CN114907152A - 巨大芽孢杆菌rl-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用 - Google Patents

巨大芽孢杆菌rl-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物与环保技术领域，特别是涉及巨大芽孢杆菌RL‑126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用，该菌株已于2022年3月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.24619；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该巨大芽孢杆菌RL‑126菌株具有降解木质纤维素的能力，能够提高秸秆降解率，促进秸秆腐熟以及营养成分的释放，增加土壤酶活性。并且，该巨大芽孢杆菌RL‑126菌株还能拮抗农作物致病菌。将以巨大芽孢杆菌RL‑126菌株腐熟的秸秆还田后，可提高作物产量。

Description

巨大芽孢杆菌RL-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用
技术领域
本发明涉及微生物与环保技术领域，特别是涉及巨大芽孢杆菌RL-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用。
背景技术
我国是农业大国，秸秆理论资源量达8.86亿吨，可收集资源量约为7.38亿吨，其中玉米秸秆占比约为32.5%。秸秆作为一种农业固体废物，资源化综合利用方式多样，但作为工业原料的运输和储存成本过高，因此，将秸秆直接还田、转化为有机肥仍然是目前我国秸秆利用的最佳方式之一。农作物秸秆富含有机质和无机养分，是优良的有机肥原料。据测定，玉米秸秆中氮、磷、钾的含量分别为0.61%、0. 21%、2.28%，秸秆还田经自然界的微生物分解后，其中的N、P、K及其他矿质元素等被释放进入土壤，实现元素循环，对缓解我国氮、磷、钾肥比例失调的矛盾，弥补磷、钾化肥不足有十分重要的意义。同时秸秆腐解可有效增加土壤有机质含量，改善土壤团粒结构和理化性状，改良土壤，培肥地力，增加作物产量。
秸秆主要是由纤维素、半纤维素和木质素等秸秆“三素”组成，此外还包含一定量的果胶、氮化物和少量的无机盐养分。纤维素是由多个葡萄糖缩合而成的多糖，结构相对复杂，分子量较大。半纤维素是由多个单糖构成的异质多聚体。木质素则是一种酚类聚合物，主要由醇单体构成。在秸秆中，秸秆“三素”互相包被缠连，呈现出复杂的、断断续续的层状结构，这种复杂的结构使得秸秆在自然条件下降解困难，进而导致需利用降解来开发利用秸秆的方法存在诸多问题。例如，若将秸秆直接还田，由于其降解速度缓慢，则会造成土壤过于松透，空隙不均衡，播种后种子不能与土壤充分接触，发芽生长受到影响，出苗不齐，尤其是玉米—小麦轮作区，小麦播种后常会出现不发芽、苗弱、倒伏、枯死现象，冬季小麦还易发生冻害，严重影响小麦的高产。同时，如果前茬作物患病，秸秆直接还田还会造成病原微生物在田间的传播，加重病害发生。这也是我国每年有大量秸秆并未得到妥善利用，秸秆抛弃、焚烧现象严重的重要原因之一。
但秸秆的随意抛弃、焚烧现象会带来一系列环境问题。而环保对于生态环境、经济发展、人类健康等都存在长远影响。因此，有效降解秸秆，加快推进秸秆综合利用，不仅有利于稳定农业生态平衡、缓解资源约束，还对减少秸秆抛弃、焚烧带来的环保问题，减轻环保压力具有十分重要的积极意义。
发明内容
针对秸秆不易降解的技术问题，本发明提供了巨大芽孢杆菌RL-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用。该巨大芽孢杆菌RL-126菌株能够提高秸秆降解率、促进秸秆腐熟，应用于秸秆还田后能够促进作物生长，提高产量。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一方面，本发明实施例提供巨大芽孢杆菌RL-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用。该巨大芽孢杆菌RL-126菌株从小麦产区健壮麦苗根际土壤中分离得到，其分类名称为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），于2022年3月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 24619；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
经试验研究表明，巨大芽孢杆菌RL-126菌株有较高的纤维素酶活性和较强的降解木质素的能力，能够提高秸秆降解率，促进秸秆腐熟以及营养成分的释放，增加土壤酶活性。并且，该巨大芽孢杆菌RL-126菌株还能拮抗农作物致病菌，如小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌和小麦根腐病菌。将以巨大芽孢杆菌RL-126菌株腐熟的秸秆还田后，可提高作物产量，并可减少病原微生物在田间的传播。
