CN114908122B - 一种用于表达外源蛋白的新型流感病毒载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明构建了一种以流感病毒PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因为骨架的载体，该载体对PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列进行截短，再将NA基因截短片段连接至PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS截短基因序列上，制备了一种可容纳比传统流感载体更大外源基因的新型载体。基于该载体的容纳大片段基因特质，在外源基因的选择上更具广泛性，包括荧光报告基因、抗原基因、治疗性基因等。本实验具备的载体构建方法，成熟简便，便于操作，成功率高。构建的该新型载体能高效表达多种外源蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用来表达外源蛋白的新型流感病毒载体及其制备方法.
背景技术
流感病毒为单负链RNA病毒，因此直接将病毒基因组vRNA注入细胞内不能产生有感染性的病毒颗粒。反向遗传学拯救***方面的进展使得从cDNA直接得到有感染性的病毒粒子成为可能，一方面加快了流感病毒疫苗开发进程，另一方面大大提高了流感病毒生物学性质研究速度，也为将流感病毒改造成为有用的基因载体提供了强有力的技术支持。流感病毒反向遗传学拯救***的发展为流感病毒载体的开发提供了方便而又有力的技术支撑。纵观流感病毒载体的开发历程，反向遗传学***是载体能否研发成功的关键技术之一。流感病毒载体有着非常广阔的应用前景，但是目前流感病毒载体的开发还不成熟。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种流感病毒载体。
本发明的第二个目的在于提供一种流感病毒载体的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供上述流感病毒在外源蛋白表达上的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种携带外源基因的流感病毒载体。
本发明的第五个目的在于提供一种携带外源基因的流感病毒载体的构建方法。
本发明的第六个目的在于提供一种外源蛋白的表达方法。
本发明所采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种流感病毒载体，所述载体包含：
流感病毒基因PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS的截短基因序列，所述截短基因序列包括所述流感病毒基因PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS的3’与5’端的编码区包装信号序列；和，
***在所述PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS截短基因序列中的NA基因截短片段，所述NA基因截短片段包含NA基因的3’端编码区包装信号。
优选在PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS截短基因序列的开放阅读框中***NA基因截短片段。
NA是流感病毒粒子表面的第二种糖蛋白，是一种典型的Ⅱ型糖蛋白，氨基端朝向病毒粒子内部。NA蛋白在结构上形成一个四聚体，每个蛋白单体都由一段短的非保守的氨基端细胞质区、一个疏水的跨膜区、一个茎区和一个球状的头部组成。本发明选取N端第1-201个核苷酸，该段包含了NA 3’端编码区的包装信号(183个核苷酸)。将该片段***截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列上。此时，该NA基因截短片段作为一个基座，与***的外源基因连接，达到将外源基因带到流感病毒表面的目的。
所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选地：所述流感病毒载体衍生自甲型或乙型流感病毒株，优选为H1N1亚型流感病毒株，例如，例如PR8流感病毒株。
作为本发明的一个实施例，所述流感病毒载体包含截短的PB2基因序列，所述截短的PB2基因序列分别保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全部截掉；将NA基因截短片段(SEQ ID NO.1)***截短的PB2基因序列上。
第二方面，本发明提供一种流感病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)将流感病毒PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS基因中的至少一个截短，保留所述基因的3’与5’端的编码区包装信号序列；
(2)将NA基因截短片段***被截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列中，得到流感病毒载体；所述NA基因截短片段包含3’端编码区包装信号；
优选在PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS截短基因序列的开放阅读框中***NA基因截短片段。
优选地，所述NA基因截短片段的核苷酸序列为：
atgaatccaaatcagaaaataacaaccattggatcaatctgtctggtagtcggactaattagcctaatattgcaaatagggaatataatctcaatatggattagccattcaattcaaactggaagtcaaaaccatactggaatatgcaaccaaaacatcattacctataaaaatagcacctgggtaaaggacacaacttca(SEQ ID NO.1)
所述NA基因截短片段所编码的氨基酸序列为：
MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTWVKDTTS(SEQ ID NO.2)
第三方面，本发明提供第一方面所述的流感病毒载体在表达外源蛋白上的应用。
作为优选地，所述的蛋白表达可在鸡胚或真核细胞内进行。
作为优选地，所表达的蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
第四方面，本发明提供一种携带外源基因的流感病毒载体，其包含截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列，截短基因序列保留3’与5’端的编码区包装信号序列；且截短的基因序列中***有外源基因与NA基因截短片段的融合基因，所述NA基因截短片段包含3’端编码区包装信号。
作为优选地，所述NA基因截短片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
作为优选地，所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选地，所述外源基因与NA基因截短片段通过接头序列(linker)相连。
常用的linker有GGGSG、GGGGS或GSG。当然，还可以采用其他常用的融合蛋白linker。
作为优选地，所述流感病毒载体衍生自甲型或乙型流感病毒株，优选为H1N1亚型流感病毒株。
第五方面，本发明提供一种携带外源基因的流感病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)将流感病毒基因组PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS基因中的至少一个截短，保留3’与5’端的编码区包装信号序列；
(2)将外源基因与NA基因截短片段连接后，***流感病毒截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列上，得到一种携带外源基因的流感病毒载体；所述NA基因截短片段包含3’端编码区包装信号；
