CN114920599A - 一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，将鲜猪粪与粉碎后的农作物秸秆混合均匀，调节初始C/N比约为26:1；调节含水率大约60％；以干重为基础将硅藻土添加到堆肥混合物中。为了保证堆肥***含氧量充足，在整个实验过程中堆肥的底部均进行强制曝气，通风速度为0.35L/kg(DW)/h。堆制40天，堆肥结束后，喹诺酮类抗性基因降低98％以上，重金属抗性基因降低98％以上，移动遗传元件丰度降低97％以上；本发明降低了猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、重金属抗性基因和ISCR1的丰度，同时设备简单、操作简便、所用材料成本低廉，且堆肥产品稳定肥效高，适合大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于养殖场固体废弃物处理技术领域，特别涉及一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因(aac(6’)-Ib-cr、gryA)、重金属抗性基因(pcoA)和移动遗传元件(ISCR1)丰度的方法。
背景技术
畜牧业被认为是ARGs在环境中传播的主要贡献者之一。然而动物肠道对抗生素的不完全代谢会导致高浓度的抗生素残留于其粪便中。此外，重金属也常用作饲料添加剂，但动物肠道对重金属的吸收有限，约有25％–75％的重金属以代谢物或原型的形式被排出体外。一般认为铜的相对毒性高于锌，其已成为畜禽养殖业废弃物管理中日益严重的问题，严重威胁人类健康和植物生存。先前的研究表明，重金属抗性基因(MRGs)的丰度反映了重金属对微生物的实际选择压力。ARGs和MRGs可以通过多种机制被重金属共同选择，如共抗性、交叉抗性和共调控机制。伴随着畜禽粪便的还田使用，残留的高浓度抗生素和重金属可能会对环境微生物施加选择性压力，从而诱导耐药细菌的产生，并促进ARGs通过土壤-植物***进入食物链。ARGs可能通过宿主增殖进行垂直基因转移或环境中细菌间移动遗传元件(MGEs)介导的水平基因转移(HGT)而在动物、环境和人类之间轻易传播。一旦ARGs被人类病原体或机会病原体捕获并形成“超级细菌”，可能会对全球人类健康构成潜在风险。
好氧堆肥是循环利用牲畜粪便的有效生物修复方法。成熟产品可为农作物提供养分，改善土壤结构，丰富土壤有机质含量，因此在农业生产中得到广泛的应用。然而，大量的研究证明堆肥对ARGs有不同的影响，因此有必要探索更有效的堆肥策略来控制ARGs的传播。纳米零价铁、高吸水性树脂和生物炭等具有较大比表面积的添加剂可以在堆肥过程中吸附重金属，有助于降低ARGs的丰度。然而，这些添加剂价格昂贵，破坏生态环境，且难以回收。因此，识别出更安全、更便宜、更有效的添加剂将有助于提高堆肥过程中ARGs的控制。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，采用不同比例(0％、4％、8％)的硅藻土加入到猪粪堆肥中，改善堆肥的环境，可避免猪粪农用后抗性基因直接进入土壤环境进一步威胁人类健康，并具操作简单、成本低廉的优势。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将农作物秸秆粉碎晒干后作为堆肥调理剂，与鲜猪粪充分混合得到秸秆和猪粪的混合物，农作物秸秆的加入量满足混合物的初始C/N比为25:1–30:1，并通过添加蒸馏水将含水率保持在55％～60％；
步骤(2)，在步骤(1)调节含水率之后的混合物中加入硅藻土，得到堆肥原料；
步骤(3)，将所述堆肥原料堆制在堆肥反应器中，在堆肥底部强制曝气，定时进行翻堆，保证充足的氧气，放置于堆肥试验场达到腐熟。
在一个实施例中，所述步骤(1)，农作物秸秆为小麦秸秆，其粉碎至1–2cm。
在一个实施例中，所述步骤(2)，以猪粪和秸秆干重为基础，硅藻土按照3～10％的比例加入。
在一个实施例中，所述步骤(3)，调节堆肥原料的pH为8.0。
在一个实施例中，所述步骤(3)，放置于堆肥试验场40天达到腐熟。
在一个实施例中，所述堆肥反应器为：直径40cm、高52cm，工作体积为70L，反应器设有保温措施，底部利用气泵进行强制曝气，中部有一个测温孔用于每日测温，上部有一个集气孔用于集气。
在一个实施例中，堆肥结束后，产物中喹诺酮类抗性基因总丰度降低98％以上，pcoA丰度降低98％以上，ISCR1丰度降低97％以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明具备设备简单、操作简便、原料易得等优点，且缩短了堆肥腐熟期，得到稳定的堆肥产品。
