CN114907960A - 一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法，所述***包括：微流控芯片，设置有荧光信号监测位点、成像位点和分选位点；荧光检测单元，配置为在荧光信号监测位点激发荧光信号并采集荧光信号；成像单元，配置为在成像位点采集液滴的图像；分选单元，配置为在分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出；信号处理器，基于荧光信号识别到有液滴通过荧光信号监测位点时，触发成像单元在成像位点采集液滴的图像；所述信号处理器基于图像分析判断出液滴内包裹目标细胞时，触发分选单元在分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。本发明利用荧光信号对液滴进行监测，提高了监测效率和准确度，从而大幅度提高了液滴分选的精准度和通量。

Description

一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法
技术领域
本发明涉及细胞分选技术领域，具体涉及一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法。
背景技术
无标记活细胞筛选指的是不对细胞进行任何预处理，仅根据细胞自身的生理表型特征，在保证细胞活性的前提下，将目标细胞从一个群体中分离出来，并用于后续的培养、分析和利用。无标记活细胞筛选在生物学领域具有十分广泛的应用前景，尤其值得一提的是，其在筛选具有重要工业或医疗价值的微生物细胞方面具有巨大的应用潜力。液滴微流控被认为是实现无标记活细胞筛选的最佳技术途径之一，这主要是因为大量的微液滴可以为群体中每个细胞提供独立的生长空间，细胞在各自的空间内生长并展现生理表型，细胞分泌的大分子蛋白或小分子化合物被限制在各自的液滴空间内，细胞之间的干扰被彻底排除，使具有特定表型特征的细胞更容易被识别并筛选出来。
目前，基于液滴微流控的无标记活细胞筛选方法可根据细胞表型检测原理分为五类：光吸收/散射法、拉曼光谱法、质谱法、电化学法、成像法。其中，拉曼光谱法、质谱法和电化学法仅能够检测细胞代谢物，因此应用范围有限；光吸收/散射法仅能够检测细胞数量变化，应用范围也十分有限；成像法可以检测包括细胞形态、数量、代谢活性在内的多种生理表型特征，具有更加广泛的应用前景。因此，发展基于成像的液滴微流控无标记活细胞筛选技术意义重大。
基于成像的液滴微流控无标记活细胞筛选方法通常包括以下步骤：
(1)使用微流控芯片生成尺寸均一的微液滴，在生成微液滴的同时将单个或多个细胞包裹到微液滴内；
(2)收集并孵育微液滴，使微液滴内的细胞生长并展现生理表型；
(3)将微液滴注入到微流控液滴分选芯片内，采集每个微液滴的图像，并通过分析微液滴内细胞的生理表型特征来识别目标细胞；
(4)在识别到目标细胞后，将包裹有目标细胞的微液滴分选出来，并通过回收分选后的微液滴得到目标细胞，最终实现细胞筛选的目的。
以上方法的核心点在于步骤(3)中的微液滴图像采集和细胞生理表型特征分析。其中，微液滴图像数据的采集和分析速度直接决定了细胞筛选的通量；微液滴图像的质量和细胞生理表型特征分析的性能直接影响了细胞筛选的灵敏度和精度。目前，已有一系列的微液滴图像采集和细胞生理表型特征分析方法被提出来。这些方法根据图像采集方式可以分为两类：
一、连续图像采集方法：使用高速相机以固定的频率不间断地采集微流控芯片通道的图像，并实时地分析每次采集到的图像内是否有流经的微液滴；当分析到所采集图像内有微液滴时，进一步分析液滴内的细胞生理表型特征，并判断此微液滴内的细胞是否为目标细胞；当判定为是目标细胞后，执行液滴分选功能以回收目标细胞。
连续图像采集方法中，高速相机所采集到的图像大多为无效数据，即未拍摄到液滴的图像数据。然而，为了寻找拍摄到了液滴的图像，这些无效数据仍然需要被逐个分析，而图像分析是整个技术方法的限速步骤，对大量无效图像数据的分析严重影响了液滴分选的执行效率，同时限制了细胞的筛选通量。此外，对无效数据的分析也浪费了大量的硬件资源，在想要达到相同的细胞筛选效果的前提下，设备成本会更高。这种方法的液滴分选频率可以达到10-30Hz。
