CN114908099A - 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一系列携带人为设计的SMN1基因表达框的重组腺相关病毒。体内实验表明，重组腺相关病毒载体能够高效地导入中枢神经***，持续稳定地表达SMN1蛋白，延长脊髓性肌萎缩(SMA)模型动物的生存期，增加其体重，恢复其生长发育。结果提示，该重组腺相关病毒载体可开发成为新的SMN1基因突变引起的脊髓性肌萎缩治疗药物。

Description

携带设计SMN1基因表达框的重组腺相关病毒及应用
本申请是申请日为2018年6月28日的、发明名称为“携带设计SMN1基因表达框的重组腺相关病毒及应用”的中国专利申请201810686041.9的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组腺相关病毒载体携带人为设计的SMN1基因表达框及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular astrophy，SMA)是一组儿童和少年常见的常染色体隐性遗传病。国外文献提示发病率为1/6000到1/10000(Nicole S，et al.Muscle&Nerve.2002；26(1):4-13.)，人群中携带者频率约为1/40到1/50之间。我国南方人群发病率估计为1/53000(Chung B,et al.J Child Neurol.2003； 18(3):217-219.)。
该病以脊髓前角运动神经元退行性变引起的肌肉萎缩与瘫痪为特征(MaryamOskoui，et al. Neurotherapeutics.2008；5:499-506.Nicole S，et al.Muscle&Nerve.2002；26(1):4-13.Talbot K.Journal of Inherited Metabolic Diseases.1999；22(4):545-554.)，症状主要表现在四肢，其中近端重于远端，下肢的症状往往先于上肢出现(Thomas TH,et al.Neuromuscular Disorders.1994；4(5-6):497-502.)。若肋间肌被影响还会影响呼吸功能，危及生命。患者的生存率一般取决于呼吸功能是否受到影响，运动相关的肌群往往减低患者的生存质量，但不威胁生命(Thomas TH,et al.NeuromuscularDisorders.1994；4(5-6):497-502. Kroksmark AK,et al.European Journal ofPediatric Neurology.2001；5(5):191-198.Russman BS,et al.J Child Neuro.1992；7(4):347-353.)。有部分患者还会出现手指的肌纤维颤动(Iannaccone ST.Seminars inNeurology. 1998；18(1):19-26.)。面部肌肉一般少见被累及(Iannaccone ST,etal.Pediatric Neurology.1993； 9(3):187-193.)。SMA患者的认知功能一般正常，一般在SMA疾病的后期，往往会出现患者智力水平和运动能力严重分离的情况(Thomas TH,etal.Neuromuscular Disorders.1994；4(5-6):497-502.Iannaccone ST. Seminars inNeurology.1998；18(1):19-26.)。
国际SMA联合会根据患者的发病年龄、运动能力和寿命制定了SMA的分类原则。将SMA分为I 型、II型和III型等3个型别(Munsat T.Neuromuscular Disorders.1991；1(2):81.Munsat TL,et al. Neuromuscular disorders.1992；2(5-6):423-428.)。
脊髓性肌萎缩I型是最常见的型别(也被称作Werdnig-Hofffmann病、机型SMA、婴儿期SMA)。一般于出生后6个月内发病。SMA I型的患儿一般不能独坐，且多在两岁之前死亡(Cobben JM,et al. Neuromuscular Disorders.2008；18(7):541-544.)。此型的特征是严重的进行性的肌无力与肌张力减弱 (Iannaccone ST.Seminars in Neurology.1998；18(1):19-26.)。I型SMA是最重要的引起婴儿死亡的遗传病之一(Nicole S，et al.Muscle&Nerve.2002；26(1):4-13.)。
SMA II型是中间型(又被称为青少年型SMA、慢性SMA)。发病于6-18个月。此类患者可以独坐，但是不能独自行走。且经常出现呼吸道功能障碍(Bertini E,etal.Neuromuscular Disorders. 2005；15(11):802-816.)。一般此类患者寿命超过两岁，有时甚至可存活至***，甚至存活更长时间(Zerres K,et al.Journal of theNeurological Sciences.1997；146(1):67-72.)。
SMA III型为轻型SMA(又称为Kugelberg-Welander病、Wohlfart-Kugelberg-Welander病)。一般都在18个月之后发病，该患者有些可以独立行走，***病情有可能出现反复。寿命多正常(Zerres K,et al.Journal of the Neurological Sciences.1997；146(1):67-72.)。
有文献报道了一种严重型的SMA，出生前就开始发病，生后一个月就死亡，这一型被称为SMA0 型，也叫先天型SMA(Dubowitz V.European Journal of PediatricNeuroloy.1999；3(2):49-51.)。SMA疾病谱中的另一个极端为SMA IV型，又称为成人型SMA，一般在35岁之后发病(Maryam Oskoui，et al. Neurotherapeutics.2008；5:499-506.)。
SMA实际上具有很宽泛的临床谱，三个主型之下还有各个亚型，分型之间也有重叠。比如有些患儿，虽然不能独坐，但是生存期却很长(Thomas TH,et al.NeuromuscularDisorders.1994；4(5-6):497-502.)。有些患儿虽属SMA I型，但是可以自主活动头部(SMAI型的特征表现即头部不能自主活动)；有的SMA I型患儿发病后，病情进展并不迅速，有些患儿虽然6个月之前发病，但仍可以独坐；有些在18个月内发病，但可以独走(Russman BS,et al.J Child Neuro.1992；7(4):347-353.)。因此有人提出，患儿在发病后表现出的最大限度的运动能力，比发病时间能更好法人预测患儿的疾病严重程度(Zerres K,et al.Neuromuscular Disorders.1999；9(4):272-278.)。
SMA致病基因定位于5q13.3，被命名为SMN(运动神经元生存基因)基因(Brzustowicz LM,et al. Nature.1990；344(6266):540-541.)。SMN基因长20kb，cDNA为1.7kb，含8个外显子。该基因有2种形式，靠近端粒的SMN1(SMNt)及靠近着丝粒的SMN2(SMNc)(Nicole S，et al.Muscle&Nerve. 2002；26(1):4-13.)。两者高度同源(99％)，在编码区内的差异仅外显子7的同义突变(密码子280，SMN1 为TTC，SMN2为TTT)，其他差异均位于非编码区，均不影响编码功能(Nicole S，et al.Muscle&Nerve. 2002；26(1):4-13.)。
SMN编码全长的SMN转录产物fl-SMN(full-length survival motor neuron，全长运动神经元存活基因转录本)编码1个包含294个氨基酸，分子量为38kD的蛋白，称为SMN蛋白。SMN蛋白在所有哺乳纲生物的组织和细胞中均有广泛表达，在脑、肾脏、肝脏，尤其是运动神经元中高水平表达，在骨骼肌和心肌细胞中中等水平表达，在淋巴细胞中则低水平表达。研究发现运动神经元中SMN蛋白的表达量在各年龄段是稳定的，而其他组织器官中SMN蛋白量随年龄增长而下降，这表明运动神经元的生存及其功能的发挥严格依赖于高水平的SMN蛋白的表达(吴志国，等.中华医学遗传学杂志.2003；20(5):430-432.)。
SMN蛋白的具体功能目前还不清楚(Sumner CJ.J Child Neuro.2007；22(8):979-989.)。在运动神经元中，mRNA的剪接很可能依赖SMN蛋白(Lefebvre S,et al.Cell.1995；80(1):155-165.)。运动神经元生存蛋白可能还对神经元轴突的生长起关键作用(McWhorter ML,et al.The Journal of Cell Biology.2003； 162(5):919-931.)，SMN蛋白在对抗SOD1的毒性，保护神经细胞方面也有作用。然而在SMA患者的所有细胞中都发现SMN蛋白的减少。而这种蛋白的缺少是否仅仅对运动神经元的功能造成影响便不得而知(Zou T,et al.Biochemical and Biophysical Research Communication.2007；364(4):850-855.)。还有多种其他对于SMA的病理过程的假设，包括细胞凋亡程序失调，谷氨酸盐产生的兴奋毒性，氧化应激等等(Takeuchi Y,et al.J Child Neuro.1994；9(3):287-289.)。
SMN蛋白在中枢神经***中主要分布在细胞质中，在骨骼肌中主要分布在细胞核中，在核内聚集成一个gems结构(Patrizi AL,et al.Eur J Hum Genet.1999；7(3):301-309.)，在基因的转录和剪接中具有重要作用。SMA病因即是由于SMN1基因纯合缺失或复合杂合突变，使功能性蛋白SMN表达量减少，造成脊髓前角运动神经元细胞变性，导致肌肉萎缩和瘫痪(吴志国，等.中华医学遗传学杂志.2003；20(5): 430-432.)。
SMN1基因表达产物90％为SMN蛋白，而SMN2基因转录本90％缺少外显子7，只有10％的包含外显子7的转录本，仅表达10％左右的SMN蛋白(Lorson Cl,et al.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.1999；96(11):6307-6311.)，因此SMN2的存在不能完全代偿SMN1 基因突变带来的SMN蛋白的缺失。SMN2异常剪接形成的缺少外显子7的转录本称作Δ7SMN2。Δ7SMN2 产生的机制有两种主要观点：Cartegni等认为发生在SMN2基因外显子7的+6位碱基C突变为T破坏了外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer，ESE)，导致SMN2外显子7被剪切(Cartegni L,etal.American Journal of Human Genetics.2006；78(1):63-77.)；Kashima和Manley发现C突变为T后产生了一个外显子剪接沉默子(exonic splicing silencer，ESS)，可以募集hnRNP A1抑制蛋白到SMN2，从而造成SMN2外显子7的剪切(Tsuyoshi Kashima,etal.Nature Genetics.2003；34:460-463.)。有人证明了在内含子7的+100 位的另一个寡核苷酸的改变，产生了一个hnRNP A1在SMN2的结合位点，它对外显子7的剪切很必要，其突变阻碍该蛋白的结合，增加包含外显子7的fl-SMN RNA的产量(Tsuyoshi Kashima,etal.PNAS.2007； 104(9):3426-3431.)。
另外SMN蛋白自身寡聚化对其功能很重要(Wolstencroft EC,et al.Hum MolGenet.2005；14: 1199-1210.)。而SMN2基因表达主要产生的截短的Δ7SMN2蛋白的自身寡聚化能力降低，虽在体外能改善SMA，但不能阻止SMA表型，且其生化性质不稳定，很快会被降解，不能补偿SMN1的缺失(Le TT, et al.Hum Mol Genet.2005；14:845-857.)。
综上所述，SMNl基因存在缺陷而正常的SMN2基因不能完全代偿，最终引起SMN蛋白缺乏是SMA 主要的发病机制。所以，采取各种途径提升SMN蛋白表达是SMA最根本、最有前景的治疗策略。在依赖 SMN的治疗策略中，主要包括SMNl基因替代治疗、增强SMN2基因启动子活性、增加SMN2基因全长转录本的表达、稳定SMN等。具体治疗方案大致包括3类：基因治疗、反义寡核苷酸、小分子化合物。此外，也有不依赖于提升SMN蛋白的治疗策略，如干细胞治疗、神经肌肉保护类药物等。目前，针对上述不同治疗方案，已有至少18种SMA候选药物的33项研究进入临床试验阶段(http://clinicaltrials.gov)。
依赖SMN的治疗：(1)基因治疗：基因治疗方法是通过病毒载体引人外源性SMN基因，直接增加体内SMN蛋白的表达，是一项非常有前景的SMA候选治疗方法。2009年Foust等报道了9型自补型腺相关病毒载体(self-complementary adeno-associated virus type9，scAAV9)较其他血清型腺相关病毒载体更容易通过血脑屏障，可以经静脉注射后运输至中枢神经***，感染约60％的运动神经元(Foust KD,et al.Nat Biotechnol.2009；27(1):59-65.)，这为SMA的治疗提供了新的思路。随后各种携带SMN1基因表达框的 scAAV9(scAAV9-SMN)便开始较广泛地用于SMA治疗研究。Foust等建立了重型Δ7SMA小鼠模型(后简称“Δ7SMA小鼠”)，将携带CB启动子(由人巨细胞病毒增强子和鸡beta-actin启动子组成)的SMN1 基因表达框的重组9型自身互补腺相关病毒载体scAAV9-CB-SMN1，以5×1011vg(viral genome)/只的剂量经面静脉注射至出生第一天后的重型Δ7SMA模型小鼠，其生存期延长到了250d，明显长于未给药组Δ7SMA小鼠的平均生存期15.5d(Foust KD，et al.NatBiotechnol.2010；28(3):271-274.)。此外，给药组小鼠的体重、运动功能及病理学表现均显著优于未给药组小鼠。Valori等设计了一种基因表达框不同于 scAAV9-CB-SMN1结构的scAAV9病毒。该病毒采用人巨细胞病毒启动子(CMV)调控序列优化SMN1 基因的表达框。将病毒以1×1011vg(viral genome)/只的剂量经面静脉注射至出生第一天后的Δ7SMA小鼠体内，结果表明，平均延长69天，小鼠体重、运动能力及病理学表现不同程度提高(Valori CF，et al.Science Translational Medicine.2010；2(35):35ra42.)。Dominguez等采用磷酸甘油酸酯启动子(PGK)调控优化SMN1 基因表达，用scAAV9携带构建SMN1表达框，4.5×1010vg(viral genome)/只的剂量经颞静脉注射至出生第一天后的Δ7SMA小鼠体内，模型小鼠生存期延长至160天(平均值)，小鼠体重、运动能力也有增加(Dominguez E，et al.HumanMolecular Genetics.2011；20(4):681-693.)。三项研究设计了三种不同的SMN1 表达框结构，通过scAAV9载体携带后均能有效地导入中枢神经***，表达SMN1蛋白，显示出治疗作用。其中scAAV9-CB-SMN1的作用在其他哺乳动物模型中也得到验证(Duque SI，et al.AnnNeurol.2015； 77(3):399-414.Meyer K，et al.Mol Ther.2015；23(3):477-487.)。Duque等开展的一项SMA猪模型实验结果显示，SMA症状出现前，采用scAAV9-CB-SM,1基因治疗可以防止幼猪肌力下降和肌电图的异常改变；在SMA幼猪出现后肢肌力下降和步态异常等症状后再采取scAAV9-CB-SMN1基因治疗，后肢肌无力症状虽然未完全改善，但也未进一步加重或完全麻痹，证明症状出现后予以基因治疗仍然可以阻止SMA症状的进一步加重(DuqueSI，et al.Ann Neurol.2015；77(3):399-414.)。Meyer等在小鼠和猴子体内实验中发现scAAV9-CB-SMN1经脑室内给药，有效作用剂量比静脉给药降低近10倍(Meyer K，et al.MolTher.2015； 23(3):477-487.)。基于该治疗方案在动物模型上的可观疗效，美国食品药品监督管理局(FDA)已于2014 年批准scAAV9-CB-SMN1(AVXS-101)进入I期临床试验阶段，受试对象为15例SMAl型患儿。2017年新英格兰医学杂志报道结果显示，15例SMA1型患儿接受AVXS-101治疗后都出现运动功能增强和生存期延长(Mendell JR,et al.N Engl JMed.2017；377:1713-1722.)，证明了scAAV9-CB-SMN1(AVXS-101) 治疗SMA的可行性。目前，对15例受试者的观察仍在继续中。
(2)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)：人工合成的ASOs片段是依据沃森-克里克碱基配对法则，特异性结合于SMN2基因外显子7的剪接抑制序列，促进外显子7的正确剪接，以提升全长 SMN2转录本的表达。目前用于SMA治疗研究的ASOs中，以结合于SMN2基因内含子7剪接沉默子Nl 序列(intronie splicing silencer，ISS-N1)作用较为显著(Singh NK,et al.Mol Cell Biol.2006；26(4):1333-1346. Hua YM,et al.PLoSBiology.2007；5(4):e73.Zhou HY,et al.Hum Gene Ther.2013；24(3):331-342.15-17)。国际上已开展的多项细胞模型和小鼠模型实验证明2’-O-甲基(MOE)ASO和吗啉ASO可以增加全长SMN2 基因表达，提升SMN蛋白水平，改善SMA相关表现(Mitrpant C,et al.PLoSOne.2013；8(4):e62114.Keil JM,et al.Mol Ther Nucleic Acids.2014；3:e174.OsmanEY,et al.Hum Mol Genet.2014；23(18):4832-4845. Nizzardo M,et al.ClinTher.2014；36(3):340-356.18-21)。Zhou等经侧脑室单次注射吗啉ASO后，小鼠脑和脊髓内全长SMN2转录本表达上调，生存期延长到230天，明显长于未处理组的9天左右(Zhou HY,etal.Hum Gene Ther.2013；24(3):331-342.17)。Mitrpant等的实验结果显示重型SMA小鼠经ASO治疗后生存期延长至37～126天，明显长于对照组的15天(Mitrpant C,et al.PLoSOne.2013；8(4):e62114.18)。 Rigo等开展的另外一项小鼠实验显示，向SMA小鼠侧脑室采取连续7天输注或单次侧脑室注射MOE-ASO 后，腰段脊髓内全长SMN2基因水平提升至3倍，并且分别维持至52周和36周左右(Rigo F，et al.J Pharmacol Exp Ther.2014；350(1):46-55.)。此外，Rigo等还开展了一项非人类灵长动物模型实验，该实验通过向成年猕猴鞘内注射不同剂量的MOE-ASO以研究药物进入灵长类动物体内后的分布情况，结果显示 MOE-ASO在其脊髓各节段、小脑、脑桥以及大脑皮层内广泛分布，尤其以腰段脊髓MOE-ASO浓度最高，该实验结果为临床试验中药物在人体内的分布及代谢研究提供了理论依据(Rigo F，etal.J Pharmacol Exp Ther.2014；350(1):46-55.)。MOE-ASO的候选药物Nusinersen(原名ISIS-SMNRX)通过多项I、II期临床试验，对上百例SMAl、2、3型患儿进行了鞘内注射Nusinersen，评估了该药在人体内的分布及代谢情况 (Chiriboga CA,etal.Neurology.2016；86(10):890-897.)，结果显示Nusinersen安全性、耐受性较好(Chiriboga CA,et al.Neurology.2016；86(10):890-897.)。后续的III期临床试验证明Nusinersen对SMA 患儿的临床疗效显著。2016年12月23日美国食品和药品管理局(FDA)批准Nusinersen上市销售，商品名为SPINRZA，成为首个用于治疗儿童和成人SMA的新药(https://www.accessdata.fda.gov/)。
