CN114891115A

CN114891115A - 一种car细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用

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Publication number: CN114891115A
Application number: CN202210148733.4A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 刘昊
Original assignee: Hangzhou Meizhong Disease Gene Research Institute Co ltd
Current assignee: Hangzhou Meizhong Disease Gene Research Institute Co ltd
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2022-08-12

Abstract

本发明公开了一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用，其中，一种CAR细胞疗法用核酸构建体，包括依次串连的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域，所述胞内信号域由DAP10CD、CD137CD和CD3ζSD所组成。一种慢病毒载体，包含CAR细胞疗法用核酸构建体的基因。一种细胞制剂，为导入有前述慢病毒载体的免疫效应细胞。一种细胞制剂在癌症治疗中的应用。本发明所制备出的细胞制剂相较于其他CAR结构构建的免疫细胞制剂具有较高的活性，尤其该类CAR结构修饰的NK细胞，对表达目标靶点肿瘤细胞(如表达Her‑2的乳腺癌细胞)具有极高的杀伤能力。

Description

一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用

【技术领域】

本发明涉及细胞免疫治疗的技术领域，特别是一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用的技术领域。

【背景技术】

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。传统的肿瘤治疗方式，如手术、放疗和化疗，是近几十年来用于肿瘤治疗的主要策略。但是，病人容易对药物和放疗治疗产生抗性，致使高频率的肿瘤复发。近年来，肿瘤细胞治疗因其靶向性、效果显著和几无副作用等优点得到了极大关注，逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要手段，被业界称为肿瘤的绿色疗法，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。

肿瘤的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)疗法，指一种用嵌合抗原受体修饰的免疫细胞***的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得了很好的效果，具有精准、快速和高效的特点，有可能治愈癌症，非常有前景。在通常情况下，肿瘤的嵌合抗原受体细胞疗法通过基因工程技术，将识别肿瘤的定位导航装置嵌合抗原受体转导入免疫细胞(如T细胞和NK细胞)，对应地重组为CAR-T细胞和CAR-NK细胞。CAR-T细胞和CAR-NK细胞能够利用其转导的CAR结构，专门识别体内肿瘤细胞后获得激活，通过免疫作用释放大量的多种效应因子，从而高效地杀灭肿瘤细胞，达到治疗恶性肿瘤的目的。

嵌合抗原受体通常由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域以及包含或不包含共刺激结构域的细胞内信号传导结构域序贯串联组成。随着科学技术研究的持续推进，CARs至今已经发展到了***。其中，第一代CARs包含胞外单链可变片段scFv、跨膜区和单个胞内激活信号CD3ζ或FcεRIγ。第一代CAR-T细胞只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，其体内抗肿瘤活性受到极大限制，并且T细胞增殖减少最终会导致T细胞的凋亡。第二代CARs在第一代CARs的基础上引入了一个共刺激分子，提高了肿瘤杀伤效力。在第三代CARs中，则搭载了多个共刺激因子，如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等。共刺激分子可以激活T细胞内的JNK、ERK和NF-κB等信号通路，使T细胞在抗肿瘤活性、增殖活性、存活周期和细胞因子(如IL-2、TNF-α和IFN-γ)的分泌延长等方面均产生显著提高。***CARs在第三代CARs的基础上增加了可选择性的标记及编码CARs扩增和***的启动子。

研究表明，CAR设计和内在特性也会影响CAR修饰免疫细胞的扩增和持久性。目前，包含CD3-ζ信号结构域和共刺激结构域(通常为CD28或4-1BB)的第二代CARs仍然是临床使用中最常见的核酸构建体。此外，研究发现，采用CD28作为共刺激分子时，T细胞虽然杀伤作用强但持续时间短，而采用4-1BB作为共刺激分子时，T细胞虽然持续时间长但杀伤能力有限。

