CN114910549A - 一种基于maldi-tof ms的***i的定量检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于MALDI‑TOF MS的***I的定量检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括：裂解液；键合***I抗体的磁珠；N15标记的***I内标使用液；校准品；芥子酸基质使用液。该检测方法是以N15标记的IGF I为内标加入到含IGF I的标准蛋白溶液和样本中，根据仪器上得到的IGF I与内标响应值的比值实现对IGF I的定量检测，具有一致性好、抗干扰强、方法学稳定、通量高、成本低、样品用量少、可实现前处理自动化等优点。该检测方法对IGF I检测能力为1548个/天。检测方法的LOQ为1ng/mL，远远低于目前临床检测方法的20ng/mL，检测范围由现有方法的20～1600ng/mL扩展到5～2000ng/mL的范围，并且该方法基本不受IGFBP3的干扰，且重现性良好CV<3％。

Description

一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测试 剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域。更具体地，涉及一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测试剂盒及检测方法。

背景技术

***I(InsuLin-like growth factor I，IGF I)又名SomatomedinC，是肝脏合成并分泌到外周血中的一种分泌蛋白，其成熟蛋白由70个氨基酸组成，其中6个半胱氨酸相互形成了维持其空间结构的3对二硫键，因其结构与胰岛素类似而被命名。

IGF I的分泌主要受生长激素(GH)随着血液循环到达肝脏与其细胞表面的生长激素受体结合后触发肝脏分泌的，能够直接作用于多种组织和器官，是GH促进生长作用的执行者。因此，通过对GH-IGF I轴的检测可以筛查出高风险人群中的垂体生长激素代谢异常疾病的发病个体，及时诊治杜绝并发症的发生，同时还可以在疾病病因的溯源和确诊后的用药指导等方面发挥重要作用。由于GH的分泌受多种因素影响且呈脉冲式(晚上比白天分泌多)，在外周血中的GH波动较大，不适合作为GH-IGF I轴检测的临床指标。IGF I作为一个公认的外周血中的含量比较稳定的分泌型蛋白质，其分泌量的多少不仅可以提示GH是否与其受体结合并触发IGF I的分泌，还可以调节下丘脑对GH的分泌，是GH-IGF I轴检测的理想指标。目前，IGF I的临床检测方法以化学发光免疫分析技术为主，该技术在IGF I定量结果重现性以及定量准确性方面暴露出很多问题，如不同品牌或同一品牌不同批次试剂盒定量重现性差、结果偏高、灵敏度差、定量范围窄、无法实现实验室间比对等诸多问题。文献报道，梅奥诊所回溯了2007年10月到2012年7月之间使用的32个批号ImmuLite 2000试剂盒的IGF1检测结果(Lot no.401-481)发现，lot424-427试剂盒的定量结果偏低，而lot441-492的定量结果持续升高。从原理上来说，化学发光免疫分析技术通过测量与待测物特异性结合的二抗上发光物质发出的光强度来间接地实现对待测物的定量，因此该技术的稳定性受到了抗体特异性、非特性吸附、嗜异性抗体、干扰物等多种因素的干扰，导致定量结果的波动性较大不能满足临床对生长激素缺乏症患儿IGF I水平的长期监测。而且该技术不能区分血清内的内源和外源的IGF I，无法实现对治疗效果的有效评价进而无法提示医生及时调整治疗方向。近年来，一些医学检测实验室和质谱仪器公司开发出了一种基于质谱技术(三重四极杆质谱)的IGF I定量技术——通过酸性乙醇沉淀法释放结合状态的IGF I后，利用LC-MS/MS串联技术靶向地对完整的IGF I或IGF I酶切肽段进行定量。该方法相对于化学发光免疫分析技术来说抗干扰性强、结果稳定，但是该技术前处理复杂、检测时间长、通量低、试剂耗材成本高不适合作为临床的IGF I定量方法进行推广。

因此，亟需开发一种新型的***I的定量检测试剂盒及其配套的检测方法。

发明内容

针对以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测试剂盒。该试剂盒灵敏度高、精密度高、准确性好。

本发明的第二个目的在于提供一种与上述试剂盒配套使用的检测方法。该检测方法是基于MALDI-TOF MS平台开发了一种抗干扰强、方法学稳定、通量高、成本低、样品用量少、可实现前处理自动化的IGF I定量检测技术。