第二方面，本发明实施例还提供一种促进农作物秸秆腐熟的方法，将秸秆粉碎后喷洒含氮源的水溶液，再喷洒所述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的菌悬液，发酵30天以上。
细菌生长需要碳源和氮源，秸秆能够提供碳源，结合喷入的含氮源的水溶液，有利于巨大芽孢杆菌RL-126菌株的生长繁殖，使菌量增多，促进秸秆降解。其中氮源可选尿素，补充尿素既可以提供细菌生长所需的氮源，还可以补充小麦生长所需的肥料。
优选地，所述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的菌悬液的活菌浓度为1×107~2×107cfu/mL。
第三方面，本发明实施例还提供一种菌剂，所述菌剂包括上述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的活菌株。
该菌剂可用于在秸秆还田时与秸秆和肥料共同翻入土壤，促进秸秆在土壤中降解、腐熟，释放营养成分，提高土壤酶活性，并拮抗土壤中的病原菌，促进作物健康生长。
优选地，所述菌剂为液体菌剂。
第四方面，本发明实施例还提供一种在秸秆还田的方法，将秸秆粉碎，施用上述液体菌剂后，与肥料共同翻压到地下，3~7天后种植作物。
将施用了含有巨大芽孢杆菌RL-126活菌株的菌剂的秸秆与肥料共同翻压到地下后，肥料能够提供巨大芽孢杆菌RL-126活菌株生长需要的营养成分，促进巨大芽孢杆菌RL-126菌株的生长繁殖，进而促进秸秆在地下降解、发酵腐熟、释放养分，并能提高土壤酶活性，从而提高作物产量。
优选地，所述肥料为复混肥料，施入量为50~70kg/亩。
优选地，所述复混肥料中的氮、磷、钾元素比例为：N:P2O5:K2O=15:15:15；总养分≥45%。
优选地，所述秸秆的用量为3000~5000斤/亩，所述液体菌剂中巨大芽孢杆菌RL-126菌株菌悬液的活菌浓度为1×109~2×109cfu/mL。
本发明的有益效果在于：本发明通过利用巨大芽孢杆菌RL-126菌株来提高秸秆降解率，促进秸秆腐熟，减少秸秆还田后造成的病原微生物在田间的传播，有利于促进农业固废秸秆的妥善利用，对于减少秸秆抛弃、焚烧等破坏环境的现象，减轻环保压力具有十分重要的积极意义。
附图说明
图1为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株纤维素酶活性检测结果；
图2为实施例1中葡萄糖含量标准曲线；
图3为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株纤维素酶活力检测结果；
图4为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株滤纸酶活力检测结果；
图5为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株降解苯胺蓝活性检测结果；
图6为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株漆酶活力检测结果；
图7为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株锰过氧化物酶活力检测结果；
图8为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株木质素过氧化物酶活力检测结果；
图9为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株对小麦纹枯病的拮抗作用；
图10为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株对小麦全蚀病的拮抗作用；
图11为实施例1中巨大芽孢杆菌RL-126菌株对小麦根腐病的拮抗作用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所采用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
以下实施例中所采用的原料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。
以下实施例中采用Excel 2003软件处理数据和绘表，采用SPSS13.0软件进行统计分析，采用最小显著极差法（LSD）进行差异显著性检验（P＜0.05）。
实施例1
本发明实施例提供了巨大芽孢杆菌RL-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用。
1、材料与方法
1.1玉米秸秆粉
将玉米秸秆切碎至2~3cm小段，放入烘箱烘干，用植物粉碎机粉碎后过40目筛。
1.2培养基
所有培养基均用121℃高压蒸汽灭菌30min。