(3)小分子化合物：可提高SMN蛋白水平的小分子化合物种类较多，不同类别的小分子化合物上调 SMN蛋白的作用机制也不尽相同(Cherry JJ，et al.EMBO Mol Med.2013；5(7):1035-1050.)。以丙戊酸为研究热点的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)类药物，可能通过对染色质重塑、改变转录因子的结构以提升转录因子的活性，增加全长SMN2转录本量，继而提升全长SMN蛋白水平(Mohseni J,et al.Genet Mol Biol.2013；36(3):299-307.)。在初期细胞水平研究观察到全长SMN2转录本的上调后，尽管有临床试验报道在SMA2型患儿中观察到有SMN蛋白水平提升及四肢肌力改善的效果(Swoboda KJ,et al.PLoS One.2009；4(5):e5268.Piepers S,et al.J Neurol Neurosurg Psychiatry.2011；82(8):850-852.26-27)，但仍有多数的临床试验结果显示HDACI对SMA2、3型患儿及SMA4型成人患者的SMN蛋白水平提升及四肢肌力改善作用并不明显心(Mereuri E,et al.NeuromusculDisord.2004；14(2):130-135.Darbar IA,et al.BMC Neurology. 2011；11:36.KisselJT,et al.Muscle Nerve.2014；49(2):187-192.28-30)，所以HDACI类药物的临床疗效及应用前景尚不能被充分肯定。经高通量筛查技术(high-throughput screen，HTS)筛选出的具有增加 SMN2基因表达作用的小分子化合物，如RNA脱帽酶抑制剂RG3039，通过抑制mRNA 5’端m7GPPPN 帽子结构水解，具有稳定SMN2基因mRNA结构的功能，从而提升SMN蛋白总量，改善重型△7SMA小鼠运动功能并延长生存期(Lutz CM,et al.J Clin Invest.2011；121(8):3029-3041.Gogliotti RG,et al.Hum Mol Genet.2013；22(20):4084-4101.31-32)。目前RG3039的I期临床试验已经结束，结果显示该药安全且耐受性良好，但II期临床试验现已中止，制药公司未公布具体原因。同样，小分子R006885247和LMl070 也可提升SMN2基因的表达，目前已分别开展了I期、II期临床试验(杨兰，等.中华儿科杂志.2016；54 (8)：634-637.)。小分子RO7034067(RG7916)也是一种SMN2基因表达的激活剂，目前已在荷兰和日本完成临床安全性评价试验，正准备在美国开展临床安全性评价(https://www.clinicaltrials.gov)。改良后的二代HTS技术筛选出的一些SMN2基因剪接调节剂SMN-C1、SMN-C2、SMN-C3可以促进全长SMN2 基因的表达，因该类化合物可以经口服后通过血脑屏障，并且在临床前研究中作用显著而成为新的研究热点。Naryshkin等研究发现轻型SMA和重型Δ7SMA小鼠在连续10d口服SMN-C2、SMN-C3后，小鼠脑和股四头肌内SMN蛋白水平均明显提升，重型Δ7SMA小鼠的体重增长可接近正常鼠，其生存期较未处理组明显延长(Naryshkin NA,et al.Science.2014；345(6197):688-693.)。但目前SMN-C1、SMN-C2、SMN-C3尚处于临床前研究阶段。2.不依赖SMN的治疗：在脊髓前角运动神经元发生不可逆的变性损伤之前，采取一些神经肌肉保护措施对SMA患儿运动功能的维持也非常重要。干细胞治疗、神经细胞保护因子、肌肉增强类药物等不依赖于提升SMN蛋白表达的治疗方法通过不同途径保护运动神经元及其神经通路的功能，对前述提升SMN蛋白的治疗措施有一定辅助作用。
干细胞治疗是将诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)分化成运动神经元后，移植到脊髓中，替代已变性退化的运动神经元，从而恢复神经肌肉***的功能，已有临床研究表明该方法可以改善SMAl型患儿的运动功能(Zanetta C,et al.JCell Mol Med.2014；18(2):187-196.Villanova M,et al.Am J Phys Med Rehabil.2015；94(5)：410-415.34-35)，被认为是一种有潜力的治疗策略。神经保护因子类药物利鲁唑、奥利索西(Olesoxime)均是用于肌萎缩侧索硬化症治疗的药物，在SMA临床试验的结果显示利鲁唑可以延长SMA1型患儿存活时间，但对运动功能的改善作用不明显(Russman BS，etal.Arch Neurol. 2003；60(11):1601-1603)，奥利索西则可以较好地维持SMA2型和3型患儿已具备的运动功能，所以美国和欧盟已同意将奥利索西用于SMA的辅助治疗。另一种用于多发性硬化症治疗的药物4-氨基吡啶(4-AP， Ampyra)可以阻滞钾离子通道从而维持运动神经元的兴奋性，进而增加肌肉收缩(Bordet T，et al.J Pharmacol Exp Ther.2007；322(2):709-720.)，FDA已批准该药在SMA3型患儿中开展Ⅲ期临床试验，用于评估4-AP 的临床效果。此外，近年来用于心脏衰竭介导骨骼肌肌病研究的骨骼肌钙蛋白活化剂CK-2127107(Hwee DT， et al.J Pharmacol Exp Ther.2015；353(1):159-168.)，因其具有提高骨骼肌肌力，改善SMA患儿肌肉萎缩、无力而用于SMA治疗的研究，目前CK-2127107已进人SMA II期临床试验。自1995年SMA的致病基因被定位以来，该病的发病机制一直是科学家们探索的热点。虽然目前仍缺乏有效的治疗方法，但基于提高SMN蛋白表达的治疗研究所取得的***成果为SMA的治疗带来了希望。其中基因治疗 scAAV9-SMN的优点是可以通过单次大剂量给药满足治疗需要，避免了多次注射，动物实验也显示该方法效果显著、安全性好，但临床试验中不小的病毒使用剂量(最高达2×1014vg/kg)可能带来的安全性问题，仍然值得进一步关注。而且如何生产出大量的病毒载体以满足国际上SMA患儿的治疗需要也是一个亟待解决的难题。SPINRZA可以特异性地作用于SMN2基因，所以副作用少，效果也很明显，但不能有效通过血脑屏障，需要重复鞘内注射，患儿依从性降低。小分子化合物类的优点是给药方便，口服给药后通过血脑屏障作用于中枢神经***，缺点是种类繁多的小分子化合物并非特异性作用于SMN基因，所以无法确定对其他基因的不良反应。此外，动物实验和临床试验均提示SMA的治疗存在一个相对较窄的时间窗，如何确定最佳给药时间也是一关键问题。因此，有必要研制新的SMA治疗药物，为广大SMA患者提供新的选择。
在本发明中我们采用基因治疗的策略，针对SMA基因药物可能存在的局限性，设计一系列新的SMA 基因治疗候选药物。首先我们设计了新的SMN1基因表达框结构，自主设计了多个序列短小、表达水平高的启动子元件，对SMN1基因编码区序列进行了序列优化，从而提高SMN1基因转导入体内后的表达水平。其次我们还尝试在SMN1基因表达框的3’UTR(3’-untranslated region)加入人miR-122靶序列，利用正常肝脏中高表达miR-122的特点(Jopling C.RNA Biol.2012；9(2):137-142.)，根据miRNA抑制基因表达的原理(KimVN.Nat Rev Mol Cell Biol.2005；6(5):376-385.)，以减少给药后SMN1在肝脏中的表达水平，降低SMN蛋白在肝脏中过表达可能带来的安全性风险。然后我们还提供了一种自主设计的双链AAV载体结构，其主要特征是对AAV载体中一个或两个反向末端重复序列(invertedrepeat terminal，ITR)进行了缺失突变，有助于提高AAV载体的体内转导效率，提升SMN1基因导入体内的表达水平(专利申请号： CN201510931560.3.Zhou Q，et al.Sci Rep.2017；7(1):5432.)。再次我们还提供了除AAV9外的其他血清型AAV药物设计，具体为AAV5和AAVrh10，两种AAV均可有效地将其携带的SMN1表达框递送至神经***。最后，我们还比较了不同给药方式(如静脉注射给药、髓鞘内注射给药和脑室内给药等方式)对设计药物安全性和有效性的影响。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)因在腺病毒制品中发现而得名(Atchison RW,et al. Science.1965；149:754-756.Hoggan MD,et al.Proc Natl SciUSA.1966；55:1467-1474.)。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA(Rose JA,et al.Proc Natl Acad Sci USA.1969； 64:863-869.)，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人***瘤病毒(Geoffroy MC,et al.Curr Gene Ther.2005；5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(Chiorini JA,et al.Curr Top Microbiol Immunol.1996；218:25-33.)，而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)(Atchison RW,etal.Science.1965；149: 754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”(inverted terminal repeat,ITR)，呈回文-发卡结构(Lusby E,et al.JVirol.1980；34:402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框 (ORF)，分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ,et al.Proc Natl AcadSci USA.1982；79:2077-2081.Laughlin CA,et al.Gene.1983；23:65-73.)。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X,et al.J Virol.1997；71(2):941-948.)。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site， RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM,et al.Proc Natl Acad SciUSA.1996；93(15):7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H,et al.J Virol.1989；63(7):3034-3039.)。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区(Srivastava A,et al.J Virol.1983； 45(2):555-564.)。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs(terminal resolution site)和GAGY重复基序(repeatmotif)特异性结合(Hüser D,et al.PLoS Pathog.2010；6(7): e1000985.)，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep 结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。 VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV 载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs(terminal resolution site)序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率(Wang Z,et al. GeneTher.2003；10(26):2105-2111.McCarty DM,et al.Gene Ther.2003；10(26):2112-2118.)。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的 ssAAV(single-stranded AAV)，即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z,et al.Mol Ther. 2006；14(3):316-327.)。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能(Samaranch L,et al.Hum Gene Ther.2012；23(4):382-389.)。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM,et al.Hum GeneTher Methods.2015； 26(2):71-76.)，容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装***，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装***主要包括三质粒共转染***、腺病毒为辅助病毒***、单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus type 1，HSV1) 为辅助病毒的包装***以及基于杆状病毒的包装***。其中，三质粒转染包装***因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装***，也是目前国际上主流的生产***。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染***在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装***(Yuan Z,et al.Hum Gene Ther,2011,22(5):613-624.)，该***生产效率高，但包装***中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装***是另一类应用较为广泛的AAV载体包装***。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以 HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略(伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44(5)：506-509。Conway JE,et al.Gene Ther,1999,6:986-993.)。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略 (Wustner JT,et al.Mol Ther,2002,6(4):510-518.)。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV 的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat，ITR)/外源基因表达框，然后两个重组 HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒(Booth MJ,et al.Gene Ther,2004,11:829-837.)。Thomas 等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞***(Thomas DL,et al.Gene Ther,2009,20:861-870.)，使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装***。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产***中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒(Chen H.Mol Ther.2008；16(5):924-930.Galibert L,et al.J Invertebr Pathol,2011,107Suppl:S80-93.)以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略(Mietzsch M,et al.Hum Gene Ther.2014；25:212-222.Mietzsch M,et al. Hum Gene Ther.2015；26(10):688-697.)。每种包装***都各具特点，可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年11月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有204项 (http://www.abedia.com/wiley/vectors.php)。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物 Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物(
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S. Mol Ther.2012；20(10):1831-1832.)；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑蒙症(RPE65基因突变引起)基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物 (https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm)。血友病B(Kay MA,et al. Nat Genet.2000；24(3):257-261.)的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。