优选地，所述NA基因截短片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第六方面，本发明提供一种外源蛋白的表达方法，包括如下步骤：
1)将流感病毒基因组PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS基因中的至少一个截短，保留3’与5’端的编码区包装信号序列；
2)将外源蛋白编码基因与NA基因截短片段连接后，***流感病毒截短的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列上；
3)将步骤2得到的重组流感病毒进行扩大培养；
优选地，所述NA基因截短片段包含3’端编码区包装信号。
进一步优选地，所述NA基因截短片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
进一步优选地，所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
进一步优选地，所述外源基因与NA基因截短片段通过接头序列(linker)相连。
优选地，所述的蛋白表达可在鸡胚或真核细胞内进行。
优选地，所表达的蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
本发明的有益效果是：构建了一种以流感病毒PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列为骨架的载体，该载体对PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS基因序列进行截短，再将NA基因截短片段连接至PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M或NS截短基因序列上，制备了一种可容纳比传统流感载体更大外源基因的新型载体。基于该载体的容纳大片段基因特质，在外源基因的选择上更具广泛性，包括荧光报告基因、抗原基因、治疗性基因等。本实验具备的载体构建方法，成熟简便，便于操作，成功率高。构建的该新型载体能高效表达多种外源蛋白。
附图说明
图1pM-PR8-NA构建流程图。
图2pM-PR8-PB2构建流程图。
图3pM-PR8-PB2骨架结构图。
图4流感病毒载体pMPR8-PB2-NA结构图。
图5载体构建设计示意图。
图6pMPR8-PB2-NA-EGFP构建流程图。
图7pMPR8-PB2-NA-EGFP骨架与片段的PCR扩增结果。
图8质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP的PCR扩增鉴定结果。
图9质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP转染293T细胞后，荧光显微镜下观察细胞发出绿色荧光。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1一种新型流感病毒载体
一种新型流感病毒载体，所述载体包含截短的PB2基因序列，截短的PB2基因序列仅保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号；且截短的基因序列的开放阅读框中***有NA基因截短片段，所述NA基因截短片段包含NA基因的3’端编码区包装信号。具体构建方法如下：
1流感载体pMPR8-NA的构建
在NCBI搜索PR8-NA序列(基因序列号为AF389120.1)，得到并合成NA基因；合成pM载体(pM为已知通用且高表达的载体，可通过生物公司合成)；以合成NA基因为模板，以na_F和na_R为引物PCR扩增获得NA基因片段，做胶回收纯化；以合成pM载体为模板，以pM1_F和pM1_R为引物PCR扩增获得pM骨架片段，做胶回收纯化；
将NA基因与pM载体骨架用Exnase酶进行同源重组，转化Top10接种Amp抗性LB固体培养基，得到克隆质粒pMPR8-NA(图1)。
na_F：gttggggccagcgaaagcaggggtttaaa(SEQ ID NO.3)，
na_R：ggttattagtagaaacaaggagttttttgaacaga(SEQ ID NO.4)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，10s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
pM1_F：tttctactaataacccggcggcccaaaat(SEQ ID NO.5)，
pM1_R：ttcgctggccccaacttcggaggtcgaccag(SEQ ID NO.6)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，20s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
2阳性质粒pMPR8-NA的PCR鉴定
na_F：gttggggccagcgaaagcaggggtttaaa(SEQ ID NO.7)，
na_R：ggttattagtagaaacaaggagttttttgaacaga(SEQ ID NO.8)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，10s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
3流感载体pMPR8-PB2的构建
在NCBI搜索PR8-PB2序列(基因序列号为AF389115.1)，得到并合成PB2基因；合成pM载体(pM为已知通用且高表达的载体，可通过生物公司合成)；以合成PB2基因为模板，以pb2_F和pb2_R为引物PCR扩增获得PB2基因片段，做胶回收纯化；以合成pM载体为模板，以pM2_F和pM2_R为引物PCR扩增获得pM骨架片段，做胶回收纯化；
将PB2基因与pM载体骨架用Exnase酶进行同源重组，转化Top10接种Amp抗性LB固体培养基，得到克隆质粒pMPR8-PB2(图2)。
pb2_F：tggggccagcgaaagcaggtcaattatatt(SEQ ID NO.9)，
pb2_R：gggttattagtagaaacaaggtcgttttta(SEQ ID NO.10)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，15s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
pM2_F：ttctactaataacccggcggcccaaaatgc(SEQ ID NO.11)，
pM2_R：ctttcgctggccccaacttcggaggtcg(SEQ ID NO.12)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，20s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
4阳性质粒pMPR8-PB2的PCR鉴定
pb2_F：tggggccagcgaaagcaggtcaattatatt(SEQ ID NO.13)，
pb2_R：gggttattagtagaaacaaggtcgttttta(SEQ ID NO.14)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，15s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
5流感载体pMPR8-PB2-NA的构建
以pM-PR8-NA质粒为模板，以NA1_F和NA1_R为引物PCR扩增获得NA基因截短片段(SEQ ID NO.1)，做胶回收纯化；
