CN114904012B - 一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物、其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物‑药物偶联物、其制备方法及其用途。本发明的活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物‑药物偶联物的结构式如式Ⅰ所示。R为重复单元A和重复单元B聚合而成的分子链，重复单元A为：其中，RD为RDOH脱去羟基后的取代基，所述RDOH为抗肿瘤药物分子；重复单元B为：本发明提供的活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物‑药物偶联物能够解决ROS响应性DDS中药物释放不足的问题，在抗肿瘤药物的开发和应用中具有非常高的应用潜力。

Description

一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物、其制备 方法及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物、其制备方法及其用途。
背景技术
药物传递***(drug delivery system，DDS)是指人们在防治疾病的过程中所采用的各种药物的给药形式。其设计理念是把药物在必要的时间、以必要的量、输送到必要的部位，以达到最大的疗效和最小的毒副作用。
目前，活性氧(ROS)响应性的DDS已被广泛报道。作为内源性刺激物，ROS包括超氧化物(O2 -)、次氯酸根离子(OCl-)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)、羟基自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)，并且在肿瘤细胞中可达到0.1mM的高水平，这比正常细胞(～0.02μM)高一千倍。肿瘤细胞中如此高水平的ROS已被用做刺激源应用在了药物递送***当中。然而，在许多情况下，这些ROS响性的DDS并没有实现药物的充分释放。这种低释放效率可部分归因于不同肿瘤组织中ROS水平的异质性，或缺乏更智能、更具协同性的DDS。
肉桂醛(CA)是肉桂中的主要成分，其安全性已得到美国食品和药物管理局(FDA)的认可。据报道CA能够在线粒体中产生ROS，并通过放大氧化应激诱导癌细胞凋亡。然而，CA中的醛基会发生快速氧化，且其抗肿瘤功效低，这阻碍了CA在抗肿瘤药物中的应用。中国发明专利“CN113072704A一种基于活性氧自放大降解的聚硫缩醛及其制备方法和应用”公开了一种基于活性氧自放大降解的聚硫缩醛及其制备方法和应用。本发明提供的聚硫缩醛由肉桂醛衍生而来，结构式如下：
该聚硫缩醛的结构可有效保护CA中的醛基不被氧化。同时，聚硫缩醛中的硫缩醛键在ROS存在的条件下可响应断裂，而硫缩醛键响应断裂后释放出的CA可在细胞内产生ROS，CA产生的ROS又进一步使聚硫缩醛中的硫缩醛链断裂，产生自放大降解的效果。将这种聚硫缩醛作为肿瘤药物载体，其易于受到肿瘤内的ROS诱导而高效降解，有助于快速将药物释放于肿瘤细胞内，这为药物的有效释放开辟了新的途径。
然而，CA产生ROS的作用需要在线粒体中进行，上述聚硫缩醛不具有靶向富集至肿瘤细胞线粒体中的作用，这限制了其自放大降解释放药物作用的发挥。且此聚合物亲疏水结构单元不明确，难以形成稳定的纳米空腔用于包载抗肿瘤药物。因此，有必要提供新的载药体系，对CA和抗肿瘤药物进行负载，并能够实现靶向富集至线粒体的功能。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物、其制备方法及其用途，目的在于提供一种能够有效靶向富集至肿瘤细胞线粒体，并产生级联放大降解作用，有效在肿瘤细胞中释放抗肿瘤药物。
一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物，其特征在于，它的结构式如式Ⅰ所示：
其中，n的取值选自43-227，
R为x个重复单元A和y个重复单元B聚合而成的分子链，x的取值选自2-10，优选为5-10，y的取值选自20-40，
重复单元A为：其中，RD为RDOH脱去羟基后的取代基，所述RDOH为抗肿瘤药物分子；
重复单元B为：其中RB选自氢或甲基，X选自O、
优选的，所述RDOH为紫衫醇、多西他赛、阿霉素、表阿霉素、卡培他滨、卡巴他赛、2-甲氧基***、喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、拓扑替康或伊立替康。
优选的，所述重复单元B选自
优选的，所述RDOH为紫衫醇，所述重复单元B选自
n＝113，x＝3，y＝25。
本发明还提供上述偶联物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备如下化合物A：
(2)制备如下化合物B：
(3)化合物A、化合物B和甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯通过如下反应式制备式Ⅰ所示化合物：
其中，n、R和RD如权利要求1或2所述。
优选的，步骤(1)具体包括如下步骤：
(1.1)按照如下反应式制备化合物TA-CA-NH2：
(1.2)按照如下反应式制备化合物R1-TA-CA-NH2：
(1.3)按照如下反应式制备化合物CTA-NPC：
(1.4)按照下反应式制备化合物A：
优选的，步骤(2)具体包括如下步骤：
(2.1)按照如下反应式制备化合物TA-CA：
(2.2)按照如下反应式制备化合物MA-TA-CA：
(2.3)按照如下反应式制备化合物B：
优选的，步骤(3)中，所述化合物A、化合物B和甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯的投料比为摩尔比1:(20-40):(2-7)；
和/或，所述反应在引发剂的作用下进行，所述引发剂选自VA044、AIBN、ACVA或V501中的至少一种；
和/或，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂选自DMSO和H2O体积比9:1的混合液、1,4-二氧六环、四氢呋喃或三氟乙醇中的至少一种；
和/或，所述反应的条件为：在惰性气氛中，45-85℃下反应16-48小时。
本发明还提供一种胶束，它是由上述偶联物形成的。
优选的，所述胶束的粒径为100-200nm；
和/或，所述胶束的zeta电位在pH＝7.4的环境中为-15～-5mV，所述胶束的zeta电位在pH＝6.0的环境中为+10～+25mV，所述胶束的zeta电位在pH＝5.2的环境中为+25～+30mV。
本发明还提供上述偶联物或者胶束在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明还提供一种药物，它是以上述偶联物或者胶束作为活性成分，加上药学上可接受的辅料后制成的。