因此，现有的嵌合抗原受体免疫细胞疗法在用于肿瘤治疗上仍有许多不尽理想之处。例如CAR-T细胞治疗过程中会出现多种不良反应，包括细胞因子释放综合征等。而且由于这些毒副反应的临床表现往往错综复杂，变化多端，进展迅速；而且每种CAR修饰细胞制品因为生产工艺或CAR结构的不同有着独特不同效应特征，有待进一步充分的认识及精确的评估。

【发明内容】

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种含有特定胞内信号结构组合的CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用，所制备出的细胞制剂相较于其他CAR结构构建的免疫细胞制剂具有较高的活性，尤其该类CAR结构修饰的NK细胞，对表达目标靶点肿瘤细胞(如表达Her-2的乳腺癌细胞)具有极高的杀伤能力。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种CAR细胞疗法用核酸构建体，包括依次串连的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域；

所述信号肽为Human IgKVIII、Human IL-2或Human insulin等；

所述抗原结合区为anti-CD19 scFv、anti-Her-2 scFv、anti-ROR1 scFv或anti-BCMA scFv等；

所述胞外铰链区为来自CD8、CD28、CTLA4、PD-1、NKG2D、IgG1、含CH2CH3区域的IgG4或不含CH2CH3区域的IgG4的铰链区序列等；

所述跨膜结构域为来自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、DAP10、DAP12、NKG2A、NKG2D、PD-1或CTLA的跨膜结构域序列等；

所述胞内信号域由DAP10 CD、CD137 CD和CD3ζSD所组成。

作为优选，所述信号肽为CD8 SP，所述CD8 SP的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

作为优选，所述抗原结合区为Her-2scFv，所述Her-2scFv的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述胞外铰链区为CD8 H、CD28 H或IgG4 H-CH2-CH3，所述CD8 H的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述CD28 H的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述IgG4 H-CH2-CH3的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

作为优选，所述跨膜结构域为CD8 TMD、CD28 TMD或NKG2D TMD，所述CD8 TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述CD28 TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述NKG2DTMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

作为优选，所述DAP10 CD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，所述CD137 CD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20所示，所述CD3ζSD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ IDNO.27和SEQ ID NO.28所示。

作为优选，所述胞内信号域的顺序为DAP10 CD-CD137 CD-CD3ζSD，所述DAP10 CD-CD137 CD-CD3ζSD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。

一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含如前述任一种CAR细胞疗法用核酸构建体的基因。

一种细胞制剂，为导入有前述慢病毒载体的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞为T细胞、NK细胞或巨噬细胞，所述免疫效应细胞的来源为自体、同种异体、干细胞分化或特定细胞系。

作为优选，所述NK细胞。

一种细胞制剂在癌症治疗中的应用。

本发明的有益效果：

本发明采用依次串连的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域构成核酸构建体，并限定胞内信号域由DAP10 CD、CD137 CD和CD3ζSD所组成，再通过慢病毒载体技术制备出相应的细胞制剂。本发明所制备出的细胞制剂相较于其他CAR结构构建的免疫细胞制剂具有较高的活性，尤其该类CAR结构修饰的NK细胞，对表达目标靶点肿瘤细胞(如表达Her-2的乳腺癌细胞)具有极高的杀伤能力。

本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

【附图说明】

图1是实施例一至三的CAR序列组合图；

图2是T-CAR/NK-CAR1/NK-CAR2序列在pUC57载体上用BamHI和XbaI酶切后核苷酸电泳检测结果；

图3是pCDH-SFFV-Luc-T2A-EGFP的载体图谱；

图4是含有不同胞内结构CAR的慢病毒滴度测定流式细胞图；

图5是NK细胞纯化扩增后的流式细胞图；

图6是不同靶向Her-2 CAR慢病毒转染NK细胞后转染效率鉴定的流式细胞分析结果；

图7是不同胞内结构的靶向Her-2 CAR-NK细胞在体外对乳腺癌细胞的杀伤；

图8是不同组CAR-NK细胞的基础及与不同乳腺癌细胞共培养后IFN-γ(左)和TNF-α(右)的分泌水平；

图9是NK-CAR2的载体图谱。

图2中：泳道1为核酸分子量标准；泳道1～3分别对应T-CAR、NK-CAR1和NK-CAR2序列部分；泳道4为酶切后pCDH-SFFV-Luc-T2A-EGFP载体部分。