营养琼脂培养基（Nutrient Agar，NA）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，水1000 mL，pH 7.0~7.2。
NB培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH 7.0~7.2。
羧甲基纤维素（CMC）鉴别培养基：CMC-Na 7.5 g，KH2PO41.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 1.25 g，琼脂20.0 g，水1000 mL，pH 7.0~7.2。
苯胺蓝（Azure-B）培养基：5 g酵母膏，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl，苯胺蓝0.1 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L。
液体发酵培养基：无机盐培养基中加入过40目筛的玉米秸秆粉（10.0 g/L）。无机盐培养基：KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO3 2.5 g，CaCl2 0.1 g，(NH4)2SO4 1.2 g，FeSO4 0.01 0 g，水100 mL，pH 7.0~7.2。
种子培养基：NaH2PO4·2H2O 2.0 g，Na2HPO4·2H2O 4.0 g，葡萄糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨10.0 g，水1000 mL，pH 7.0~7.2。
1.3试剂及配制方法
3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取3,5-二硝基水杨酸10.0 g，置于约600 mL水中，逐渐加入NaOH l0.0 g，在50℃水浴中磁力搅拌溶解后，依次加入酒石酸钾钠200.0 g、苯酚（重蒸）2.0 g和无水亚硫酸钠5.0 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。
0.05 mol/L pH 4.8柠檬酸缓冲液：称取一水柠檬酸4.83 g，溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94 g，用水定容至1000 mL，调节pH 4.8备用。
1.0% CMC-Na溶液：称取2.0 g CMC-Na，精确至1.0 mg，缓缓加入柠檬酸缓冲液约150 mL并加热至80-90℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至200 mL，用2.0 mol/L HCl或NaOH调节pH 4.8，定容到200 mL，混匀贮存于4℃冰箱中备用。
1.4巨大芽孢杆菌RL-126菌株纤维素酶活性定性检测
将巨大芽孢杆菌RL-126菌株点种在CMC鉴别培养基平板上，37℃恒温培养至长成菌落，倒入1.0 g/L的刚果红溶液，染色1 h后弃去刚果红，用1.0 mol/L的NaCl浸泡1 h脱色，观察平板菌落周围有无水解带。
水解带如图1所示，可见，巨大芽孢杆菌RL-126菌株纤维素酶活性较高。
菌株纤维素水解带的大小在某种程度上代表了菌株产纤维素酶能力的强弱，为了进一步验证试验结果的可靠性，本研究采用连续取样的方式检测了发酵液纤维素酶及滤纸酶活性。
1.5巨大芽孢杆菌RL-126菌株合成纤维素酶活性的定量检测
将巨大芽孢杆菌RL-126菌株接种于NB培养基中37℃摇床振荡培养过夜，按10%的接种量（V/V）接种于液体发酵培养基中，25℃恒温培养，分别于培养3、5、7、9、11 d时取5.0mL发酵液，8000 r/min离心10 min取上清液即粗酶液，以不接菌的空白发酵培养基作对照，测定其纤维素酶活力和滤纸酶活力。纤维素酶及滤纸酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法。
1.5.1葡萄糖含量标准曲线绘制
准确称取105℃下烘干至恒重的葡萄糖2.5 g，精确至0.1 mg，用蒸馏水定容至50mL，配置成50 mg/mL葡萄糖标准贮备溶液。分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至50 mL，摇匀得到葡萄糖浓度分别为0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/mL的标准溶液。按表1分别吸取葡萄糖标准溶液、缓冲液和DNS试剂于各管中（每管号作3个平行），混匀。将试管置于沸水浴反应10min，迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL混匀，540 nm测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得线性回归方程，线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
表1葡萄糖标准曲线