本发明基于正反馈策略设计并合成了活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物。该偶联物中具有pH敏感的N,N-二异丙胺(DPA)部分，DPA在肿瘤细胞酸性环境中可以与质子结合形成带正电荷的铵。由于带正电荷的纳米颗粒可与带负电荷的线粒体膜发生强烈相互作用，因此共聚物中的DPA部分有利于将偶联物转移到线粒体。同时，该偶联物具有ROS响应的特性，能够在肿瘤细胞环境中释放出抗肿瘤药物和CA，CA在线粒体中能够进一步产生ROS，对偶联物产生自降解作用，进一步促进抗肿瘤药物和CA的释放。基于上述原理，本发明的偶联物中各功能部分的协同合作能够显着增强偶联物释放抗肿瘤药物的能力，进而增强其抗肿瘤功效。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中MA-TA-CA-PTX的核磁共振氢谱；
图2为实施例1中mPEG5k-NPC的核磁共振氢谱；
图3为实施例1中mPEG5k-TA-CA-NH2的核磁共振氢谱；
图4为实施例1中mPEG5k-TA-CA-CTA的核磁共振氢谱；
图5为实施例1中mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)的核磁共振氢谱；
图6为对比例1中MA-TK-PTX的核磁共振氢谱；
图7为对比例1中mPEG5k-TK-CTA的核磁共振氢谱；
图8为对比例1中mPEG5k-TK-block-poly(TK-PTX-co-DPA)的核磁共振氢谱；
图9为对比例2中mPEG5k-CTA的核磁共振氢谱；
图10为对比例2中mPEG5k-block-poly(TK-PTX-co-DPA)的核磁共振氢谱；
图11为聚合物的分子量测试结果；
图12为不同pH下胶束的Zeta电位；
图13为不同pH下胶束的粒径；
图14为实施例2制备的胶束的TEM图像；
图15为前药体外释放实验结果；
图16为以PBS、CA、TA-CA-前药、TK-前药或前药处理4T1细胞2h后的荧光图像，其中CA浓度为12μg/mL，各前药组中PTX浓度为48μg/mL。通过荧光探针DCFH-DA(绿色：DCFH)检测细胞ROS水平。比例尺:50μm；
图17为各前药对4T1细胞的IC50；
图18为前药处理4T1细胞2h后，其在细胞内的定位(Cy5浓度为0.5μg/mL)；其中，Lystracker Green和Mitotracker Green分别标记4T1细胞中的线粒体和溶酶体，比例尺:25μm；
图19为4T1细胞暴露于PTX前药或CA 4h后线粒体膜电位变化的CLSM图像，比例尺:25μm；
图20为使用Cy5通过IVIS Spectrum***进行体外荧光成像，监测药物在主要器官/肿瘤中的分布和荷瘤小鼠给药后的生存时间，数据以mean±SD表示，n＝3；
图21为荷瘤小鼠给药后肿瘤增殖曲线图(n＝6)，每隔一天记录肿瘤的长度和宽度；
图22为通过分离的肿瘤质量计算肿瘤生长抑制率(n＝6)；
图23为荷瘤小鼠被不同药物处理后的体重变化；
图24 H&E、免疫组化和免疫荧光染色检测肿瘤组织坏死、增殖(Ki67)、血管生成(CD31)和凋亡，比例尺:50μm，数据以均数±SD表示，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，无特别说明的情况下，所用的试剂和材料均为市售品。
实施例1偶联物mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)的合成
本实施例通过如下合成路线合成得到本发明偶联物的一种优选结构mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)(简称TA-CA-Prodrug)：
上述反应式中x＝3，y＝25。
具体步骤如下：
步骤一：
将肉桂醛(CA,10.00g,75.67mmol)和β-巯基乙醇(11.82g,151.33mmol)溶解在70mL THF中，然后在0℃下加入ZrCl4(3.53g,15.13mmol)。将反应混合物在0℃下再搅拌30分钟，再蒸发除去溶剂。所得粗产物经硅胶层析纯化得到TA-C A-OH白色固体(18.19g)，产率89％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.49-7.44(m,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.29-7.23(m,1H),6.59(d,J＝15.6Hz,1H),6.18(dd,J＝15.6,9.0Hz,1H),4.82(m,3H),3.56(m,4H),2.74-2.60(m,4H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ136.27,130.80,129.12,128.54,128.32,126.93,61.24,51.31,33.79.HR-MS(ESI):[M+Na]+calcd for C13H18O2S2 293.0640,found293.0644.
步骤二：
将TA-CA-OH(1.00g,3.70mmol)溶于30mL含有三乙胺(TEA,0.77mL,5.55mmol)的无水THF，并冰浴下将甲基丙烯酰氯(0.39g,3.70mmol)的THF溶液缓慢加入反应体系。反应在冰浴中继续进行4小时。过滤除去三乙胺盐酸盐的白色固体，蒸除滤液中的溶剂。所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到无色油状的MA-TA-CA-OH(0.98g)，产率为78％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.50-7.44(m,2H),7.36-7.32(m,2H),7.29-7.29(m,1H),6.61(d,J＝15.6Hz,1H),6.21(dd,J＝15.6,9.0Hz,1H),6.04(m,1H),5.70(m,1H),4.86(d,J＝9.0Hz,1H),4.28(t,J＝6.6Hz,2H),3.57(t,J＝6.8Hz,2H),2.97-2.82(m,2H),2.75-2.62(m,2H),1.90-1.85(m,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ166.73,136.16,136.09,131.17,129.11,128.39,128.14,126.97,126.50,63.90,61.20,51.30,33.82,29.82,18.43.HR-MS(ESI):[M+Na]+calcd for C17H22O3S2361.0903,found 361.0907.
