表8中。
表8热稳定性
从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在预孵育15min后在高达70℃下是稳定的，因为它维持超过80％活性。
pH最佳值。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的pH最佳值，在如下pH下进行上述反应条件测定：pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0 7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。使用以下缓冲液来代替在该反应条件测定中所描述的乙酸盐缓冲液：100mM的琥珀酸、HEPES、CHES、CAPSO、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH用HCl或NaOH调整到2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。
结果示于表9中。
表9pH最佳值
从这些结果可知在给定条件下草酸青霉菌葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有最高活性。该草酸青霉菌葡糖淀粉酶在宽泛的pH范围内是有活性的，因为它在从pH 2至7维持超过50％活性。
pH稳定性。为了评估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定进行修改,其中使用上述pH最佳值下的缓冲液，在具有pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0 7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液中将酶溶液(50微克/mL)预孵育20小时。预孵育之后，向该溶液中添加20微升可溶性淀粉至100微升的最终体积并且如上所述进行该测定。
结果示于表10中。
表10pH稳定性
从这些结果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在预孵育20小时后从pH 3至pH7是稳定的并且其在pH 8下降低活性。
实例5
蛋白酶Pfu的热稳定性
购买自日本宝酒造生物公司的激烈热球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性使用如与实例2中相同的方法进行检测。发现热稳定性(相对活性)在pH 4.5下是110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。
实例6
草酸青霉菌菌株葡糖淀粉酶基因的克隆
草酸青霉菌菌株cDNA的制备。
通过按照cDNA末端***(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司(Invitrogen Corp.))的3’快速扩增技术的说明来合成cDNA。
草酸青霉菌菌株葡糖淀粉酶基因的克隆。
使用下文所示的、被设计成用来从5’末端放大葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物来克隆草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因。
正义引物：5’-atgcgtctcactctattatcaggtg-3’(SEQ ID NO:15)
通过PCR用正义引物和AUAP(由cDNA末端***的3’快速扩增技术提供)、通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶(美国加利福尼亚州卡尔斯巴市的英杰公司)来扩增全长基因。扩增反应是由5μl的10×PCR缓冲液、2μl的25mM MgCl2、1μl的10mM dNTP、1μl的10uM正义引物、1μl的10uM AUAP、2μl的第一链cDNA、0.5μl的HIFI Taq、以及37.5μl的去离子水构成的。PCR程序是：94℃，3分钟；10个循环：94℃持续40秒，60℃40秒、每循环降低1℃，68℃持续2分钟；25个循环：94℃持续40秒，50℃40秒，68℃持续2分钟；在68℃下进行最终延伸持续10分钟。
使用一个pGEM-T载体***(美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(PromegaCorporation))将获得的PCR片段克隆到pGEM-T载体(美国威斯康星州麦迪的逊市普洛麦格公司)中以产生质粒AMG 1。对***到质粒AMG 1中的葡糖淀粉酶基因进行测序确认。将含有质粒AMG 1(表示为NN059173)的大肠杆菌菌株TOP10于2009年11月23日保藏在德国微生物与菌种保藏中心(DSMZ)并且指定保藏号为DSM 23123。
实例7
克隆的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表达
通过PCR使用以下所示的两种克隆引物F和引物R将草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因重新从质粒AMG 1克隆到曲霉菌表达载体中，这两种克隆引物是基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物F：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:16)
引物R：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:17)
用质粒AMG 1来进行PCR反应以便扩增全长基因。PCR反应是由40μg的质粒AMG1DNA、1μl的每种引物(100μM)、12.5μl的2X扩展剂高保***体混合物(Extensor Hi-Fidelity Master Mix，英国拜力公司(ABgene))、以及9.5μl的PCR级水构成。使用DYAD PCR仪(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad实验室国际公司)进行PCR反应，该仪器的程序为：在94℃下持续2分钟，随后进行94℃持续15秒、50℃持续30秒、以及72℃持续1分钟的25次循环；并且然后在72℃下10分钟。
通过1.0％琼脂糖凝胶电泳使用1×TAE缓冲液来分离反应产物，其中将约1.9kb的PCR产物带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用
PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国)进行纯化。根据制造商的说明，使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto)的BD生物科学公司(BD Biosciences))将与草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因相对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO 2005/042735 A1所述的。
将2μl体积的连接混合物用于转化25μl的融合蓝色(Fusion Blue)大肠杆菌细胞(包含在N-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒中)。在42℃下热休克45秒并在冰中冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm下在37℃下孵育90分钟，随后铺在每ml含50μg氨苄西林的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用微型JETSTAR(德国Genomed公司)纯化来自所选择的菌落的质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序(Sanger sequencing)来验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。选择这些质粒之一用于进一步表达，并将其命名为XYZ XYZ1471-4。
如WO 95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的XYZ1471-4质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(Cove(科夫)，1996，Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学报)133:51-56)(1M)板上将原生质体与6％的低熔琼脂糖(惠泰克生物分子应用公司(Biowhittaker MolecularApplications))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(1M)板以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶，即Griton XTPrecast凝胶(伯乐公司(BioRad)，美国加利福尼亚州)上分析来自每个孔的10μl培养液，以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴别最好的转化株。在原始转化板上鉴别所选择的转化株并将其作为孢子保存在20％甘油贮备物中并冷冻保存(-80℃)。
培养。在100ml的MLC培养基中接种所选择的转化株并在30℃下在旋转振荡器上的500ml摇瓶中培养2天。将3ml的培养液接种到100ml的M410培养基中并在30℃下培养3天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。