二、触发式图像采集方法：使用光电探测器监测流经微流控芯片通道的微液滴，当有液滴通过芯片通道时，光电探测器会检测到光亮度的脉冲式变化，此时触发高速相机采集微液滴的图像；随后对图像进行实时分析，识别液滴轮廓，分析液滴内的细胞生理表型特征，并判断此微液滴内的细胞是否为目标细胞；当判定为是目标细胞后，执行液滴分选功能以回收目标细胞。
触发式图像采集方法的硬件构成方式为：微流控芯片放置在倒置显微镜载物台上，高速相机安装在倒置显微镜成像光路上，采用透射光照明并产生明场显微图像；使用分光镜将物镜采集到的光信号一分为二，其中一部传递给高速相机用于成像，另外一部分传递给光电探测器用于监测液滴。液滴经过导致的不规则脉冲信号被转换为脉冲电平信号，并传送给高速相机用于触发对液滴的图像采集；高速相机输出端连接到电脑主机上，图像数据被传输给电脑主机，图像数据的分析在电脑主机上执行；当检测到目标细胞并需要执行液滴分选时，电脑主机发送分选指令给能够产生分选电脉冲信号的设备，最终信号被传递给微流控液滴分选芯片并执行液滴分选。这种方法的液滴分选频率可以达到40-100Hz。
现有的触发式图像采集方法是通过检测透射光强度变化来实现对流经微流控芯片通道内微液滴的监测。这种方法在监测到液滴之后再采集图像，避免了采集大量无效图像数据，但是也带来了新的问题，主要包括：
微液滴体积很小，由微液滴导致的透射光强度变化十分微弱，因此基于此原理的微液滴监测信号的信噪比很低，微液滴的监测的灵敏度和准确性较低，导致液滴的筛选通量较低。若是想要准确地检测到液滴，需要使用Pinhole(针孔)将检测范围缩小到与液滴直径相近的程度。Pinhole的尺寸选择、相对于高速相机视野位置的设置都十分繁琐，且后期校正也很繁琐。
高速相机成像与光电探测器监测微液滴使用了相同的照明光源，为了同时满足成像和监测液滴的需求，需要同时调整光照强度、相机曝光时间、光电探测器灵敏度，使三者高度匹配，这使各个设备的设置工作量大大增加。同时，为了确保微液滴监测信号的稳定性，检测过程中需要固定照明光源的强度，因此成像的照明光强度无法根据不同的成像需要被随意调节，这极大地降低了此类方法的灵活性。
光电探测器监测微液滴信号使用透射光的方式照明，因此对微液滴和其内部细胞的成像也只能使用基于透射光照明的明场成像这一种方式，这极大地限制了此类方法的应用范围。
基于透射光强度的微液滴监测容易受到多种因素的影响，例如：微液滴内部细胞等物质成分会导致光强度的变化，使用不同的油水体系形成的微液滴界面折射率不同会导致光信号变化率的变化，等等。这些问题都会导致微液滴监测的灵敏度和准确度降低，进而影响细胞筛选的可靠性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法，以解决如何提高液滴监测的灵敏度和准确度进而提高筛选通量的问题。
为了解决上述问题，本发明的一方面是提供一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***，所述***包括：
微流控芯片，包括微流控通道，配置为用于输送液滴；所述微流控通道上依次设置有荧光信号监测位点、成像位点和分选位点；
荧光检测单元，配置为用于向所述荧光信号监测位点发射激发光以激发荧光信号，并采集所述荧光信号；
成像单元，配置为用于在所述成像位点采集液滴的图像；
分选单元，配置为用于在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出；
信号处理器，分别与所述荧光检测单元、成像单元和分选单元连接；
其中，所述信号处理器基于所述荧光信号识别到有液滴通过所述荧光信号监测位点时，触发所述成像单元在所述成像位点采集所述液滴的图像；所述信号处理器基于所述图像判断所述液滴内包裹目标细胞时，触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。