本发明中，我们选择AAV载体来携带SMN1基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因(Salgenik M,et al.Microbiol Spectr.2015；3(4).)，免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达(ChenZY,et al.Mol Ther.2001；3(3):403-410.)，避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射、鞘内注射和脑室内注射都高效地转导中枢神经***(Foust KD，et al.Nat Biotechnol.2009；27:59-65.Yang B，et al.Mol Ther.2014；22(7): 1299-1309.Evers M,et al.Journal of Neurology Neurosurgery&Psychiatry.2016；87(Suppl 1):A91.2-A91.Gray SJ,et al.Gene Ther.2013；20:450-459.Gholizadeh S,et al.Hum Gene Ther Methods.2013；1:1-9.)，保证SMN1 基因表达框能够在体内中枢神经***中高效地表达SMN蛋白，补偿SMN蛋白，回复机体的生理功能。
为了降低静脉给药过程中SMN蛋白在肝脏中的过表达可能带来的安全性风险，我们利用正常肝脏特异性高表达miR-122的特点(Jopling C.RNA Biol.2012；9(2):137-142.)，在SMN1基因表达框的3’ UTR区克隆入人miR-122靶序列。借用miRNA抑制基因表达的原理(Kim VN.Nat Rev Mol Cell Biol.2005；6(5):376-385.)，肝细胞内的miR-122分子会抑制SMN蛋白的表达，显著降低SMN蛋白在肝脏中的表达。
miRNAs(microRNAs)是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸(nucleotide，nt) 的单链非编码RNA(Bartel DP.Cell.2004；116:281-297.Kim VN.NatRev Mol Cell Biol.2005；6:376-385.)。 1993年miRNA首先在秀丽线虫(C.elegans)中发现(Lee RC,et al.Cell.1993；75:843-854.Wightman B,et al. Cell.1993；75:855-862.)。C.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小RNA分子，表明自身编码小RNA分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小 RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现(Lagos-Quintana M,etal.Science.2001；294:853-858.Lau NC,et al.Science.2001；294:858-862.Lee RC,etal.Science.2001；294:862-864.)，miRNA开始成为该类小RNA的统称。miRNA调节人类大约60％基因的表达(Lewis BP,et al.Cell.2005；120:15-20.Friedman RC,et al. GenomeRes.2009；19:92-105.)，在多种生理和病理过程中发挥重要作用(Careton M,et al.CellCycle.2007；6: 2127-2132.Ambros V.Cell.2003；113:673-676.Schichel R,etal.Oncogene.2008；27:5959-5974.)。
miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中(Olena AF,et al.JCell Physiol.2010；222: 540-545.Kim VN,et al.Trends Genet.2006；22:165-173.)。在细胞内，miRNA的产生过程如下述(Winter J,et al.Nat Cell Biol.2009；11:228-234.)。首先在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA；pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶III Drosha 和DGCR8分子组成的加工复合体作用pri-microRNA，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体 miRNA分子pre-microRNA(Lee Y,et al.Nature.2003；425:415-419.Denli AM,etal.Nature.2004；432: 231-235.Gregory RI,et al.Nature.2004；432:235-240.Han J,etal.Genes Dev.2004；18:3016-3027.Landthaler M,et al.Curr Biol.2004；14:2162-2167.)。然后在转运蛋白Exportin-5的协助下，pre-microRNA从细胞核进入细胞质中(LundE,et al.Science.2003；303:95-98.Yi R,et al.Genes Dev.2003；17:3011-3016.Bohnsack MT,et al.RNA.2004；10:185-191.)，经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链RNA分子 (Jiang F,et al.Genes Dev.2005；19:1674-1679.Saito K,et al.PLoS Biol.2005；3:e235.)。最后，双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencingcomplex，RISC)。RISC识别mRNA中靶序列，通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平，在转录后水平调节基因的表达(Storz G,et al.CurrOpin Microbiol.2004；7:140-144.Fabian MR,et al.Annu Rev Biochem.2010；79:351-379.Valencia-Sanchez MA,et al.Genes Dev.2006；20:515-524.)。因此利用细胞内高表达的miRNA，在外源基因的3’ UTR(untranslated region)***该miRNA的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。
根据以上设计思路，我们制备得到多种携带SMN1基因表达框的重组AAV病毒，并设计制备得到携带萤火虫荧光素酶基因(Fluc)编码框的rAAV-Fluc对照病毒。将这些病毒分别等剂量经静脉、鞘内或脑室内等注射方式注射至SMA小鼠模型体内，评价设计携带SMN1基因表达框的重组AAV病毒的有效性。结果显示，相比rAAV-Fluc对照病毒，携带SMN1基因表达框的重组AAV病毒经静脉、鞘内或脑室内等注射方式注射后都能够高效地转导中枢神经***，在神经元中表达产生SMN蛋白，恢复神经元的生理功能，显著延长小鼠模型的生存期。相比于，前述已有的基于AAV载体的SMA基因治疗策略，特别是已经处于临床试验阶段的AVXS-101，在本发明中我们独特的SMN1表达框设计，提高了SMN1表达框在体内的表达水平，降低了病毒的使用剂量。结合我们以前发明的突变ITR结构，我们将设计的SMN1基因表达框***含有突变ITR结构的AAV载体，进一步提高了制备病毒转导体内后的表达效率。在本发明中，除AAV9外，我们还评价了AAV5和AAVrh10用于SMA基因治疗的可能性，结果表明AAV5和AAVrh10 同AAV9一样，经静脉、鞘内或脑室内等注射方式注射体内后均能高效地转导中枢神经***，表达产生 SMN蛋白，表现出同AAV9一致的应用前景。虽然AAV5的转导效率略低于AAV9和AAVrh10，但通过加大给药剂量仍能达到同AAV9和AAVrh10等同的转导效率。而且在本发明中，我们还探索多种可能的给药方式，鞘内和脑室内等注射方式能够在较低的给药剂量下实现神经元的高效转导，表达产生SMN蛋白，有效缓解SMN1基因突变主要导致的神经***损伤作用，为SMA基因治疗提供新的给药方式选择。静脉注射AAV病毒载体会导致肝脏中外源基因高效表达，可能带来安全性风险。我们还设计了含有人 miR-122靶序列的SMN1表达框，制备得到含有该表达框的重组AAV载体，静脉注射后肝脏中SMN蛋白表达水平明显下降，而神经***中SMN蛋白表达水平则未受影响，为降低肝脏中SMN蛋白过表达可能带来的安全性风险提供了新的选择。
总之，在本发明中我们设计制备了多种含有SMN1表达框的重组AAV载体，体内评价结果表明这些结构设计可在比文献报道更低的剂量下达到理想的治疗作用。我们还评价了不同给药方式对治疗效果的影响，发现在动物模型中鞘内、脑室内和静脉等注射方式均能达到较好的治疗效果。我们还通过引入人 miR-122靶序列来增强设计药物在静脉注射时的安全性。我们还得到了AAV5和AAVrh10等两种新的可用于SMA基因治疗的AAV载体血清型。这些都为SMA的基因治疗提供了新的选择。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一系列携带人为设计SMN1基因表达框的重组AAV病毒载体并将其应用于SMA治疗。人为设计的SMN1基因表达框使其进入体内后高效地表达产生SMN1蛋白，降低达到SMA 治疗有效性的AAV病毒需要剂量。通过对重组AAV病毒载体血清型的选择、主要顺式作用元件反向末端重复序列的突变改造，选择合适的AAV病毒载体，实现了人为设计SMN1基因表达框高效地转运至目标器官和组织。将含有人为设计SMN1基因表达框的重组AAV病毒载体转导SMA模型小鼠，能够显著地延长SMA小鼠生存期，增加其体重，显示出巨大的SMA治疗药物开发潜力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了人为设计的SMN1基因表达框，其特征在于，该表达框包含人为设计的启动子、密码子优化的SMN1编码区序列、人miR-122靶序列等序列元件及其相关的组合形式。具体地，在实施例1和实施例 3中，人为设计了5种启动子，用萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因评价了5种启动子在体内外的转导效率差异，根据体内外实验结果筛选得到2种可用于SMN1基因表达设计的启动子。在实施例4中，比较了 SMN1编码区序列密码子优化对SMN1表达框作用于SMA模型动物的有效性影响，发现优化的SMN1编码区序列体现出更好的有效性。实施例4中，还评价了SMN1基因表达框中引入人miR-122靶序列对其作用效果的影响，结果发现表达框中***人miR-122靶序列可显著降低SMN1蛋白在肝脏中表达，降低SMN1 过表达可能带来的肝毒性。
本发明提供携带人为设计SMN1基因表达框的重组AAV病毒，其特征在于，对重组AAV病毒中反向末端重复序列进行删除B-B’序列、C-C’序列和D序列等突变，使制备得到重组AAV病毒转导体内后具有更高的转导效率和更迅速地表达SMN1蛋白。具体地，在实施例1中，我们构建了多种含有突变反向末端重复序列的AAV质粒载体。实施例3中，我们比较了实施例1中构建AAV病毒的体内表达水平并评价了突变体是否有助于提高含有SMN1基因表达框AAV病毒对SMA模型小鼠的治疗作用。结果发现，删除AAV病毒反向末端重复序列中的B-B’序列、C-C’序列和D序列有助于提高包装制备得到重组AAV病毒的体内转导效率，增强设计SMA基因药物的有效性。
本发明提供的携带人为设计SMN1基因表达框的重组AAV病毒，其特征还在于，重组AAV病毒包括多种血清型，如AAV5、AAV9和AAVrh10等，不同血清型的AAV病毒均可穿透血脑屏障，将SMN1 基因表达框运送至神经元中，表达产生SMN1蛋白，从而达到治疗SMA疾病的作用。具体地，在实施例 6中比较不同血清型AAV病毒载体携带SMN1基因表达框对于SMA模型小鼠的有效性影响，结果发现虽然不同的血清型之间存在差异，但都能够延长模型的生存期，增加模型体重，显示出治疗SMA疾病的潜力。
本发明提供的SMA基因治疗药物，其特征在于，该药物为携带人为设计SMN1框的重组AAV病毒。该病毒一次给药就能够长期持续地在SMA模型小鼠体内表达产生人SMN1蛋白，恢复模型小鼠的生理功能，延长生存期。
本发明提供的SMA基因治疗药物，其特征还在于，该药物的给药方式可能是静脉注射、鞘内注射或脑室内注射。不同的注射方式会影响药物的使用剂量，但都可以延长SMA模型动物的生存期。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示：
pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System(Agilent Technologies，美国)，由本公司购自 AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-RC质粒，来源于AAV Helper Free System(Agilent Technologies，美国)，由本公司购自 AgilentTechnologies公司并保存。pAAV-RC质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV2 外壳蛋白。
pAAV-R2C5质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies，美国) 中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV基因组(GenBank ID：NC_006152.1)中外壳蛋白编码序列Cap5 (基因组中第2207至4381位序列)替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C5质粒序列。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C5质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C5质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII 至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C5质粒。pAAV-R2C5质粒包含完整的AAV5的cap基因和AAV2的rep 基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV5病毒中提供病毒包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、 Rep52和Rep40)和AAV5外壳蛋白。
pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies，美国) 中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列(GenBankID：AY530579)替换pAAV-RC 质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9 质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9 质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV9病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV9外壳蛋白。
pAAV-R2C10质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System(AgilentTechnologies，美国) 中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAVrh10外壳蛋白编码序列(GenBank ID：AY243015.1)替换pAAV-RC 质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C10质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得 pAAV-R2C10质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C10质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2C10 质粒。pAAV-R2C10质粒包含完整的AAVrh10的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVrh10病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAVrh10 外壳蛋白。
pAAV-DJ质粒，包含完整的AAVDJ的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVDJ病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAVDJ外壳蛋白。由本公司购自美国Cell Biolabs公司并保存。
对照小鼠，C57BL/6J小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，用作动物实验的野生型对照。
GM03813细胞株，购自美国Coriell Cell Repository，来源于SMA I型患者的细胞株(Coovert DD， et al.Hum Mol Genet.1997；6:1205-1214.)。本发明中用作启动子筛选的体外实验用细胞株。
SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠，购自美国Jackson laboratory实验室，小鼠编号为005025，雌雄各 5只，用于繁殖得到SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠，用作设计SMA基因药物的动物评价模型。模型的繁殖过程和基因型鉴别参照Jackson laboratory实验室说明。SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠在实施例中称为“SMA模型小鼠”或“SMA小鼠”。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体 pAAV2neo(Dong X,et al.PLoS ONE.2010；5(10):e13479.)。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp 的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGHpolyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、 BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2pAAV2neo-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图3pAAV2neo-CAS-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAS promoter，人为设计合成的启动子，序列信息详见SEQID No.1。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图4pAAV2neo-CAT-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAT promoter，人为设计合成的启动子，序列信息详见SEQID No.2。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图5pAAV2neo-CAR-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAR promoter，人为设计合成的启动子，序列信息详见SEQID No.3。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图6pAAV2neo-CAP-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAP promoter，人为设计合成的启动子，序列信息详见SEQID No.4。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图7pAAV2neo-CA-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CA promoter，人巨细胞增强子和鸡beta-actin启动子拼接而成，序列信息详见SEQ ID No.5。 Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图8pscAAV-CA-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ IDNo.6。CA promoter，人巨细胞病毒基因增强子和鸡beta-actin启动子拼接而成，序列信息详见SEQ ID No.5。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图9pscAAV-CAR-Fluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ IDNo.6。CAR promoter，人为设计的启动子，序列信息详见SEQ ID No.3。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图10pscAAV-U-CAR-Fluc载体结构示意图。U-ITR，删除B-B’和C-C’序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ ID No.8。ΔU-ITR，删除D序列的U-ITR序列，序列信息详见SEQ ID No.10。CAR promoter，人为设计的启动子，序列信息详见SEQ ID No.3。Fluc，萤火虫荧光素酶基因编码序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图11pscAAV-CA-SMN1载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ IDNo.6。CA promoter，人巨细胞病毒基因增强子和鸡beta-actin启动子拼接而成，序列信息详见SEQ ID No.5。SMN1，人运动神经元存活基因1编码序列，序列信息详见SEQ ID No.12。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图12pscAAV-CA-coSMN1载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQID No.6。CA promoter，人巨细胞增强子和鸡beta-actin启动子拼接而成，序列信息详见SEQ ID No.5。coSMN1，人源表达优化的人运动神经元存活基因1编码序列，序列信息详见SEQ ID No.13。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图13pscAAV-CAR-SMN1载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ IDNo.6。CAR promoter，人为设计的启动子序列，序列信息详见SEQ ID No.3。SMN1，人运动神经元存活基因1编码序列，序列信息详见SEQ ID No.12。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。 Neo，新霉素抗性基因读框。
图14pscAAV-CAR-coSMN1载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQID No.6。CAR promoter，人为设计的启动子序列，序列信息详见SEQ ID No.3。coSMN1，人源表达优化的人运动神经元存活基因1 编码序列，序列信息详见SEQ ID No.13。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图15pscAAV-U-CAR-coSMN1载体结构示意图。U-ITR，删除B-B’和C-C’序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ ID No.8。ΔU-ITR，删除D序列的U-ITR序列，序列信息详见SEQ ID No.10。 CAR promoter，人为设计的启动子，序列信息详见SEQ ID No.3。coSMN1，人源表达优化的人运动神经元存活基因1编码序列，序列信息详见SEQ ID No.13。BGHpolyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图16pscAAV-CAR-SMN1-122T载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ ID No.6。CAR promoter，人为设计的启动子序列，序列信息详见SEQ ID No.3。SMN1，人运动神经元存活基因1编码序列，序列信息详见SEQ ID No.12。miR-122T，人miR-122完全互补的靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图17pscAAV-CAR-coSMN1-122T载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp 的反向末端重复序列。ΔITR，删除D序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ ID No.6。CAR promoter，人为设计的启动子序列，序列信息详见SEQ IDNo.3。coSMN1，人源表达优化的人运动神经元存活基因1 编码序列，序列信息详见SEQ IDNo.13。miR-122T，人miR-122完全互补的靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图18pscAAV-U-CAR-coSMN1-122T载体结构示意图。U-ITR，删除B-B’和C-C’序列的反向末端重复序列，序列信息详见SEQ ID No.8。ΔU-ITR，删除D序列的U-ITR序列，序列信息详见SEQ ID No.10。 CAR promoter，人为设计的启动子，序列信息详见SEQ ID No.3。coSMN1，人源表达优化的人运动神经元存活基因1编码序列，序列信息详见SEQ ID No.13。miR-122T，人miR-122完全互补的靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。
图19不同启动子在HEK293细胞中表达效率比较结果。以萤火虫荧光素酶Fluc为报告基因比较不同启动子的表达效率。包装制备得到携带不同启动子调控的Fluc表达框的AAVDJ病毒。以感染复数 (muhiplieity of infection，MOI)为1000的感染剂量感染HEK293细胞，每种病毒感染3个复孔。病毒感染细胞48h后，用Bright-Glo萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relative lightunit，RLU)表示。CA，转导rAAVDJ-CA-Fluc病毒细胞；CAS，转导 rAAVDJ-CAS-Fluc病毒细胞；CAR，转导rAAVDJ-CAR-Fluc病毒细胞；CAT，转导rAAVDJ-CAT-Fluc 病毒细胞；CAP，转导rAAVDJ-CAP-Fluc病毒细胞。
图20不同启动子在GM03813细胞中表达效率比较结果。以萤火虫荧光素酶Fluc为报告基因比较不同启动子的表达效率。包装制备得到携带不同启动子调控的Fluc表达框的AAVDJ病毒。以感染复数 (muhiplieity of infection，MOI)为1000的感染剂量感染GM03813细胞，每种病毒感染3个复孔。病毒感染细胞48h后，用Bright-Glo萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relativelight unit，RLU)表示。CA，转导rAAVDJ-CA-Fluc病毒细胞；CAS，转导 rAAVDJ-CAS-Fluc病毒细胞；CAR，转导rAAVDJ-CAR-Fluc病毒细胞；CAT，转导rAAVDJ-CAT-Fluc 病毒细胞；CAP，转导rAAVDJ-CAP-Fluc病毒细胞。
图21不同启动子在C57BL/6J小鼠肝脏内表达效率比较结果。以萤火虫荧光素酶Fluc为报告基因比较不同启动子的表达效率。包装制备得到携带不同启动子调控的Fluc表达框的AAV9病毒。以1×1012vg (viral genome)/只的剂量经尾静脉注射至C57BL/6J小鼠体内，每种病毒注射5只小鼠。注射病毒4周后，处死小鼠，分离肝脏，采用组织细胞总蛋白抽提试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)提取组织总蛋白，用蛋白质定量试剂盒(BCA法)(北京普利莱基因技术有限公司)测定提取总蛋白的蛋白浓度。根据测定浓度，将总蛋白稀释成0.5μg/μL，取20μL蛋白溶液，用Bright-Glo萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relative light unit，RLU)表示。CA，转导rAAV9-CA-Fluc病毒小鼠；CAS，转导rAAV9-CAS-Fluc病毒小鼠；CAR，转导rAAV9-CAR-Fluc病毒小鼠；CAT，转导rAAV9-CAT-Fluc病毒小鼠；CAP，转导rAAV9-CAP-Fluc病毒小鼠。
图22不同启动子在C57BL/6J小鼠脑内表达效率比较结果。以萤火虫荧光素酶Fluc为报告基因比较不同启动子的表达效率。包装制备得到携带不同启动子调控的Fluc表达框的AAV9病毒。以1×1012vg (viral genome)/只的剂量经尾静脉注射至C57BL/6J小鼠体内，每种病毒注射5只小鼠。注射病毒4周后，处死小鼠，分离脑部组织，采用组织细胞总蛋白抽提试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)提取组织总蛋白，用蛋白质定量试剂盒(BCA法)(北京普利莱基因技术有限公司)测定提取总蛋白的蛋白浓度。根据测定浓度，将总蛋白稀释成0.5μg/μL，取20μL蛋白溶液，用Bright-Glo萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relative light unit，RLU)表示。CA，转导rAAV9-CA-Fluc病毒小鼠；CAS，转导rAAV9-CAS-Fluc病毒小鼠；CAR，转导rAAV9-CAR-Fluc病毒小鼠；CAT，转导rAAV9-CAT-Fluc病毒小鼠；CAP，转导rAAV9-CAP-Fluc病毒小鼠。
图23注射携带SMN1或coSMN1基因表达框重组AAV病毒延长SMA模型小鼠生存期。6种不同的重组AAV病毒(AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、 scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射 SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，其中AAV9-CA-Fluc和AAV9-CAR-Fluc为对照病毒，每种病毒注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的生存期。 WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV9-CA-Fluc，注射AAV9-CA-Fluc病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-Fluc，注射AAV9-CAR-Fluc病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CA-SMN1，注射 scAAV9-CA-SMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CA-coSMN1，注射scAAV9-CA-coSMN1病毒的 SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-SMN1，注射scAAV9-CAR-SMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图24注射携带SMN1或coSMN1基因表达框重组AAV病毒的SMA模型小鼠体重变化情况。6 种不同的重组AAV病毒(AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、 scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射 SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，其中AAV9-CA-Fluc和AAV9-CAR-Fluc为对照病毒，每种病毒注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的体重变化情况。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV9-CA-Fluc，注射AAV9-CA-Fluc病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-Fluc，注射AAV9-CAR-Fluc病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CA-SMN1，注射 scAAV9-CA-SMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CA-coSMN1，注射scAAV9-CA-coSMN1病毒的 SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-SMN1，注射scAAV9-CAR-SMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图25SMN1或coSMN1基因表达框中加入miR-122靶序列对SMA模型小鼠生存期影响。4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T、scAAV9-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，其中scAAV9-CAR-SMN1-122T、scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMN1或coSMN1基因表达框中含有单个的完全碱基互补的人miR-122靶序列，每种病毒注射5只SMA 模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的生存期。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV9-CAR-SMN1，注射scAAV9-CAR-SMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-SMN1-122T，注射scAAV9-CAR-SMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T，注射 scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图26SMN1或coSMN1基因表达框中加入miR-122靶序列对SMA模型小鼠体重变化影响。4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T、 scAAV9-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，其中scAAV9-CAR-SMN1-122T、scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMN1或coSMN1基因表达框中含有单个的完全碱基互补的人miR-122靶序列，每种病毒注射5只SMA 模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的体重变化。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV9-CAR-SMN1，注射scAAV9-CAR-SMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-SMN1-122T，注射scAAV9-CAR-SMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T，注射 scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图27转导含有miR-122靶序列病毒后SMA小鼠体内coSMN1表达水平变化。 scAAV9-CAR-coSMN1和scAAV9-CAR-coSMN1-122T重组AAV病毒以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，其中scAAV9-CAR-coSMN1-122T 病毒的coSMN1基因表达框中含有单个的完全碱基互补的人miR-122靶序列，每种病毒注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒3个月后，分离心脏、肝脏、骨骼肌、肺、脾、肾和脑等组织。提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中coSMN1 RNA拷贝数和GAPDH RNA拷贝数，计算coSMN1 RNA拷贝数和GAPDH RNA拷贝数的比值，用于表示coSMN1基因的表达水平。