【具体实施方式】

实施例一至三、靶向her-2CAR的设计及获取：

一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：包括依次串连的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域；

信号肽(Signal peptide,SP)是一支负责把新合成的蛋白质引导到细胞含不同膜结构亚细胞器内的短(长度为5～30个氨基酸)肽链，一般位于蛋白的N端。

所述信号肽为常用于重组蛋白的信号肽，如Human IgKVIII、Human IL-2或Humaninsulin等。更进一步的，所述信号肽为CD8 SP，所述CD8 SP的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

抗原结合区能够与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原紧密结合，决定着CAR结构的靶向性，是决定修饰后免疫细胞效应的核心结构。抗原结合区为来源于靶向特定目标抗原单克隆抗体的由轻链(VL)和重链(VH)及位于其间的带有韧性的铰链(linker)连接形成的单链抗体(single chain fragment variable,scFv)。单链抗体的重链或轻链分别连接信号肽和铰链区。

其中，靶向抗原可包括α-叶酸受体(卵巢癌和上皮癌)、CAIX(肾癌)、CD19(B细胞恶性肿瘤、CLL和ALL)、CD20(B细胞恶性肿瘤和淋巴瘤)、CD22(B细胞恶性肿瘤)、CD23(CLL)、CD24(胰腺癌)、CD30(淋巴瘤)、CD33(AML)、CD38(NHL)、CD44v7/8(子***)、CEA(结肠直肠癌)、EGFRvIII(胶质母细胞瘤)、EGP-2(多种恶性肿瘤)、EGP-40(结肠直肠癌)、EphA2(胶质母细胞瘤)、Erb-B2(乳腺癌、***癌和结肠癌)、FBP(卵巢癌)、GD2(神经母细胞瘤和黑素瘤)、GD3(黑素瘤)、HER2(胰腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤和骨肉瘤)、HMff_MAA(黑素瘤)、IL_13Ra2(神经胶质瘤和胶质母细胞瘤)、KDR(肿瘤血管***)、κ轻链(B细胞恶性肿瘤)、L1(神经母细胞瘤)、MAGE-A1(黑素瘤)、间皮素(间皮瘤)、MUC1(乳腺癌和卵巢癌)、MUC16(卵巢癌)、NY-ES0-1(多发性骨髓瘤)、癌胚抗原(各种肿瘤)、PSCA(***癌)、PSMA(***癌)、ROR1(B-CLL)、TAG-72(腺癌)以及VEGF-R2(肿瘤新血管***)等。

所述抗原结合区为anti-CD19 scFv、anti-Her-2scFv、anti-ROR1 scFv或anti-BCMA scFv等。更进一步的，所述抗原结合区为Her-2scFv，所述Her-2scFv的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

胞外铰链区(Hinge,H)连接胞外抗原结合区和跨膜结构域。胞外铰链区的长度取决于靶细胞抗原表位的位置和暴露程度。此外，多项研究表明CAR-T细胞活化与铰链区长度有关。因此，调整铰链区的长度可以使CAR-T细胞和靶细胞处于最佳距离，在抗原抗体结合过程中避免大型磷酸酶的作用减弱CAR信号。然而，在某些情况下，抗原表位可能相对不可接近，需要使用更长的铰链区，使scFv可以克服空间位阻，有效结合抗原。综上所述，由于抗原表位不同，铰链区的最佳长度也不同，在靶向新抗原时，需要相应地调整铰链区的长度。

所述胞外铰链区为来自CD8、CD28、CTLA4、PD-1、NKG2D、IgG1、含CH2CH3区域的IgG4或不含CH2CH3区域的IgG4的铰链区序列等。更进一步的，所述胞外铰链区为CD8 H、CD28 H或IgG4 H-CH2-CH3，所述CD8 H的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述CD28 H的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述IgG4 H-CH2-CH3的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。

跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)，能够将CAR的细胞外结构域与细胞内信号转导结构域连接，并将受体锚定到免疫细胞膜上。