(2)将小麦秸秆粉碎，能降低纤维素的聚合度，有利于纤维素的降解，且能增大堆肥原料与硅藻土接触的比表面积。添加小麦秸秆能够改善堆体中氧气和水分条件。
(3)硅藻土的添加能够促进堆肥原料中纤维素类物质的生物降解。
(4)在堆肥中添加硅藻土能够提高堆体温度，延长高温期，提高微生物活性，加速堆肥腐熟，可以降低猪粪中喹诺酮类抗性基因(aac(6’)-Ib-cr、gryA)、pcoA和ISCR1的丰度。实施例中喹诺酮类抗性基因降低98％以上，pcoA丰度降低98％以上，ISCR1丰度降低97％以上。
附图说明
图1为堆肥过程中不同处理对喹诺酮类抗性基因丰度的影响。
图2为堆肥过程中不同处理对pcoA丰度的影响。
图3为堆肥过程中不同处理对ISCR1丰度的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
本发明为一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，尤其适用于使用抗生素和重金属控制疾病和促进动物生长的规模化养殖场产生的猪粪，包括如下步骤：
(1)检测晒干后的农作物秸秆和鲜猪粪的C、N含量及含水率；
(2)将农作物秸秆粉碎，与鲜猪粪充分混合；其中，农作物秸秆作为堆肥调理剂，用量达到鲜猪粪与农作物秸秆混合物的C/N比为26:1。示例地，本发明中，农作物秸秆选择小麦秸秆，其粉碎至1–2cm。本实施例中，鲜猪粪从中国陕西省咸阳市杨凌区的一个中型养殖场收集(34°28′N,108°07′E)。
(3)通过添加蒸馏水将堆体含水率(MC)保持在大约60％，可选范围一般为55-60％，将硅藻土加入到秸秆和猪粪的混合物中，得到堆肥原料。硅藻土为一种天然多孔硅酸盐材料，储量丰富，廉价易得。由于其化学惰性、大比表面积、高孔隙率和显著的吸附特性，常被用作吸附剂。一般用于吸附废水中的抗生素、重金属和染料。其对ARGs的影响尚不清楚。
本发明中硅藻土的作用是促进了铜由生物有效态向稳定态转化，从而降低了铜施加的选择性压力。此外，硅藻土通过降低MGEs的丰度来抑制HGT过程，从而削弱了ARGs的扩散。本发明中，以猪粪和秸秆的干重为基础，硅藻土的添加量一般宜为3～10％。
同时，硅藻土可以在减少温室气体排放的同时增加氮保存，从而促进腐殖化并提高堆肥产品的腐熟度。
(4)将堆肥原料堆制在堆肥反应器中，调节堆肥原料的pH为8.0，在堆肥底部强制曝气，定时进行翻堆，保证充足的氧气，放置于堆肥试验场达到腐熟。本实施例中，堆肥反应器为：直径40cm、高52cm，工作体积为70L。反应器设有保温措施，底部利用气泵进行强制曝气，中部有一个测温孔用于每日测温，上部有一个集气孔用于集气。
本发明实验中，设置三种处理分别为不添加硅藻土的CK(对照)、添加4％硅藻土的T1和添加8％硅藻土的T2。为了保证堆肥***含氧量充足，在整个实验过程中堆肥的底部均进行强制曝气，通风速度为0.35L/kg(DW)/h。堆制40天，堆肥结束后，喹诺酮类抗性基因降低98％以上，重金属抗性基因降低98％以上，移动遗传元件丰度降低97％以上。
本发明得到的堆肥产品品质和安全性高，可适用于工厂化大规模生产，能降低堆肥产品施入土壤后抗生素抗性基因的传播风险，具有更高效更优质更安全的优势，是降低畜禽粪便环境风险、提高堆肥产物质量的有效策略。所得堆肥尤其适用于黄土种植的蔬菜。研究表明超高温堆肥对于降低抗生素抗性基因丰度效果显著，后续可以通过添加硅藻土与超高温堆肥接合的方法进一步优化方案。
实施例1：硅藻土对喹诺酮类抗性基因(aac(6’)-Ib-cr、gryA)丰度的影响
将鲜猪粪与粉碎后的小麦秸秆混合均匀，调节初始C/N比为约为26:1，通过添加蒸馏水将含水率保持在大约60％。将不同比例的硅藻土(0％、4％和8％)加入到秸秆和猪粪的混合物中。将堆料充分混匀后装入体积为70L的聚氯乙烯反应器，堆制40天，在堆肥底部强制曝气、定时进行翻堆以保证充足的氧气。总共设3次重复。
由图1可以看出，添加硅藻土能够明显降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因(aac(6’)-Ib-cr、gryA)的丰度。不同时期对喹诺酮类抗性基因丰度的降低程度不同。高温时期，添加8％硅藻土处理中aac(6’)-Ib-cr、gryA丰度降低0.53logs–2.53logs，对照处理仅降低0.36logs–1.22logs。腐熟期，检测的喹诺酮类抗性基因均降低，添加硅藻土处理降低约1.93logs–3.10logs，而对照处理降低约1.40logs。堆肥结束后，对照处理中喹诺酮类抗性基因总丰度仅降低96％左右，而添加硅藻土使得喹诺酮类抗性基因总丰度降低约99％左右，并且8％硅藻土添加处理中喹诺酮类抗性基因丰度最低。