以pM-PR8-PB2质粒为模板，以dM-PB2_F和dM-PB2_R为引物，PCR扩增得到pM-PR8-PB2骨架，做胶回收纯化。pM-PR8-PB2骨架中的PB2基因被截短，仅保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号(图3)。
将NA基因截短片段(SEQ ID NO.1)与pM-PR8-PB2骨架片段用Exnase酶进行同源重组，转化Top10接种Amp抗性LB固体培养基，得到克隆质粒pMPR8-PB2-NA(图4)。
NA1_F：taatatcgatgaatccaaatcagaaaataac(SEQ ID NO.15)，
NA1_R：tgtgccgctgcctgaagttgtgtcctttacccag(SEQ ID NO.16)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，5s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
dM-PB2_F：tcaggcagcggcacagcgaccaaaagaattcgg(SEQ ID NO.17)，
dM-PB2_R：ggattcatcgatattagatttcttagttctt(SEQ ID NO.18)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；62℃，20s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
6阳性质粒pMPR8-PB2-NA的PCR鉴定
PB2-NCR_F：CAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCA(SEQ ID NO.19)，
PB2-NCR_R：AAACAAGGTCGTTTTTAAACTATTCGACA(SEQ ID NO.20)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，5s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
实施例2携带EGFP基因的新型流感载体的构建
1构建pMPR8-PB2-NA-EGFP质粒
以pCDNA3.1-EGFP(pCDNA3.1为已知通用且高表达的载体，pCDNA3.1-EGFP可通过生物公司合成)为模板，以EGFP1_F和EGFP1_R为引物PCR扩增获得EGFP片段，做胶回收纯化。
以pMPR8-PB2-NA质粒为模板，以dM-PB2-NA_F和dM-PB2-NA_R为引物，PCR扩增得到pM-PR8-PB2-NA骨架，做胶回收纯化。
将EGFP片段与pM-PR8-PB2-NA骨架片段用Exnase酶进行同源重组，转化Top10接种Amp抗性LB固体培养基，得到克隆质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP。
EGFP-1_F：tcaggcagcggcggcttggtgagcaagggcgagg(SEQ ID NO.21)，
EGFP-1_R：gtcgctgttttacttgtacagctcgtcca(SEQ ID NO.22)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，5s；72℃，20s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
dM-PB2-NA_F：caagtaaaacagcgaccaaaagaattcgg(SEQ ID NO.23)，
dM-PB2-NA_R：gccgccgctgcctgaagttgtgtcctttaccca(SEQ ID NO.24)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，20s；72℃，20s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
4阳性质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP的PCR鉴定
PB2-NCR_F：CAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCA(SEQ ID NO.25)，
PB2-NCR_R：AAACAAGGTCGTTTTTAAACTATTCGACA(SEQ ID NO.26)，
PCR条件：98℃，3min；98℃，10s；56℃，5s；72℃，20s；cycles 30；72℃，5min；4℃10min。
5质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP转染293T细胞后的EGFP蛋白表达验证
将质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP以2.5ug的量转染至293T细胞，48h后在荧光显微镜下观察，可观察到细胞携带绿色荧光。如图9所示，结果表明，质粒pMPR8-PB2-NA-EGFP转染293T细胞后能检测到EGFP荧光蛋白的表达。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司
<120> 一种用于表达外源蛋白的新型流感病毒载体及其构建方法
<130>
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> influenza virus
<400> 1
atgaatccaa atcagaaaat aacaaccatt ggatcaatct gtctggtagt cggactaatt 60
agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga ttagccattc aattcaaact 120
ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca ttacctataa aaatagcacc 180
tgggtaaagg acacaacttc a 201
<210> 2
<211> 67
<212> PRT
<213> influenza virus
<400> 2
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser
65
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttggggcca gcgaaagcag gggtttaaa 29
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggttattagt agaaacaagg agttttttga acaga 35
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttctactaa taacccggcg gcccaaaat 29
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttcgctggcc ccaacttcgg aggtcgacca g 31
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gttggggcca gcgaaagcag gggtttaaa 29
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggttattagt agaaacaagg agttttttga acaga 35
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tggggccagc gaaagcaggt caattatatt 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggttattag tagaaacaag gtcgttttta 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttctactaat aacccggcgg cccaaaatgc 30