KO，未注射病毒SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-对照小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的 SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T，注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图28不同形式ITR结构病毒对SMA模型小鼠生存期影响。4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1、 scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。其中scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒含有正常AAV2的ITR及缺失D序列的正常AAV2的ITR(ΔITR)；scAAV9-U-CAR-coSMN1、scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒含有删除B-B’和C-C’序列的AAV2 ITR(U-ITR)及同时缺失D序列、B-B’序列和C-C’序列的AAV2 ITR(ΔU-ITR)。注射病毒后，记录小鼠的生存期。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射 scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T，注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-U-CAR-SMN1-122T，注射 scAAV9-U-CAR-SMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-U-CAR-coSMN1-122T，注射 scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图29不同形式ITR结构病毒对SMA模型小鼠体重变化影响。4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1、 scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。其中scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒含有正常AAV2的ITR及缺失D序列的正常AAV2的ITR(ΔITR)；scAAV9-U-CAR-coSMN1、scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒含有删除B-B’和C-C’序列的AAV2 ITR(U-ITR)及同时缺失D序列、B-B’序列和C-C’序列的AAV2 ITR(ΔU-ITR)。注射病毒后，记录小鼠的体重变化。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射 scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T，注射 scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-U-CAR-SMN1-122T，注射scAAV9-U-CAR-SMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-U-CAR-coSMN1-122T，注射scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图30转导不同形式ITR结构病毒后SMA小鼠体内coSMN1表达水平变化。4种不同的重组AAV 病毒(scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1、scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。其中scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒含有正常AAV2的ITR及缺失D序列的正常AAV2的ITR(ΔITR)；scAAV9-U-CAR-coSMN1、scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒含有删除B-B’和C-C’序列的AAV2 ITR(U-ITR)及同时缺失D序列、B-B’序列和C-C’序列的AAV2 ITR(ΔU-ITR)。注射病毒3个月后，分离心脏、肝脏、骨骼肌、肺、脾、肾和脑等组织。提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中coSMN1 RNA拷贝数和GAPDH RNA拷贝数，计算coSMN1 RNA拷贝数和GAPDH RNA拷贝数的比值，用于表示coSMN1基因的表达水平。KO，未注射病毒SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-对照小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T，注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-U-CAR-SMN1-122T，注射scAAV9-U-CAR-SMN1-122T病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-U-CAR-coSMN1-122T，注射scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图31不同注射方式对SMA模型小鼠生存期影响。2种不同的重组AAV病毒 (scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T)经3种不同的注射方式注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒每种注射方式注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。其中，静脉注射方式(IV)的注射剂量为5×1013vg/kg(viral genome，vg)，鞘内注射方式(IT)的注射剂量为1×1013vg/kg(viral genome，vg)，脑室内注射方式(ICV)的注射剂量为1×1013vg/kg (viral genome，vg)。注射病毒后，记录小鼠的生存期。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1(IV)，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(IV)，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(IT)，经鞘内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(IT)，经鞘内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(ICV)，经脑室内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(ICV)，经脑室内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图32不同注射方式对SMA模型小鼠体重变化影响。2种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T)经3种不同的注射方式注射SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒每种注射方式注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。其中，静脉注射方式(IV)的注射剂量为5×1013vg/kg(viral genome，vg)，鞘内注射方式(IT)的注射剂量为1×1013vg/kg(viral genome，vg)，脑室内注射方式(ICV)的注射剂量为1×1013vg/kg (viral genome，vg)。注射病毒后，记录小鼠的体重。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1(IV)，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(IV)，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(IT)，经鞘内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(IT)，经鞘内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(ICV)，经脑室内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(ICV)，经脑室内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图33不同注射方式下SMA小鼠体内coSMN1表达水平比较结果。2种不同的重组AAV病毒 (scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T)经3种不同的注射方式注射SMA模型小鼠 (SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒每种注射方式注射5只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。其中，静脉注射方式(IV)的注射剂量为5×1013vg/kg(viralgenome，vg)，鞘内注射方式(IT)的注射剂量为1×1013vg/kg(viral genome，vg)，脑室内注射方式(ICV)的注射剂量为1×1013vg/kg (viral genome，vg)。注射病毒3个月后，分离心脏、肝脏、骨骼肌、肺、脾、肾和脑等组织。提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中coSMN1 RNA拷贝数和GAPDH RNA拷贝数，计算coSMN1 RNA拷贝数和GAPDH RNA拷贝数的比值，用于表示coSMN1基因的表达水平。KO，未注射病毒SMN2+/+,SMN Δ7+/+,smn-/-对照小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(IV)，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的 SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(IV)，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(IT)，经鞘内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA 模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(IT)，经鞘内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA 模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1(ICV)，经脑室内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1-122T(ICV)，经脑室内方式注射scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠。
图34不同AAV载体血清型经静脉注射后对SMA模型小鼠生存期影响。3种不同的重组AAV病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经静脉注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5 只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的生存期。WT，C57BL/6J 野生型对照小鼠；KO-AAV5-CAR-coSMN1，经静脉方式注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAVrh10-CAR-coSMN1，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图35不同AAV载体血清型经静脉注射后对SMA模型小鼠体重变化影响。3种不同的重组AAV 病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经静脉注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5 只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的体重。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV5-CAR-coSMN1，经静脉方式注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAVrh10-CAR-coSMN1，经静脉方式注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图36不同AAV载体血清型经鞘内注射后对SMA模型小鼠生存期影响。3种不同的重组AAV病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1)以1×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经鞘内注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5 只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的生存期。WT，C57BL/6J 野生型对照小鼠；KO-AAV5-CAR-coSMN1，经鞘内注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，经鞘内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAVrh10-CAR-coSMN1，经鞘内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图37不同AAV载体血清型经鞘内注射后对SMA模型小鼠体重变化影响。3种不同的重组AAV 病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1)以1×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经鞘内注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5 只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的体重。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV5-CAR-coSMN1，经鞘内注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠；KO-AAV9-CAR-coSMN1，经鞘内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAVrh10-CAR-coSMN1，经鞘内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图38不同AAV载体血清型经脑室内注射后对SMA模型小鼠生存期影响。3种不同的重组AAV 病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1)以1×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经脑室内注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5 只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的生存期。WT，C57BL/6J 野生型对照小鼠；KO-AAV5-CAR-coSMN1，经脑室内注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，经脑室内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAVrh10-CAR-coSMN1，经脑室内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
图39不同AAV载体血清型经脑室内注射后对SMA模型小鼠体重变化影响。3种不同的重组AAV 病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1)以1×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经脑室内注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5 只SMA模型小鼠，注射时SMA小鼠年龄为1日龄。注射病毒后，记录小鼠的体重。WT，C57BL/6J野生型对照小鼠；KO-AAV5-CAR-coSMN1，经脑室内注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAV9-CAR-coSMN1，经脑室内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠； KO-AAVrh10-CAR-coSMN1，经脑室内注射scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠。
具体实施方式
本发明公开了一系列携带人为设计SMN1基因表达框的重组腺相关病毒，包含病毒的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1质粒载体构建
(1)启动子设计合成