α-环糊精亲和凝胶。使10克环氧基活化的琼脂糖6B(英国查尔方特圣吉尔斯(Chalfont St.Giles)的通用电气医疗集团)粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶合溶液(100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH)并在室温下孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH 10的100ml 1M乙醇胺中，并在50℃下孵育4小时以进行封闭。随后使用pH 8的50mMTris-HCl和可替代地pH 4.0的50mM NaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液(50mMNaOAc，150mM NaCl，pH 4.5)将该凝胶装填在35-40ml的柱中。
从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μm PES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液，并施加在之前在50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH 5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现一条单独的带。
实例8
草酸青霉菌葡糖淀粉酶的定点变体的构建和表达
用实例7所述的质粒XYZ1471-4、使用以下所示的引物K79VF和K79VR(这些引物被设计成用于将成熟序列的位置79处的赖氨酸(K)取代为缬氨酸(V))以及以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940(这两个引物基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆)进行两个PCR反应。
引物K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC(SEQ ID NO:18)
引物K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG(SEQ ID NO:19)
引物F-NP003940:5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:20)
引物R-NP003940:5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:21)
在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎(PTC-200DNA Engine)进行PCR。
根据制造商的说明通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用N-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学公司)将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO 2005/042735 A1所述的。
使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(东洋公司(TOYOBO))。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒微型试剂盒(凯杰公司)从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择这些质粒之一来用于进一步表达并且它其命名为pPoPE001。
如WO 95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pPoPE001质粒相混合，并且添加250微升的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟，并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(科夫，1996，生物化学与生物物理学报133:51-56)中将原生质体与1％的琼脂糖L(日本基因公司(Nippon Gene))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖板上以用于转化株选择(每板4ml顶层琼脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六个转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE凝胶上分析来自每个孔的10μl培养液以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力来鉴别最好的转化株。
实例9
定点Po AMG变体PE001的纯化
将所选择的变体转化株和表达实例6所述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的菌株培养在100ml的YP-2％麦芽糖培养基中，并且培养物通过0.22μmPES过滤器过滤，并施加在之前于50mM NaOAc、150mM NaCl、pH 4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。随后相对于pH 5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。
实例10
PE001蛋白酶稳定性的表征
将40μl在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的酶溶液(1mg/ml)与1/10体积的1mg/ml蛋 白酶溶液相混合，该蛋白酶是例如在生物化学杂志(Biochem J.)1975年4月；147(1):45-53中所述的曲霉酸性蛋白酶I(aspergillopepsin I)、或从西格玛公司(Sigma)可商购的产品以及在生物化学杂志[0264-6021]八幡町市岛(Ichishima)2003年第371卷iss:Pt 2第541页中所述的奥瑞素(aorsin)，并且在4℃或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H2O而不是蛋白酶添加到样品之中。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。
在SDS-PAGE中，PE001仅示出与完整分子相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kDa的更低分子大小的一条带。
表11蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果
N.D.:未检测到。
实例11
培养过程中更少切割
在32℃下将变体和野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的曲霉菌转化株在含有4X稀释的、补充有10mM乙酸钠缓冲液的YP-2％麦芽糖培养基(pH 4.5)的6孔MT板中培养1周。
将培养物上清液装载在SDS-PAGE上。
表12培养物上清液的SDS-PAGE结果
N.D.:未检测到。
在发酵过程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而变体则仅产生完整的分子。
实例12
变体与亲本相比的葡糖淀粉酶活性
针对野生型草酸青霉菌的纯化的酶和变体葡糖淀粉酶检查如上文所述作为AGU测量的葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：6分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
表13
实例13
具有增强的热稳定性的葡糖淀粉酶变体的纯化
可以类似于实例8中描述的程序构建并表达显示出增加的热稳定性的变体。所有变体菌来源于PE001。在YPM培养基中表达以后，将包含T65A或Q327F取代的变体如下进行微纯化：
通过经由0.22μm过滤器过滤除去菌丝体。向滤板(华特曼(Whatman)，UNI过滤器(Unifilter)800μl，25-30μm MBPP)的孔中添加50μl柱材料(根据制造商的推荐，与Mini-Leak二乙烯砜-活化的琼脂糖培养基偶联的α-环糊精)。通过两次添加200μl缓冲液用结合缓冲液(200mM乙酸钠，pH4.5)平衡该柱材料，剧烈震荡10min(海道夫(Heidolph)，Titramax101摇床，1000rpm)并且通过真空除去缓冲液(华特曼，UniVac 3)。随后，添加400μl培养上清液和100μl结合缓冲液，并且在剧烈振荡下将板孵育30min。通过真空除去未结合的材料并且重复结合步骤。通常地，每个变体使用4个孔。然后通过添加200μl具有减少的离子强度的缓冲液(50/10/5mM乙酸钠，pH 4.5)进行三个洗涤步骤，振荡15min并且通过真空除去缓冲液。通过两次添加100μl洗脱缓冲液(250mM乙酸钠，0.1％α-环糊精，pH 6.0)洗脱结合的AMG，振荡15min并且通过真空收集在微量滴定板中的洗脱材料。将合并的洗脱物浓缩并且使用具有10kDa截留单位的离心过滤器(Millipore Microcon Ultracel YM-10)将缓冲液变为50mM乙酸钠，pH 4.5。将微纯化的样品保存在-18℃下直到热稳定性测试。
实例14
蛋白质热解折叠分析(TSA，热转变测定(Thermal shift assay))。
使用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测T65A和Q327F变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(应用生物***公司(Applied Biosystems)；一步一加(Step-One-Plus))进行。