Figure 601814DEST_PATH_IMAGE001
所得葡萄糖含量标准曲线如图2所示。该标准曲线的回归方程为y=0.166x－0.163，方差R2=0.999，表明此曲线具有良好的线性关系。
1.5.2 纤维素酶活力的测定
向25 mL具塞试管中加入2.0 mL以0.05 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液配制的1.0% CMC-Na溶液，50℃水浴预热5 min。加入0.5 mL巨大芽孢杆菌RL-126菌株发酵上清液，摇匀，50℃反应30 min后取出，迅速加入DNS试剂3.0 mL，放入沸水浴显色10 min，取出后立即置于冰水中冷却至室温，用水定容至25.0 mL，摇匀。以相同条件下沸水浴灭活5 min的发酵上清液为空白，540 nm测定其吸光度值，通过查1.5.1中的葡萄糖含量标准曲线求出还原糖的含量。
酶活力单位的定义：在上述条件下，每毫升酶液在1 min内催化底物生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL。纤维素酶活力计算公式：
X=（5.56×M×n）/V×t；
式中X，MC酶活力（U/mL）；
M，吸光度在标准曲线上查得（或计算出）的葡萄糖量（mg）；
n，酶液的稀释倍数；
V，酶液体积（mL）；
t，时间（min）；
5.56为1 mg葡萄糖的μmol数（1000/180=5.56）。
1.5.3 滤纸酶活力的测定
向25 mL具塞试管加入50.0 mg无淀粉新华滤纸和2.0 mL 0.05 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液，50℃水浴预热5 min，加入巨大芽孢杆菌RL-126菌株发酵上清液0.5 mL，以相同条件下沸水浴灭活5 min发酵上清液为空白对照，50℃水浴保温1 h，立即向试管中加入3.0 mL DNS溶液，充分摇匀后沸水浴放置10 min，立即冷却后用蒸馏水定容至25.0 mL，充分混匀。540 nm测定样品OD值，在1.5.1中的葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖量，根据葡萄糖量计算出滤纸酶活力。酶活力单位的定义及计算公式同1.5.2的纤维素酶活力计算公式。
1.5.4 结果
结果表明，巨大芽孢杆菌RL-126菌株在发酵11 d时纤维素酶活力达18.97 U/mL（如图3所示），滤纸酶活力为19.34 U/mL（如图4所示）。
1.6巨大芽孢杆菌RL-126菌株降解木质素能力的定性检测
巨大芽孢杆菌RL-126菌株降解木质素能力采用Azure-B平板脱色法进行。在苯胺蓝培养基上以十字划线法接种巨大芽孢杆菌RL-126菌株，37℃避光培养5 d，根据培养基中菌落的脱色圈来定性检测其木质素降解情况。结果如图5所示，可见，巨大芽孢杆菌RL-126菌株对苯胺蓝降解活性较高。
为了进一步验证试验结果的可靠性，本研究采用连续取样的方式检测了发酵液漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶活性。
1.7 巨大芽孢杆菌RL-126菌株降解木质素能力定量检测
将巨大芽孢杆菌RL-126菌株接种于NB培养基中37℃摇床振荡培养过夜，按10%的接种量（V/V）接种于液体发酵培养基中，25℃恒温培养，分别于培养3、5、7、9、11 d时取5.0mL发酵液，4000 r/min离心10 min取上清液即粗酶液，以不接菌的空白发酵培养基作对照，测定其漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶活力。
漆酶活力测定：通过监测ABTS（2, 2-连氮-二-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）的氧化来测定巨大芽孢杆菌RL-126菌株漆酶活性。反应体系为3 mL，反应混合液中含有2 mL 0.5mmol/L ABTS（溶于0.1 mmol/L pH 5.0的醋酸—醋酸钠缓冲溶液中），添加RL-126菌株发酵上清液1 mL于37℃启动反应，在420 nm下测定吸光度的变化值。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量。
锰过氧化物酶活力测定：50 mmol/L的乳酸钠缓冲液（pH 4.5）3.4 mL，1.6 mmol/L的MnSO4溶液0.1mL，0.4 mL的巨大芽孢杆菌RL-126菌株发酵上清液，预热至37℃加入1.6mmol/L的H2O2溶液0.1 mL启动反应，测定反应最初3 min内λ=240 nm处吸光度变化，一个酶活力单位用每分钟吸光值增加0.1的酶量表示。
木质素过氧化物酶活力的测定：通过在310nm下监测藜芦醇被氧化成藜芦醛进行测定。反应体系为3 mL，反应混合液含有1.85 mL 0.24 mmol/L藜芦醇和1.0 mL发酵上清液，预热至37℃后加入0.1 mL 6 mmol/L的H2O2启动反应，测定3 min后在310 nm下吸光度值的增加量。一个活力单位（U）定义为每分钟氧化1 μmol藜芦醇所需要的酶量。