具体的方案中，所述微流控通道包括主输送通道、与所述主输送通道的第一端连接的第一注入通道和第二注入通道、与所述主输送通道的第二端连接的第一输出通道和第二输出通道；所述荧光信号监测位点、成像位点和分选位点按照第一端至第二端的方向依次设置在所述主输送通道上，并且所述分选位点临近于所述第一输出通道和所述第二输出通道的交汇点设置。
具体的方案中，所述微流控芯片连接有流体驱动装置，所述流体驱动装置用于向所述第一注入通道注入液滴以及向所述第二注入通道注入连续液相，并驱动所述液滴从所述主输送通道的第一端朝向第二端流动。
具体的方案中，所述荧光检测单元包括激发光模块和探测模块，所述激发光模块包括光源和光束整形元件，所述探测模块包括会聚透镜和高速探测器；其中，所述光源发出的激发光通过所述光束整形元件后入射至所述荧光信号监测位点以激发荧光，被激发的荧光经由所述会聚透镜会聚入射至所述高速探测器，所述高速探测器将采集到的荧光信号发送至所述信号处理器。
具体的方案中，所述成像单元包括照明模块、物镜、成像透镜和高速成像相机，所述照明模块和所述物镜位于所述微流控通道的相对上下两侧，所述照明模块发出的照明光被所述物镜收集，经由所述成像透镜聚焦于所述高速成像相机，所述高速成像相机将采集到的图像信号发送至所述信号处理器。
具体的方案中，所述分选单元包括电压放大器和电极，所述电极设置在所述微流控芯片中，所述电极位于所述主输送通道的侧面且临近于所述分选位点，所述电压放大器在所述信号处理器的控制下向所述电极施加电压以产生非均匀电场，从而将包裹目标细胞的液滴分选出。
本发明的另一方面是提供一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选方法，采用如上所述的无标记活细胞筛选***，所述方法包括步骤：
驱动液滴随同连续液相在所述微流控芯片的微流控通道中从第一端流向第二端；
控制所述荧光检测单元向所述荧光信号监测位点发射激发光以激发液滴的荧光信号，采集所述荧光信号并反馈至所述信号处理器；
所述信号处理器根据所述荧光信号判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点：若是，则触发所述成像单元在所述成像位点采集所述液滴的图像并反馈至所述信号处理器；
所述信号处理器根据所述图像判断所述液滴内是否包裹了目标细胞：若是，触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。
具体的方案中，所述判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点包括：所述信号处理器持续接收从所述荧光检测单元反馈的荧光信号序列，将所述荧光信号序列与设定的荧光信号阈值进行比较：当所述荧光信号序列的信号值首先从低于阈值跳变至高于阈值并产生上升沿，然后再从高于阈值跳变至低于阈值并产生下降沿，则判定有液滴通过所述荧光信号监测位点。
具体的方案中，所述根据所述图像判断所述液滴是否包裹了目标细胞包括：对采集到的液滴的原始图像进行背景滤波；应用形态学算子对滤波后的图像进行处理，识别液滴边界及液滴内的细胞，得到细胞的掩模形态数据；计算获取液滴内掩模标记的细胞的表型特征并与预设的条件进行比较，若所述表型特征符合预设的条件，则判定所述液滴包裹了目标细胞。
具体的方案中，所述触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出包括：所述信号处理器控制所述分选单元在所述分选位点以产生非均匀电场，使所述包裹目标细胞的液滴的流动路径偏移，控制所述包裹目标细胞的液滴从预定的输出通道流程，从而筛选出所述包裹目标细胞的液滴。
本发明实施例提供的基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法，使用激发光激发液滴自带的荧光信号，基于荧光信号对液滴进行识别和判定，具有如下的有益效果：
(1)无需使用pinhole(针孔)限制监测区域，硬件搭建更加简单；激发光会在高速相机的成像视野内形成光斑，只要将微流控芯片通道对准光斑即可实现对通道内流经微液滴的监测，设备的设置更加方便，且不需要频繁校准。