所述跨膜结构域为来自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、DAP10、DAP12、NKG2A、NKG2D、PD-1或CTLA的跨膜结构域序列等。其中，CD3ζ跨膜结构域能够使CAR形成同源二聚体或与内源TCR形成异二聚体，增强CAR-T细胞活性，而CD8α和CD28的跨膜结构域能够促进CAR在细胞表面表达。更进一步的，所述跨膜结构域为CD8TMD、CD28 TMD或NKG2D TMD，所述CD8TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述CD28 TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述NKG2D TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

共刺激域(Costimulatory Domain,CD)可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。

所述胞内信号域由DAP10 CD、CD137 CD和CD3ζSD所组成。更进一步的，所述DAP10CD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，所述CD137 CD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，所述CD3ζSD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示。所述胞内信号域的顺序为DAP10 CD-CD137 CD-CD3ζSD，所述DAP10 CD-CD137 CD-CD3ζSD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。

其中，所涉及的核酸序列和多肽序列如下表1所示：

表1序列表

将上述多种不同的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域依次组合串连，得到如图1所示的实施例一至三的CAR序列组合，具体序列分别为SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33。

实施例四、慢病毒载体的构建：

将实施例一至三的CAR序列进行合成，并将合成后的CAR序列克隆在pUC57载体中，分别命名为pUC57-T-CAR、pUC57-NK-CAR1和pUC57-NK-CAR2。提取pUC57-T-CAR、pUC57-NK-CAR1和pUC57-NK-CAR2质粒，用QuickCut限制性内切酶BamHI和XbaI(Takara公司)进行酶切。其中，酶切体系如下：

pUC57-T-CAR/pUC57-NK-CAR1/pUC57-NK-CAR21μg，BamHI和XbaI各1μl，10XQuickCut Green Buffer2μl，用水补到20μl，37℃水浴15min，酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒(购自Takara公司)进行DNA片段回收(结果见图2，从电泳图上可以看出泳道1～3为pUC57-T-CAR/pUC57-NK-CAR1/pUC57-NK-CAR2载体经BamHI和XbaI酶切后释放出T-CAR/NK-CAR1/NK-CAR2的条带)。再用同样的方法BamHI和XbaI酶切pCDH-SFFV-Luc-T2A-EGFP载体(图3)，用琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切后的载体片段(结果见图2，从电泳图上可以看出泳道4为酶切后pCDH-SFFV-Luc-T2A-EGFP载体部分)。

将回收后的T-CAR/NK-CAR1/NK-CAR2片段与酶切后的载体通过T4连接酶(购自Takara公司)进行连接。其中，反应体系和条件如下：

经BamHI和XbaI酶切的T-CAR/NK-CAR1/NK-CAR2和pCDH-SFFV-Luc-T2A-EGFP载体分别定量，再根据载体，目的条带1：3摩尔比加进体系，10X T4 DNALigase Buffer 1μl，连接酶1μl，用水补到10μl，16℃连接4h或者过夜。连接产物转化入E.coli DH5a感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，扩大培养后，用质粒提取试剂盒(购自Axygene公司)按照试剂盒操作说明提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序检测，将正确的载体命名为pCDH-T-CAR/pCDH-NK-CAR1/pCDH-NK-CAR2。

实施例五、慢病毒包装和滴度测定：

1)质粒：

·pCDH-T-CAR/pCDH-NK-CAR1/pCDH-NK-CAR2；

·VSV-G：pMD2.G(Addgene#12259)；

·Rev：pRSV-Rev(Addgene#12253)；

·Gag/Pol：pMDLg/pRRE(Addgene#12251)。

2)细胞系：

·低传代数293T细胞。

3)试剂：

·293T培养基：高糖DMEM(含丙酮酸钠和谷氨酰胺)+10％FBS+GlutaMAX；

·病毒收获培养基：取50ml 293T培养基，加入0.5g BSA(SigmaA9418)和终浓度为10～15mM的HEPES，0.22μm过滤；

·Opti-MEM培养基：用于混合转染复合物；

·转染试剂：X-tremeGENE HP DNA(或其他低毒性高效率的试剂)。

4)包装流程：

·第一天：根据下表2种植293T细胞；

·第二天-上午：根据下表2准备混合Opti-MEM培养基、质粒和转染试剂，为293T细胞换新鲜培养基，混合物在室温静置15～30min后逐滴加入293T细胞培养体系中，并轻柔摇匀；