检测结果表明，巨大芽孢杆菌RL-126菌株在培养9 d时，漆酶活力达到最大值，为11.68 U/mL（如图6所示）；在培养7 d时，锰过氧化物酶活力达到最大值，达到54.66 U/mL（如图7所示）；在培养9 d时，木质素过氧化物酶活力达到最大值，达到6.84 U/mL（如图8所示）。
1.8 巨大芽孢杆菌RL-126菌株对秸秆腐解率检测
选取粗细与长度接近的完整的玉米秸秆，裁成约2 cm小段，称取40 g秸秆（烘干重），喷洒溶解有0.4 g尿素的去离子水10 mL，处理1组（T1）在秸秆均匀喷洒活菌含量1×107 cfu/mL的巨大芽孢杆菌悬液10 mL，处理2组（T2）在秸秆均匀喷洒活菌含量2×107 cfu/mL的巨大芽孢杆菌悬液10 mL，以喷洒去离子水为对照组（CK）。将秸秆装入40目尼龙网袋中，水平埋入约5~10 cm土层（以覆土厚度5 cm为准）。取样时间分别为埋后30、90、150 d，每次取3个重复，取样后用水洗至无色，烘干后称重，计算秸秆的腐解率。秸秆腐解率%=秸秆腐解后干质量/腐解前干质量。
结果如表2所示：
表2巨大芽孢杆菌RL-126菌株对秸秆降解率的影响
Figure 975026DEST_PATH_IMAGE002
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同字母表示同一检测时间下不同处理组的数据经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
结果表明，秸秆腐熟30 d，3个处理之间差异显著，T2处理秸秆降解率最高，达46.17%，T1处理秸秆降解率显著低于T2处理，但显著高于对照组，表明利用巨大芽孢杆菌RL-126菌株处理30 d后，玉米秸秆的降解率显著提高，提高巨大芽孢杆菌的接种量，玉米的降解率随之显著提高。利用巨大芽孢杆菌RL-126菌株腐熟玉米秸秆90 d后，和对照相比，秸秆降解率显著提高，T2处理高于T1处理，但两者之间差异不显著。巨大芽孢杆菌处理150 d后，三个处理之间差异不显著。试验结果表明，巨大芽孢杆菌RL-126菌株显著提高了玉米秸秆的降解率，提高菌剂接种剂量，秸秆降解率也显著提高。但经过长时间处理后，添加菌剂对秸秆腐熟的促进作用在减弱。巨大芽孢杆菌RL-126的加入，在短时间处理时（30 d）作用效果显著，表明该菌剂的施用可以快速地促进秸秆腐熟降解，从而避免秸秆还田对小麦出苗造成的不利影响，促进了小麦的出苗及生长。
1.9 巨大芽孢杆菌RL-126菌株促进玉米秸秆腐熟的田间效果试验
试验地点为河北省保定市清苑区大张庄村，地势平坦，水浇条件良好。玉米秸秆机械粉碎后全量还田，试验共设3个处理，每个处理666.7 m2。处理1，人工收获玉米后将秸秆清理干净，基施复混肥料60 kg/亩，翻地时将肥料翻压到地下；处理2：玉米机械收获，秸秆粉碎至粒径小于2cm，基施复混肥料60 kg/亩，翻地时将打碎的秸秆和肥料一起翻压到地下；处理3，玉米机械收获，秸秆粉碎至粒径小于2cm，每亩地喷施活菌含量为1×109 cfu/mL的巨大芽孢杆菌RL-126液体菌剂20 L，基施复混肥料60 kg/亩，翻地时将菌剂同打碎的秸秆和肥料一起翻压到地下。翻地后第5天，种植小麦，之后统一管理。其中，各处理组基施的复混肥料相同，N:P2O5:K2O=15:15:15，总养分≥45%；处理2和处理3组的秸秆量相同，均为4000斤/亩。
在小麦乳熟期，取样测定穗数、穗粒数、千粒重，根据所取植株总产量折合亩产，分析秸秆还田及巨大芽孢杆菌RL-126菌株对小麦产量的影响，结果如表3所示。
表3 不同处理对小麦产量的影响
处理 穗数/m2 穗粒数 千粒重/g 产量/（g/m2）
处理1 792.17±44.46a 32.69±3.18a 31.76±1.89a 822.46±35.37b
处理2 794.65±37.21a 33.46±2.73a 32.19±2.68a 855.90±23.51ab
处理3 824.89±40.17a 32.19±2.96a 34.02±2.24a 903.34±37.92a
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同字母表示同一检测指标、不同处理组的数据经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
结果表明，和处理1相比，处理2和处理3小麦的穗数、穗粒数、千粒重和产量均有增加，其中穗数、穗粒数和千粒重增加不显著，处理3小麦相较于处理1产量增加显著。和处理1比较，处理2小麦产量达到855.90 g/m2，增产4.07%；处理3小麦产量为903.34 g/m2，增产9.83%。和处理2比较，处理3小麦产量增产5.54%，以上结果表明秸秆还田配施巨大芽孢杆菌RL-126可以通过提高有效分蘖数和籽粒重来提高产量，作用效果显著。
1.10 土壤理化性质和酶活力检测