(2)液滴的监测与高速相机成像采用不同波长的光信号，互相不串扰，用于成像的照明光源强度可以根据需要随意调节，且对液滴内细胞的成像模式更加多样化，除了明场成像，还可使用暗场、相差、DIC等多种成像模式，应用范围得到极大扩展。
(3)微液滴监测信号信噪比更高，且信号不受微液滴内容物的影响，也不受微液滴自身物理和化学性质的影响，因此监测信号稳定性更高，由此提高了液滴监测的灵敏度和准确度，提高细胞筛选的可靠性，也提高了细胞筛选通量，细胞液滴的分选频率可以达到1000Hz以上。
附图说明
图1是本发明实施例提供的无标记活细胞筛选***的结构框图；
图2是本发明实施例中的微流控通道的结构示意图。
具体实施方式
为了实现前述和相关目的，本发明包括下文中充分描述并且在权利要求中特别指出的特征。以下描述和附图详细阐述了本发明的某些说明性方面和实施方式。然而，这些仅指示可以采用本发明原理的各种方式中的几种。当结合附图考虑时，根据本发明的以下详细描述，本发明的其他目的、优点和新颖特征将变得显而易见。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
针对现有的基于成像的液滴微流控无标记活细胞筛选方法中筛选通量较低的问题，以及在触发式图像采集方法中，由于监测液滴的光电探测器和采集液滴图像的成像设备使用同一照明光源而带来的诸多问题，本发明实施例提供了一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法，使用激发光激发液滴自带的荧光信号，基于荧光信号对液滴进行识别和判定，进而基于液滴的判定结果触发成像设备拍照，由此提高了监测效率和准确度，结合液滴的图像分析，大幅度提高了液滴分选的精准度和通量，可以实现对液滴内不同表型细胞群的高通量筛选。
基于以上的构思，本发明实施例首先提供了一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***，所述***包括微流控芯片、荧光检测单元、成像单元、分选单元和信号处理器。
其中，所述微流控芯片至少包括微流控通道，配置为用于输送液滴；并且所述微流控通道上依次设置有荧光信号监测位点、成像位点和分选位点。所述荧光检测单元配置为用于向所述荧光信号监测位点发射激发光以激发荧光信号，并采集所述荧光信号。所述成像单元配置为用于在所述成像位点采集所述液滴的图像信号。所述分选单元配置为用于在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出；所述信号处理器分别与所述荧光检测单元、成像单元和分选单元连接。
其中，所述信号处理器基于所述荧光信号识别并判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点，若是，则触发所述成像单元在所述成像位点采集所述液滴的图像。所述信号处理器还基于所述图像判断所述液滴是否包裹了目标细胞，若是，则触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。
在本实施例中，参阅图1和图2，所述微流控芯片1设置于载物台2上，所述微流控芯片1中设置有微流控通道10，所述微流控通道10包括主输送通道11、与所述主输送通道11的第一端连接的第一注入通道12和第二注入通道13、与所述主输送通道11的第二端连接的第一输出通道14和第二输出通道15。其中，所述第一注入通道12用于注入液滴，所述第二注入通道13用于注入连续液相。所述第一输出通道14用于供分选出的包裹目标细胞的液滴流出，所述第二输出通道15则用于供除了包裹目标细胞的液滴之外的其他液滴以及其他流体流出。需要说明的是，从所述第一注入通道12注入的液滴包括包裹目标细胞的液滴、包裹非目标细胞的液滴以及未包裹任何细胞的空白液滴。
进一步地，如图2所示，所述主输送通道11上依次设置有荧光信号监测位点16、成像位点17和分选位点18，所述荧光信号监测位点16、成像位点17和分选位点18按照从所述主输送通道11的第一端至第二端的方向(即液滴的流动方向)依次设置在所述主输送通道11上，并且所述分选位点18临近于所述第一输出通道14和所述第二输出通道15的交汇点设置。