在一个96孔板中，将25微升微纯化的、处于约100微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与宝石橙(5:1)相混合(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR密封件密封该平板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测E501V+Y504T变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪(应用生物***公司(Applied Biosystems)；一步一加(Step-One-Plus))进行。
在一个96孔板中，在具有或不具有200ppm阿卡波糖(Acarbose)(西格玛公司A8980)的情况下，将15微升纯化的、处于约50微克/ml的50mM乙酸盐(pH 4,5)中的样品与宝石橙(1:1)相混合(所得浓度＝5X；来自供应商的母液＝5000X)。用光学PCR密封件密封该平板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。
将Tm值计算为第一衍生物的最大值(dF/dK)(参考：格雷戈里(Gregory)等人；生物分子筛选杂志(J Biomol Screen)2009 14:700)。
表14a.
表14b.
实例15
通过差示扫描量热法(DSC)分析热稳定性
基本如在实例8中所描述构建在特定位置处具有取代和/或缺失的额外的位点特异性变体并且如在实例11中所描述进行纯化。
使用VP-毛细管差示扫描量热器(美国新泽西州的皮斯卡塔韦的米克罗卡公司(MicroCal Inc.))，通过差示扫描量热法(DSC)在pH 4.0或4.8处(50mM乙酸钠)测定纯化的Po-AMG PE001衍生的变体的热稳定性。在以200K/hr的恒定的程序化加热速率下，在选择的缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.0或4.8)中加热酶溶液后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。
将样品和参考溶液(约0.3ml)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参考：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡10分钟，随后从20℃到110℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精确度测定变性温度。
分离的变体以及DSC数据披露于下表15中。
表15.
实例16
通过热应激测试和pNPG测定分析热稳定性
从来自实例15的经鉴别的取代变体之一(被鉴别为GA008)开始，通过热应激测定测试额外的变体，在该热应激测定中在83℃下热休克5min后，测定来自生长培养物的上清液的葡糖淀粉酶(AMG)活性。
在热休克以后，测量变体连同在非应激样品中的变体的残余活性。
Po-AMG pNPG活性测定的说明：
草酸青霉菌葡糖淀粉酶pNPG活性测定是一种光谱端点测定(spectrometricendpoint assay)，其中将样品一分为二并且进行热应激地和非热应激地测量。所以，数据输出是应激样品中的残余活性的量度。
生长：
向无菌微量滴定板(MTP)的每个孔中添加200μL富生长培养基(没有Dowfax的FTX-14)。将来自冻存物的感兴趣的菌株一式三份地直接接种在MTP中。在20个孔中接种基准物。将具有培养基的未接种的孔用作测定空白。将MTP放在包含湿巾的塑料箱中，以阻止孵育过程中这些孔的蒸发。将塑料箱在34℃下放置4天。
测定:
将50μL上清液转移至50μL 0.5M NaAc(pH 4.8)中，以获得的准确的样品pH。
将50μL稀释物转移至PCR板上并且在PCR仪中在83℃下热应激5分钟。将剩余的一半稀释物保持在室温下。
将20μL的应激的和非应激的样品转移至标准MTP中。添加20μLpNPG-底物，以起始该反应。将该板在室温下孵育1小时。
终止该反应并且通过添加50μL 0.5M Na2CO3进行显色。在405nm处，在酶标仪(分子设备公司(Molecular Devices))上测量黄色。
缓冲液：
0.5M NaAc pH 4.8
0.25mMNaAc，pH 4.8
底物，6mM pNPG：
15mg在10mL 0.25NaAc(pH 4.8)中的4-硝基苯基D-吡喃葡萄糖苷终止/显色溶液：
0.5M Na2CO3
数据处理：
在Excel中，来自应激和非应激样品两者的原始Abs405数据是用其对应的空白进行空白消减的。计算残余活性(％残余活性＝(Abs非应激–(Abs非应激–Abs应激))/Abs非应激*100％)并且相对于基准Po-amg0008绘图。
表16
表17
实例17
根据本发明的热稳定性变体的葡糖淀粉酶活性测试
已经使用在实例16中描述的pNPG测定证实了在表15、16、和17中披露的所有以上描述的变体在培养上清液上的葡糖淀粉酶活性。
实例18
使用α-淀粉酶A(AAA)、蛋白酶196、以及葡糖淀粉酶493(GA493)用于液化以及使用葡糖淀粉酶BL3(BL3)和纤维素分解组合物A(CCA)用于发酵，进行乙醇生产
液化(Labomat)
针对总重量150g(32.50％)干固体(DS)，每一液化接受玉米粉(86.3％DS)、回槽(7.2％DS)和自来水。回槽以30％w/w浆体重量共混。初始浆体pH是5.2并且因此在液化之前不进行调节。根据下表添加所有酶。
使用以下条件，液化发生在Labomat中：5℃/min。渐变(Ramp)，17分钟渐变，在85℃下103分钟保持时间，整个运行40rpm，200mL不锈钢容器。液化之后，将所有容器在冰浴中冷却并且准备基于下文SSF下列出的方案用于发酵。
同时糖化发酵(SSF)
用50％w/w氢氧化钠或40％v/v硫酸将上述两种糊状物调节至pH 5.0。向每种糊状物中施加青霉素至3ppm的总浓度，并且向每种糊状物中添加作为氮源的尿素至1000ppm的总浓度。通过每一15mL预钻孔的试管等分大约4.5g糊状物而向这些管中装入糊状物，以允许CO2释放。将诺维信葡糖淀粉酶Spirizyme Excel和纤维素酶Celluclast根据下表给予到这些管中：
向每个管中添加适当体积的蒸馏水以保持所有管中固体处于相同浓度。所有处理一式五份执行。给予酶之后，每个管接受100μL的再水合酵母。再水合酵母是通过混合5.5g的富酶泰斯RED STAR于100mL自来水中并且在32℃孵育大约30分钟制备的。在SSF方法中，对所有管进行涡旋，并且然后于32℃水浴中孵育52小时。
发酵52小时后进行发酵取样。每种样品用50μL的40％v/v H2SO4失活、涡旋、以3000rpm离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤。通过HPLC分析所有样品。
结果：
随着将纤维素分解组合物A(CCA)添加到SSF方法中，存在从α-淀粉酶(AAA)液化的玉米醪的0.73g/L乙醇得率增加。当添加蛋白酶196以及葡糖淀粉酶493(GA493)连同α-淀粉酶A到该液化中，以及添加纤维素分解组合物A(CCA)到SSF中时，总乙醇得率增加1g/L。
实例19
使用α-淀粉酶A或α-淀粉酶AA369、蛋白酶Pfu2、以及葡糖淀粉酶498(GA498)用于液化以及使用葡糖淀粉酶BL4(BL4)和纤维素分解组合物A或B(CCA或CCB)用于发酵，进行乙醇生产
液化(Labomat)
针对总重量375g(32.50％)干固体(DS)，每一液化接受玉米粉(86.3％DS)、回槽(7.2％DS)和自来水。回槽以30％w/w浆体重量共混。在液化之前调节初始浆体pH。根据下表添加所有酶。
使用以下条件，液化发生在Labomat中：在200mL不锈钢容器中，按照5℃/min增加温度直到高达80℃；保持2min，然后按照2℃/min增加温度直到高达85℃；在85℃保持103min。液化之后，将所有糊状物冷冻储存直到它们准备用于基于下文SSF下列出的方案的发酵。
同时糖化发酵(SSF)
用50％w/w氢氧化钠或40％v/v硫酸将上述每种糊状物调节至pH 5.0。向每种糊状物中施加青霉素至3ppm的总浓度，并且向每种糊状物中添加作为氮源的尿素至800ppm的总浓度。通过添加水将两种糊状物的固体含量调节至30％。通过每一15mL预钻孔的试管等分大约4.5g糊状物而向这些管中装入糊状物，以允许CO2释放。将葡糖淀粉酶BL4和纤维素分解组合物CCA或CCB根据下表给予到这些管中：
向每个管中添加适当体积的蒸馏水以保持所有管中固体处于相同浓度。所有处理一式五份执行。给予酶之后，每个管接受100μL的再水合酵母。再水合酵母是通过混合5.5g的富酶泰斯RED STAR于100mL自来水中并且在32℃孵育大约30分钟制备的。在SSF方法中，对所有管进行涡旋，并且然后于32℃水浴中孵育51小时。
发酵51小时后进行发酵取样。每种样品用50μL的40％v/v H2SO4失活、涡旋、以3000rpm离心10分钟，并且通过0.45μm沃特曼PP过滤器(Whatman PP filter)过滤。通过HPLC分析所有样品。
结果：
随着将纤维素分解组合物A(CCA)添加到SSF方法中，与发酵中不添加纤维素分解组合物、通过α-淀粉酶A(AAA)液化的玉米醪相比，存在高达0.74％的乙醇得率增加。随着将纤维素分解组合物B(CCB)添加到相同糊状物中，存在高达2.28％的乙醇得率增加。
当添加蛋白酶Pfu2以及葡糖淀粉酶498(GA493)连同α-淀粉酶369到该液化中，以及添加纤维素分解组合物A(CCA)到SSF中时，与不添加纤维素分解组合物的相同糊状物相比，总乙醇得率增加高达1.62％。随着将纤维素分解组合物B(CCB)添加到相同糊状物中，存在高达2.80％的乙醇得率增加。
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