步骤三：
将MA-TA-CA-OH(0.20g,0.59mmol)溶解在20mL含有TEA(0.16mL,1.18mmol)的无水THF和中，并加入催化量的DMAP。在冰浴下，将4-硝基苯氧羰基氯(0.18g，0.89mmol)的THF溶液缓慢加入上述混合物中。反应体系在室温下搅拌过夜。过滤除去产生的三乙胺盐酸盐固体，将滤液滴加到PTX(530.80mg，0.59mmol)和DMAP(216.24mg，1.77mmol)的二氯甲烷(DCM)溶液中。反应24小时后，混合物用稀HCl、饱和Na2CO3和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂，所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到MA-TA-CA-PTX，为白色固体(0.59g)，产率为82％。
MA-TA-CA-PTX的1H NMR谱图如图1所示。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.99(d,J＝7.1Hz,2H),7.86(d,J＝7.2Hz,2H),7.73(t,J＝7.2Hz,1H),7.66(t,J＝7.4Hz,2H),7.55(t,J＝7.2Hz,1H),7.51-7.42(m,7H),7.37-7.30(m,2H),7.27(t,J＝7.2Hz,1H),7.21-7.17(m,1H),6.62(dd,J＝15.6,7.6Hz,1H),6.31(s,1H),6.22(dd,J＝15.6,9.0Hz,1H),6.03(s,1H),5.85(s,1H),5.68(s,1H),5.55(t,J＝8.6Hz,1H),5.42(d,J＝7.1Hz,1H),5.36(d,J＝8.6Hz,1H),4.96-4.87(m,3H),4.67(s,1H),4.38-4.23(m,4H),4.15-4.09(m,1H),4.04-3.97(m,2H),3.59(d,J＝7.2Hz,1H),2.95-2.85(m,4H),2.39-2.21(m,4H),2.10(d,J＝2.4Hz,3H),1.86(s,3H),1.81(s,3H),1.69-1.60(m,1H),1.50(s,4H),1.03-1.01(m,6H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ202.81,170.10,169.37,169.15,166.75,166.72,165.63,154.11,139.62,137.37,136.07,136.01,135.99,134.42,133.88,132.01,131.63,130.32,130.02,129.21,129.11,128.77,128.50,128.00,127.87,127.62,127.03,126.51,84.03,80.66,77.08,75.70,75.09,74.88,71.55,71.10,70.87,67.84,63.71,57.82,54.33,51.29,46.47,43.37,36.95,34.77,29.89,29.83,29.49,26.75,22.99,21.81,21.10,18.41,14.38,10.21.HR-MS(ESI):[M+Na]+calcd for C65H71NO18S2 1240.4005,found 1240.4014.
步骤四：
将CA(2.91g，22.00mmol)和2,2,2-三氟-N-(2-巯基乙基)乙酰胺(8.00g，46.20mmol)溶解在100毫升THF中，冰浴下加入氯化铝(1.47g，11.00mmol)，继续冰浴下搅拌10分钟。蒸除溶剂，所得粗产物经硅胶色谱纯化，得到TA-CA-NHCOCF3，为白色固体(9.06g)，产率89％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.48(d,J＝7.3Hz,2H),7.35(t,J＝7.0Hz,2H),7.30-7.24(m,1H),6.64(d,J＝15.6Hz,1H),6.20(dd,J＝15.6,9.0Hz,1H),4.85(d,J＝8.9Hz,1H),3.46-3.38(m,4H),2.76(m,4H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ156.47,156.11,135.69,131.13,128.65,128.00,127.20,126.57,117.30,114.44,50.10,29.32.HR-MS(ESI):[M+Na]+calcd for C17H17F2N2O2S2 483.0606,found 483.0608.
步骤五：
将TA-CA-NHCOCF3(5.00g,10.86mmol)溶解在50mL甲醇中并加入50mL NaOH(2.17g,54.29mmol)水溶液。将混合物搅拌30分钟以完全去保护三氟乙酰基。减压除去甲醇，所得溶液用DCM(100mL)萃取3次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂得TA-CA-NH2，为淡黄色粘稠液体(2.49g)，产率为85％。
步骤六：
将CTA(0.30g,1.07mmol)在冰浴下加入到30mL含有2-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,0.71g,1.88mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA,0.31mL,1.88mmol)的二氯甲烷中，再加入2-氨基乙醇(65.60mg，1.07mmol)。此反应体系在室温下继续反应10分钟。溶液用饱和碳酸氢钠、稀HCl和饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂，所得粗产品通过硅胶色谱柱纯化，得到CTA-OH，为紫色粘稠物(0.31g)，产率为90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.91(d,J＝7.2Hz,2H),7.69(t,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,2H),3.40(q,J＝6.0Hz,2H),3.12(q,J＝6.0Hz,2H),2.49-2.34(m,4H),1.91(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ229.02,175.28,149.37,138.79,134.20,131.61,123.93,64.99,51.58,46.83,43.47,38.59,35.77,28.35.HR-MS(ESI):[M+Na]+calcd forC15H18N2O2S2 345.0702,found 345.0688.
步骤七：
在催化量的DMAP存在下，将CTA-OH(0.30g,0.93mmol)溶于20mL含有三乙胺(0.26mL,1.86mmol)的无水THF中。在冰浴下，将氯甲酸4-硝基苯酯(0.37g，1.86mmol)的THF溶液滴加到上述反应体系中，并继续反应过夜。过滤除去生成的三乙胺盐酸盐固体，蒸除有机溶剂。粗产物经硅胶柱色谱纯化得到CTA-NPC，为紫色粘稠物(0.27g)，产率为60％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.26(d,J＝9.2Hz,2H),7.89(d,J＝7.6Hz,2H),7.56(t,J＝7.4Hz,1H),7.40-7.37(m,4H),4.38(t,J＝5.2Hz,2H),3.68-3.65(m,2H),2.73-2.54(m,3H),2.48-2.38(m,1H),1.94(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ222.44,170.73,155.29,152.37,145.47,145.34,144.41,133.07,128.56,126.61,125.31,121.72,67.85,45.99,38.61,38.52,33.93,31.84,24.26.HR-MS(ESI):[M+Na]+calcd for C22H21N3O6S2 510.0764,found510.0765.