进一步地，如图1所示，所述微流控芯片1连接有流体驱动装置3，所述流体驱动装置3用于向所述第一注入通道12注入液滴以及向所述第二注入通道13注入连续液相，并驱动所述液滴从所述主输送通道11的第一端朝向第二端流动。
在本实施例中，所述荧光检测单元包括激发光模块和探测模块。如图1所示，所述激发光模块包括光源31和光束整形元件32，所述探测模块包括会聚透镜34和高速探测器35。其中，所述光源31发出的激发光通过所述光束整形元件32后入射至所述荧光信号监测位点16以激发荧光，被激发的荧光经由所述会聚透镜34会聚入射至所述高速探测器35。所述高速探测器35与所述信号处理器4连接，所述高速探测器35将采集到的荧光信号S1发送至所述信号处理器4。
其中，所述光源31由激光器或发光二极管光源提供，本实施例中选择为激光器，即激发光为激光。所述光束整形元件32用于将光源31发出的激发光整形成特定的光束，所述光束整形元件32可以选自用于将光束准直成平行光的准直器或用于将圆形光斑整形为线形光斑的柱面镜组，本实施例中选择为柱面镜组，可以提高信号检测的信噪比。在另外的一些实施例中，所述光束整形元件32不限于如上所述的准直器和柱面镜组这两种元件。
进一步地，在本实施例中，如图1所示，由于激发光的光路与荧光信号的光路存在重叠的部分，因此，所述荧光检测单元中还设置有第一分光镜33，所述光源31发出的激发光通过所述光束整形元件32后经由所述第一分光镜33反射后入射至所述荧光信号监测位点16以激发荧光，被激发的荧光透射通过所述第一分光镜33后经由所述会聚透镜34会聚入射至所述高速探测器35。
基于以上实施例所述的荧光检测单元，其中的激发光模块持续向所述荧光信号监测位点16发射激发光而持续激发荧光，所述探测模块则持续不停地采集荧光信号。当液滴随同连续液相在所述主输送通道11中通过所述荧光信号监测位点16，从液滴上激发的荧光信号与从其他流体上激发的荧光信号具有差异，由此所述信号处理器4能够基于接收到的荧光信号识别出当前通过所述荧光信号监测位点16的是否为液滴，实现对液滴的监测，进而根据监测结果确定是否需要触发成像单元进行拍摄以获取图像信息。
本实施例中，如图1所示，所述成像单元包括照明模块21、物镜22、成像透镜24和高速成像相机25。其中，所述照明模块21和所述物镜22位于所述微流控芯片1的相对两侧，具体是位于所述微流通道10的相对两侧，如图1中，所述照明模块21位于所述微流控芯片1的相对上方，而所述物镜22则位于所述微流控芯片1的相对下方。
具体地，所述照明模块21发出的照明光被所述物镜22收集，经由所述成像透镜24聚焦于所述高速成像相机25。所述高速成像相机25与所述信号处理器4连接，所述信号处理器4控制所述高速成像相机25对图像进行采集，并且所述高速成像相机25将采集到的图像信号S2发送至所述信号处理器4。
进一步地，在本实施例中，如图1所示，由于成像光路与激发光光路以及荧光信号光路存在重叠的部分，因此，所述成像单元中还设置有第二分光镜23，所述照明模块21发出的照明光被所述物镜22收集，经所述第二分光镜23反射后由所述成像透镜24聚焦于所述高速成像相机25。所述光源31发出的激发光通过所述光束整形元件32后经由所述第一分光镜33反射后，透射通过所述第二分光镜23再由所述物镜22聚焦入射至所述荧光信号监测位点16，被激发的荧光被所述物镜22收集，依次透射通过所述第二分光镜23和所述第一分光镜33后经由所述会聚透镜34会聚入射至所述高速探测器35。
基于以上实施例所述的成像单元，当所述信号处理器4基于接收到的荧光信号判定当前通过所述荧光信号监测位点16的流体为液滴时，所述信号处理器4向所述高速成像相机25发出拍照触发指令S3，由所述高速成像相机25根据所述拍照触发指令S3在临近于所述荧光信号监测位点16的成像位点17采集液滴的图像，并将该图像信号S2发送至所述信号处理器4，进而所述信号处理器4根据该图像信号S2判断所述液滴是否为包裹目标细胞的液滴。