在1.9中的小麦收获时，采用5点取样法收集各处理5~10 cm深度土壤。用2.5:1（质量比）的水土比浸提法测土壤pH，土壤有机质测定采用重铬酸钾容量法，全氮测定采用凯氏定氮法，碱解氮测定采用碱扩散法，速效磷测定采用碳酸氢钠溶解钼锑抗比色法，有效钾测定采用乙酸铵溶解火焰光度计法。脲酶活性检测采用苯酚钠—次氯酸钠比色法：以24 h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示；碱性磷酸酶活性检测采用磷酸苯二钠比色法：以24 h后1 g土壤中释出的酚的质量（mg）表示；纤维素酶活性检测采用3,5-硝基水杨酸比色法：以72 h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示；过氧化氢酶活性检测采用高锰酸钾滴定法：以每g干土1 h内消耗的0.1 mol/L KMnO4体积数（以mL计）表示。土壤理化性质检测结果如表4所示，土壤生物酶活性检测结果如表5所示。
表4 不同处理对土壤理化性质的影响
处理 全氮 （%） 碱解氮 （mg/kg） 速效磷 （mg/kg） 速效钾 （mg/kg） 有机质 （g/kg） pH
处理1 2.32±0.06b 147.72±11.92b 33.72±3.46b 210.48±5.24c 11.68±2.87b 8.68±0.08a
处理2 2.54±0.05a 182.47±7.57a 41.28±3.75a 240.62±4.73b 16.77±1.28a 8.39±0.02b
处理3 2.48±0.04a 179.90±13.40a 43.69±2.89a 261.93±5.18a 15.93±1.13a 8.22±0.03c
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同字母表示同一检测指标、不同处理组的数据经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
表5 不同处理对土壤酶活力的影响
处理 脲酶活性 [mg/(g·d)] 纤维素酶活性 [mg/(10g·72h)] 碱性磷酸酶活性[mg/(g·d)] 过氧化氢酶活性[mL(KMnO4)/(h·g)]
处理1 1.52±0.17c 3.38±0.39c 5.13±0.47c 1.21±0.09b
处理2 2.14±0.33b 4.12±0.24b 6.34±0.56b 1.55±0.18a
处理3 2.95±0.42a 4.91±0.31a 7.05±0.35a 1.51±0.24a
注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同字母表示同一检测指标、不同处理组的数据经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。
土壤理化性质检测结果表明，秸秆还田增加了土壤全氮、碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量，促使土壤pH降低，效果显著。巨大芽孢杆菌RL-126的施用进一步增加了土壤速效磷和速效钾的含量，促使土壤pH降低，其中速效钾和pH变化显著。全氮、碱解氮和有机质有所下降，但差异不显著。表明巨大芽孢杆菌RL-126的施用促进了秸秆的降解以及营养成分的释放，效果显著。
土壤生物酶活性检测结果表明，秸秆还田增加了土壤脲酶、纤维素酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性，效果显著。巨大芽孢杆菌RL-126的施用进一步增加了土壤脲酶、纤维素酶和碱性磷酸酶活性，和没有添加菌剂的处理2相比，脲酶和纤维素酶活性差异显著，碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性差异不显著。处理3和没有进行秸秆还田的处理1相比，脲酶活性增加94.08%，纤维素酶活性增加45.27%，碱性磷酸酶活性增加37.43%，表明巨大芽孢杆菌RL-126的施用显著增加了土壤酶活性。
1.11 巨大芽孢杆菌RL-126菌株对小麦根部病害病原菌拮抗作用检测
将26℃恒温培养5 d的小麦全蚀病和纹枯病病原菌用打孔器选取直径0.7 cm的小块接种于PDA平板中央。将小麦根腐病病原菌接种到PDA斜面，26℃恒温培养7 d。将无菌水加入病原菌斜面，用无菌玻璃棒轻刮病原菌，使孢子悬浮。用无菌水调整悬浮液中孢子数量使其浓度为1×106/mL，孢子数量通过血球计数板进行计数。将10 mL病原菌孢子悬浮液和100 mL PDA培养基混合后倒平板。在含有3种病原菌的每个平板按照十字交叉的方法均匀打4个孔，其中3个孔放置50μL巨大芽孢杆菌无菌上清液，另外一个孔加入灭菌培养基作为阴性对照。将菌株接种到NB培养基中，37℃振荡培养过夜，按照10%接种量接入到种子培养基中，37℃振荡培养48h。吸取1mL培养液10000r/min离心5min，上清液经孔径0.22 μm亲水微孔滤膜过滤即为无菌上清液。将平板放置26℃培养箱恒温培养过夜后，将平板倒置培养5~7 d。观察抑菌圈或者抑菌带形成情况。