为达到上述第一个目的，本发明提供的技术方案为：

本发明公开一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：

裂解液；键合***I抗体的磁珠；N15标记的***I内标使用液；校准品；芥子酸基质使用液；

其中，所述校准品是由含不同浓度的***I标准蛋白和1％BSA溶液稀释而成。

本发明提供的试剂盒首次采用以尿素、硫脲、SDS、CTAB、吐温20、CHAPS等化合物作为裂解剂用于裂解血清/血浆中IGF I-IGFBP3-ALS三元复合物，以实现检测过程中免受IGFBP3的干扰，解决了该领域的技术难题，像其他能够打开蛋白质间氢键的蛋白质变性试剂或表面活性剂也在本发明的保护之内。该试剂盒结合MALDI-TOF MS技术用于***I的定量检测中，具有灵敏度高、精密度高、准确性好等优点。

进一步，所述裂解液包括裂解剂和缓冲液。其中，所述裂解剂选自盐酸胍、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、吐温20、吐温80或3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、辛基-β-葡萄糖苷、辛基硫代葡萄糖苷、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、乙基苯基聚乙二醇(NP40)中的一种或几种；优选地，所述裂解液含有4～10M的裂解剂和0.1M的Tris-HCl缓冲液。

进一步，所述键合***I抗体的磁珠是利用生物素和链霉亲和素之间的亲和作用键合而成。

进一步，所述生物素为EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin或BMCC-Biotin中的一种，还可以包括本领域常用的含有不同修饰基团的生物素；所述磁珠为链霉亲和素磁珠或羧基磁珠，还可以包括与上述生物素相匹配的其他基团修饰的磁珠；所述磁珠的直径为0.1～3.5μm。

进一步，所述校准品的不同浓度为1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL和5ng/mL。

进一步，所述芥子酸基质使用液中包括溶剂、芥子酸以及三氟乙酸。

进一步，所述溶剂为乙腈和水的混合液，所述乙腈和水的体积比为1:2，芥子酸的浓度为5～15mg/mL，三氟乙酸的体积含量为0.7％。

进一步，所述试剂盒还包括0.1％Tween 20的PBS缓冲液。

为达到上述第二个目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测样本或校准品置于离心管中，加入0.5～1倍体积量的裂解液进行涡旋混合，之后加入N15标记的***I内标使用液和3～10倍体积量的含0.1％Tween 20的PBS缓冲液涡旋混合；

(2)将键合***I抗体的磁珠加入到所述离心管中，混匀，室温反应1～60min；

(3)瞬时离心10s后，进行磁分离去上清；

(4)依次通过含0.1％Tween-20的PBS缓冲液和去离子水进行清洗；

(5)用芥子酸基质使用液进行洗脱，磁分离后得到含***I的洗脱液；

(6)将所述含***I的洗脱液点在疏水靶板上，干燥结晶，在MALDI-TOF MS上进行检测；

(7)将得到的待测样本中的***I与内标响应值的比值输入标准曲线计算出待测样本中***I的浓度。

为了解决传统检测方法对IGF I定量检测中存在的抗干扰性差、结果普遍偏高、不同批次不同品牌试剂间结果波动性大、通量低、成本高等问题，本发明研发出一种基于MALDI-TOF MS技术的检测方法，可有效解决上述问题，该检测方法是以N15标记的IGF I为内标加入到含IGF I的标准蛋白溶液和样本中，根据仪器上得到的IGF I(7649Da)与内标(7742Da)响应值的比值实现对IGF I的定量检测，具有一致性好、抗干扰强、方法学稳定、通量高、成本低、样品用量少、可实现前处理自动化等优点，该检测技术在临床上的推广将更好地诊疗GH-IGF I轴相关疾病，同时可以促进IGF I定量项目在不同医院间的互认，推动医疗资源的整合和配置优化。

进一步，所述标准曲线是以校准品溶液中***I与内标在MALDI-TOFMS上得到的响应值的比值为x，以***I的浓度为y进行标准曲线的拟合。

进一步，所述抗体与磁珠的质量比为1:50～200。

本发明的有益效果如下：

本发明研发出一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测试剂盒。所述试剂盒包括：裂解液；键合***I抗体的磁珠；N15标记的***I内标使用液；校准品；芥子酸基质使用液。该试剂盒首次采用以尿素、硫脲、SDS、CTAB、吐温20、CHAPS等化合物作为裂解剂用于裂解血清/血浆中IGF I-IGFBP3-ALS三元复合物，以实现检测过程中免受IGFBP3的干扰，具有灵敏度高、精密度高、准确性好等优点。