在以下编号的段落中进一步描述本发明：
1.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种产碳水化合物源的酶；
ii)使用一种产碳水化合物源的酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
2.如段落1所述的方法，在液化步骤i)之前进一步包括以下步骤：
a)优选地通过干式碾磨来减小含淀粉材料的粒度；
b)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆体。
3.如段落1-2中任一项所述的方法，其中至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有#6筛网的筛子。
4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中液化过程中的pH是从4.5-5.0，例如在4.5-4.8之间。
5.如段落1-3中任一项所述的方法，其中液化过程中的pH高于5.0-6.5，例如高于5.0-6.0，例如高于5.0-5.5，例如在5.2-6.2之间，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中液化过程中的温度范围是从70-100℃，例如在75-95℃之间，例如在75-90℃之间，优选在80-90℃之间，例如在82-88℃之间，例如约85℃。
7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中在步骤i)中的液化之后进行一个喷射蒸煮步骤。
8.如段落7所述的方法，其中该喷射蒸煮是在110-145℃、优选120-140℃、例如125-135℃、优选约130℃的温度下进行持续约1-15分钟，优选持续约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。
9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中糖化和发酵是依序进行或同时进行。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中糖化是在从20-75℃、优选从40-70℃、例如约60℃的温度下，以及在4和5之间的pH下进行。
11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中发酵或同时糖化发酵(SSF)在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃优选约32℃左右的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。
12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中该发酵产物是在发酵之后，例如通过蒸馏回收的。
13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
14.如段落1-13中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。
15.如段落1-14中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料来源于玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。
16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中该发酵微生物是酵母，优选酵母属菌株，尤其是酿酒酵母菌株。
17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶是细菌或真菌α-淀粉酶。
18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的那种。
19.如段落18所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是被截短的，优选被截短至具有约491个氨基酸。
20.如段落18或19所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有I181+G182位置的双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
21.如段落18-20中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，优选S242Q取代。
22.如段落18-21中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，优选E188P取代。
23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl2下可以具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之间，例如在15-70之间，例如在20-70之间，例如在25-70之间，例如在30-70之间，例如在40-70之间，例如在50-70之间，例如在60-70之间。
24.如段落1-23中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，这些变体除I181*+G182*以及任选地N193F之外具有以下突变：
25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
26.如段落1-25中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过25％的热稳定性值。
27.如段落1-26中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。
28.如段落1-27中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20与50％之间，例如在20与40％之间，例如20与30％的热稳定性。
29.如段落1-28中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50与115％之间，例如在50与70％之间，例如在50与60％之间，例如在100与120％之间，例如在105与115％之间的热稳定性。
30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10与50％之间，例如在10与30％之间，例如在10与25％之间的热稳定性。
32.如段落1-31中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
33.如段落1-32中任一项所述的方法，其中该蛋白酶在85℃下具有在60-120之间，例如在70-120％之间，例如在80-120％之间，例如在90-120％之间，例如在100-120％之间，例如110-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
34.如段落1-33中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是真菌起源的。
35.如段落1-34中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属菌株的金属蛋白酶的一种变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。
36.如段落1-35中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ IDNO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，突变选自下组：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；以及
-D79L+S87P+D142L。
37.如段落1-36中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ IDNO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L:
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
38.如段落1-37中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。
39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中示于SEQ ID NO:3中的金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下项中的一种：
-D79L S87P D142L
-D79L S87P A112P D142L
-D79L Y82F S87P A112P D142L
-S38T D79L S87P A112P A126V D142L
-D79L Y82F S87P A112P A126V D142L
-A27K D79L S87P A112P A126V D142L
-S49P D79L S87P A112P D142L
-S50P D79L S87P A112P D142L
-D79L S87P D104P A112P D142L
-D79L Y82F S87G A112P D142L
-S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L
-D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L