本实施例中，如图1和图2所示，所述分选单元包括电压放大器41和电极42，所述电极42设置在所述微流控芯片1中，所述电极42具体是位于所述主输送通道11的侧面且临近于所述分选位点18，所述电压放大器41分别与所述电极42和所述信号处理器4连接，所述电压放大器41在所述信号处理器4的控制下向所述电极42施加电压以产生非均匀电场，从而将包裹目标细胞的液滴分选出。
具体地，当所述信号处理器4根据图像信号判断液滴为包裹目标细胞的液滴时，所述信号处理器4向所述电压放大器41发出分选触发指令S4，所述电压放大器41根据所述分选触发指令S4向所述电极42施加电压从而在所述分选位点18所在的区域形成非均匀电场，进而产生介电泳力使包裹目标细胞的液滴的流动路径偏移，控制包裹目标细胞的液滴从第一输出通道14流出；而当所述信号处理器4根据图像信号S2的判断结果为液滴内未包裹目标细胞时，所述电压放大器41不向所述电极42施加电压，此时所述主输送通道11中的液滴以及其他流体按照初始的流动路径，从第二输出通道15流出，由此实现包裹目标细胞的液滴与其他液滴的分选，筛选获得包裹目标细胞的液滴。
其中，所述信号处理器4，用于实现多***间的信号同步触发，以及信号和图像处理等实时性功能。所述信号处理器4是针对实时数字信号处理操作的微处理器，具有信号输入模块和信号输出模块，可由专用标准电路、专用集成电路、数字信号处理器和现场可编程门阵列芯片等实现。本发明中优选现场可编程门阵列(FPGA)芯片。所述信号处理器4的信号输入模块分别与成像单元中的高速成像相机25和荧光检测单元中的高速探测器35相连，用于接收图像信号S2和荧光信号S1。所述信号处理器4的信号输出模块分别与成像单元中的高速成像相机25和分选单元中的电压放大器41相连，用于发出拍照触发指令S3和分选触发指令S4，实现拍照触发和分选触发的功能。信号处理器4具备从荧光信号中检测液滴和图像处理的功能，其中包含图像处理算法。信号处理器4可以设置为与计算机相连，可对实时处理的过程进行可视化展示。
基于以上实施例提供的无标记活细胞筛选***，本发明实施例还提供了一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选方法，所述方法包括以下步骤：
一、***的调试工作：将微流控芯片固定在载物台上，调节载物台的三维位置，使微流控芯片的荧光信号监测位点和成像位点处于物镜的视野内，同时调节激发光强度找到光斑位点，使其对准荧光信号监测位点。激发光光斑持续激发流经荧光信号监测位点的流体的荧光。调整光照模式和高速成像相机的曝光时间、帧率等参数，并使高速成像相机处于待机状态，等待信号处理器的拍照触发指令。调整电压放大器处于待机状态，等待信号处理器的分析触发指令。
需要说明的是，分选位点可以不处于物镜的视野内，但是，由于荧光信号监测位点、成像位点和分选位点在微流控通道上的间距很小，因此分选位点通常也是处于物镜的视野内。
二、驱动液滴随同连续液相在所述微流控芯片的微流控通道中从第一端流向第二端。
具体地，将流体驱动装置分别与装载连续相和液滴(包括包裹目标细胞的液滴、包裹非目标细胞的液滴以及未包裹任何细胞的空白液滴)的通道连接起来，调节流体驱动装置的压力，使液滴以固定距离的间隔持续性从荧光信号监测位点流经成像位点和分选位点，液滴通过频率为不小于1000Hz。
三、控制所述荧光检测单元向所述荧光信号监测位点发射激发光以激发液滴的荧光信号，采集所述荧光信号并反馈至所述信号处理器。
四、所述信号处理器根据所述荧光信号判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点：若是，则触发所述成像单元在所述成像位点采集所述液滴的图像并反馈至所述信号处理器。
具体的方案中，所述判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点包括：所述信号处理器持续接收从所述荧光检测单元反馈的荧光信号序列，将所述荧光信号序列与设定的荧光信号阈值进行比较：当所述荧光信号序列的信号值首先从低于阈值跳变至高于阈值并产生上升沿，然后再从高于阈值跳变至低于阈值并产生下降沿，则判定有液滴通过所述荧光信号监测位点。
