CN114891685B - 一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用。所述组合物包括嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88。本发明所述的制备方法通过多联发酵制备方法使菌体具有良好的抗逆性能力，可以在人体肠胃中达到较强耐消化及耐温性的嗜酸乳杆菌，同时通过菌体的协同作用使所述的益生菌达到更高活性的功效，利用此益生菌制备方法的嗜酸乳杆菌可以提升菌体生长活性，降低其面对胁迫环境的损伤，达到提升抗逆性的功效。

Description

一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于营养保健食品技术领域，具体涉及一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
益生菌是有益于宿主健康的一类微生物，1965年在Science上首次被提出。肠道菌系平衡是对人体营养和健康至关重要的因素，益生菌对人体肠道菌系有很好的调节作用，这使得益生菌的研究成为食品研究的一大热点。
益生菌作为微生态制剂的重要菌种，在维护人和动物肠道健康、促进体内微生态平衡方面起着重要的作用，大量研究表明，益生菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。
嗜酸乳杆菌(Lactobacilus acidophilus)是一种重要的益生菌，其具有改善肠道健康、调节免疫、减轻肥胖、治疗肠道疾病等众多益生功能，并且由于益生菌的产酸功能，还可以替代饲料中的酸化剂，因此被认为是一种理想的微生态制剂。在医药、食品和饲料均有应用，市场需求巨大。但常规嗜酸乳杆菌生产成本高，耐温性不佳，活性下降快，贮藏中很容易上失活，产品中活菌数很难达到规定的最小活菌限量106cfu/g。提高嗜酸乳杆菌的抗逆性生产制备方法具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。
CN108771241A公开了一种具有抗氧化作用的益生菌组合物及其用途，具体提供了该益生菌组合物的具体组成、含此益生菌组合物的益生菌粉及其在保健食品领域的应用。该益生菌组合物按质量百分比计包括：20％-40％的嗜酸乳杆菌、25％-45％的植物乳杆菌、5％-10％的木糖醇、15％-25％的菊糖。此益生菌组合物含有的木糖醇及菊糖均为功能性多糖，具有低甜、低热、血糖影响小的特点，但耐温性不佳，活性下降快，贮藏中很容易上失活。
CN111840357A公开了一种以水苏糖为主的复合微生态调节剂，为了解决直接添加双歧杆菌粉、嗜酸乳杆菌粉，其抗逆性和环境耐受性不高问题；具体以下组分原料：水苏糖、棉子低聚糖、低聚果糖、益生菌和辅料，水苏糖、棉子低聚糖、低聚果糖的重量份配比为2:1:1，该方法为提高嗜酸乳杆菌等菌粉的抗逆性采用了多种糖类进行包覆，然而并不能提升菌剂自身的抗逆性，当包衣逐渐消失后微生物复合菌剂的抗逆性和环境耐受性将大幅度下降。
因此，亟待提供一种提高嗜酸乳杆菌的抗逆性的产品及其生产制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用。本发明的目的在于解决现有技术存在的嗜酸乳杆菌发酵工艺菌粉面对复合情况菌体存活率及抗逆性不能得到很好的表现。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物，所述组合物包括嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88；
所述嗜酸乳杆菌LA85为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA85，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC NO.1.12735，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述嗜酸乳杆菌LA05为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年10月9日，保藏编号为CGMCC NO.23546，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述嗜酸乳杆菌LA88为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA88，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月15日，保藏编号为 CGMCC NO.24109，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明中，嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88三种采用的菌株具有优异的耐酸耐胆盐功效，且三种益生菌复合，相互配合，具有协同增效的作用，使所述的益生菌达到更高活性的功效，使菌体具有良好的抗逆性能力，可以在人体肠胃中达到较强耐消化及耐温性的嗜酸乳杆菌。
优选地，所述嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88的比为(4-12):(2.5-15):(1-3.5)；
其中，“4-12”例如可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12等；
其中，“2.5-15”例如可以是2.5、3、4、5、6、7、8、10、12、15等；
其中，“1-3.5”例如可以是1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.5、3、3.5等。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88混合接种于种子培养基中，进行一级培养，得到一级种子液，再将一级种子液接种于种子培养基中，进行二级培养，得到二级级种子液，最后将二级级种子液接种于高密度培养基中，进行高密度发酵，得到发酵液；
(2)将发酵液离心后，收集菌泥，将菌泥和保护剂混合，冷冻干燥，得到所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物。