参考文献(Niwa H，et al.Gene.1991；108:193-200.)，以哺乳动物表达载体pCAGGS载体(GenBank: LT727518.1)中CAG启动子(由CMV增强子和鸡beta-actin启动子组成)为基础，考虑到序列长短，删除CAG启动子中鸡beta-actin启动子部分序列，得到截短的CAG启动子，命名为CA启动子。接下来，在CA启动子序列3’端引入人SMN1基因mRNA(GenBank:NM_001297715.1)的5’端非翻译区的部分序列，得到命名为CAS启动子。在CA启动子序列3’端引入人RNA聚合酶II 14.5kDa亚基基因(GenBank: Z23102.1)中第449位至532位的内含子序列，得到命名为CAT启动子。在CA启动子序列3’端引入人 TATA盒结合蛋白相关因子1基因(GenBank:NG_012771.2)中第62804位至62890位的内含子序列，得到命名为CAR启动子。在CA启动子序列3’端引入人磷酸甘油酸酯激酶基因mRNA(GenBank:M34017.1) 的5’端非翻译区的部分序列，得到命名为CAP启动子。将CAS启动子、CAT启动子、CAR启动子、CAP 启动子和CA启动子外送南京金斯瑞生物科技公司合成，序列信息为CAS启动子(SEQ ID No.1)，CAT启动子(SEQ ID No.2)，CAR启动子(SEQ ID No.3)，CAP启动子(SEQ ID No.4)，CA启动子(SEQ ID No.5)。为了后续克隆的方便，在序列合成时设计启动子的5’端引入XhoI(5’CTCGAG3’)酶切位点，3’端引入KpnI(5’GGTACC3’)酶切位点。合成启动子序列克隆入pUC57simple载体(南京金斯瑞生物科技公司)，分别命名为pUC57-CAS(含有CAS启动子)、pUC57-CAT(含有CAT启动子)、 pUC57-CAR(含有CAR启动子)、pUC57-CAP(含有CAP启动子)和pUC57-CA(含有CA启动子)。
(2)Fluc报告基因载体构建以公司保存的pAAV2neo(图1)为基础，将萤火虫荧光素酶基因Fluc***pAAV2neo载体的KpnI和BglII 酶切位点之间，得到pAAV2neo-Fluc载体(图2)。具体为，以pGL4.14[luc2/Hygro]载体(购自美国普洛麦格公司)为模板，设计两条引物(Fluc-F和Fluc-R)PCR扩增得到含有Fluc编码区的序列片段。KpnI 和BglII双酶切消化PCR扩增得到片段，回收备用。用KpnI和BglII双酶切消化pAAV2neo载体，线性化后，回收备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞(购自大连宝生物)，挑取菌落，提取质粒，酶切鉴定，得到pAAV2neo-Fluc载体。
Fluc-F 5’ataggtaccgccaccatggaagatgcc3’(SEQ ID No.16)
Fluc-R 5’attagatctttacacggcgatcttgcc3’(SEQ ID No.17)
XhoI和KpnI双酶切消化pAAV2neo-Fluc载体，产生7808bp和778bp两个片段，回收长度为7808bp的载体片段备用。XhoI和KpnI双酶切分别消化pUC57-CAS(含有CAS启动子)、pUC57-CAT(含有CAT 启动子)、pUC57-CAR(含有CAR启动子)、pUC57-CAP(含有CAP启动子)和pUC57-CA(含有CA 启动子)载体，产生大小约为600bp和2.7kb的两个片段，回收长度约600bp的启动子片段。将回收7808bp 载体片段和回收启动子片段分别连接后，转化E.coliJM109感受态细胞(购自大连宝生物)，挑取菌落，提取质粒，酶切鉴定，各自得到pAAV2neo-CAS-Fluc载体(图3)、pAAV2neo-CAT-Fluc载体(图4)、 pAAV2neo-CAR-Fluc载体(图5)、pAAV2neo-CAP-Fluc载体(图6)和pAAV2neo-CA-Fluc载体(图7)。
以AAV2基因组(GenBank No.AF043303)中的3’端ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列(Wang Z,et al.Gene Ther.2003；10:2105-2111.)，得到ΔITR序列(SEQ ID No.6)。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-2127bp之间序列(靠近BGH polyA的ITR和SwaI酶切位点之间序列)同ΔITR序列融合，得到融合序列ΔITR-BS(SEQ ID No.7)。在ΔITR-BS融合序列两端分别添加BamHI和SwaI酶切位点后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-ΔITR-BS。BamHI和SwaI分别双酶切消化pUC57-ΔITR-BS载体、pAAV2neo-CAR-Fluc载体、 pAAV2neo-CA-Fluc载体，回收ΔITR-BS片段、切去ITR序列的pAAV2neo-CAR-Fluc载体片段、切去ITR 序列的pAAV2neo-CA-Fluc载体片段。将回收ΔITR-BS片段分别同切去ITR序列的pAAV2neo-CAR-Fluc 载体片段或切去ITR序列的pAAV2neo-CA-Fluc载体片段连接，转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物，大连)，筛选、鉴定获得pscAAV-CA-Fluc载体(图8)和pscAAV-CAR-Fluc载体(图9)。
以AAV2基因组(GenBank No.AF043303)中的3’端ITR序列为基础，根据专利(专利申请号：CN201510931560.3.)和文献(Zhou Q，et al.Sci Rep.2017；7(1):5432.)删除ITR序列中的B-B’和C-C’序列得到U-ITR序列(SEQ ID No.8)。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-2127bp之间序列 (靠近BGH polyA的ITR和SwaI酶切位点之间序列)同U-ITR序列融合，得到融合序列U-ITR-BS(SEQ ID No.9)。在U-ITR-BS融合序列两端分别添加BamHI和SwaI酶切位点后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-U-ITR-BS。进一步删除U-ITR序列中的trs序列和D序列，得到ΔU-ITR序列(SEQ IDNo.10)。为了保持载体骨架序列的一致性和克隆的方便性，在ΔU-ITR序列的3’端引入序列“5’-gctagaacaacaa-3’”，得到ΔU-ITR-MX序列(SEQ ID No.11)。在ΔU-ITR-MX 序列两端分别添加XhoI和MfeI酶切位点后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57simple 载体，获得pUC57-ΔU-ITR-MX。
BamHI和SwaI分别双酶切消化pUC57-U-ITR-BS载体、pAAV2neo-CAR-Fluc载体，回收U-ITR-BS 片段、切去ITR序列的pAAV2neo-CAR-Fluc载体片段。将回收U-ITR-BS片段同切去ITR序列的 pAAV2neo-CAR-Fluc载体片段连接，转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物，大连)，筛选、鉴定获得 pscAAV-U-CAR-Fluc-pre载体。
MfeI和XhoI双酶切消化pUC57-ΔU-ITR-MX载体、pscAAV-U-CAR-Fluc-pre载体，回收ΔU-ITR-MX 片段、切去ITR序列的pscAAV-U-CAR-Fluc-pre载体片段。将回收ΔU-ITR-MX片段同切去ITR序列的 pscAAV-U-CAR-Fluc-pre载体片段连接，转化E.coli JM109感受态细胞(宝生物，大连)，筛选、鉴定获得pscAAV-U-CAR-Fluc载体(图10)。
(3)SMN1和coSMN1基因载体
搜索NCBI GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)，得到SMN1基因mRNA序列(GenBank: NM_000344.3)。从该mRNA序列中分析得到SMN1蛋白的编码区序列，并在编码序列的5’端添加“5’ -GCCACC-3’”序列，得到SMN1序列(SEQ ID No.12)。对SMN1蛋白编码区序列进行密码子优化，并在优化后序列的5’端添加“5’-GCCACC-3’”序列，得到coSMN1序列(SEQ ID No.13)。将SMN1 序列和coSMN1序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。为了后续克隆的方便，在序列合成时设计启动子的5’端引入KpnI(5’GGTACC3’)酶切位点，3’端引入BglII(5’AGATCT3’)酶切位点。合成启动子序列克隆入pUC57 simple载体(南京金斯瑞生物科技公司)，分别命名为pUC57-SMN1(含有 SMN1序列)和pUC57-coSMN1(含有coSMN1序列)。
KpnI和BglII双酶切消化pUC57-SMN1载体，产生两个长度大约为900bp和2.7kb片段，回收长度约为900bp的SMN1序列片段。KpnI和BglII双酶切分别消化pscAAV-CA-Fluc载体(图8)和 pscAAV-CAR-Fluc载体(图9)，各自产生长度约为6.7kb和1.7kb的两个片段，回收长度为6.7kb片段。将回收得到的SMN1序列片段分别同pscAAV2neo-CA-Fluc载体酶切消化回收或pscAAV2neo-CAR-Fluc 载体酶切消化回收的6.7kb片段连接，鉴定得到pscAAV-CA-SMN1载体(图11)和pscAAV-CAR-SMN1 载体(图13)。
KpnI和BglII双酶切消化pUC57-coSMN1载体，产生两个长度大约为900bp和2.7kb片段，回收长度约为900bp的coSMN1序列片段。KpnI和BglII双酶切分别消化pscAAV-CA-Fluc载体(图8)、 pscAAV-CAR-Fluc载体(图9)、pscAAV-U-CAR-Fluc载体(图10)，各自产生长度约为6.7kb和1.7kb 的两个片段，回收长度为6.7kb片段。将回收得到的SMN1序列片段分别同pscAAV2neo-CA-Fluc载体酶切消化回收或pscAAV2neo-CAR-Fluc载体酶切消化回收或pscAAV-U-CAR-Fluc载体酶切消化回收的6.7kb 片段连接，鉴定得到pscAAV-CA-coSMN1载体(图12)、pscAAV-CAR-coSMN1载体(图14)和 pscAAV-U-CAR-coSMN1载体(图15)。
(4)含有miR-122靶序列载体构建
在SMN1序列(SEQ ID No.12)的3’端添加单个的人miR-122完全互补的靶序列，得到SMN1-122T序列(SEQ ID No.14)。在coSMN1序列(SEQ ID No.13)3’端添加单个的人miR-122完全互补的靶序列，得到coSMN1-122T序列(SEQ ID No.15)。将SMN1-122T序列和coSMN1-122T序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。为了后续克隆的方便，在序列合成时设计启动子的5’端引入KpnI(5’GGTACC3’) 酶切位点，3’端引入BglII(5’AGATCT3’)酶切位点。合成启动子序列克隆入pUC57 simple载体(南京金斯瑞生物科技公司)，分别命名为pUC57-SMN1-122T(含有SMN1-122T序列)和pUC57-coSMN1-122T (含有coSMN1-122T序列)。
KpnI和BglII双酶切消化pUC57-SMN1-122T载体，产生两个长度大约为900bp和2.7kb片段，回收长度约为900bp的SMN1-122T序列片段。KpnI和BglII双酶切分别消化pscAAV-CAR-Fluc载体(图9)，各自产生长度约为6.7kb和1.7kb的两个片段，回收长度为6.7kb片段。将回收得到的SMN1-122T序列片段同pscAAV2neo-CAR-Fluc载体酶切消化回收的6.7kb片段连接，鉴定得到pscAAV-CAR-SMN1-122T载体(图16)。
KpnI和BglII双酶切消化pUC57-coSMN1-122T载体，产生两个长度大约为900bp和2.7kb片段，回收长度约为900bp的coSMN1-122T序列片段。KpnI和BglII双酶切分别消化pscAAV-CAR-Fluc载体(图 9)、pscAAV-U-CAR-Fluc载体(图10)，各自产生长度约为6.7kb和1.7kb的两个片段，回收长度为6.7kb 片段。将回收得到的coSMN1-122T序列片段分别同pscAAV2neo-CAR-Fluc载体酶切消化回收或 pscAAV-U-CAR-Fluc载体酶切消化回收的6.7kb片段连接，鉴定得到pscAAV-CAR-coSMN1-122T载体(图 17)和pscAAV-U-CAR-coSMN1-122T载体(图18)。
实施例2重组AAV病毒制备及检定
参照文献(Xiao X,et al.J Virol.1998；72(3):2224-2232.)，应用三质粒包装***包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒(pAAV2neo-CA-Fluc、 pAAV2neo-CAT-Fluc、pAAV2neo-CAP-Fluc、pAAV2neo-CAS-Fluc、pAAV2neo-CAR-Fluc、 pscAAV-CA-SMN1、pscAAV-CA-coSMN1、pscAAV-CAR-SMN1、pscAAV-CAR-coSMN1、 pscAAV-U-CAR-coSMN1、pscAAV-CAR-SMN1-122T、pscAAV-CAR-coSMN1-122T或 pscAAV-U-CAR-coSMN1-122T)、辅助质粒(pHelper)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-DJ、 pAAV-R2C5、pAAV-R2C9或pAAV-R2C10)按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293 细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到AAVDJ-CA-Fluc、AAVDJ-CAS-Fluc、AAVDJ-CAT-Fluc、AAVDJ-CAR-Fluc、AAVDJ-CAP-Fluc、 AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAS-Fluc、AAV9-CAT-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、AAV9-CAP-Fluc、 scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-U-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T、scAAV9-CA-coSMN1-122T、 scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T、scAAV5-CAR-coSMN1和scAAVrh10-CAR-coSMN1等20种重组病毒。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下：
针对5种启动子(CA启动子、CAT启动子、CAS启动子、CAR启动子和CAP启动子)完全相同序列设计定量PCR检测用引物和探针：
CA-Q-F：5’-TGGGACTTTCCTACTTGGCA-3’(SEQ ID NO.18)
CA-Q-R：5’-GGAGAGTGAAGCAGAACGTG-3’(SEQ ID NO.19)
CA-Q-P：5’-ACCCATGGTCGAGGTGAGCCC-3’(SEQ ID NO.20)
CA-Q-F和CA-Q-R为引物，CA-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以CA-Q-F和CA-Q-R为引物特异性地扩增CA启动子和CAR 启动子相同序列中长度为89bp片段，采用TaqMan探针结合法，以108拷贝数每毫升的pAAV2neo-CA-Fluc 质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500fast，ABI)检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献(Aurnhammer C,et al.Hum Gene TherMethods.2012；23(1): 18-28.)。
实施例3启动子体内外评价实验
(1)体外评价实验
由于在体外AAVDJ载体对各种细胞都具有较高的转导活性(Grimm D,et al.JVirol.2008；82:5887-5911.)，因此我们将含有不同启动子调控的Fluc基因表达框(pAAV2neo-CA-Fluc、pAAV2neo-CAT-Fluc、 pAAV2neo-CAP-Fluc、pAAV2neo-CAS-Fluc、pAAV2neo-CAR-Fluc)包装成AAVDJ病毒。选择HEK293 细胞和GM03813细胞株用于设计启动子的体外评价。其中HEK293细胞来源于人胚胎肾细胞。GM03813 细胞株购自美国CoriellCell Repository，来源于SMA I型患者的成纤维细胞株(Coovert DD，et al.Hum MolGenet.1997；6:1205-1214.)。两种细胞分别评价设计启动子在SMA患者和非SMA患者来源细胞中的表达活性。
HEK293细胞接种96孔细胞培养板。制备得到AAVDJ-CA-Fluc、AAVDJ-CAS-Fluc、AAVDJ-CAT-Fluc、AAVDJ-CAR-Fluc、AAVDJ-CAP-Fluc病毒分别以感染复数(muhiplieity ofinfection， MOI)为1000的感染剂量感染HEK293细胞，每种病毒感染3个复孔。病毒感染细胞48h后，用Bright-Glo 萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relative light unit，RLU)表示，检测操作过程参见Bright-Glo萤光素酶检测***说明书。检测结果如图19所示。从图 19的结果可知，rAAVDJ-CAR-Fluc病毒转导HEK293细胞后Fluc的表达水平明显高于其余4种病毒 (AAVDJ-CA-Fluc、AAVDJ-CAS-Fluc、AAVDJ-CAT-Fluc和AAVDJ-CAP-Fluc)。其余4种病毒转导HEK293 细胞后Fluc的表达水平从高到低依次为AAVDJ-CA-Fluc>AAVDJ-CAP-Fluc>AAVDJ-CAT-Fluc>AAVDJ-CAS-Fluc。
接下来，我们将制备得到的AAVDJ-CA-Fluc、AAVDJ-CAS-Fluc、AAVDJ-CAT-Fluc、AAVDJ-CAR-Fluc、AAVDJ-CAP-Fluc病毒分别以感染复数(muhiplieity of infection，MOI)为1000的感染剂量感染SMA1患者来源的GM03813细胞，每种病毒感染3个复孔。病毒感染细胞48h后，用Bright-Glo 萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relative light unit，RLU)表示。检测结果如图20所示。从图20的结果可知，5种病毒转导GM03813细胞后的Fluc表达水平都低于各自转导HEK293细胞的表达水平。在5种病毒中，仍是rAAVDJ-CAR-Fluc病毒转导 GM03813细胞的Fluc表达水平最高，其余4种病毒从高到低的顺序依次为 AAVDJ-CAT-Fluc>AAVDJ-CAS-Fluc>AAVDJ-CA-Fluc>AAVDJ-CAP-Fluc，与其在HEK293细胞中的高低顺序不同。
总之，在HEK293细胞和GM03813细胞中都是CAR启动子的表达效率最高，提示该启动子可以作为一种SMA基因治疗药物设计的候选启动子。
(2)体内评价实验