步骤八：
在催化量的DMAP存在下，将mPEG5k-OH(10.00g，2.00mmol)溶解在100mL含有DIEA(3.96mL，24.00mmol)的无水DCM中。在冰浴下，将氯甲酸4-硝基苯酯(4.03g，20.00mmol)的DCM溶液滴加到上述，反应体系中，并在室温下继续反应24小时，然后减压蒸除溶剂。将浓缩混合物滴加到***(500mL)中，析出固体。通过循环进行溶解-沉淀程序，得到所需产物。在真空下干燥后，得到白色固体的mPEG5k-NPC(9.53g)，产率为92％。mPEG5k-NPC的1H NMR谱图如图2所示。
步骤九：
将mPEG5k-NPC(5g,1mmol,20mL)的DCM溶液逐滴加入TA-CA-NH2(0.81g，3mmol)溶液中。此时溶液的颜色变成黄色，并室温反应48小时。除去溶剂，将残留物溶于水中进行透析纯化，并冷冻干燥。最后，获得产品mPEG5k-TA-CA-NH2(4.58g)为白色固体，产率92％。mPEG5k-TA-CA-NH2的1H NMR谱图如图3所示。
步骤十：
将mPEG5k-TA-CA-NH2(0.5mmol)溶解在25mL DCM中。搅拌下在反应体系中滴加CTA-NPC的DCM溶液(0.49g，1mmol，25mL)，继续反应48小时。反应完成后，将反应液进行浓缩，并滴加到***(300mL)中，析出粉色固体。通过循环进行溶解-沉淀程序两次后，得到产物。真空干燥后，得到粉红色固体mPEG5k-TA-CA-CTA，产率70％。mPEG5k-TA-CA-CTA的1HNMR谱图如图4所示。
步骤十一：
mPEG5k-TA-CA-CTA(0.30g,0.055mmol)、单体MA-TA-CA-PTX(0.33g,0.27mmol)和甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(0.35g,1.64mmol)在氩气气氛下加入圆底烧瓶中。密封圆底烧瓶并将含有引发剂VA044(7.05mg,0.022mmol)的4mL DMSO/H2O(9/1,v/v)注入反应瓶中。用氩气鼓泡30分钟后，将反应混合物在47℃下搅拌24小时。此后，用液氮淬灭反应并将混合物滴加到MeOH/H2O(400mL，1/1，v/v)中，得到沉淀物，收集后真空干燥，并重新溶解在DCM中。将该溶液滴加到***(300mL)中并收集沉淀物。真空干燥后，最终的前药mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)，为淡粉色固体，产率65％。mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)的1H NMR谱图如图5所示，各结构单元的核磁特征峰在谱图中均可对应找到，表明本实施例确实合成了如上述反应式的产物结构式所示的偶联物。
实施例2 mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)胶束的制备
将mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)(10mg)溶解在100μL N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中，并在超声处理下将所得溶液缓慢加入到4mL蒸馏水中。最后，通过对去离子水透析过夜去除有机溶剂后获得纳米尺度的mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)胶束。
对比例1偶联物mPEG5k-TK-block-poly(TK-PTX-co-DPA)的合成
本对比例通过如下合成路线合成得到mPEG5k-TK-block-poly(TK-PTX-co-DPA)(简称TK-Prodrug)：
上述反应式中x＝3，y＝29。
本对比例中，MA-TK-PTX的合成与实施例1中MA-TA-CA-PTX的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的CA替换为丙酮。MA-TK-PTX的1H NMR谱图如图6所示。
TK-NH2的合成与实施例1中TA-CA-NH2的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的CA替换为丙酮。需要说明的是，本对比例中，结构式的y值与实施例1不同的原因是聚合度有所差异。
mPEG5k-TK-NH2的合成与实施例1中mPEG5k-TA-CA-NH2的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的TA-CA-NH2替换为TK-NH2。
mPEG5k-TK-CTA的合成与实施例1中mPEG5k-TA-CA-CTA的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的mPEG5k-TA-CA-NH2替换为mPEG5k-TK-NH2。mPEG5k-TK-CTA的1H NMR谱图如图7所示。
TK-Prodrug的合成与实施例1中TA-CA-Prodrug的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的mPEG5k-TA-CA-CTA替换为mPEG5k-TK-CTA，MA-TA-CA-PTX替换为MA-TK-PTX。TK-Prodrug的1H NMR谱图如图8所示。
对比例2偶联物mPEG5k-block-poly(TK-PTX-co-DPA)的合成
本对比例通过如下合成路线合成得到mPEG5k-block-poly(TK-PTX-co-DPA)(简称Prodrug)：
上述反应式中x＝3，y＝26。
本对比例中，MA-TK-PTX的合成方法与对比例1相同。
mPEG5k-CTA的合成与实施例1中mPEG5k-TA-CA-CTA的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的mPEG5k-TA-CA-NH2替换为mPEG5k-NH2。需要说明的是，本对比例中，结构式的y值与实施例1不同的原因是聚合度有所差异。mPEG5k-CTA的1H NMR谱图如图9所示。
Prodrug的合成与实施例1中TA-CA-Prodrug的合成方法、原料用量(摩尔比)相同，区别在于将原料中的mPEG5k-TA-CA-CTA替换为mPEG5k-CTA，MA-TA-CA-PTX替换为MA-TK-PTX。Prodrug的1H NMR谱图如图10所示。