在本发明中，除采用嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88三种益生菌复合外，在制备过程中还通过多联发酵制备方法，与一般地单独培养后再混合更能使菌体具有良好的抗逆性能力，从而可以在人体肠胃中达到较强耐消化及耐温性的嗜酸乳杆菌，利用此益生菌制备方法的嗜酸乳杆菌可以提升菌体生长活性，降低其面对胁迫环境的损伤，达到提升抗逆性的功效。
在本发明中，各个菌株经过复配比例的优化，同时与高活性发酵功效的培养基联合作用，赋予所述的制备方法更好地抗逆性效果。采用的菌株具有优异的耐酸耐胆盐功效；多联发酵工艺及制备方法的关键控制点；菌株间的最佳复配比例与高活性发酵培养基的联合作用。
优选地，步骤(1)中，所述种子培养基按质量浓度计包括如下组分：葡萄糖18-22g/L、牛肉浸粉8-12g/L、酵母粉4-6g/L、蛋白胨8-12g/L、乙酸钠4-6 g/L、柠檬酸钠1-3g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温80 0.5-1.5g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5-1.5g/L。
在所述种子培养基中，葡萄糖的浓度为18-22g/L，例如可以是18g/L、19 g/L、20g/L、21g/L、22g/L等。
在所述种子培养基中，牛肉浸粉的浓度为8-12g/L，例如可以是8g/L、9g/L、 10g/L、11g/L、12g/L等。
在所述种子培养基中，酵母粉的浓度为4-6g/L，例如可以是4g/L、4.5g/L、 5g/L、5.5g/L、6g/L等。
在所述种子培养基中，蛋白胨的浓度为8-12g/L，例如可以是8g/L、9g/L、 10g/L、11g/L、12g/L等。
在所述种子培养基中，乙酸钠的浓度为4-6g/L，例如可以是4g/L、4.5g/L、 5g/L、5.5g/L、6g/L等。
在所述种子培养基中，柠檬酸钠的浓度为1-3g/L，例如可以是1g/L、1.5 g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L等。
在所述种子培养基中，磷酸氢二钾的浓度为2-4g/L，例如可以是2g/L、2.5 g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L等。
在所述种子培养基中，硫酸镁的浓度为0.4-0.6g/L，例如可以是0.4g/L、 0.45g/L、0.5g/L、0.55g/L、0.6g/L等。
在所述种子培养基中，硫酸锰的浓度为0.05-0.2g/L，例如可以是0.05g/L、0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.17g/L、0.2g/L等。
在所述种子培养基中，吐温80的浓度为0.5-1.5g/L，例如可以是0.5g/L、 0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L等。
在所述种子培养基中，L-半胱氨酸盐酸盐的浓度为0.5-1.5g/L，例如可以是0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L等。
优选地，步骤(1)中，所述种子培养基需在110-120℃(例如可以是110℃、 112℃、114℃、116℃、118℃、120℃等)下灭菌15-25min(例如可以是15min、 16min、18min、20min、22min、25min等)。
优选地，步骤(1)中，所述混合接种的总接种量为1-5vol％，例如可以是 1vol％、1.5vol％、2vol％、2.5vol％、3vol％、3.5vol％、4vol％、4.5vol％、5 vol％等。
优选地，步骤(1)中，所述一级培养为静置培养，一级培养的温度为30-40℃ (例如可以是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃等)，一级培养的时间为 5-24h(例如可以是5h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、 24h等)。
优选地，步骤(1)中，所述一级种子液在种子培养基中的接种量为1-5vol％，例如可以是1vol％、1.5vol％、2vol％、2.5vol％、3vol％、3.5vol％、4vol％、4.5vol％、5vol％等。
优选地，步骤(1)中，所述二级培养为静置培养，二级培养的温度为30-40℃ (例如可以是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃等)，二级培养的时间为 5-24h(例如可以是5h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等)。
优选地，步骤(1)中，所述高密度培养基按质量浓度计包括如下组分：葡萄糖38-42g/L、牛肉浸粉14-16g/L、酵母粉8-12g/L、蛋白胨8-12g/L、乙酸钠4-6g/L、柠檬酸钠1-3g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、硫酸锰 0.05-0.2g/L、吐温80 0.5-1.5g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5-1.5g/L。
在所述高密度培养基中，葡萄糖的浓度为38-42g/L，例如可以是38g/L、 39g/L、40g/L、41g/L、42g/L等。
在所述高密度培养基中，牛肉浸粉的浓度为14-16g/L，例如可以是14g/L、 14.5g/L、15g/L、15.5g/L、16g/L等。
在所述高密度培养基中，酵母粉的浓度为8-12g/L，例如可以是8g/L、9g/L、 10g/L、11g/L、12g/L等。
在所述高密度培养基中，蛋白胨的浓度为8-12g/L，例如可以是8g/L、9g/L、 10g/L、11g/L、12g/L等。
在所述高密度培养基中，乙酸钠的浓度为4-6g/L，例如可以是4g/L、4.5 g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L等。
在所述高密度培养基中，柠檬酸钠的浓度为1-3g/L，例如可以是1g/L、1.5 g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L等。
在所述高密度培养基中，磷酸氢二钾的浓度为2-4g/L，例如可以是2g/L、 2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L等。