在另外的一些实施例中，在高速探测器的输出端连接波形整形电路(如施密特触发器)，其输出端连接至信号处理器或高速成像相机。当液滴通过时，该波形整形电路可直接输出矩形方波的触发信号，用作相机的拍照触发方式。
五、所述信号处理器根据所述液滴的图像判断所述液滴内是否包裹了目标细胞：若是，触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。
具体的方案中，所述根据所述图像判断所述细胞液滴是否包裹了目标细胞包括：对采集到的液滴的原始图像进行背景滤波；应用形态学算子对滤波后的图像进行处理，识别液滴边界及液滴内的细胞，得到细胞的掩模形态数据；计算获取液滴内掩模标记的细胞的表型特征(例如密度、形态等)并与预设的条件进行比较，若所述表型特征符合预设的条件，则判定所述液滴包裹了目标细胞。需要说明的是，所述信号处理器中对液滴的图像处理功能不限于如上所述的算法，其他可完成相应液滴内细胞识别的算法均可使用。
其中，本发明实施例中所述信号处理器选择为现场可编程门阵列(FPGA)芯片，使用基于FPGA的硬件实时图像分析方法，加快图像分析速度，可以提高液滴分选频率，增加细胞筛选通量。其中的图像识别算法基于对液滴内包裹细胞的多维度信息，可对不同表型的细胞群进行筛选分类。
具体的方案中，所述触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出包括：所述信号处理器控制所述分选单元在所述分选位点以产生非均匀电场，使所述包裹目标细胞的液滴的流动路径偏移，控制所述包裹目标细胞的液滴从预定的输出通道流程，从而筛选出所述包裹目标细胞的液滴。
综上所述，本发明以上实施例提供的基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***和方法，使用激发光激发细胞液滴自带的荧光信号，基于荧光信号对液滴进行识别和判定，具有如下的有益效果：
(1)无需使用pinhole(针孔)限制监测区域，硬件搭建更加简单；激发光会在高速成像相机的成像视野内形成光斑，只要将微流控芯片通道对准光斑即可实现对通道内流经微液滴的监测，设备的设置更加方便，且不需要频繁校准。
(2)液滴的监测与高速成像相机成像采用不同波长的光信号，互相不串扰，用于成像的照明光源强度可以根据需要随意调节，且对液滴内细胞的成像模式更加多样化，除了明场成像，还可使用暗场、相差、微分干涉相差(Differential Interference Contrast,DIC)等多种成像模式，应用范围得到极大扩展。
(3)微液滴监测信号信噪比更高，且信号不受微液滴内容物的影响，也不受微液滴自身物理和化学性质的影响，因此监测信号稳定性更高，由此提高了液滴监测的灵敏度和准确度，提高细胞筛选的可靠性，也提高了细胞筛选通量，细胞液滴的分选频率可以达到1000Hz以上。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选***，其特征在于，包括：
微流控芯片，包括微流控通道，配置为用于输送液滴；所述微流控通道上依次设置有荧光信号监测位点、成像位点和分选位点；
荧光检测单元，配置为用于向所述荧光信号监测位点发射激发光以激发荧光信号，并采集所述荧光信号；
成像单元，配置为用于在所述成像位点采集液滴的图像；
分选单元，配置为用于在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出；
信号处理器，分别与所述荧光检测单元、成像单元和分选单元连接；
其中，所述信号处理器基于所述荧光信号识别到有液滴通过所述荧光信号监测位点时，触发所述成像单元在所述成像位点采集所述液滴的图像；所述信号处理器基于所述图像判断所述液滴内包裹目标细胞时，触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。