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctttcgctgg ccccaacttc ggaggtcg 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tggggccagc gaaagcaggt caattatatt 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gggttattag tagaaacaag gtcgttttta 30
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
taatatcgat gaatccaaat cagaaaataa c 31
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgtgccgctg cctgaagttg tgtcctttac ccag 34
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcaggcagcg gcacagcgac caaaagaatt cgg 33
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggattcatcg atattagatt tcttagttct t 31
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cagcgaaagc aggtcaatta tattca 26
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aaacaaggtc gtttttaaac tattcgaca 29
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcaggcagcg gcggcttggt gagcaagggc gagg 34
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtcgctgttt tacttgtaca gctcgtcca 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caagtaaaac agcgaccaaa agaattcgg 29
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gccgccgctg cctgaagttg tgtcctttac cca 33
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cagcgaaagc aggtcaatta tattca 26
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aaacaaggtc gtttttaaac tattcgaca 29
Claims (15)
1.一种流感病毒载体，其特征在于：所述载体包含：
截短的流感病毒PB2基因序列，所述截短的流感病毒PB2基因序列保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全部截掉；和，
***在所述截短的流感病毒PB2基因序列中的NA基因截短片段，所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述流感病毒PB2基因的GenBank登录号为AF389115.1。
2.根据权利要求1所述的流感病毒载体，其特征在于：所述流感病毒载体衍生自PR8流感病毒株。
3.一种流感病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）将流感病毒PB2基因截短，保留所述基因的3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全部截掉，得到截短的流感病毒PB2基因序列；
（2）将NA基因截短片段***所述截短的流感病毒PB2基因序列中，得到流感病毒载体；所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述流感病毒PB2基因的GenBank登录号为AF389115.1。
4.权利要求1-2任一项所述的流感病毒载体在体外表达外源蛋白中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的蛋白表达在鸡胚内进行。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的蛋白表达在真核细胞内进行。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所表达的蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
8.一种携带外源基因的流感病毒载体，其包含截短的流感病毒PB2基因序列，所述截短的流感病毒PB2基因序列保留3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全部截掉；且所述截短的流感病毒PB2基因序列中***有外源基因与NA基因截短片段的融合基因，所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述流感病毒PB2基因的GenBank登录号为AF389115.1。
9.根据权利要求8所述的流感病毒载体，其特征在于，所述外源基因与NA基因截短片段通过接头序列相连。
10.根据权利要求8-9任一项所述的流感病毒载体，其特征在于：所述流感病毒载体衍生自PR8流感病毒株。
11.一种携带外源基因的流感病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）将流感病毒PB2基因截短，保留所述基因的3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全部截掉，得到截短的流感病毒PB2基因序列；
（2）将外源基因与NA基因截短片段连接后，***所述截短的流感病毒PB2基因序列上，得到一种携带外源基因的流感病毒载体；所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
所述流感病毒PB2基因的GenBank登录号为AF389115.1。
12.一种外源蛋白的体外表达方法，包括如下步骤：
（1）将流感病毒PB2基因截短，保留所述基因的3’与5’端各36个核苷酸的包装信号，其他部分全部截掉，得到截短的流感病毒PB2基因序列；
（2）将外源蛋白编码基因与NA基因截短片段连接后，***所述截短的流感病毒PB2基因序列上；
（3）将步骤（2）得到的重组流感病毒进行扩大培养；
所述NA基因截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述流感病毒PB2基因的GenBank登录号为AF389115.1。
13.根据权利要求12所述的体外表达方法，其特征在于：所述的蛋白表达在鸡胚内进行。
14.根据权利要求12所述的体外表达方法，其特征在于：所述的蛋白表达在真核细胞内进行。
15. 根据权利要求12所述的体外表达方法，其特征在于：所表达的蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
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| GR01 | Patent grant | ||
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