在所述高密度培养基中，硫酸镁的浓度为0.4-0.6g/L，例如可以是0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L、0.55g/L、0.6g/L等。
在所述高密度培养基中，硫酸锰的浓度为0.05-0.2g/L，例如可以是0.05g/L、0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.17g/L、0.2g/L等。
在所述高密度培养基中，吐温80的浓度为0.5-1.5g/L，例如可以是0.5g/L、 0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L等。
在所述高密度培养基中，L-半胱氨酸盐酸盐的浓度为0.5-1.5g/L，例如可以是0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L等。
优选地，步骤(1)中，所述高密度培养基需在110-120℃(例如可以是110℃、112℃、114℃、116℃、118℃、120℃等)下灭菌15-25min(例如可以是15min、 16min、18min、20min、22min、25min等)。
优选地，步骤(1)中，所述二级级种子液在高密度培养基中的接种量为 1-5vol％，例如可以是1vol％、1.5vol％、2vol％、2.5vol％、3vol％、3.5vol％、 4vol％、4.5vol％、5vol％等。
优选地，步骤(1)中，所述高密度发酵在搅拌下进行，所述搅拌的转速为 50-100rpm(例如可以是50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm 等)，发酵的温度为30-40℃(例如可以是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、 40℃等)，发酵的压力为0.01-0.05MPa(例如可以是0.01MPa、0.02MPa、0.03 MPa、0.04MPa、0.05MPa等)，发酵的时间为6-16h(例如可以是6h、7h、 8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h等)。
优选地，步骤(1)中，所述高密度发酵的过程中需控制发酵液的pH为5-6，例如可以是5、5.2、5.4、5.6、5.8、6等。
在本发明中，将二级级种子液接种于高密度培养基，初始发酵液pH为6.4-6.6(例如可以是6.4、6.5、6.6等)的条件下开始发酵，发酵过程中用20-25wt％ (例如可以是20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％等)碳酸钠水溶液维持pH为5-6进行发酵。高密度发酵是指提升了发酵培养基中的碳氮比构成，致菌体生长量相较常规培养基浓度更高。
优选地，步骤(2)中，所述离心的温度为3-5℃(例如可以是3℃、3.5℃、 4℃、4.5℃、5℃等)，离心的转速为6000-8000rpm(例如可以是6000rpm、 6500rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm等)，离心的时间为12-20min(例如可以是12min、14min、16min、18min、20min等)。
优选地，步骤(2)中，所述菌泥和保护剂的质量比为1:(1-2)，例如可以是 1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2等。
优选地，步骤(2)中，所述保护剂包括海藻糖、甘油、甘露醇或吐温中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)中，所述保护剂按质量百分含量计由如下组分组成：海藻糖10-15％、甘油1-2％、甘露醇0.02-0.1％、吐温-80 0.02-0.1％，余量为水。
以所述保护剂质量为100％计，所述海藻糖的含量为10-15％，例如可以是 10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
以所述保护剂质量为100％计，所述甘油的含量为1-2％，例如可以是1％、 1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等。
以所述保护剂质量为100％计，所述甘露醇的含量为0.02-0.1％，例如可以是0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％等。
以所述保护剂质量为100％计，所述吐温-80的含量为0.02-0.1％，例如可以是0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％等。
优选地，步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-42℃，例如可以是-45℃、-44℃、-43℃、-42℃等，冷冻干燥的时间为20-28h，例如可以是20h、21h、 22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h等。
优选地，步骤(2)后还需进行步骤(3)：将提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物粉碎后，低温储藏。
优选地，所述粉碎后得到的菌粉粒径为60-100目，例如可以是60目、70 目、80目、90目、100目等。
优选地，所述低温储藏的温度为-35～-10℃，例如可以是-35℃、-30℃、-25℃、 -20℃、-15℃、-10℃等。
优选地，本发明还提供一种第一方面所述的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌 LA05和嗜酸乳杆菌LA88的筛选方法，所述筛选方法具体包括以下步骤：
(a)将嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88分别接种到含不同浓度胃液的改良MRS固体培养基中，分别确定其对胃液的耐受性；