表2 Opti-MEM培养基

·第二天-下午：在转染6～8h后，轻柔换液为病毒收获培养基；

·第四天：转染后48h，取细胞培养上清于400×g离心4min，并用0.45μm过滤；按体积加入5×PEG8000溶液，每20～30min混合一次，共进行3～5次，4℃放置6h或者过夜；4℃，4000g离心20min吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体；加入适量的病毒溶解液溶解病毒沉淀，将病毒液分管，放入-80℃冰箱冻存，过夜后取一支进一步测量病毒滴度；HT-1080种24孔板，5孔，每孔42000cells，待贴壁后，进行病毒侵染；配制8ug/ml polybreneMEM培养基10ml；配置15ul病毒原液+135ul培养基；之后逐级稀释，取15ul+135ul，进行4次；随后每组取50ul，加到450ul培养基孔中，稀释级别分别为10²、10³、10⁴和10⁵；72h后，消化细胞进行流式分析GFP％，结果如图4所示，按以下公式进行计算，获得包装后的慢病毒滴度为：

TU_T-CAR＝(8.01×0.01×42000/0.5)×10000＝6.73E7 TU/ml

TU_NK-CAR1＝(2.95×0.01×42000/0.5)×100000＝2.45E8 TU/ml

TU_NK-CAR2＝(8.94×0.01×42000/0.5)×10000＝7.51E7 TU/ml。

其中，滴度(TU/mL)＝(F×C/V)×D；

F＝GFP阳性细胞频率(GFP阳性细胞百分比/100)；

C＝转导时的每孔细胞数(42,000个细胞)；

V＝转导体积(mL)(0.5mL)；

D＝慢病毒稀释因子。

实施例六、CAR-NK细胞制备：

1)NK细胞纯化和扩增：

采取20ml健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(购自GE公司)分离外周血单核细胞(PBMC)；分离的细胞计数后，按2.5X10⁶/孔密度在包被过CD16的6孔板中刺激培养72h，之后再换普通的6孔板继续培养扩增72h；用NK磁珠分选纯化细胞(购自Miltenyi Biotec公司)，加含10％FBS+200IU/ml IL-2的1640(购自Thermo Scientific)培养基继续进行诱导培养，得到纯化的NK细胞，并用流式检测CD3和CD56表型比例。检测结果如图5，其中，横轴表示CD3，纵轴表示CD56，CD3阴性且CD56阳性代表的细胞群为NK细胞，表明本方法制备的NK细胞比例大于90％；

2)靶向Her-2 CAR-NK细胞制备：

得到纯化后的NK细胞，按每孔约2.5X10⁶ NK细胞接种到24孔板(BD Biosciences)中，并在终浓度Protamine sulfate 8ug/ml(Sigma-Aldrich)及BX7951.5uM(Sigma-Aldrich)的存在下与适量的病毒上清液混合，最终体积不超过1ml；补充细胞因子，并将板在室温下以1000·g离心1h；离心后，不除去病毒上清液，将板在37℃，5％CO₂下孵育4～6h；孵育结束后，在室温下以1000·g的速度进行第二次离心1h，然后从孔和1ml新鲜的NK细胞生长培养基；将细胞在每天添加细胞因子的培养基中维持2天后，从而获得表达Her-2 CAR-NK细胞(以下简称为CAR-NK)，并进行进一步转染效率鉴定；将转染后NK细胞用重组humanHer-2-Fc蛋白孵育15min，4℃，洗涤后用PE标记的鼠抗人anti-IgG1抗体孵育15min，4℃，进一步行流式检测；结果如图6所示，其中，横坐标表示scFv表达情况。