-S70V D79L Y82F S87G A112P D142L
-D79L Y82F S87G D104P A112P D142L
-D79L Y82F S87G A112P A126V D142L
-Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L
-Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L
-A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L
40.如段落1-39中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是细菌起源的。
41.如段落1-40中任一项所述的方法，其中其中该蛋白酶是来源于热球菌属菌株，优选激烈热球菌菌株。
42.如段落1-41中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是示于US 6,358,726的SEQID NO:1、在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29中的一种蛋白酶。
43.如段落1-42中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQID NO:1或在此的SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一种蛋白酶。
44.如段落1-43中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或添加一种产碳水化合物源的酶，优选一种葡糖淀粉酶。
45.如段落1-44中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或添加的该产碳水化合物源的酶是在85℃、pH 5.3下具有至少20％、例如至少30％，优选至少35％的热稳定性的一种葡糖淀粉酶。
46.如段落44-45中任一项所述的方法，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性。
47.如段落44-46中任一项所述的方法，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性。
48.如段落44-47中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，优选来源于青霉属菌株，尤其是如WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:9或14披露的草酸青霉菌菌株。
49.如段落44-48中所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ IDNO:2中所示的成熟多肽或在此的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。
50.如段落44-49中所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是来源于草酸青霉菌菌株的、在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶的一种变体，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列用于编号)。
51.如段落44-50中任一项所述的方法，进一步地其中葡糖淀粉酶是在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的。
52.如段落1-51中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌起源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌的菌株，或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，例如WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16中任一种，优选WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶，或来源于黑层孔属的菌株。
53.如段落52所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:7的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和披露于WO 06/069289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
54.如段落52或53所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是是一种共混物，包括披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO 06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
55.如段落52-54中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的该葡糖淀粉酶是是一种共混物，包括披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO 06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
56.如段落52所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的该葡糖淀粉酶是一种共混物，包括如在WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及WO 2013/006756的SEQ ID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉(具有以下取代：G128D+D143N)。
57.如段落1-56中任一项所述的方法，进一步地其中支链淀粉酶是在液化和/或发酵过程中存在的。
58.根据段落1-57中任一项所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
59.如段落1-58所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
60.如段落1-59所述的方法，包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
61.如段落1-60所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S:
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
62.如段落1-61所述的方法，包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号),
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
-任选地一种支链淀粉酶
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
63.根据段落1-62中任一项所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
64.如段落1-63所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
65.如段落1-64所述的方法，包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种任选蛋白酶，优选来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过30％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
66.如段落1-65所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V:
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
67.如段落1-66所述的方法，包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵或同时糖化发酵过程中存在和/或添加一种纤维素分解组合物。
68.根据段落1-67中任一项所述的方法，包括以下步骤：
i)在80-90℃之间的温度下，在5.0和6.5之间的pH下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及任选的取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所示的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中一种纤维素分解组合物，例如里氏木霉纤维素分解组合物，是在发酵或同时糖化发酵过程中存在的和/或添加的，特别是包括一种或多种选自下组的多肽的里氏木霉纤维素分解组合物，该组由以下各项组成：
-一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种、或四种的混合物。
69.如段落57-68中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶，其中该支链淀粉酶优选地包括如披露于WO 2011/087836中的X47结构域。