(b)以确定的胃液浓度为起始浓度，将嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05 和嗜酸乳杆菌LA88分别接种到含胃液的改良MRS固体培养基中进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同胃液浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上直径大于1mm的菌落分别接入相同胃液浓度的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含胃液浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为二代；重复此操作，直至传代驯化培养15-30代(例如可以是15代、17代、20代、22代、24代、26代、28 代、30代等)；
(c)将驯化后的菌株分别进行筛选，接种到改良MRS液体培养基中培养，筛选出经过驯化后耐受性能力强的菌种并分别保藏，即得到耐受性高的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88。
在本发明中，第一方面和第二方面使用的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌 LA05和嗜酸乳杆菌LA88为经过上述方法筛选得到的，所用的菌株经过驯化均具有优异的耐酸耐胆盐效果。
优选地，步骤(a)中，所述不同浓度胃液指模拟人体胃肠液条件配置的胃液环境：用1mol/L的HCl将改良MRS液体培养基的pH值调至3.0-5.0(例如可以是3.0、3.5、4.0、4.5、5.0等)，121℃灭菌20min，无菌添加胃蛋白酶 3-10mg/mL(如可以使3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8 mg/mL、9mg/mL、10mg/mL等)、NaCl 0.3-0.9％(例如可以是0.3％、0.4％、 0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％等)，配制模拟胃液；通过不同浓度胃液梯度 pH3.0、4.0、5.0菌体存活量对比其存活能力。
优选地，所述改良MRS固体培养基、改良MRS液体培养基指的是指L-MRS 固体或液体培养基，是添加了L-半胱氨酸盐的MRS培养基，半胱氨酸盐酸盐具有还原性，可以消耗培养基中的氧。相较于单一MRS培养基，改良MRS培养基中菌体生长速率更快，厌氧条件更好。
优选地，步骤(a)中，所述评价耐受性的方法为：人体餐后胃液浓度稀释致3.0-5.0，优选选择相同胃液浓度pH 4.0，通过活菌计数定性判定菌种耐受酸度和胆盐浓度的能力。
优选地，步骤(c)中，使菌体增殖后，在培养基表面挑选直径大于1mm，边缘清晰菌体单一性高的菌落进行平板划线筛选。
第四方面，本发明提供一种根据第一方面所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物在制备医药、食品或饲料中的用途。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明涉及应用多联发酵提高嗜酸乳杆菌抗逆性的制备方法，本发明中所用的菌株经过驯化均具有优异的耐酸耐胆盐效果，各个菌株经过复配比例的优化，同时与高活性发酵功效的培养基联合作用，赋予所述的制备方法更好地抗逆性效果；
(2)本发明采用的菌株具有优异的耐酸耐胆盐功效；多联发酵工艺及制备方法的关键控制点；且菌株间的最佳复配比例与高活性发酵培养基的联合作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明采用的常见试剂的配方如下，在后续实施例中不再赘述。
①改良MRS固体培养基配方为：20g/L葡萄糖、10g/L牛肉浸粉、5g/L 酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸钠、3g/L磷酸氢二钾、0.5 g/L硫酸镁、0.1g/L硫酸锰、1g/L吐温80、1g/L L-半胱氨酸盐酸盐、1.5％琼脂，115℃灭菌20min。
②改良MRS液体培养基配方为：20g/L葡萄糖、10g/L牛肉浸粉、5g/L 酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸钠、3g/L磷酸氢二钾、0.5 g/L硫酸镁、0.1g/L硫酸锰、1g/L吐温80、1g/L L-半胱氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
③种子培养基配方为：20g/L葡萄糖、10g/L牛肉浸粉、5g/L酵母粉、10 g/L蛋白胨、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸钠、3g/L磷酸氢二钾、0.5g/L硫酸镁、0.1g/L硫酸锰、1g/L吐温80、1g/L L-半胱氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
④高密度培养基配方为：40g/L葡萄糖、15g/L牛肉浸粉、10g/L酵母粉、 10g/L蛋白胨、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸钠、3g/L磷酸氢二钾、0.5g/L硫酸镁、0.1g/L硫酸锰、1g/L吐温80、1g/L L-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min；
⑤嗜酸乳杆菌LA85为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA85，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC NO.1.12735，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
⑥嗜酸乳杆菌LA05为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年10月9日，保藏编号为CGMCC NO.23546，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
⑦嗜酸乳杆菌LA88为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA88，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月15日，保藏编号为CGMCC NO.24109，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
制备例