本发明还研发出一种与上述试剂盒配套使用的检测方法，该检测方法是以N15标记的IGF I为内标加入到含IGF I的标准蛋白溶液和样本中，根据仪器上得到的IGF I(7649Da)与内标(7742Da)响应值的比值实现对IGF I的定量检测，具有一致性好、抗干扰强、方法学稳定、通量高、成本低、样品用量少、可实现前处理自动化等优点。

该检测方法对每个样本的前处理时间为1.1min，每个样本的质谱检测时间为0.93min，IGF I检测能力为1548个/天。检测方法的LOQ为1ng/mL，远远低于目前临床检测方法的20ng/mL，检测范围由现有方法的20～1600ng/mL扩展到5～2000ng/mL的范围，重现性良好CV<3％(n＝96)。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1 IGF I标准曲线8个浓度梯度的MALDI-TOF MS质谱图叠图。

图2五参数Logistic拟合的IGF I定量标准曲线。

图3编号2020122307样本的MALDI-TOF MS质谱图。

图4本发明检测技术与化学发光免疫技术的相关性分析图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明中，制备方法如无特殊说明则均为常规方法。所用的原料如无特别说明均可从公开的商业途径获得。

实验例1

1、血清/血浆样本

随机选择18个血清/血浆样本，用化学发光免疫技术对其中的IGF I进行定量测试，样本具体信息和检测结果如下表所示：

表1化学发光免疫技术对18个血清/血浆样本的检测数据表

2、试剂配制

(1)10mM PBS溶液的配制：

用去离子水将0.1M的PBS溶液(2.7mM的氯化钾、137mM的氯化钠、1.76mM的磷酸钾)稀释10倍即可。

(2)0.1％Tween 20的PBS溶液的配制：

在500mL的10mM PBS溶液中加入500uL的非离子型表面活性剂Tween 20，超声辅助混匀即可。

(3)20mM的Biotin水溶液的配制：

取1mg的EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin加入224uL的去离子水涡旋将Biotin全部溶解后使用。

(4)1％BSA溶液的配制：

准确称取0.5mg的牛血清白蛋白于50mL的离心管中，加入50mL 10mM PBS溶液在超声辅助下将蛋白质固体全部溶解即可。

(5)裂解液的配制

该裂解液中含有8M的尿素和0.1M的Tris-HCl，pH8.5，具体配制过程为：尿素24.024g，Tris 0.6057g，加30mL水，用1M盐酸调pH值至8.5后，用水定容至50mL。

(6)250ng/mL IGF I内标溶液的配制

用1％BSA溶液将N15标记的IGF I配制成250ng/mL IGF I内标溶液。

(7)芥子酸(SA)基质储备液的配制

准确称取60mg芥子酸固体粉末于10mL离心管中，加入2mL乙腈(HPLC级)和4mL无水乙醇(HPLC级)涡旋混匀后，加入70uL的三氟乙酸溶液混匀后作为SA基质储备液，避光保存。