70.如段落57-69中任一项所述的方法，其中该支链淀粉酶来源于来自嗜热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌和Thermococcus hydrothermalis，或其杂合体。
71.如段落57-70中任一项所述的方法，其中该支链淀粉酶是在X4位点截短的Thermococcus hydrothermalis支链淀粉酶或具有截短位点X4的、披露于WO 2011/087836中的或示于在此的SEQ ID NO:12中的T.hydrothermalis/嗜热高温球菌杂合酶。
72.如段落57-71中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(在此的SEQ ID NO:1)是成熟α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟α-淀粉酶。
73.如段落41-72中任一项所述的方法，其中该激烈热球菌蛋白酶(在此的SEQ IDNO:13或在此的SEQ ID NO:29)和/或金黄色嗜热子囊菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)是成熟蛋白酶或与在此的SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:29、或在此的SEQ ID NO:3分别具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟蛋白酶。
74.如段落48-73中任一项所述的方法，其中该草酸青霉菌葡糖淀粉酶(在此的SEQID NO:14)是成熟葡糖淀粉酶或与在此的SEQ ID NO:14具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
75.如段落1-74所述的方法，其中该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，特别是里氏木霉，或来源于腐质霉属的菌株，特别是特异腐质霉，或来源于金孢子菌属的菌株，特别是卢克诺文思金孢子菌。
76.如段落1-75所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶。
77.如段落1-76中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种或多种选自下组的多肽，该组由以下各项组成：
-一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种、或四种的混合物。
78.如段落1-77中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属，例如米曲霉菌株，例如WO 2002/095014中披露的那种或具有β-葡糖苷酶活性的、披露于WO 2008/057637中的融合蛋白，或来源于烟曲霉，例如披露于WO 2005/047499或在此的SEQ ID NO:22或WO2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，或来源于青霉属的菌株，如披露于WO 2007/019442中的巴西青霉的菌株，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
79.如段落1-78中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如来源于嗜热子囊菌属，如金黄色嗜热子囊菌菌株的GH61多肽，例如，在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的GH61多肽；或来源于梭孢壳属，例如土生梭孢霉菌株的GH61多肽，例如，在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的GH61多肽；或来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉菌株的GH61多肽，例如，在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的GH61多肽；或来源于青霉属的菌株，例如埃默森青霉菌菌株的GH61多肽，例如，在WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:23中披露的GH61多肽。
80.如段落1-79中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉菌株的纤维二糖水解酶I，例如披露于WO 2011/057140中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:24的Cel7a CBH I，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
81.如段落1-80中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉菌株的纤维二糖水解酶II；例如在此的SEQ ID NO:25披露的纤维二糖水解酶II，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉，或来源于梭孢壳菌属的菌株，例如土生梭孢霉的菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
82.如段落1-81中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和一种β-葡糖苷酶。
83.如段落1-82中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和一种β-葡糖苷酶。
84.如段落1-83中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、以及一种CBH I。
85.如段落1-84中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBH I、以及一种CBH II。
86.如段落1-85中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
87.如段落1-86中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2)或此处的SEQ ID NO:22。
88.如段落1-87中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括WO 2011/041397中披露的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽(在此的SEQ ID NO:23)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或此处的SEQ ID NO:22或具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
89.如段落1-88中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括以下一种或多种组分
(i)一种烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)一种烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)一种烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及
(iv)一种具有纤维素分解增强活性的青霉属GH61多肽；或其同系物。
90.如段落1-89中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物按以下量给予：从0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/g DS，优选0.001-1mg/gDS，更优选从0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS。
91.一种酶组合物，包括：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；以及
-任选地一种产碳水化合物源的酶。
92.如段落91所述的组合物，其中该α-淀粉酶是细菌或真菌α-淀粉酶。
93.如段落91-92中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的。
94.如段落93所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是被截短的，优选被截短至具有约491个氨基酸。
95.如段落91-94所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在I181+G182位置具有双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
96.如段落91-95中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，优选S242Q取代。
97.如段落91-96中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，优选E188P取代。
98.如段落91-97中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl2下具有至少10的T1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之间，例如在15-70之间，例如在20-70之间，例如在25-70之间，例如在30-70之间，例如在40-70之间，例如在50-70之间，例如在60-70之间。