本制备例提供嗜酸乳杆菌的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
(a)将嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88采用涂平板的方法分别接种到含不同pH梯度胃液的改良MRS固体培养基(其中不同浓度梯度胃液配置方法为：分别用1mol/L的HCl将MRS液体培养基的pH值调至3.0-5.0，121℃灭菌20min，无菌添加特定浓度的胃蛋白酶和NaCl，模拟不同浓度梯度胃液)中，接种量均为l％，培养12h，以初始样品为对照，计算胁迫12h样品菌体的存活率，存活率＝(试验组活菌数/对照组活菌数)×100％，通过平板计数法计算活菌数。分别确定其对胃液的耐受性(嗜酸乳杆菌梯度胃液浓度存活率具体如下表1所示)；
表1
由表1测试结果可知，人体餐后胃液浓度稀释致3.0-5.0，选择相同胃液浓度pH4.0，通过活菌计数定性判定菌种耐受酸度和胆盐浓度的能力。
(b)以确定的胃液浓度(pH 4.0)为起始浓度，将嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88分别接种到含胃液的改良MRS液体培养基上进行培养；然后用接种环挑菌液在含相同胃液浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大(平均直径为1mm)的菌落接入pH 4.0的模拟人工胃液培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含胃液浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为二代，如此传代驯化培养20代；
(c)将驯化后的菌株分别进行筛选(筛选即在培养基表面挑选个头大，平均直径为1mm，边缘清晰菌体单一性高的菌落)，接种量均为l％，接种到改良 MRS液体培养基中在37℃下培养24h，并保存于甘油管中，即得到耐受性高的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88。
实施例1
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，所述具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88按照6.5:2:1.5的比例混合接入10mL种子培养基中，所述混合接种的总接种量为5vol％，37℃静置培养12h即为一级种子；将活化的一级种子以5vol％的接种量接种于200mL种子培养基中，37℃静置培养8h即为二级种子，最后将二级种子液以2vol％的接种量转接入发酵培养基中进行高密度发酵，发酵温度为37℃、搅拌转速80rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23wt％碳酸钠维持pH为5.4，通入氮气维持罐压为0.03MPa，厌氧发酵11h，收集所述的发酵液；
(2)将发酵液在4℃下以6500rpm的转速离心15min，收集菌泥，将质量比为1:1.5的菌泥和保护剂(其中，海藻糖12％、甘油1.5％、甘露醇0.06％、吐温0.04％，余量为水)混合，在-45℃下冷冻干燥24h，得到所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物；
(3)将所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物粉碎成粒径为60目的菌粉后，在-20℃下低温储藏，得到所述的具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉。
实施例2
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，所述具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88按照6:3:1的比例混合接入10mL种子培养基中，所述混合接种的总接种量为4vol％，35℃静置培养14h即为一级种子；将活化的一级种子以4vol％的接种量接种于200mL种子培养基中，35℃静置培养10h 即为二级种子，最后将二级种子液以1vol％的接种量转接入发酵培养基中进行高密度发酵，发酵温度为35℃、搅拌转速60rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用24wt％碳酸钠维持pH为5.3，通入氮气维持罐压为0.03MPa，厌氧发酵12h，收集所述的发酵液；
(2)将发酵液在4℃下以6000rpm的转速离心20min，收集菌泥，将质量比为1:1的菌泥和保护剂(其中，海藻糖15％、甘油1％、甘露醇0.1％、吐温 0.1％，余量为水)混合，在-45℃下冷冻干燥24h，得到所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物；
(3)将所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物粉碎成粒径为60目的菌粉后，在-20℃下低温储藏，得到所述的具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉。
实施例3
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，所述具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88按照4:2.5:3.5的比例混合接入10mL种子培养基中，所述混合接种的总接种量为3vol％，35℃静置培养14h即为一级种子；将活化的一级种子以3vol％的接种量接种于200mL种子培养基中，35℃静置培养10h即为二级种子，最后将二级种子液以3vol％的接种量转接入发酵培养基中进行高密度发酵，发酵温度为35℃、搅拌转速60rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用22wt％碳酸钠维持pH为5.5，通入氮气维持罐压为0.03MPa，厌氧发酵11h，收集所述的发酵液；
(2)将发酵液在4℃下以7000rpm的转速离心15min，收集菌泥，将质量比为1:2的菌泥和保护剂(其中，海藻糖10％、甘油2％、甘露醇0.02％、吐温 0.02％，余量为水)混合，在-45℃下冷冻干燥24h，得到所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物；