(8)芥子酸(SA)基质使用液的配制

取适量的芥子酸(SA)基质储备液，按基质储备液与去离子水的体积比为3:2的比例与去离子水涡旋混合即可。

3、抗体-磁珠的键合

300ug的IGF I抗体加入到30kDa的超滤管中，于12000×g离心力条件下离心至管内液体被全部除尽为止，取出离心管加入200uL的10mM PBS缓冲溶液涡旋30s后12000×g离心力条件下离心5min(此操作重复2次)。取出超滤管后，加入400uL的10mM PBS缓冲溶液和12uL的20mM Biotin溶液(EZ-Link SuLfo-NHS-Biotin)涡旋30s后置于室温下反应30min。Biotin与抗体充分反应后，将超滤管置于离心机中12000×g离心力条件下离心10min，加入200uL的10mM PBS缓冲溶液涡旋30s后12000×g离心力条件下离心5min(此操作重复2次)。取30mg链霉亲和素磁珠(磁珠的直径为1.5um)加入到5mL的离心管中，将盛有磁珠的离心管置于磁力架上磁力分离5min并弃去全部上清液后，取下离心管用2.5mL的10mM PBS缓冲溶液重溶磁珠后将与Biotin键合好的抗体全部转移到磁珠悬浮液中，并用10mM PBS多次洗涤、转移超滤管中的抗体到磁珠悬浮液中，涡旋均匀后于室温下翻转3小时保证键合Biotin的抗体与链霉亲和素磁珠充分键合。抗体与磁珠键合后，将5mL试管置于磁力架上磁力分离5min后用2mL的10mM PBS洗磁珠2次，最后用3mL的0.1％Tween 20的PBS溶液重悬磁珠待用，该抗体浓度为100ug/mL。

4、IGF I标准曲线制备

用1％BSA溶液将IGF I标准蛋白配制成0.1mg/mL的IGF I标准蛋白储备液。随后再用1％BSA溶液将IGF I标准蛋白储备液逐级稀释为1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL和5ng/mL等8个浓度水平的IGF I标准蛋白溶液。准确移取40uL不同浓度的IGF I标准蛋白溶液样本于0.6mL的离心管中，加入20uL的裂解液涡旋后，室温下1500转/分震荡10min后加入130uL的0.1％Tween 20的PBS溶液和30uL的IGF1内标使用液涡旋混匀，加入10uL键合抗体的磁珠悬浮液(用前涡旋30s，且每5个样扣盖涡旋10s一次后使用)涡旋混匀，室温下置于翻转仪上反应10min，取下用瞬时离心机转10s后立即置于磁力架上进行磁力分离1min，弃去管中液体后加入200uL的0.1％Tween 20的PBS溶液涡旋30s左右确保磁珠全部悬浮后置于磁力架上进行磁力分离1min(重复操作3次)。弃去上清液后，在0.6mL离心管中加入200uL去离子水涡旋30s后置于磁力架上磁力分离1min后弃去上清液，再用100uL的去离子水重复一次该操作。将不含液体的离心管置于迷你离心机中离心30s后置于磁力架上磁力分离30s，用10uL的枪头小心吸尽离心管底部的微量液体，随后准确加入10uL的SA基质使用液涡旋30s后置于磁力架上磁力分离30s，取2uL的无色透明洗脱液点在于39℃的电热板上预热的靶板上进行加热，待靶板上的样品全部结晶后用MALDI-TOF MS采集数据。所得结果见图1。

其中，MALDI-TOF MS采集条件为：

激光器：半导体激光器；激光频率：1000Hz；二维平台移动速度：1.5mm/sec；FocusMass：4500～7500Da；采集质量范围：2kDa～35kDa。

以标准溶液中IGF I与内标(N15标记的IGF I)在MALDI-TOF MS上得到的Y-value的比值为x，以IGF I的浓度为y进行定量标准曲线的拟合。本方法将二者比值的平方根作为y变量，将IGF I的浓度作为x变量输入，选择五参数Logistic对IGF I定量标准曲线进行拟合，见图2，五参数Logistic曲线拟合方程如下：

y＝(A-D)/[(1+(x/C)^B)]ⁿ+D(相关系数r²＝0.9996)，

其中：A＝63.95659；

B＝-0.24037；

C＝3411.95918；

D＝0.13802；

n＝3.63501。

5、血清/血浆样本中IGF I的定量

准确移取20uL的血清/血浆于0.6mL的离心管中，加入20uL的裂解液涡旋后，室温下1500转/分震荡10min后加入130uL的0.1％Tween 20的PBS溶液和30uL的IGF1内标使用液涡旋混匀，加入10uL键合抗体的磁珠悬浮液(用前涡旋30s，且每5个样扣盖涡旋10s一次后使用)涡旋混匀，室温下置于翻转仪上反应10min，取下用瞬时离心机转10s后立即置于磁力架上进行磁力分离1min，弃去管中液体后加入200uL的0.1％Tween 20的PBS溶液涡旋30s左右确保磁珠全部悬浮后置于磁力架上进行磁力分离1min(重复操作4次)。弃去上清液后，在0.6mL离心管中加入200uL去离子水涡旋30s后置于磁力架上磁力分离1min后弃去上清液，再用100uL的去离子水重复一次该操作。将不含液体的离心管置于迷你离心机中离心30s后置于磁力架上磁力分离30s，用10uL的枪头小心吸尽离心管底部的微量液体。随后准确加入10uL的SA基质使用液涡旋30s后置于磁力架上磁力分离30s，取2uL的无色透明洗脱液点在于39℃的电热板上预热的靶板上进行加热，待靶板上的样品全部结晶后用MALDI-TOF MS采集数据。

