CN114908060B - 一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CNT，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.45116。利用该菌株分泌获得的苯酰菌胺单克隆抗体用于进行食品安全检测中苯酰菌胺残留的分析检测。本发明获得的苯酰菌胺单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测，其对苯酰菌胺有较好的检测灵敏度和特异性(IC₅₀值为1.09ng/mL、对苯酰菌胺类似物交叉率小于1％，交叉率＝(苯酰菌胺的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％。

Description

一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，尤其是指一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

苯酰菌胺是一种苯甲酰胺类保护性杀菌剂，具有新颖的作用机理，在卵菌纲真菌剂中较独特，它通过微管蛋白-亚基的结合和微管细胞骨架的破裂来抑制菌核***，不影响游动孢子的游动、包囊形成或萌发，伴随着菌核***的第一个循环，芽管的伸长受到抑制，从而阻止病菌穿透寄主植物。苯酰菌胺是抗有丝***类杀菌剂中唯一对卵菌有效的药剂，可有效防治包括葡萄和马铃薯在内的果树和蔬菜等作物上由卵菌纲真菌引起的病害，如马铃薯和番茄晚疫病、黄瓜霜霉病和葡萄霜霉病等，对葡萄霜霉病有特效，具有较长的持效期和很好的耐雨水冲刷性能，其新颖的作用机理，杀菌谱广、活性高，符合我国的农药发展方向具有广阔的应用前景和市场前景。目前，美国已经规定了其在蔬菜、水果等多种农产品中的残留限量，因此，研究建立苯酰菌胺的残留检测方法具有重要意义。

对于苯酰菌胺残留的检测，常采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相或液相色谱质谱联用法。但这些方法存在样品前处理复杂和检测时间长等不足，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对苯酰菌胺的高效、快速的检测方法。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在抗生素残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测苯酰菌胺的前提是得到对苯酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对苯酰菌胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的苯酰菌胺单克隆抗体对苯酰菌胺具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为1.09ng/mL)，可以用于建立苯酰菌胺的免疫学检测方法，检测食品中苯酰菌胺的残留。

本发明的第一个目的是提供一种分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45116。

本发明的第二个目的是提供所述的杂交瘤细胞株的制备方法，制备过程中使用的苯酰菌胺半抗原为ZOX-COOH，其分子结构式：

在本发明的一种实施例中，制备过程中使用的苯酰菌胺完全抗原为ZOX-COOH-BSA，其分子结构式：

本发明还提供了所述分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，具体包含如下步骤：

(1)使用苯酰菌胺半抗原制备苯酰菌胺完全抗原，将获得的苯酰菌胺完全抗原制备成含抗原弗氏佐剂与含抗原不完全弗氏佐剂；

(2)将得到的含抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用含抗原完全弗氏佐剂，加强免疫采用含抗原不完全弗氏佐剂；

(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中苯酰菌胺抗体含量高的获得免疫的小鼠；

(4)将筛选出的小鼠用含抗原不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的苯酰菌胺完全抗原进行；

(5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的培养基为RPMI-1640培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。

在本发明的一种实施例中，所述苯酰菌胺完全抗原通过以下方法制备得到：将苯酰菌胺半抗原和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于有机溶剂中反应，得到苯酰菌胺半抗原ZOX-COOH溶液；同时，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于有机溶剂后，加入到苯酰菌胺半抗原ZOX-COOH溶液中，混合反应得到A液；将牛血清蛋白BSA用缓冲溶液稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液，并用缓冲液透析反应液，得到所述苯酰菌胺完全抗原ZOX-COOH-BSA。

在本发明的一个实施例中，所述有机溶剂为DMF。

在本发明的一个实施例中，所述缓冲溶液为碳酸盐缓冲溶液；所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。

本发明还提供了苯酰菌胺包被原的合成方法，具体：

将苯酰菌胺半抗原(ZOX-COOH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应，得到苯酰菌胺半抗原(ZOX-COOH)溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于有机溶剂后，加入到ZOX-COOH溶液中，室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将鸡卵白蛋白(OVA)用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原(ZOX-COOH-OVA)。

本发明的第三个目的是提供一种苯酰菌胺单克隆抗体，所述苯酰菌胺单克隆抗体由中所述杂交瘤细胞株分泌得到。

本发明的第四个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的苯酰菌胺单克隆抗体。

本发明的第五个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的苯酰菌胺单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。

本发明的第六个目的是提供一种试纸条，所述试纸条含有中所述杂交瘤细胞株、中所述的苯酰菌胺单克隆抗体和所述组合物中的一种或多种。

本发明的第七个目的是提供一种芯片，所述芯片含有中所述杂交瘤细胞株、所述的苯酰菌胺单克隆抗体和所述组合物中的一种或多种。

本发明的第八个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的苯酰菌胺单克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒、所述的试纸条或所述的芯片在检测苯酰菌胺中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明的有益效果：本发明获得的苯酰菌胺单克隆抗体可以用于免疫分析检测，其对苯酰菌胺有较好的检测灵敏度和特异性(IC₅₀值为1.09ng/mL、对苯酰菌胺类似物交叉率小于1％，交叉率＝(苯酰菌胺的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％。

生物材料样品保藏：一株分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CNT，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45116。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明苯酰菌胺单克隆抗体对苯酰菌胺的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明实施例所用培养基如下：