为了进一步说明本发明的技术效果，下面通过实验对以上实施例和对比例制备的各偶联物的物化性质和活性进行测试。在以下实验结果的讨论中，TA-CA-Prodrug、TK-Prodrug和Prodrug也被统称为“前药”或“PTX前药”。
实验例1 GPC实验
为了计算聚合物分子量，进行了凝胶渗透色谱(GPC)分析。取2mg两亲聚合物溶解在800μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入200μLLiCl(0.2M水溶液)。过滤后，混合溶液用于GPC分析。DMF/LiCl(4/1，体积比)的混合溶液用作流动相，流速为0.5mL/min。通过普鲁士蓝标准品的标准曲线，确定各聚合物的分子量。结果如图11所示。
从结果来看，相较于各大分子链转移剂(mPEG5k-TA-CA-CTA、mPEG5k-TK-CTA、mPEG5k-CTA)，所得聚合物的分子量都有明显增加，且单分散性较好，说明聚合反应已成功进行。
实验例2胶束粒径和电位
本实验例研究实施例2制备得到的胶束的粒径和电位。
实验方法：动态光散射(DLS)实验用于测量自组装纳米粒子的水相粒径，PALS方法用于检测其zeta电位。将制备的两亲聚合物纳米颗粒利用去离子水稀释为1mg/mL。去离子水的pH通过1mol/L的稀盐酸和1mol/L的氢氧化钠调节，用pH计检测。然后，将溶液转移到比色皿中，并通过全方位多角度粒度分析仪和高灵敏度zeta电位计(美国布鲁克海文仪器公司)进行测量。测量参数为：检测角度＝90°，平衡时间＝60s，测量时间＝30s，测量温度＝25℃。每个样品记录三次。
不同pH下胶束的电位结果如图12所示，由于TA-CA-Prodrug中存在pH敏感部分DPA，zeta电位从pH 7.4时的-10.32mV增加到pH 6.0时的+23.23mV和pH 5.2时的+27.70mV。
不同pH下胶束的粒径如图13所示，TA-CA-Prodrug的粒径大小在pH 7.4时为150.72nm(PDI 0.24)和在pH 6.2时为173.24nm(PDI 0.22)。
实施例2的胶束在透射电子显微镜(TEM)下显示出球形形态，如图14所示，说明TA-CA-Prodrug自组装过程形成了胶束结构。
实验例3体外药物释放实验
实验方法：为了研究TA-CA-Prodrug释放效率过氧化氢浓度之间的关系，进行如下测试：在37℃(n＝3，n为实验重复次数)下，将1.0mg/mL的TA-CA-Prodrug胶束悬浮在2.0mL含有不同浓度H2O2(0、0.01、0.1和1mM)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)溶液中。在给定的时间间隔内，取出100μL溶液并用乙腈稀释至1mL，利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC，SHIMADZU，日本)进行测量。
为了评估聚合物结构对药物释放效率的影响，将TK-Prodrug和Prodrug悬浮在含有0.1mM H2O2的PBS溶液中。然后，以与上述类似的程序进行实验。
结果如图15所示，在没有ROS(H2O2)的情况下，PTX和CA的释放量可以忽略不计，这表明TA-CA-Prodrug在低ROS水平下的正常组织中药物释放较难，因此这种DDS可以减少PTX的副作用。在ROS的刺激下，在HPLC色谱图中观察到PTX和CA的峰，这证明了TA-CA-Prodrug能够响应ROS释放PTX和CA。在低ROS浓度(0.01mM)下，约20％的PTX从TA-CA-Prodrug释放了出来，释放速度非常缓慢。随着ROS浓度的增加，释放的PTX量和释放速率均显着升高，表明TA-CA-Prodrug的药物释放与ROS浓度呈正相关。因此，及时补偿细胞内ROS消耗，有利于药物的有效释放。
比较相同ROS浓度下TA-CA-Prodrug、TK-Prodrug和Prodrug的药物释放曲线。与Prodrug相比，TA-CA-Prodrug和TK-Prodrug释放了更多的PTX。
实验例4体外ROS检测
实验方法：本实验例中小鼠乳腺肿瘤细胞系(4T1)来源于中国科学院(上海，中国)。用荧光探针以二氯荧光素-二乙酸酯(DCFH-DA)检测分别用TA-CA-Prodrug、TK-Prodrug、Prodrug或CA处理的4T1细胞内产生的ROS。对不同样品处理4T1细胞并作用不同时间后，用DCF-DA(μM)染色30min，然后用荧光显微镜下观察细胞图像。
结果如图16所示。经TA-CA-Prodrug处理后的细胞内绿色荧光强度明显强于TK-Prodrug处理后的细胞。经TA-CA-Prodrug处理后的细胞中ROS水平是TK-Prodrug组细胞的1.21倍。在三种前药中，TA-CA-Prodrug诱导的ROS水平最高，部分归因于TA-CA-Prodrug释放的两种可诱导ROS生成的化合物CA和PTX。此外，由于ROS的正反馈，PTX从TA-CA-Prodrug中快速、充分的释放也可能是细胞内ROS差异的原因。Prodrug处理组细胞内ROS水平低于TK-Prodrug处理组，可能是由于PTX从Prodrug中释放的速度较慢，因为Prodrug的共聚主链中没有ROS响应连接物。
实验例5细胞活力测定
实验方法：以每孔5000个细胞的密度将4T1细胞接种于96孔板中。培养24h后，用PTX、TA-CA-Prodrug、TK-Prodrug或Prodrug(0-90μg/mL的PTX浓度)溶解于新鲜培养基中处理贴附细胞48h。每孔加入含有10％CCK-8(Dojindo)的RPMI 1640。将96孔板放置于细胞培养箱中继续孵育2.5h，然后在450nm处测量吸光度。IC50值由GraphPad Prism 8.0.2计算得出。本实验例中IC50值以PTX质量计算。
结果如图17所示。三种前药处理后细胞活力与三种前药中PTX的浓度存在相关性。Graphpad Prism中计算得到CA、TA-CA-Prodrug、TK-Prodrug和Prodrug的IC50值分别为3.93μg/mL、1.31μg/mL、4.32μg/mL和7.13μg/mL，明显高于PTX(0.04μg/mL)。与PTX相比，TA-CA-Prodrug、TK-Prodrug和Prodrug的细胞毒性较低，这是由于其被细胞内化的过程缓慢，以及药物释放需要时间。
实验例6前药亚细胞定位