将得到的每个样本的IGF I与内标(N15标记的IGF I)的比值输入作为y值输入拟合曲线计算出样品管中的IGF I浓度，谱图处理为：基线校正：DefauLt方式；质谱图平滑：采用Moving-Average方式，设置9个窗口；MiniSNR:1；％Height to use:1；质荷比校准：以m/z7649(IGF I的质谱峰)质谱峰进行校准；校准方式：单点校准；自动内校准质荷比：m/z7742(内标的质谱峰)；自动内校准限度：2000in PPM。根据如下计算公式进行计算：

样本中IGF I的含量按照下面的公式进行计算：

C_IGFI—反应管中IGF I的浓度(ng/mL)

V—样本的取样体积(μL)

18个血清的定量结果如下表所示：

表2本发明检测方法对18个血清/血浆样本的检测数据表

图3为编号2020122307样本的MALDI-TOF MS质谱图。

对比表1和表2可知，本发明的检测方法比现有的IGF I检测平台(化学发光免疫技术)的测定结果偏低，通过相关性分析发现，相关性分析图见图4，两个方法的相关系数为0.9883，说明两个方法定量结果的差异是方法学本身造成的***偏差。

该发明不仅具有方法学稳定、通量高、成本低、样本需求量少等优势，同时与现有方法具有很好的相关性，由此说明本发明的方法能够满足临床对IGF I定量的需求。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

裂解液；键合***I抗体的磁珠；N15标记的***I内标使用液；校准品；芥子酸基质使用液；

其中，所述校准品是由含不同浓度的***I标准蛋白和1％BSA溶液稀释而成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括裂解剂和缓冲液；优选地，所述裂解剂选自盐酸胍、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、吐温20、吐温80或3-((3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)-1-丙磺酸内盐、辛基-β-葡萄糖苷、辛基硫代葡萄糖苷、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇中的一种或多种；优选地，所述裂解液含有4～10M的裂解剂和0.1M的Tris-HCl缓冲液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述键合***I抗体的磁珠是利用生物素和链霉亲和素之间的亲和作用键合而成。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素为EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin或BMCC-Biotin中的一种；所述磁珠为链霉亲和素磁珠或羧基磁珠；所述磁珠的直径为0.1～3.5μm。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品的不同浓度为1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL和5ng/mL。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述芥子酸基质使用液中包括溶剂、芥子酸以及三氟乙酸。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述溶剂为乙腈和水的混合液，所述乙腈和水的体积比为1:2，芥子酸的浓度为5～15mg/mL，三氟乙酸的体积含量为0.7％。

8.一种基于MALDI-TOF MS的***I的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待测样本或校准品置于离心管中，加入0.5～1倍体积量的裂解液进行涡旋混合，之后加入N15标记的***I内标使用液和3～10倍体积量的含0.1％Tween 20的PBS缓冲液涡旋混合；

(2)将键合***I抗体的磁珠加入到所述离心管中，混匀，室温反应1～60min；

(3)瞬时离心10s后，进行磁分离去上清；

(4)依次通过含0.1％Tween-20的PBS缓冲液和去离子水进行清洗；

(5)用芥子酸基质使用液进行洗脱，磁分离后得到含***I的洗脱液；

(6)将所述含***I的洗脱液点在疏水靶板上，干燥结晶，在MALDI-TOFMS上进行检测；

(7)将得到的待测样本中的***I与内标响应值的比值输入标准曲线计算出待测样本中***I的浓度。

9.根据权利要求8所述的定量检测方法，其特征在于，所述标准曲线是以校准品溶液中***I与内标在MALDI-TOF MS上得到的响应值的比值为x，以***I的浓度为y进行标准曲线的拟合。

10.根据权利要求8所述的定量检测方法，其特征在于，所述抗体与磁珠的质量比为1:50～200。

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