实施例2：硅藻土对pcoA丰度的影响
将鲜猪粪与粉碎后的小麦秸秆混合均匀，调节初始C/N比为约为26:1，通过添加蒸馏水将含水率保持在大约60％。将不同比例的硅藻土(0％、4％和8％)加入到秸秆和猪粪的混合物中。将堆料充分混匀后装入体积为70L，的聚氯乙烯反应器，堆制40天，在堆肥底部强制曝气、定时进行翻堆以保证充足的氧气。总共设3次重复。
由图2可以看出，添加硅藻土处理能够显著降低猪粪堆肥中pcoA的丰度。堆肥提供了一个好氧环境，这可能不利于pcoA的维持，因为携带pcoA的微生物在厌氧条件下具有更明显的生存优势。此外，硅藻土显著降低了生物有效态铜的浓度，从而降低了铜的选择压力，这与硅藻土处理中pcoA的较低丰度一致。与CK相比，添加硅藻土使得pcoA的丰度比CK低一个数量级，因此ARGs的增殖被进一步抑制。
实施例3：硅藻土对ISCR1丰度的影响
将鲜猪粪与粉碎后的小麦秸秆混合均匀，调节初始C/N比为约为26:1，通过添加蒸馏水将含水率保持在大约60％。将不同比例的硅藻土(0％、4％和8％)加入到秸秆和猪粪的混合物中。将堆料充分混匀后装入体积为70L，的聚氯乙烯反应器，堆制40天，在堆肥底部强制曝气、定时进行翻堆以保证充足的氧气。总共设3次重复。
由图3可以看出，添加硅藻土处理能够显著降低猪粪堆肥中ISCR1的丰度。由于硅藻土的加入，使得堆体温度快速增加进入高温期，且高温持续较久，致使部分抗性微生物被杀灭，同时降低了ISCR1丰度。堆肥结束后，对照处理ISCR1丰度降低94.90％，添加硅藻土处理使ISCR1丰度降低97％以上，其中添加8％硅藻土处理使ISCR1丰度降低99％以上。
综上，本发明降低了猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、重金属抗性基因和ISCR1的丰度，同时设备简单、操作简便、所用材料成本低廉，且堆肥产品稳定肥效高，适合大范围推广应用。
Claims (8)
1.一种降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，将农作物秸秆粉碎晒干后作为堆肥调理剂，与鲜猪粪充分混合得到秸秆和猪粪的混合物，农作物秸秆的加入量满足混合物的初始C/N比为25:1–30:1，并通过添加蒸馏水将含水率保持在55％～60％；
步骤(2)，在步骤(1)调节含水率之后的混合物中加入硅藻土，得到堆肥原料；
步骤(3)，将所述堆肥原料堆制在堆肥反应器中，在堆肥底部强制曝气，定时进行翻堆，保证充足的氧气，放置于堆肥试验场达到腐熟。
2.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，农作物秸秆为小麦秸秆，其粉碎至1–2cm。
3.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，以猪粪和秸秆干重为基础，硅藻土按照3～10％的比例加入。
4.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，调节堆肥原料的pH为8.0。
5.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，放置于堆肥试验场40天达到腐熟。
6.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，所述堆肥反应器为：直径40cm、高52cm，工作体积为70L，反应器设有保温措施，底部利用气泵进行强制曝气，中部有一个测温孔用于每日测温，上部有一个集气孔用于集气。
7.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，堆肥结束后，产物中喹诺酮类抗性基因总丰度降低98％以上，pcoA丰度降低98％以上，ISCR1丰度降低97％以上。
8.根据权利要求1所述降低猪粪堆肥中喹诺酮类抗性基因、pcoA和ISCR1丰度的方法，其特征在于，所述猪粪来自使用抗生素和重金属控制疾病和促进动物生长的规模化养殖场。
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