在体外评价实验的基础上，我们进一步将5种启动子调控的Fluc基因表达框包装成AAV9病毒，得到 AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAS-Fluc、AAV9-CAT-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、AAV9-CAP-Fluc等5种病毒。病毒的制备过程如实施例2所述。病毒制备完成后，5种病毒分别以1×1012vg(viral genome)/只的剂量经尾静脉注射至C57BL/6J小鼠体(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)内，每种病毒注射5只小鼠。注射病毒4周后，处死小鼠，分离肝脏和脑组织，采用组织细胞总蛋白抽提试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)提取组织总蛋白，用蛋白质定量试剂盒(BCA法)(北京普利莱基因技术有限公司)测定提取总蛋白的蛋白浓度。根据测定浓度，将总蛋白稀释成0.5μg/μL，取20μL蛋白溶液，用Bright-Glo萤光素酶检测***(Promega，美国)检测细胞中Fluc表达水平，检测结果用相对光强度单位(relativelight unit， RLU)表示。检测操作过程如Bright-Glo萤光素酶检测***说明书所示。5种病毒在肝脏和脑组织中的Fluc 表达水平分别如图21(肝脏)和图22(脑)所示。从图21的结果可知，5种病毒转导小鼠肝脏后， rAAV9-CAR-Fluc病毒的Fluc表达水平最高，明显高于其余4种病毒。其余4种病毒在小鼠肝脏的Fluc 表达水平从高到低依次为AAV9-CAT-Fluc>AAV9-CA-Fluc>AAV9-CAS-Fluc>AAV9-CAP-Fluc。从图22 的结果可知，同肝脏中类似，在脑组织中仍然是rAAV9-CAR-Fluc病毒的Fluc表达水平最高，并且显著高于其他4种病毒。但其余4种病毒的表达水平高低顺序不同于其在肝脏中的表达水平高低顺序，4种病毒在脑组织中的Fluc表达水平高低顺序具体为AAV9-CA-Fluc>AAV9-CAT-Fluc>AAV9-CAS-Fluc> AAV9-CAP-Fluc。
体内评价实验结果再次表明，CAR启动子在小鼠肝脏和脑组织中表达水平明显高于其他4种启动子，可作为SMA基因药物设计的候选启动子。
综合体内外评价实验结果，CAR启动子在体内外评价实验中都表现出比其余4种启动子更高的表达活性，为SMA基因药物设计提供新的启动子选择。由于AVXS-101药物结构中启动子同CA启动子类似，因此在后续的SMA药物有效性评价实验中将CA启动子调控的SMN1基因表达框作为可用的阳性对照。
实施例4SMA基因药物的体内有效性评价实验
在SMA基因药物的设计过程中，我们主要考虑SMN1基因编码序列是否优化、基因表达框中是否添加人 miR-122靶序列、AAV载体反向末端重复序列(ITR)是否突变等3种因素对SMA基因药物的体内有效性和安全性的影响。选择SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠进行SMA基因药物的体内有效性评价。SMN2+/+, SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠由SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠交配繁殖而来。SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-种鼠购自美国Jackson laboratory实验室，小鼠编号为005025。模型的繁殖过程和基因型鉴别参照Jackson laboratory 实验室说明。
(一)SMN1基因编码序列优化对SMA基因药物有效性影响
首先我们评价了SMN1基因编码序列优化对SMA基因药物有效性的影响。制备得到了AAV9-CA-Fluc、 AAV9-CAR-Fluc、scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1和 scAAV9-CAR-coSMN1等6种病毒。其中AAV9-CA-Fluc和AAV9-CAR-Fluc为单链AAV病毒，分别为 CA启动子和CAR启动子调控的Fluc基因表达框，用作有效性评价的阴性对照。scAAV9-CA-SMN1、 scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1和scAAV9-CAR-coSMN1等4种病毒为双链AAV病毒，分别为CA启动子和CAR启动子调控的SMN1基因表达框或优化的coSMN1基因表达框，用于比较序列优化对SMA基因药物有效性的影响。
将6种不同的重组AAV病毒(AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1)以5×1013vg/kg(viralgenome，vg) 的剂量经尾静脉注射1日龄的SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，其中AAV9-CA-Fluc和 AAV9-CAR-Fluc为对照病毒，每种病毒注射5只SMA模型小鼠。注射病毒后，记录小鼠的生存期。结果如图23所示。从图23的结果可知，注射AAV9-CA-Fluc和AAV9-CAR-Fluc小鼠的生存期不超过15天，同文献报道(Le TT，et al.Hum Mol Genet.2005；14(6):845-857.)一致。而注射scAAV9-CA-SMN1、 scAAV9-CA-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠生存期均出现延长，且注射含有CAR启动子病毒(scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1)模型小鼠的生存期延长时间长于注射含有CA启动子病毒(scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1)模型小鼠，注射含有优化后的coSMN1基因病毒(scAAV9-CA-coSMN1或scAAV9-CAR-coSMN1)模型小鼠的生存期延长时间都长于各自的携带未优化的SMN1基因病毒(scAAV9-CA-SMN1或scAAV9-CAR-SMN1)。结果说明CAR 启动子元件和SMN1基因序列优化都有助于提高SMA基因治疗药物对SMA动物模型的治疗效果。此外，从图23的结果我们还可知，注射scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠生存期都短于野生型的C57BL/6J小鼠，但差异不大，表明基因药物可以显著延长SMA模型小鼠的生存期。
同时，我们在不同时间点记录了注射携带SMN1或coSMN1基因表达框重组AAV病毒(AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1)的SMA模型小鼠体重变化情况。在体重记录过程中，考虑到记录时间点时可能出现有的实验小鼠已经死亡，我们只记录存活小鼠的体重，因此图中展示的每个时间点的实验小鼠体重的平均值实为存活小鼠的体重平均值。结果如图24所示。从图24的结果可知，注射AAV9-CA-Fluc和 AAV9-CAR-Fluc小鼠的体重增加速度明显低于注射携带SMN1或coSMN1基因表达框重组AAV病毒 (AAV9-CA-Fluc、AAV9-CAR-Fluc、scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1、 scAAV9-CAR-coSMN1)的SMA模型小鼠以及野生型小鼠，而后死亡，无体重记录，说明SMA模型小鼠体内表达Fluc基因无法恢复其生理功能。而注射scAAV9-CA-SMN1、scAAV9-CA-coSMN1、 scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠的体重增加速度同野生型小鼠一致，且4种病毒之间未见明显差异，说明注射表达SMN1蛋白的病毒后，能够有效地恢复SMA模型小鼠的生长发育，体重增加。
(二)miR-122靶序列对SMA基因药物有效性的影响
接下来，我们比较了miR-122靶序列对SMA基因药物有效性的影响。制备得到了scAAV9-CAR-SMN1、 scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T和scAAV9-CAR-coSMN1-122T等4种病毒。其中 scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1分别携带CAR启动子调控的SMN1基因表达框和coSMN1 基因表达框，不含有人miR-122靶序列。scAAV9-CAR-SMN1-122T、scAAV9-CAR-coSMN1-122T分别携带CAR启动子调控的含有人miR-122靶序列的SMN1基因表达框和coSMN1基因表达框，且含有人 miR-122靶序列。
将4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T和scAAV9-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射1日龄的SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5只SMA模型小鼠。注射病毒后，记录小鼠的生存期。结果如图25所示。从图25的结果可知，注射scAAV9-CAR-SMN1-122T 和scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒SMA模型小鼠的生存期延长时间长于注射不含有人miR-122靶序列的scAAV9-CAR-SMN1和scAAV9-CAR-coSMN1病毒的SMA模型小鼠，说明人miR-122靶序列的加入有助于提高SMA基因治疗药物在SMA模型小鼠中的有效性。此外，从图25的结果我们还可知，注射 scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T和scAAV9-CAR-coSMN1-122T 病毒的SMA模型小鼠生存期都短于野生型的C57BL/6J小鼠，但差异不大，表明4种基因药物可以显著延长SMA模型小鼠的生存期。
同时，我们在不同时间点记录了注射4种SMA基因治疗药物(scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T和scAAV9-CAR-coSMN1-122T)的SMA模型小鼠体重变化情况。在体重记录过程中，考虑到记录时间点时可能出现有的实验小鼠已经死亡，我们只记录存活小鼠的体重，因此图中展示的每个时间点的实验小鼠体重的平均值实为存活小鼠的体重平均值。结果如图 26所示。从图26的结果可知，注射scAAV9-CAR-SMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-SMN1-122T 和scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠的体重增加速度同野生型小鼠一致，且4种病毒之间未见明显差异，说明注射表达SMN1蛋白的病毒后，能够有效地恢复SMA模型小鼠的生长发育，体重增加。
我们进一步检测了在coSMN1基因表达框中加入miR-122靶序列对coSMN1基因表达的影响。注射病毒3个月后，scAAV9-CAR-coSMN1和scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒注射组各处死1只小鼠，分离心脏、肝脏、骨骼肌、脾、肺、脑和肾等器官，提取各种器官的总RNA，定量PCR测定总RNA中的 coSMN1 RNA拷贝数以及小鼠GAPDH RNA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶RNA)拷贝数，拷贝数用Ct值表示，计算coSMN1 RNA的Ct值和小鼠GAPDH RNA的Ct值的差值，用于2的Ct值差值的幂表示coSMN1 RNA 的相对表达水平。检测时，以未注射病毒的SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-)为对照。在本发明中没有检测SMN1基因表达变化，主要的考虑是SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-)含有人的 smn2基因(Monani UR，et al.Hum MolGenet.2000；9(3):333-339.)和缺失外显子7的人smn1基因(Le TT， et al.Hum MolGenet.2005；14(6):845-857.)，能够表达产生人的SMN1 mRNA和SMN2 mRNA，同携带 SMN1基因表达框病毒转导体内表达产生的SMN1 mRNA序列完全相同，定量PCR检测方法无法有效区分。故发明中未对病毒转导前后的SMN1基因表达水平进行检测。
定量PCR方法测定总RNA中SMN1 RNA或coSMN1 RNA和小鼠GAPDH RNA的Ct值。具体过程如下：
针对coSMN1 RNA序列设计定量PCR检测用引物和探针：
coSMN1-Q-F：5’-CACCACCTCCAATCTGTCCT-3’(SEQ ID NO.21)
coSMN1-Q-R：5’-TAGTAGCCGGTGTGATAGCC-3’(SEQ ID NO.22)
coSMN1-Q-P：5’-ACGATGCCGATGCCCTGGGC-3’(SEQ ID NO.23)。
针对小鼠GAPDH RNA序列设计定量PCR检测用引物和探针：
GAPDH-Q-F：5’-AACGGATTTGGCCGTATTGG-3’(SEQ ID NO.24)
GAPDH-Q-R：5’-AATCTCCACTTTGCCACTGC-3’(SEQ ID NO.25)
GAPDH-Q-P：5’-CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3’(SEQ ID NO.26)
coSMN1-Q-F/coSMN1-Q-R和GAPDH-Q-F/GAPDH-Q-R为引物，coSMN1-Q-P和GAPDH-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以coSMN1-Q-F和coSMN1-Q-R为引物特异性地扩增SMN1序列中长度为97bp片段，以GAPDH-Q-F 和GAPDH-Q-R为引物特异性地扩增GAPDH序列中长度为66bp片段，采用一步反应TaqMan探针结合法测定检测样品中的SMN1 RNA、coSMN1 RNA和GAPDH RNA的扩增Ct值(表示拷贝数)，应用One Step PrimerScript RT-PCR Kit(PerfectReal Time)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号： ABI 7500fast，ABI)检测。操作过程参见One Step PrimerScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂说明书。
定量PCR检测结果如附图27所示。从图27的结果可知，相比于未注射病毒SMA模型小鼠(SMN2+/+, SMNΔ7+/+,smn-/-)，注射scAAV9-CAR-coSMN1和scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒组小鼠，在心肌、骨骼肌、脾、肾、脑和肺等器官中coSMN1表达水平升高，说明2种病毒经静脉注射后能够有效地转导全身组织器官表达产生coSMN1 RNA分子。进一步，静脉给药***注射时，AAV载体对肝脏转导效率高。我们的实验结果表明在coSMN1基因表达框的3’UTR加入肝脏中高表达的miR-122的靶序列可有效地抑制coSMN1基因的表达(图27)，降低了肝脏中过表达SMN1蛋白可能带来的副作用，增加基因药物的有效性。图27的结果还显示在SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-)中未检测到coSMN1基因的表达，这是因为coSMN1基因为密码子优化后的人的SMN1基因编码序列，其DNA序列已不同于SMA 模型小鼠表达产生的人SMN1 RNA序列，故针对病毒携带的人优化后的coSMN1基因的定量PCR检测用探针和引物无法识别并结合SMA模型小鼠表达产生的人SMN1 RNA序列，没有检测信号，也说明本发明中采用的定量PCR探针和引物可特异性地识别并结合人SMN1 RNA序列优化后的coSMN1序列，检测结果可靠性高。
(三)AAV载体反向末端重复序列(ITR)突变对SMA基因药物有效性的影响最后，我们比较了AAV载体反向末端重复序列(ITR)突变对SMA基因药物有效性的影响。制备得到了scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1和 scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T等4种病毒。其中scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T分别携带CAR启动子调控的coSMN1基因表达框和含有miR-122靶序列的coSMN1基因表达框，且AAV 病毒中ITR序列分别为正常的ITR序列和缺失D序列的ΔITR序列。而scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T分别携带CAR启动子调控的coSMN1基因表达框和含有miR-122靶序列的 coSMN1基因表达框，但AAV病毒ITR序列分别为缺失B-B’序列以及C-C’序列的U-ITR序列和缺失 B-B’序列、C-C’序列以及D序列的ΔU-ITR序列。
将4种不同的重组AAV病毒(scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)以5×1013vg/kg(viral genome，vg)的剂量经尾静脉注射1日龄的SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)，每种病毒注射5只SMA模型小鼠。注射病毒后，记录小鼠的生存期。结果如图28所示。从图28的结果可知，注射 scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒SMA模型小鼠的生存期延长时间长于注射scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠，说明删除AAV病毒ITR 序列中B-B’序列以及C-C’序列得到的U-ITR序列有助于提高SMA基因治疗药物在SMA模型小鼠中的有效性。此外，从图28的结果我们还可知，注射scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、 scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠生存期都短于野生型的 C57BL/6J小鼠，但差异不大，表明4种基因药物可以显著延长SMA模型小鼠的生存期。
同时，我们在不同时间点记录了注射4种SMA基因治疗药物(scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)的SMA模型小鼠体重变化情况。在体重记录过程中，考虑到记录时间点时可能出现有的实验小鼠已经死亡，我们只记录存活小鼠的体重，因此图中展示的每个时间点的实验小鼠体重的平均值实为存活小鼠的体重平均值。结果如图29所示。从图29的结果可知，注射scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、 scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒的SMA模型小鼠的体重增加速度同野生型小鼠一致，且4种病毒之间未见明显差异，说明注射表达SMN1蛋白的病毒后，能够有效地恢复SMA 模型小鼠的生长发育，体重增加。