实验方法：将4T1细胞铺在8孔腔室载玻片(Cellvis)上培养，每孔5000个细胞，孵育48h后分别用含等量Cy5(浓度为0.5μg/mL)的TA-CA-前药、TK-前药或前药处理细胞2h。分别用Hoechst 33342、Lystracker Green和Mitotracker Green对细胞核、溶酶体和线粒体进行染色，并在CLSM(NIKON)下采集图像。使用image J软件分析Pearson相关系数(Pcc)、Manders重叠系数(Moc)和Manders共定位系数。
PTX前药在4T1细胞内的转运结果如图18所示，细胞与装载有Cy5(红色)的前药处理2h后，用Hoechst 33342(蓝色)、Lysotracker(绿色)和Mito-tracker(绿色)染色对细胞的细胞核、溶酶体和线粒体进行荧光标记。CLSM图像中的红色荧光信号是由被细胞内化的前药物产生的。由于溶酶体和线粒体被标记为绿色，所以前药和溶酶体或线粒体的共定位区域应显示为黄色荧光。细胞内的绿色荧光信号(溶酶体示踪剂)和红色荧光信号(前药)交织在一起，但在图18A中可以看到非常微弱的黄色荧光信号。这一结果表明，只有少量前药在内化后转移到溶酶体。然而，在图18B中发现红色信号(前药)和绿色信号(线粒体)高度重叠。重叠区域出现强烈的黄色荧光信号，表明前药大部分被转运到线粒体而不是溶酶体。由于在酸性环境下，这些前药在晚期内涵体中具有正的表面电位，这些前药物可能能够从内涵体逃逸，并与带负电荷的线粒体膜相互作用。此外，前药在线粒体中的定位有利于TA-CA-Prodrug的药物和CA释放。线粒体是产生ROS的主要细胞器之一，线粒体周围的ROS水平往往较高。TA-CA-Prodrug到达线粒体后，高ROS水平有利于TA-CA-Prodrug释放CA和PTX。释放的CA可以与线粒体相互作用产生更多ROS，进一步促进该前药的ROS响应性药物释放。
实验例7线粒体膜电位
实验方法：为检测线粒体膜电位的变化，采用JC-10荧光探针对不同前药处理后的4T1细胞线粒体进行染色。处理后的细胞用无酚红RPMI 1640培养基洗涤。然后将JC-10溶解于37°的完全培养基中，置于培养箱黑暗中染色20min。用含2％胎牛血清的新鲜无酚红RPMI1640培养基替代原培养基，在CLSM下观察。流式细胞仪检测：处理后的细胞用胰蛋白酶消化，离心收集，使用温热的JC-10溶液悬浮细胞，放置于培养箱中孵育20min，然后通过流式细胞仪(FACS Aria II,Becton Dickinson,USA)检测。
结果如图19所示。由于这些前药物积累在线粒体中，且前药物释放CA和PTX后可在细胞内产生ROS。因此，推测前药可能对线粒体产生损伤。JC-10可通过线粒体膜电位的变化(Δψm)来评估4T1癌细胞的线粒体功能。药物与细胞处理4h后，用JC-10染料染色20min。与受损线粒体膜相互作用的“J-单体”显示为绿色荧光，而与正常线粒体膜相互作用的“J-聚集体”显示为红色荧光。如图19中，与对照组相比，三种前药处理后的细胞中红色荧光强度明显降低。红色荧光的减少或绿色荧光的增加表明线粒体膜受到了高水平去极化的损害。TA-CA-Prodrug释放的CA和PTX可快速生成ROS，这表明TA-CA-Prodrug破坏线粒体功能的作用最强。
实施例8体内成像研究
实验方法：雌性BALB/c小鼠来源于成都达硕生物研究所(中国成都)。动物研究程序按照华西医院实验动物护理和使用指南进行，并经四川大学动物伦理委员会批准。4T1荷瘤小鼠经尾静脉给予Cy5@TA-CA-Prodrug、Cy5@TK-Prodrug或Cy5@Prodrug(Cy5剂量为1mg/kg)。注射后的4、12、24或24h，在BALB/c小鼠中检测这些前药的生物分布。用生理盐水中彻底冲洗手术切除的器官/组织(肿瘤，心脏，脾，肝，肺和肾)，并放置在体内成像***(PerkinElmer)进行明场及荧光成像(0.5s曝光时间；激发滤光片＝640nm，发射滤光片＝680nm)。
结果如图20所示。4T1荷瘤小鼠静脉注射前药后，3种前药的Cy5信号主要出现在肝脏和脾脏(图20A和20B)。4h时，肝脏和脾脏中TK-Prodrug的积累量高于TA-CA-Prodrug和Prodrug，这可能与TK-Prodrug粒径较大有关。因此，TK-Prodrug可能肝和脾的网状内皮吞噬***摄取。TA-CA-Prodrug由于粒径较小，富集于肾脏，可通过肾脏排出。由于粒径小，其被网状内皮***摄取较少。因此，更多的TA-CA-Prodrug可以在血液中循环，血液循环时间更长，从而增加其在肿瘤部位的富集。随着时间延长至48h,TA-CA-Prodrug在肿瘤部位的Cy5荧光信号逐渐增强，表明TA-CA-Prodrug在肿瘤部位有良好的聚集和保留。然而，肿瘤中Prodrug和TK-Prodrug的Cy5荧光信号在24h达到峰值，之后就逐渐下降(图20B)。
实验例9体内抗肿瘤作用
实验方法：体内抗肿瘤实验采用雌性BALB/c小鼠，体重为20±2g。每只小鼠皮下注射1×106个4T1细胞，用于构建4T1乳腺肿瘤移植小鼠模型。当肿瘤大小达到50mm3左右，开始进行抗肿瘤实验。小鼠随机分为5组，每组6只。每隔一天给一次药，给药5次。静脉注射生理盐水，PTX，TA-CA-前药，TK-前药或前药(相同的PTX剂量为10mg kg-1)。在预先设定的时间点，使用游标卡尺评估肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)计算公式如下:肿瘤体积＝L×W2/2，其中L和W分别为肿瘤的长度和宽度。此外，每隔一天记录体重变化。
结果如图21、22所示。通过监测肿瘤体积，TA-CA-Prodrug对肿瘤生长的抑制作用最强，而TK-Prodrug和Prodrug对肿瘤生长的抑制作用适中。根据肿瘤的质量计算肿瘤生长抑制率(TGI)。TGI在游离PTX治疗组为21.9％，而在Prodrug、TK-Prodrug和TA-CA-Prodrug治疗组分别为30.5％、34.3％和58.9％(图22)。这些结果表明TA-CA-Prodrug具有良好的抗肿瘤作用，其IC50最低，在肿瘤中有较高的生物分布。尽管肿瘤中TK-Prodrug的积累量低于Prodrug，但TK-Prodrug治疗组的TGI略高于Prodrug治疗组(图22)。这是由于TK-Prodrug的共聚物主链中存在可被ROS破坏的反应性TK基团。
另一发面，4T1荷瘤小鼠不同药物处理后的体重变化如图23所示。不同前药处理的小鼠体重没有明显变化，这意味着前药表现出较低的全身毒性。
实施例10苏木精-伊红染色、免疫组化以及TUNEL染色