(3)将所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物粉碎成粒径为60目的菌粉后，在-20℃下低温储藏，得到所述的具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉。
实施例4
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88 的配比为13:2:5。
实施例5
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88 的配比为2:16:2。
实施例6
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88 的配比为3:2:5。
实施例7
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，最后将二级种子液以1vol％的接种量转接入发酵培养基中进行高密度发酵，发酵温度为37℃、搅拌转速50rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23wt％碳酸钠维持pH为5.0，通入氮气维持罐压为 0.01MPa，厌氧发酵8h，收集所述的发酵液。
实施例8
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，最后将二级种子液以3vol％的接种量转接入发酵培养基中进行高密度发酵，发酵温度为37℃、搅拌转速200rpm、初始pH为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23wt％碳酸钠维持pH为6.0，通入氮气维持罐压为0.02MPa，厌氧发酵14h，收集所述的发酵液。
实施例9
本实施例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，不接种上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌 LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88，直接接种未经筛选的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88。
对比例1
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，仅将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA85接入10mL种子培养基中，接种量为5vol％，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例2
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，仅将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA05接入10mL种子培养基中，接种量为5vol％，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例3
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，仅将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA88接入10mL种子培养基中，接种量为5vol％，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例4
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，仅将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌 LA05按照7:3的比例混合接入10mL种子培养基中，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例5
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，仅将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA85和嗜酸乳杆菌 LA88按照7.5:2.5的比例混合接入10mL种子培养基中，其他步骤与实施例1 完全相同。
对比例6
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，仅将上述制备例筛选后保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌 LA88按照1:1的比例混合接入10mL种子培养基中，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例7
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，将嗜酸乳杆菌LA85替换为嗜酸乳杆菌NCFM，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例8
本对比例提供一种嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1) 中，将嗜酸乳杆菌LA05替换为嗜酸乳杆菌NCFM，其他步骤与实施例1完全相同。
对比例9
本对比例提供一种具有高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，将嗜酸乳杆菌LA88替换为嗜酸乳杆菌NCFM，其他步骤与实施例1完全相同。
试验例1
菌液活菌数测试
测试样品：实施例1-9制备过程中步骤(1)收集所述的发酵液，对比例1-9 制备过程中步骤(1)收集所述的发酵液；
样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
测试方法：
液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72h±2h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
菌落计数:选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位 (colony-formingunits，CFU)表示。