我们进一步检测了注射4种SMA基因治疗药物(scAAV9-CAR-coSMN1、 scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)后，SMA模型小鼠不同组织的coSMN1基因表达情况。注射病毒3个月后，每组各处死1只小鼠，分离心脏、肝脏、骨骼肌、脾、肺、脑和肾等器官，提取各种器官的总RNA，定量PCR测定总RNA中的coSMN1 RNA拷贝数以及小鼠GAPDH RNA拷贝数，拷贝数用Ct值表示，计算coSMN1 RNA的Ct值和小鼠GAPDHRNA 的Ct值的差值，用于2的Ct值差值的幂表示coSMN1 RNA的相对表达水平。检测时，以未注射病毒的 SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-)为对照。
定量PCR方法测定总RNA中coSMN1 RNA和小鼠GAPDH RNA的Ct值。具体过程如下：
针对coSMN1 RNA序列设计定量PCR检测用引物和探针：
coSMN1-Q-F：5’-CACCACCTCCAATCTGTCCT-3’(SEQ ID NO.21)
coSMN1-Q-R：5’-TAGTAGCCGGTGTGATAGCC-3’(SEQ ID NO.22)
coSMN1-Q-P：5’-ACGATGCCGATGCCCTGGGC-3’(SEQ ID NO.23)。
针对小鼠GAPDH RNA序列设计定量PCR检测用引物和探针：
GAPDH-Q-F：5’-AACGGATTTGGCCGTATTGG-3’(SEQ ID NO.24)
GAPDH-Q-R：5’-AATCTCCACTTTGCCACTGC-3’(SEQ ID NO.25)
GAPDH-Q-P：5’-CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-3’(SEQ ID NO.26)
coSMN1-Q-F/coSMN1-Q-R和GAPDH-Q-F/GAPDH-Q-R为引物，coSMN1-Q-P和GAPDH-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以coSMN1-Q-F和coSMN1-Q-R为引物特异性地扩增SMN1序列中长度为97bp片段，以GAPDH-Q-F 和GAPDH-Q-R为引物特异性地扩增GAPDH序列中长度为66bp片段，采用一步反应TaqMan探针结合法测定检测样品中的SMN1 RNA、coSMN1 RNA和GAPDH RNA的扩增Ct值(表示拷贝数)，应用One Step PrimerScript RT-PCR Kit(PerfectReal Time)试剂(Takara，大连，中国)，使用荧光定量PCR仪(型号： ABI 7500fast，ABI)检测。操作过程参见One Step PrimerScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂说明书。
定量PCR检测结果如附图30所示。从图30的结果可知，相比于未注射病毒SMA模型小鼠(SMN2+/+, SMNΔ7+/+,smn-/-)，注射scAAV9-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1-122T、scAAV9-U-CAR-coSMN1 和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒组小鼠，在心肌、骨骼肌、脾、肾、脑和肺等器官中coSMN1表达水平升高，说明4种病毒经静脉注射后能够有效地转导全身组织器官表达产生SMN1 RNA或coSMN1 RNA 分子。而且在脑中，注射scAAV9-U-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T病毒组小鼠的coSMN1 表达水平明显高于注射scAAV9-CAR-coSMN1和scAAV9-CAR-coSMN1-122T病毒组小鼠，表明U-ITR能够提高AAV病毒转导体内后的基因表达水平，有助于提升设计SMA基因药物的有效性。进一步，我们的实验结果还显示，注射含有miR-122靶序列病毒(scAAV9-CAR-coSMN1-122T和 scAAV9-U-CAR-coSMN1-122T)小鼠的肝脏中coSMN1基因的表达水平明显低于注射不含有miR-122靶序列病毒(scAAV9-CAR-coSMN1和scAAV9-U-CAR-coSMN1)小鼠(图30)，表明在coSMN1基因表达框的3’UTR加入肝脏中高表达的miR-122的靶序列有效地抑制了coSMN1基因在肝脏中表达，降低了肝脏中过表达SMN1蛋白可能带来的副作用，增加基因药物的有效性。
总之，在本实施例中，我们通过实验比较分析了SMN1基因编码序列是否优化、基因表达框中是否添加人miR-122靶序列、AAV载体反向末端重复序列(ITR)是否突变等3种因素对SMA基因药物的体内有效性和安全性的影响，发现SMN1基因编码序列优化、表达框中加入人miR-122靶序列以及AAV载体反向末端重复序列(ITR)都有助于提高SMA基因药物的体内有效性。因此设计的SMA药物结构可同时考虑3种因素或3种因素的1种因素以及3种因素的2种因素组合。
实施例5不同给药方式对SMA基因药物的体内有效性影响实验
在验证设计药物有效性的基础上，我们进一步比较了不同给药方式对设计SMA基因药物体内有效性的影响。我们制备获得了scAAV9-CAR-coSMN1和scAAV9-CAR-coSMN1-122T两种病毒，将两种病毒分别以静脉注射(IV)、鞘内注射(IT)和脑室内注射(ICV)等3种不同的给药方式注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+, SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)体内，比较不同注射方式之间SMA模型小鼠的生存期、体重变化及coSMN1表达水平。
将scAAV9-CAR-coSMN1或scAAV9-CAR-coSMN1-122T以静脉注射(IV)、鞘内注射(IT)和脑室内注射(ICV)等3种不同的给药方式注射至1日龄SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)体内，每种病毒经一种注射方式注射5只小鼠。静脉注射(IV)的给药剂量为5×1013vg/kg，鞘内注射(IT)和脑室内注射(ICV)的给药剂量都为1×1013vg/kg。注射完成后，记录小鼠的生存期。结果如图31所示。从图31的结果可知，虽然鞘内注射和脑室内注射的注射剂量比静脉注射的注射剂量低5倍，但是3种注射方式小鼠之间的生存期延长时间未见明显差异。而且在3种注射方式中，注射含有miR-122靶序列病毒的小鼠的生存期延长时间都长于注射不含有miR-122靶序列病毒小鼠，同前面的发现一致。
同时，我们还在不同的时间点记录了注射病毒小鼠的体重，结果如图32所示。从图32的结果可知，注射病毒后，3种注射方式小鼠的体重均随着时间的延长而逐渐增加，直至不在变化，同野生型C57BL/6J 小鼠的体重变化规律一致，说明3种注射方式都能够有效地恢复SMA模型小鼠的生长发育。
我们进一步检测了通过3种不同的注射方式(静脉注射、鞘内注射和脑室内注射)注射SMA基因药物(scAAV9-CAR-coSMN1或scAAV9-CAR-coSMN1-122T)后，SMA模型小鼠不同组织的coSMN1基因表达情况。注射病毒3个月后，每组各处死1只小鼠，分离心脏、肝脏、骨骼肌、脾、肺、脑和肾等器官，提取各种器官的总RNA，定量PCR测定总RNA中的coSMN1 RNA拷贝数以及小鼠GAPDH RNA拷贝数，拷贝数用Ct值表示，计算coSMN1 RNA的Ct值和小鼠GAPDHRNA的Ct值的差值，用于2的 Ct值差值的幂表示coSMN1 RNA的相对表达水平。检测时，以未注射病毒的SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMN Δ7+/+,smn-/-)为对照。具体的检测过程详见实施例5。检测结果如图33所示。从图33的结果可知，相比于静脉注射给药SMA模型小鼠，鞘内注射和脑室内注射给药SMA模型小鼠脑中的coSMN1表达水平明显升高，说明鞘内注射和脑室内注射比静脉注射更容易转导神经元。而且我们还发现鞘内注射和脑室内注射给药小鼠的肝脏、骨骼肌、心肌等组织也检测到coSMN1表达。虽然这两种给药方式下，小鼠的肝脏、骨骼肌、心肌等组织coSMN1基因表达水平低于静脉注射给药，但是差异不大，同文献报道一致(Armbruster N，et al.Mol Ther Methods Clin Dev.2016；3:16060.)，提示AAV载体穿透血脑屏障可能是双向的。我们的实验结果还显示，3种注射方式下注射含有miR-122靶序列病毒(scAAV9-CAR-coSMN1-122T)小鼠的肝脏中coSMN1基因的表达水平都明显低于注射不含有miR-122靶序列病毒(scAAV9-CAR-coSMN1和 scAAV9-U-CAR-coSMN1)小鼠(图33)，表明在coSMN1基因表达框的3’UTR加入肝脏中高表达的 miR-122的靶序列有效地抑制了coSMN1基因在肝脏中表达，降低了肝脏中过表达SMN1蛋白可能带来的副作用，增加基因药物的有效性。
总之，在本实施例中，我们比较分析了3种不同的给药方式(静脉注射、鞘内注射和脑室内注射) 对设计SMA基因药物的体内有效性影响。结果表明3种给药方式均能有效地延长SMA模型小鼠的生存期，增加其体重，而且鞘内注射和脑室内注射需要的有效剂量更低，为SMA基因药物的给药方式提供了新的选择。
实施例6不同AAV载体血清型对SMA基因药物的体内有效性影响实验
在本实施例中，我们比较了不同AAV载体血清型对设计SMA基因药物体内有效性的影响。我们制备获得了scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1、scAAVrh10-CAR-coSMN1等3种病毒，将3种病毒分别以静脉注射(IV)、鞘内注射(IT)和脑室内注射(ICV)等3种不同的给药方式注射至SMA模型小鼠(SMN2+/+, SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)体内，比较同一注射方式条件下注射不同AAV血清型病毒SMA模型小鼠的生存期和体重变化。
(一)静脉注射给药时AAV载体血清型对SMA基因药物的体内有效性影响将scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1或scAAVrh10-CAR-coSMN1病毒经静脉以5×1013vg/kg 的剂量注射至1日龄SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)体内，每种病毒注射5只小鼠。注射完成后，记录小鼠的生存期。结果如图34所示。从图34的结果可知，3种病毒注射SMA模型小鼠后都能够延长其生存期，但不同的AAV载体血清型对SMA模型小鼠生存期的延长程度存在差异，AAV9 (scAAV9-CAR-coSMN1)的效果最好，AAVrh10(scAAVrh10-CAR-coSMN1)次之，AAV5 (scAAV5-CAR-coSMN1)最弱。尽管如此，但是注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒SMA模型小鼠的平均生存期为285.5天，显著长于SMA模型小鼠的预期生存期(不超过15天)，因此包括AAV5在内的AAVrh10 和AAV9都可作为SMA基因药物设计的候选血清型。
同时，我们还在不同的时间点记录了注射病毒小鼠的体重，结果如图35所示。从图35的结果可知，不同血清型AAV病毒注射病毒后，小鼠的体重均随着时间的延长而逐渐增加，直至不在变化，同野生型 C57BL/6J小鼠的体重变化规律一致，说明3种血清型AAV病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、 scAAV9-CAR-coSMN1和scAAVrh10-CAR-coSMN1)都能够有效地恢复SMA模型小鼠的生长发育。
(二)鞘内注射给药时AAV载体血清型对SMA基因药物的体内有效性影响将scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1或scAAVrh10-CAR-coSMN1病毒经鞘内以1×1013vg/kg 的剂量注射至1日龄SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)体内，每种病毒注射5只小鼠。注射完成后，记录小鼠的生存期。结果如图36所示。从图36的结果可知，scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1或scAAVrh10-CAR-coSMN1病毒注射SMA模型小鼠后都能够延长其生存期，但不同的AAV载体血清型对SMA模型小鼠生存期的延长程度存在差异，AAV9(scAAV9-CAR-coSMN1) 的效果最好，AAVrh10(scAAVrh10-CAR-coSMN1)次之，AAV5(scAAV5-CAR-coSMN1)最弱。注射 scAAV5-CAR-coSMN1病毒SMA模型小鼠的平均生存期为299天，显著长于SMA模型小鼠的预期生存期(不超过15天)，因此包括AAV5在内的AAVrh10和AAV9都可作为SMA基因药物设计的候选血清型。
同时，我们还在不同的时间点记录了注射病毒小鼠的体重，结果如图37所示。从图37的结果可知，不同血清型AAV病毒注射病毒后，小鼠的体重均随着时间的延长而逐渐增加，直至不在变化，同野生型 C57BL/6J小鼠的体重变化规律一致，说明3种血清型AAV病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、 scAAV9-CAR-coSMN1和scAAVrh10-CAR-coSMN1)经鞘内注射后，都能够有效地恢复SMA模型小鼠的生长发育。
(三)脑室内注射给药时AAV载体血清型对SMA基因药物的体内有效性影响将scAAV5-CAR-coSMN1、scAAV9-CAR-coSMN1或scAAVrh10-CAR-coSMN1病毒经脑室内以1×1013vg/kg的剂量注射至1日龄SMA模型小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠)体内，每种病毒注射5 只小鼠。注射完成后，记录小鼠的生存期。结果如图38所示。从图38的结果可知，3种病毒注射SMA 模型小鼠后都能够延长其生存期，但不同的AAV载体血清型对SMA模型小鼠生存期的延长程度存在差异， AAV9(scAAV9-CAR-coSMN1)和AAVrh10(scAAVrh10-CAR-coSMN1)效果相当，AAV5 (scAAV5-CAR-coSMN1)最弱。尽管如此，但是注射scAAV5-CAR-coSMN1病毒SMA模型小鼠的平均生存期为304天，明显长于SMA模型小鼠的预期生存期(不超过15天)，因此包括AAV5在内的AAVrh10 和AAV9都可作为SMA基因药物设计的候选血清型。
同时，我们还在不同的时间点记录了注射病毒小鼠的体重，结果如图39所示。从图39的结果可知，不同血清型AAV病毒注射病毒后，小鼠的体重均随着时间的延长而逐渐增加，直至不在变化，同野生型 C57BL/6J小鼠的体重变化规律一致，说明3种血清型AAV病毒(scAAV5-CAR-coSMN1、 scAAV9-CAR-coSMN1和scAAVrh10-CAR-coSMN1)都能够有效地恢复SMA模型小鼠的生长发育。
总之，在本实施例中，我们比较了AAV5、AAV9和AAVrh10等3种血清型对于SMA基因治疗药物有效性的影响。虽然不同血清型之间的有效性存在一定的差异，但基于3种血清型AAV的SMA基因药物均可显著延长SMA动物模型生存期，恢复模型的生理功能。而且3种血清型在3种不同的给药方式下 (静脉注射、鞘内注射和脑室内注射)呈现出相似的规律，表明除AAV9外的AAV5和AAVrh10两种血清型也可以用于SMA基因治疗药物的设计。
Figure IDA0003741753980000011
Figure IDA0003741753980000021
Figure IDA0003741753980000031
Figure IDA0003741753980000041
Figure IDA0003741753980000051
Figure IDA0003741753980000061
Figure IDA0003741753980000071

Claims (12)

1.一种优化的编码人SMN1蛋白的基因；所述SMN1基因为人运动神经元生存基因，其中所述基因包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
2.一种人运动神经元生存基因(SMN1)表达框，其特征在于，包含启动子和SEQ ID NO:13所示的编码人SMN1蛋白的基因；所述SMN1基因为人运动神经元生存基因。
3.如权利要求2所述的SMN1基因表达框，其中所述表达框还携带人miRNA靶序列，
优选地，其中所述miRNA靶序列的个数为1个，或其中所述miRNA靶序列的个数大于1个，且大于1个的靶序列通过间隔序列串联连接；
更优选地，其中所述人miRNA靶序列为与人miR-122完全互补的靶序列。
4.如权利要求2-3任一项所述的SMN1基因表达框，其中所述启动子选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
5.如权利要求2-4任一项所述的SMN1基因表达框，其中所述SMN1基因表达框包含SEQID NO:15所示的携带miR-122靶序列的SMN1编码序列。
6.如权利要求2-5任一项所述的SMN1基因表达框，其中所述表达框包含：
(Ⅰ)选自SEQ ID NO:1,2,4或5所示的启动子；和
(II)SEQ ID NO:13所示的人SMN1基因编码序列；和
(Ⅲ)人miR-122靶序列。
7.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求2-6中任一项所述的SMN1基因表达框，
优选地所述重组腺相关病毒载体是scAAV病毒，
优选地，其中所述重组腺相关病毒包含5’ITR序列和3’△ITR序列；或所述重组腺相关病毒包含5’U-ITR序列和3’△U-ITR序列。
8.如权利要求7所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10，
优选地，其中所述血清型为AAV5、AAV9或AAVrh10。
9.如权利要求7-8所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体包含单个反向末端重复序列突变体或2个相同的反向末端重复序列突变体或2个不同的反向末端重复序列突变体，
优选地，其中所述的反向末端重复序列突变体选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8和SEQID NO.10。
10.一种基因药物，其特征在于，包括权利要求2-6任一项所述的基因表达框或权利要求7-9任一项所述的重组腺相关病毒载体，
优选地，所述药物为静脉注射药物、鞘内注射药物或脑室内注射药物。
11.权利要求7-9任一项所述的重组腺相关病毒载体在制备用于有效缓解或治愈因人运动神经元生存基因SMN1突变带来的不良症状的药物中的用途，
优选地，其中所述药物为静脉注射药物、鞘内注射药物或脑室内注射药物，
优选地，其中所述药物为静脉注射给药同鞘内注射给药或脑室内注射给药的联合给药组合。
12.一种启动子，其序列选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
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