99.如段落91-98中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S:
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
100.如段落91-99中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过25％的热稳定性值。
101.如段落91-100中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，例如超过105％，例如超过110％，例如超过115％，例如超过120％的热稳定性。
102.如段落91-101中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，例如在20％与40％之间，例如20％与30％的热稳定性。
103.如段落91-102中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，例如在50％与70％之间，例如在50％与60％之间，例如在100％与120％之间，例如在105％与115％之间的热稳定性。
104.如段落91-103中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，例如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
105.如段落91-10486-99中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，例如在10％与30％之间，例如在10％与25％之间的热稳定性。
106.如段落91-105中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
107.如段落91-106中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶在85℃下具有在60-120之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定法确定的。
108.如段落91-107中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是真菌起源的。
109.如段落91-108中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属菌株的金属蛋白酶的一种变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
110.如段落91-109中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3，具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L:
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
111.如段落91-110中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶变体与WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或在此的SEQ ID NO:3具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。
112.如段落91-111中任一项所述的组合物，其中示于在此的SEQ ID NO:3中的金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下项中的一种：
-D79L S87P D142L；
-D79L S87P A112P D142L；
-D79L Y82F S87P A112P D142L；
-S38T D79L S87P A112P A126V D142L；
-D79L Y82F S87P A112P A126V D142L；
-A27K D79L S87P A112P A126V D142L；
-S49P D79L S87P A112P D142L；
-S50P D79L S87P A112P D142L；
-D79L S87P D104P A112P D142L；
-D79L Y82F S87G A112P D142L；
-S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L；
-D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L；
-S70V D79L Y82F S87G A112P D142L；
-D79L Y82F S87G D104P A112P D142L；
-D79L Y82F S87G A112P A126V D142L；
-Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L；
-Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L；
-A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L；
113.如段落91-112中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是细菌起源的。
114.如段落91-113中任一项所述的组合物，其中其中该蛋白酶是来源于热球菌属菌株，优选地激烈热球菌菌株。
115.如段落91-114中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是示于US6,358,726的SEQ ID NO:1、在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29中的一种蛋白酶。
116.如段落91-115中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是与US6,358,726中的SEQ ID NO:1、在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一种蛋白酶。
117.如段落91-116中任一项所述的组合物，其中产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶。
118.如段落91-117中任一项所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是在85℃、pH 5.3下具有至少20％、例如至少30％，优选至少35％的热稳定性的一种葡糖淀粉酶。
119.如段落91-118中任一项所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在pH 5.0的pH最佳值下具有至少90％，优选至少95％，优选至少97％的相对活性。
120.如段落91-120中任一项所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性。
121.如段落91-120中任一项所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶优选来源于青霉属菌株，尤其是草酸青霉菌菌株，披露为WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:9或14。
122.如段落91-121中所述的组合物，其中该葡糖淀粉酶与WO2011/127802的SEQID NO:2中所示的成熟多肽或在此的SEQ ID NO:9或14具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。
123.如段落91-122中所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是来源于草酸青霉菌菌株的、在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶的一种变体，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列用于编号)。
124.如段落91-123中任一项所述的组合物，进一步包括一种葡糖淀粉酶。
125.如段落91-124中任一项所述的组合物，进一步包括一种支链淀粉酶。
126.如段落91-125中任一项所述的组合物，包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地来源于草酸青霉菌的一种葡糖淀粉酶。
127.如段落91-126中任一项所述的组合物，包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶；
-一种蛋白酶，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌；
-任选地一种支链淀粉酶；
-来源于草酸青霉菌的一种葡糖淀粉酶。
128.如段落91-127中任一项所述的组合物，包括
-一种α-淀粉酶，优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)；
-任选地一种蛋白酶，优选来源于激烈热球菌或金黄色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地来源于草酸青霉菌的一种葡糖淀粉酶。