检测结果表明，巨大芽孢杆菌RL-126菌株对小麦全蚀病菌具有显著的抑制作用，抑菌带宽度达1.21 cm（如图9所示），对小麦纹枯病菌的抑菌带宽度为1.12 cm（如图10所示），对小麦根腐病菌具有显著的抑制活性，抑菌圈直径达2.41 cm（如图11所示）。
实施例2
本实施例提供了一种促进农作物秸秆腐熟的方法：
将秸秆粉碎至粒径小于2cm后，每1kg秸秆喷洒250mL 40mg/mL的尿素水溶液，再喷洒250mL活菌含量1×107~2×107cfu/mL的巨大芽孢杆菌RL-126菌株菌悬液，发酵30天以上。
实施例3
本实施例提供了一种液体菌剂，该菌剂为含有巨大芽孢杆菌RL-126活菌株的液体制剂，活菌含量为1×109~2×109 cfu/mL。
实施例4
本实施例提供了一种秸秆还田的方法，将秸秆粉碎至粒径小于2cm，每亩（秸秆用量为3000~5000斤/亩）喷施实施例3中的液体菌剂20L后，与基施复混肥料（N:P2O5:K2O=15:15:15；总养分≥45%，用量为60kg/亩）共同翻压到地下，3~7天后种植作物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北冀微生物技术有限公司，河北农业大学
<120> 一株巨大芽孢杆菌RL-126及其促作物生长的应用
<130> 20220511
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1408
<212> DNA
<213> 16SrDNA
<400> 1
gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg ttagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg ggaaaccgaa gctaataccg 120
gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg tttcggctat cacttacaga 180
tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcata 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta caagagtaac 420
tgcttgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080
tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg 1200
tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag ccaatcccat aaaaccattc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cggtggagta actagccg 1408

Claims (10)

1.巨大芽孢杆菌RL-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的保藏编号为CGMCC No. 24619。
2.一种促进农作物秸秆腐熟的方法，其特征在于，将秸秆粉碎后喷洒含氮源的水溶液，再喷洒权利要求1所述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的菌悬液，发酵30天以上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的菌悬液的活菌浓度为1×107~2×107cfu/mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮源为尿素。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述巨大芽孢杆菌RL-126菌株的活菌株。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂。
7.一种秸秆还田的方法，其特征在于，将秸秆粉碎，施用权利要求6所述的液体菌剂后，与肥料共同翻压到地下，3~7天后种植作物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肥料为复混肥料，施入量为50~70kg/亩。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述复混肥料中的氮、磷、钾元素比例为：N:P2O5:K2O=15:15:15；总养分≥45%。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述秸秆的用量为3000~5000斤/亩，所述液体菌剂中巨大芽孢杆菌RL-126菌株菌悬液的活菌浓度为1×109~2×109cfu/mL。
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