具体测试结果如表2所示：
表2
由表2测试结果可知，所述的制备方法益采用的菌种嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88具有良好的抗逆性功效，各个菌株经过复配比例的优化，同时与高活性发酵功效的培养基联合作用，使得收集的发酵液中活菌数达到40×108CFU/g以上。
试验例2
冻干存活率测试
测试样品：实施例1-9最终制备得到的高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，对比例1-9最终制备得到的乳杆菌菌粉；
样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
测试方法：
固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min 制成1:10的样品匀液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72h±2h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
菌落计数:选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位 (colony-formingunits，CFU)表示。
具体测试结果如表3所示：
表3
由表3测试结果可知，所述的制备方法益采用的菌种嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88具有良好的抗逆性功效，各个菌株经过复配比例的优化，同时与高活性发酵功效的培养基联合作用，使得嗜酸乳杆菌菌粉活菌数达到40×1010CFU/g以上，冻干存活率达到90％以上。
由实施例1和对比例1-3的对比可知，发酵液活菌数较三组单独培养的菌体生长状态更佳，表明多联发酵协同培养过程下菌体相互作用嵌合，对培养基的利用率明显提升，相同培养基条件下，菌体活菌数有显著优势。
试验例3
抗逆性测试
测试样品：实施例1-9最终制备得到的高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，对比例1-9最终制备得到的乳杆菌菌粉；
测试方法：
(1)耐胃酸性能检测方法
用1mol/L的HCl将MRS液体培养基的pH值调至3.0-5.0，121℃灭菌20 min，无菌添加胃蛋白酶3-10mg/mL，NaCl 0.3％-0.9％，配制模拟胃液。取活化后的嗜酸乳杆菌按1％的接种量接种于pH4.0浓度的溶液中37℃水浴培养3h，每隔30min摇匀一次，于0h、1h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算1h和3h样品菌体的存活率，存活率(％)＝(1h或3h时的活菌数/0h 时的活菌数)×100％，通过平板计数法计算活菌数。
(2)耐胆盐性能检测方法
在MRS液体培养基中加入猪胆盐，使其浓度达到0.15％。将活化后的嗜酸乳杆菌按1％的接种量接种于上述浓度的液体培养基中，37℃水浴培养3h，每隔30min摇匀一次，于0h、1h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算1h和3h样品菌体的存活率，存活率(％)＝(1h或3h时的活菌数/0 h时的活菌数)×100％，通过平板计数法计算活菌数。
具体测试结果如表4所示：
表4
由表4测试结果可知，多联发酵制备工艺培养的D组的具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，尤其是其在胃酸中3h时的存活率81.2％，不仅远远高于对照菌株组，而且其在胆盐中1h至3h的存活率衰减也显著小于对照组，这说明所述多联嗜酸乳杆菌可以再与胃部相似的高酸性条件及肠道中存在的胆汁浓度下有效存活，并且其在人体肠胃中的抗逆性也有显著提升的表现，取得了良好的效果。
试验例4
加速测试
测试样品：实施例1-9最终制备得到的高抗逆性的嗜酸乳杆菌菌粉，对比例1-9最终制备得到的乳杆菌菌粉；
测试方法：取冻干储藏嗜酸乳杆菌菌粉，根据其组别使用铝箔塑封分装为 2g/袋，每组二十袋的检测标准样品包装。将样品置于温度37±2℃、相对湿度 RH 75±5％的恒温储藏箱、避免光线直射的条件下贮存12周，于0、2、4、8、 12周分别取样作活菌计数。以0周样品为对照，计算加速样品菌体的存活率，取0周样品为对照，存活率(％)＝(检测时的活菌数/初始时的活菌数)×100％，通过平板计数法计算活菌数。
具体测试结果如表5所示：
表5
由表5测试结果可知，在37℃加速条件下，通过多联发酵及复合培养下得到的嗜酸乳杆菌粉相较对比组在2周、4周、8周和12周的存活率都显著良好，在长期加热条件下其存活率有明显降低。与对照组比较后在统计学上有显著性的差异(P<0.05)，多菌复合的菌体构成，通过嵌合的胞外产物在长期稳定性方面其存活率有明显提升。
综上所述，通过多联发酵及复合培养下得到的嗜酸乳杆菌在菌体活菌数、耐酸耐胆盐及胁迫条件下的抗逆性在实际测试中均有更强的适应性效果，在农用饲料中，生产资料面对各地不同的储藏条件及实际气候情况，多菌混合的菌体结构在保存活性方面也有更好的实际表现。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (23)

1.一种提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物，其特征在于，所述组合物包括嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88；
所述嗜酸乳杆菌LA85为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA85，保藏于中国科学院微生物研究所，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC NO.1.12735，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述嗜酸乳杆菌LA05为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA05，保藏于中国科学院微生物研究所，保藏时间为2021年10月9日，保藏编号为CGMCC NO.23546，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述嗜酸乳杆菌LA88为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA88，保藏于中国科学院微生物研究所，保藏时间为2021年12月15日，保藏编号为CGMCC NO.24109，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88的质量比为(4-12):(2.5-15):(1-3.5)。