实验方法：用各种PTX前药处理小鼠16天后，处死小鼠，分离肿瘤和内脏器官，在10％PBS缓冲液中性甲醛中固定24h，制备石蜡切片。然后，用苏木精和伊红(H&E)对切片进行染色。在光学显微镜下观察切片的组织学变化。对肿瘤切片用抗CD31和抗ki67抗体染色，在光学显微镜下采集免疫组化图像。采用(Promega Corp，USA)Dead End荧光TUNEL***对肿瘤组织切片进行染色。经脱氧核糖核酸酶处理的切片作为阳性对照。用光学显微镜(Imager Z2，Zeiss，Germany)对切片进行采图。
实验结果如图24所示。H&E染色后，前药组中切片可见组织大面积坏死，细胞间质减少，结构疏松，细胞核碎裂。TA-CA-Prodrug治疗组的组织病理损害程度最高。TUNEL染色检测肿瘤的原位凋亡，CD31和Ki67免疫组化检测肿瘤的抗血管生成和增殖能力。在使用TA-CA-Prodrug治疗的肿瘤中，Ki67和CD31阳性细胞的数量最低，这表明TA-CA-Prodrug能显著抑制肿瘤组织的增殖和血管生成。此外，经TUNEL染色后，TA-CA-Prodrug治疗的肿瘤中凋亡细胞数量明显增加。这些结果表明，TA-CA-Prodrug对肿瘤增殖和转移的抑制作用包括有效诱导肿瘤组织凋亡，抑制肿瘤组织细胞增殖和血管生成。
通过以上实施例和实验例能够可见，本发明的偶联物形成的胶束可以被4T1细胞内吞，并且具有时间依赖性。由于该偶联物分子中DPA部分可在酸性微环境中质子化，因而可以从晚期内体逃逸后到达线粒体。暴露于线粒体产生的高水平ROS后，该偶联物分子中CA和PTX的释放被触发。释放的CA可以与线粒体相互作用以产生更多的ROS，导致线粒体膜电位降低，并促进更多PTX从前药中释放。释放的PTX引起细胞周期停滞，并抑制其增值。这种新型前药中的级联ROS反馈效应增强了细胞周期停滞效应，最终导致肿瘤细胞凋亡。本发明的实施例制备的偶联物TA-CA-Prodrug形成的胶束与两个对照组(TK-Prodrug和Prodrug形成的胶束)相比，具有优化的共聚物结构和ROS放大的化疗作用，在消除荷瘤小鼠肿瘤方面具有突出的表现。
由此可证明，本发明提供的偶联物所形成的胶束能够解决ROS响应性DDS中药物释放不足的问题，在抗肿瘤药物的开发和应用中具有非常高的应用潜力。

Claims (6)

1.一种活性氧自补充的两亲性嵌段共聚物-药物偶联物，其特征在于，它按照如下方法制备得到：
步骤一：
将75.67mmol肉桂醛和151.33mmolβ-巯基乙醇溶解在70mL THF中，在0℃下加入15.13mmol ZrCl4；在0℃下再搅拌30分钟，蒸发除去溶剂；所得粗产物经硅胶层析纯化得到TA-CA；
步骤二：
将3.70mmolTA-CA溶于30mL含有5.55mmol三乙胺的无水THF，冰浴下将3.70mmol甲基丙烯酰氯的THF溶液缓慢加入反应体系，反应在冰浴中继续进行4小时，过滤除去三乙胺盐酸盐的白色固体，蒸除滤液中的溶剂，所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到无色油状的MA-TA-CA；
步骤三：
将0.59mmol MA-TA-CA溶解在20mL含有1.18mmolTEA的无水THF和中，加入催化量的DMAP；在冰浴下，将0.89mmol4-硝基苯氧羰基氯的THF溶液缓慢加入；反应体系在室温下搅拌过夜，过滤除去产生的三乙胺盐酸盐固体，将滤液滴加到0.59mmolPTX和1.77mmolDMAP的二氯甲烷溶液中，反应24小时后，混合物用稀HCl、饱和Na2CO3和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到MA-TA-CA-PTX；
步骤四：
将22.00mmolCA和46.20mmol2,2,2-三氟-N-(2-巯基乙基)乙酰胺溶解在100毫升THF中，冰浴下加入11.00mmol氯化铝，继续冰浴下搅拌10分钟；蒸除溶剂，所得粗产物经硅胶色谱纯化，得到TA-CA-NHCOCF3；
步骤五：
将10.86mmolTA-CA-NHCOCF3溶解在50mL甲醇中，并加入50mL含54.29mmolNaOH的水溶液，将混合物搅拌30分钟完全去保护三氟乙酰基；减压除去甲醇，所得溶液用100mLDCM萃取3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂得TA-CA-NH2；
步骤六：
将1.07mmol CTA在冰浴下加入到30mL含有1.88mmol2-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和1.88mmolN,N-二异丙基乙胺的二氯甲烷中，再加入1.07mmol2-氨基乙醇，此反应体系在室温下继续反应10分钟，溶液用饱和碳酸氢钠、稀HCl和饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，所得粗产品通过硅胶色谱柱纯化，得到CTA-OH；
步骤七：
在催化量的DMAP存在下，将0.93mmolCTA-OH溶于20mL含有1.86mmol三乙胺的无水THF中；在冰浴下，将1.86mmol氯甲酸4-硝基苯酯的THF溶液滴加到反应体系中，继续反应过夜；过滤除去生成的三乙胺盐酸盐固体，蒸除有机溶剂，粗产物经硅胶柱色谱纯化得到CTA-NPC；
步骤八：
在催化量的DMAP存在下，将2.00mmolmPEG5k-OH溶解在100mL含有24.00mmolDIEA的无水DCM中；在冰浴下，将20.00mmol氯甲酸4-硝基苯酯的DCM溶液滴加到反应体系中，在室温下继续反应24小时，减压蒸除溶剂，将浓缩混合物滴加到500mL***中，析出固体，通过循环进行溶解-沉淀程序，得到所需产物；在真空下干燥后，得到mPEG5k-NPC；
步骤九：
将含有1mmol mPEG5k-NPC的20mLDCM溶液逐滴加入含有3mmolTA-CA-NH2的溶液中，室温反应48小时，除去溶剂，将残留物溶于水中进行透析纯化，并冷冻干燥，获得产品mPEG5k-TA-CA-NH2；
步骤十：
将0.5mmolmPEG5k-TA-CA-NH2溶解在25mL DCM中；搅拌下在反应体系中滴加含有1mmolCTA-NPC的25mLDCM溶液，继续反应48小时；反应完成后，将反应液进行浓缩，并滴加到300mL***中，析出粉色固体；通过循环进行溶解-沉淀程序两次后，得到产物；真空干燥后，得到mPEG5k-TA-CA-CTA；
步骤十一：