129.如段落91-128中任一项所述的组合物，包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182以及取代N193F；以及任选地另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；
-任选地一种支链淀粉酶；
-任选地一种SEQ ID NO:14的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
130.如段落91-129中任一项所述的组合物，包括：
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182+N193F；以及另外地以下取代集合中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所示的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V；
-K79V+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:14进行编号)；
131.如段落91-130中任一项所述的组合物，包括
-来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的一种α-淀粉酶，具有双缺失I181+G182+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用在此的SEQ ID NO:1进行编号)。
-一种来源于激烈热球菌的蛋白酶，优选在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ IDNO:29中所示的蛋白酶；
-一种如在SEQ ID NO:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：
-K79V+P11F+T65A+Q327F
-K79V+P2N+P4F+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
132.如段落126-131中任一项所述的组合物，其中该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶，其中该支链淀粉酶优选地包括如披露于WO2011/087836中的X47结构域。
133.如段落126-132中任一项所述的组合物，其中该支链淀粉酶来源于来自嗜热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌和Thermococcus hydrothermalis，或其杂合体。
134.如段落126-133中任一项所述的组合物，其中该支链淀粉酶是在X4位点截短的Thermococcus hydrothermalis支链淀粉酶或具有截短位点X4的、披露于WO 2011/087836中的或示于在此的SEQ ID NO:12中的T.hydrothermalis/嗜热高温球菌杂合酶。
135.如段落126-134中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(在此的SEQ ID NO:1)或其变体是成熟α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟α-淀粉酶。
136.如段落91-135中任一项所述的组合物，其中该激烈热球菌蛋白酶(在此的SEQID NO:13或在此的SEQ ID NO:29)和/或金黄色嗜热子囊菌蛋白酶(在此的SEQ ID NO:3)、或其变体是成熟蛋白酶或与在此的SEQ ID NO:13或在此的SEQ ID NO:29、或SEQ ID NO:3分别具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟蛋白酶。
137.如段落91-136中任一项所述的组合物，其中该草酸青霉菌葡糖淀粉酶(在此的SEQ ID NO:14)或其变体是成熟葡糖淀粉酶或与在此的SEQ ID NO:14具有至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性至少96％一致性至少97％一致性至少99％一致性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
Claims (20)
1.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及
-任选地一种产碳水化合物源的酶；
ii)使用一种产碳水化合物源的酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中液化过程中的pH是在高于5.0-6.5之间，例如高于5.0-6.0，例如高于5.0-5.5，例如在5.2-6.2之间，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，例如在此的SEQ ID NO:1中所示的α-淀粉酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在I181+G182位置具有双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属菌株的金属蛋白酶的一种变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该蛋白酶是来源于热球菌属菌株，优选激烈热球菌菌株。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶优选来源于青霉属菌株，尤其是在此的SEQ ID NO:9或14中披露的草酸青霉菌菌株。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，进一步地其中葡糖淀粉酶是在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的该葡糖淀粉酶是真菌起源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或来自木霉属的菌株，优选里氏木霉；或来自篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或来自密孔菌属的菌株；或来自粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌或来自黑层孔属的菌株。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，包括以下步骤：
i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
-一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，优选来源于激烈热球菌和/或金黄色嗜热子囊菌；以及
-一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶；
ii)使用一种葡糖淀粉酶进行糖化；
iii)使用一种发酵生物进行发酵；
其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
12.如权利要求1至11所述的方法，其中该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，特别是里氏木霉，或来源于腐质霉属的菌株，特别是特异腐质霉，或来源于金孢子菌属的菌株，特别是卢克诺文思金孢子菌。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括披露于在此的SEQ IDNO:23中的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、以及披露于在此的SEQID NO:22中的烟曲霉β-葡糖苷酶或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
14.一种酶组合物，包括：
-一种α-淀粉酶；
-任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值；
-任选地一种支链淀粉酶；以及
-一种产碳水化合物源的酶。
15.如权利要求14所述的组合物，其中该α-淀粉酶来自芽胞杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的一种变体，例如WO 99/019467中的SEQ IDNO:3或在此的SEQ ID NO:1中所示的α-淀粉酶。
16.如权利要求14-15所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在I181+G182位置具有双缺失，并且任选地具有N193F取代、或R179+G180缺失(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属菌株的金属蛋白酶的一种变体，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，尤其是金黄色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是来源于热球菌属菌株，优选激烈热球菌菌株。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶,该葡糖淀粉酶在85℃、pH 5.3下具有至少20％、例如至少30％，优选至少35％的热稳定性。
20.如权利要求14-19中任一项所述的组合物，其中该产碳水化合物源的酶是一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶优选来源于青霉属菌株，尤其是在此的SEQ ID NO:9或14中披露的草酸青霉菌菌株。
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