3.一种根据权利要求1或2所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
（1）将嗜酸乳杆菌LA85、嗜酸乳杆菌LA05和嗜酸乳杆菌LA88混合接种于种子培养基中，进行一级培养，得到一级种子液，再将一级种子液接种于种子培养基中，进行二级培养，得到二级种子液，最后将二级种子液接种于高密度培养基中，进行高密度发酵，得到发酵液；
（2）将发酵液离心后，收集菌泥，将菌泥和保护剂混合，冷冻干燥，得到所述提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物。
4.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基按质量浓度计包括如下组分：葡萄糖18-22 g/L、牛肉浸粉8-12g/L、酵母粉4-6 g/L、蛋白胨8-12 g/L、乙酸钠4-6 g/L、柠檬酸钠1-3 g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、硫酸镁0.4-0.6 g/L、硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温80 0.5-1.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5-1.5 g/L。
5.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基需在110-120℃下灭菌15-25 min。
6.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混合接种的总接种量为1-5 vol%。
7.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述一级培养为静置培养，一级培养的温度为30-40℃，一级培养的时间为5-24h。
8.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述一级种子液在种子培养基中的接种量为1-5 vol%。
9.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述二级培养为静置培养，二级培养的温度为30-40℃，二级培养的时间为5-24h。
10.根据权利要求3或4所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高密度培养基按质量浓度计包括如下组分：葡萄糖38-42 g/L、牛肉浸粉14-16 g/L、酵母粉8-12 g/L、蛋白胨8-12 g/L、乙酸钠4-6 g/L、柠檬酸钠1-3 g/L、磷酸氢二钾2-4 g/L、硫酸镁0.4-0.6 g/L、硫酸锰0.05-0.2 g/L、吐温80 0.5-1.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5-1.5 g/L。
11.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高密度培养基需在110-120℃下灭菌15-25 min。
12.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述二级种子液在高密度培养基中的接种量为1-5 vol%。
13.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高密度发酵在搅拌下进行，所述搅拌的转速为50-100 rpm，发酵的温度为30-40℃，发酵的压力为0.01-0.05 MPa，发酵的时间为6-16 h。
14.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高密度发酵的过程中需控制发酵液的pH为5-6。
15.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心的温度为3-5℃，离心的转速为6000-8000 rpm，离心的时间为12-20min。
16.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述菌泥和保护剂的质量比为1:(1-2)。
17.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述保护剂包括海藻糖、甘油、甘露醇或吐温-80中的任意一种或至少两种的组合。
18.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述保护剂按质量百分含量计由如下组分组成：海藻糖10-15%、甘油1-2%、甘露醇0.02-0.1%、吐温-80 0.02-0.1%，余量为水。
19.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述冷冻干燥的温度-45~-42℃，冷冻干燥的时间为20~28 h。
20.根据权利要求3所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）后还需进行步骤（3）：将提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物粉碎后，低温储藏。
21.根据权利要求20所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，所述粉碎后得到的菌粉粒径为60-100目。
22.根据权利要求20所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物的制备方法，其特征在于，所述低温储藏的温度为-35~-10℃。
23.一种根据权利要求1或2所述的提高嗜酸乳杆菌抗逆性的组合物在制备医药、食品或饲料中的用途。
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