将0.055mmolmPEG5k-TA-CA-CTA、0.27mmol单体MA-TA-CA-PTX和1.64mmol甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯在氩气气氛下加入圆底烧瓶中；密封圆底烧瓶并将含有0.022mmol引发剂VA044的4mL体积比9/1的DMSO/H2O注入反应瓶中；用氩气鼓泡30分钟后，将反应混合物在47℃下搅拌24小时；用液氮淬灭反应并将混合物滴加到400mL体积比1/1的MeOH/H2O中，得到沉淀物，收集后真空干燥，并重新溶解在DCM中；将得到的溶液滴加到300mL***中并收集沉淀物；真空干燥后，得到最终的偶联物mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)。
2.权利要求1所述的偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：
将75.67mmol肉桂醛和151.33mmolβ-巯基乙醇溶解在70mL THF中，在0℃下加入15.13mmol ZrCl4；在0℃下再搅拌30分钟，蒸发除去溶剂；所得粗产物经硅胶层析纯化得到TA-CA；
步骤二：
将3.70mmolTA-CA溶于30mL含有5.55mmol三乙胺的无水THF，冰浴下将3.70mmol甲基丙烯酰氯的THF溶液缓慢加入反应体系，反应在冰浴中继续进行4小时，过滤除去三乙胺盐酸盐的白色固体，蒸除滤液中的溶剂，所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到无色油状的MA-TA-CA；
步骤三：
将0.59mmol MA-TA-CA溶解在20mL含有1.18mmolTEA的无水THF和中，加入催化量的DMAP；在冰浴下，将0.89mmol 4-硝基苯氧羰基氯的THF溶液缓慢加入；反应体系在室温下搅拌过夜，过滤除去产生的三乙胺盐酸盐固体，将滤液滴加到0.59mmol PTX和1.77mmol DMAP的二氯甲烷溶液中，反应24小时后，混合物用稀HCl、饱和Na2CO3和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，所得残余物通过硅胶色谱纯化，得到MA-TA-CA-PTX；
步骤四：
将22.00mmol CA和46.20mmol 2,2,2-三氟-N-(2-巯基乙基)乙酰胺溶解在100毫升THF中，冰浴下加入11.00mmol氯化铝，继续冰浴下搅拌10分钟；蒸除溶剂，所得粗产物经硅胶色谱纯化，得到TA-CA-NHCOCF3；
步骤五：
将10.86mmolTA-CA-NHCOCF3溶解在50mL甲醇中，并加入50mL含54.29mmolNaOH的水溶液，将混合物搅拌30分钟完全去保护三氟乙酰基；减压除去甲醇，所得溶液用100mLDCM萃取3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂得TA-CA-NH2；
步骤六：
将1.07mmol CTA在冰浴下加入到30mL含有1.88mmol 2-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和1.88mmol N,N-二异丙基乙胺的二氯甲烷中，再加入1.07mmol 2-氨基乙醇，此反应体系在室温下继续反应10分钟，溶液用饱和碳酸氢钠、稀HCl和饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，所得粗产品通过硅胶色谱柱纯化，得到CTA-OH；
步骤七：
在催化量的DMAP存在下，将0.93mmol CTA-OH溶于20mL含有1.86mmol三乙胺的无水THF中；在冰浴下，将1.86mmol氯甲酸4-硝基苯酯的THF溶液滴加到反应体系中，继续反应过夜；过滤除去生成的三乙胺盐酸盐固体，蒸除有机溶剂，粗产物经硅胶柱色谱纯化得到CTA-NPC；
步骤八：
在催化量的DMAP存在下，将2.00mmol mPEG5k-OH溶解在100mL含有24.00mmol DIEA的无水DCM中；在冰浴下，将20.00mmol氯甲酸4-硝基苯酯的DCM溶液滴加到反应体系中，在室温下继续反应24小时，减压蒸除溶剂，将浓缩混合物滴加到500mL***中，析出固体，通过循环进行溶解-沉淀程序，得到所需产物；在真空下干燥后，得到mPEG5k-NPC；
步骤九：
将含有1mmol mPEG5k-NPC的20mL DCM溶液逐滴加入含有3mmol TA-CA-NH2的溶液中，室温反应48小时，除去溶剂，将残留物溶于水中进行透析纯化，并冷冻干燥，获得产品mPEG5k-TA-CA-NH2；
步骤十：
将0.5mmol mPEG5k-TA-CA-NH2溶解在25mL DCM中；搅拌下在反应体系中滴加含有1mmolCTA-NPC的25mLDCM溶液，继续反应48小时；反应完成后，将反应液进行浓缩，并滴加到300mL***中，析出粉色固体；通过循环进行溶解-沉淀程序两次后，得到产物；真空干燥后，得到mPEG5k-TA-CA-CTA；
步骤十一：
将0.055mmol mPEG5k-TA-CA-CTA、0.27mmol单体MA-TA-CA-PTX和1.64mmol甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯在氩气气氛下加入圆底烧瓶中；密封圆底烧瓶并将含有0.022mmol引发剂VA044的4mL体积比9/1的DMSO/H2O注入反应瓶中；用氩气鼓泡30分钟后，将反应混合物在47℃下搅拌24小时；用液氮淬灭反应并将混合物滴加到400mL体积比1/1的MeOH/H2O中，得到沉淀物，收集后真空干燥，并重新溶解在DCM中；将得到的溶液滴加到300mL***中并收集沉淀物；真空干燥后，得到最终的偶联物mPEG5k-TA-CA-block-poly(TA-CA-PTX-co-DPA)。
3.一种胶束，其特征在于：它是由权利要求1所述的偶联物形成的。
4.按照权利要求3所述的胶束，其特征在于：所述胶束的粒径为100-200nm；
和/或，所述胶束的zeta电位在pH＝7.4的环境中为-15～-5mV，所述胶束的zeta电位在pH＝6.0的环境中为+10～+25mV，所述胶束的zeta电位在pH＝5.2的环境中为+25～+30mV。
5.权利要求1所述的偶联物，或者权利要求3或4所述的胶束在制备抗肿瘤药物中的用途。
6.一种药物，其特征在于：它是以权利要求1所述的偶联物，或者权利要求3或4所述的胶束作为活性成分，加上药学上可接受的辅料后制成的。
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