RPMI-1640培养基：L-精氨酸290mg/L、L-门冬酰胺50mg/L、L-门冬氨酸20mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L、L-谷氨酸20mg/L、甘氨酸10mg/L、L-组氨酸15mg/L、L-羟脯氨酸20mg/L、L-异亮氨酸50mg/L、L-亮氨酸50mg/L、L-赖氨酸盐酸盐40mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸15mg/L、L-脯氨酸20mg/L、L-丝氨酸30mg/L、L-苏氨酸20mg/L、L-色氨酸5mg/L、L-酪氨酸23.19mg/L、L-缬氨酸20mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、硝酸钙100mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、无水磷酸二氢钠676.13mg/L、氯化钾400mg/L、氯化钠6000mg/L、葡萄糖2000mg/L、还原谷胱甘肽1mg/L、酚红5mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、生物素0.2mg/L、D-泛酸钙0.25mg/L、叶酸1mg/L、i-肌醇35mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱3mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、核黄素0.2mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、维生素B120.005 mg/L、碳酸氢钠2000mg/L。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00gNaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％吐温20的PBS；

抗体稀释液：PBS加入0.1％明胶。

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

苯酰菌胺抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将苯酰菌胺标准品稀释0，0.041，0.123，0370，1.11，3.33,10和30ng/mL等浓度，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图(结果如图1所示)，获得苯酰菌胺标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1：苯酰菌胺半抗原的合成

由于苯酰菌胺小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将苯酰菌胺偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于苯酰菌胺分子结构中不含有氨基，羧基，羟基，因此需要在其结构上衍生出羧基。

本发明衍生后的苯酰菌胺半抗原结构如下：

衍生过程如下：

将100mg苯酰菌胺溶解于5mL吡啶中，加入200mg CMO，70℃水浴磁力搅拌反应6h，使用氮气将反应液吹干，沉淀物溶解于2m L三氯甲烷溶液中，等体积超纯水萃取三次。收集有机相，氮气吹干，沉淀物即为衍生产物。

实施例2：苯酰菌胺完全抗原的合成

称取6mg苯酰菌胺半抗原(ZOX-COOH)，4.5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取6.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到ZOX-COOH溶液中，室温搅拌反应4-6h(称为A液)。取5mg BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至2mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原ZOX-COOH-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。

实施例3：苯酰菌胺包被原的合成

将4mg苯酰菌胺半抗原(ZOX-COOH)、2.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到苯酰菌胺半抗原(ZOX-COOH)溶液；将4.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于100μL无水DMF后，加入到ZOX-COOH溶液中，室温搅拌进行反应4-6h，得到A液；将5mg鸡卵白蛋白(OVA)用2mL浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释，得到B液；将逐滴将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，除去未反应的小分子半抗原，得到包被原(ZOX-COOH-OVA)。

实施例4：分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得：将苯酰菌胺完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1～4)×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用苯酰菌胺为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；

选择对苯酰菌胺标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；

按上述方法进行三次亚克隆，最终获得苯酰菌胺单克隆抗体细胞株CNT。

实施例5：苯酰菌胺单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶苯酰菌胺杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化；

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测得苯酰菌胺单克隆抗体的IC₅₀值为1.09ng/mL、对苯酰菌胺类似物交叉率小于1％，结果见表，说明对苯酰菌胺有很好的灵敏度，可用于苯酰菌胺免疫分析检测。(交叉率＝(苯酰菌胺的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％)。

表1

化合物	<![CDATA[IC<sub>50</sub>(ng/mL)]]>	交叉率(％)
			苯酰菌胺	1.09	100
氟酰胺	>500	<1
			环酰菌胺	>500	<1
吡噻菌胺	>500	<1
			双炔酰菌胺	>500	<1

实施例6：苯酰菌胺单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株CNT通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于苯酰菌胺的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.3μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.041ng/mL，0.123ng/mL，0370ng/mL，1.11ng/mL，3.33ng/mL，10ng/mL和30ng/mL的苯酰菌胺标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL以1:32000稀释的抗苯酰菌胺单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL2M的H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

苯酰菌胺单克隆抗体对苯酰菌胺的抑制标准曲线如图1所示，用ic-ELISA测定苯酰菌胺单克隆抗体的IC₅₀值为1.09ng/mL，说明该抗体对苯酰菌胺有较好的灵敏度，可用于苯酰菌胺的免疫分析检测。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种分泌苯酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2022年03月03日，保藏编号CGMCC No.45116。

2.一种苯酰菌胺单克隆抗体，其特征在于，所述苯酰菌胺单克隆抗体由权利要求1中所述杂交瘤细胞株分泌得到。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株和/或权利要求2所述的苯酰菌胺单克隆抗体。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求2所述的苯酰菌胺单克隆抗体和权利要求3所述的组合物中的一种或多种。

5.一种试纸条，其特征在于，所述试纸条含有权利要求1中所述杂交瘤细胞株、权利要求2中所述的苯酰菌胺单克隆抗体和权利要求3所述组合物中的一种或多种。

6.一种芯片，其特征在于，所述芯片含有权利要求1中所述杂交瘤细胞株、权利要求2中所述的苯酰菌胺单克隆抗体和权利要求3所述组合物中的一种或多种。

7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求2所述的苯酰菌胺单克隆抗体、权利要求3所述的组合物、权利要求4所述的试剂盒、权利要求5所述的试纸条或权利要求6所述的芯片在检测苯酰菌胺中的应用。

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