2.根据权利要求1所述的无标记活细胞筛选***，其特征在于，所述微流控通道包括主输送通道、与所述主输送通道的第一端连接的第一注入通道和第二注入通道、与所述主输送通道的第二端连接的第一输出通道和第二输出通道；所述荧光信号监测位点、成像位点和分选位点按照第一端至第二端的方向依次设置在所述主输送通道上，并且所述分选位点临近于所述第一输出通道和所述第二输出通道的交汇点设置。
3.根据权利要求2所述的无标记活细胞筛选***，其特征在于，所述微流控芯片连接有流体驱动装置，所述流体驱动装置用于向所述第一注入通道注入液滴以及向所述第二注入通道注入连续液相，并驱动所述液滴从所述主输送通道的第一端朝向第二端流动。
4.根据权利要求3所述的无标记活细胞筛选***，其特征在于，所述荧光检测单元包括激发光模块和探测模块，所述激发光模块包括光源和光束整形元件，所述探测模块包括会聚透镜和高速探测器；其中，所述光源发出的激发光通过所述光束整形元件后入射至所述荧光信号监测位点以激发荧光，被激发的荧光经由所述会聚透镜会聚入射至所述高速探测器，所述高速探测器将采集到的荧光信号发送至所述信号处理器。
5.根据权利要求3所述的无标记活细胞筛选***，其特征在于，所述成像单元包括照明模块、物镜、成像透镜和高速成像相机，所述照明模块和所述物镜位于所述微流控通道的相对上下两侧，所述照明模块发出的照明光被所述物镜收集，经由所述成像透镜聚焦于所述高速成像相机，所述高速成像相机将采集到的图像信号发送至所述信号处理器。
6.根据权利要求3所述的无标记活细胞筛选***，其特征在于，所述分选单元包括电压放大器和电极，所述电极设置在所述微流控芯片中，所述电极位于所述主输送通道的侧面且临近于所述分选位点，所述电压放大器在所述信号处理器的控制下向所述电极施加电压以产生非均匀电场，从而将包裹目标细胞的液滴分选出。
7.一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选方法，其特征在于，采用如权利要求1-6任一所述的无标记活细胞筛选***，所述方法包括步骤：
驱动液滴随同连续液相在所述微流控芯片的微流控通道中从第一端流向第二端；
控制所述荧光检测单元向所述荧光信号监测位点发射激发光以激发液滴的荧光信号，采集所述荧光信号并反馈至所述信号处理器；
所述信号处理器根据所述荧光信号判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点：若是，则触发所述成像单元在所述成像位点采集所述液滴的图像并反馈至所述信号处理器；
所述信号处理器根据所述液滴的图像判断所述液滴内是否包裹了目标细胞：若是，触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出。
8.根据权利要求7所述的无标记活细胞筛选方法，其特征在于，所述判断是否有液滴通过所述荧光信号监测位点包括：
所述信号处理器持续接收从所述荧光检测单元反馈的荧光信号序列，将所述荧光信号序列与设定的荧光信号阈值进行比较：当所述荧光信号序列的信号值首先从低于阈值跳变至高于阈值并产生上升沿，然后再从高于阈值跳变至低于阈值并产生下降沿，则判定有液滴通过所述荧光信号监测位点。
9.根据权利要求7所述的无标记活细胞筛选方法，其特征在于，所述根据所述液滴的图像判断所述液滴内是否包裹了目标细胞包括：
对采集到的液滴的原始图像进行背景滤波；
应用形态学算子对滤波后的图像进行处理，识别液滴边界及液滴内的细胞，得到细胞的掩模形态数据；
计算获取液滴内掩模标记的细胞的表型特征并与预设的条件进行比较，若所述表型特征符合预设的条件，则判定所述液滴包裹了目标细胞。
10.根据权利要求7所述的无标记活细胞筛选方法，其特征在于，所述触发所述分选单元在所述分选位点将包裹目标细胞的液滴分选出包括：
所述信号处理器控制所述分选单元在所述分选位点以产生非均匀电场，使所述包裹目标细胞的液滴的流动路径偏移，控制所述包裹目标细胞的液滴从预定的输出通道流程，从而筛选出所述包裹目标细胞的液滴。
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