实施例七、CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤：

1)CAR-NK细胞对肿瘤细胞杀伤力检测：

将Her-2阳性乳腺癌细胞BT474和Her-2阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468用培养基调整到1X10⁶/ml，加入终浓度为5ug/ml Calcein-AM进行标记，37℃孵育1h，用PBS洗涤三遍后，用无酚红1640完全培养基重悬细胞，计数；调整肿瘤细胞10000/孔加入到96孔圆底板中；按E：T为10：1、5：1、2.5：1、1.25：1、0.625：1和0.03125：1分别加入空载体转染的Mock NK细胞及相应不同组CAR-NK细胞1X10⁵、5X10⁴、2.5X10⁴、1.25X10⁴、0.625X10⁴和0.03125X10⁴；肿瘤细胞再加一组2％Triton X-100及不处理组，100g离心5min，37℃共培养3h后，300g离心5min，每孔吸取100ul转移至96平底板中检测OD值；检测结果如图7所示，表明含DAP10 CD-CD137 CD-CD3ζSD胞内信号域NK-CAR2的CAR-NK细胞对Her-2阳性乳腺癌细胞杀伤力显著高于其他组NK细胞，而对于Her-2阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468的杀伤无明显差别；

2)检测CAR-NK细胞与不同细胞共培养后IFN-γ和TNF-α分泌水平

将Her-2阳性乳腺癌细胞BT474及Her-2阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468按E：T为2.5：1与空载体转染的MockNK细胞及不同组CAR-NK细胞共培养12h后取上清行ELISA检测上清中IFN-γ和TNF-α的浓度；检测结果如图8所示，含DAP10-CD137-CD3zeta胞内信号域NK-CAR2的CAR-NK细胞与Her-2阳性乳腺癌细胞BT474共培养后IFN-γ和TNF-α的分泌水平明显高于其他组。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州美中疾病基因研究院有限公司

<120> 一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD8)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 多肽序列(SP)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 核酸序列(Her-2 scFv)

<400> 3

caggtacaac tgcagcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cctctgggta tcctttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggacagg gtttaaagtg gatgggctgg attaacacct ccactggaga gtcaacattt 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgacttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aagtgaagac tcggctacat atttctgtgc aagatgggag 300

gtttaccacg gctacgttcc ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ttcctctggc 360

ggtggcggtt ctggtggcgg tggctccggc ggtggcggtt ctgacatcca gctgacccag 420

tctcacaaat tcctgtccac ttcagtagga gacagggtca gcatcacctg caaggccagt 480

caggatgtgt ataatgctgt tgcctggtat caacagaaac caggacaatc tcctaaactt 540

ctgatttact cggcatcctc ccggtacact ggagtccctt ctcgcttcac tggcagtggc 600

tctgggccgg atttcacttt caccatcagc agtgtgcagg ctgaagacct ggcagtttat 660

ttctgtcagc aacattttcg tactccattc acgttcggct cggggacaaa attggagatc 720

<210> 4

<211> 240

<212> PRT

<213> 多肽序列(Her-2 scFv)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe

130 135 140

Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser

145 150 155 160

Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln

210 215 220

His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

<210> 5

<211> 135

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD8H)

<400> 5

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 6

<211> 45

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD8H)

<400> 6

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 7

<211> 117

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD28H)

<400> 7

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 8

<211> 39

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD28H)

<400> 8

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 9

<211> 687

<212> DNA

<213> 核酸序列(IgG4H-CH2-CH3)

<400> 9

gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360

gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 600

gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660

aagagcctct ccctgtctct gggtaaa 687

<210> 10

<211> 229

<212> PRT

<213> 多肽序列(IgG4H-CH2-CH3)

<400> 10

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 11

<211> 63

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD8TMD)

<400> 11

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD8TMD)

<400> 12

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 13

<211> 81

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD28TMD)

<400> 13

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD28TMD)

<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 核酸序列(NKG2DTMD)

<400> 15

ccattttttt tctgctgctt catcgctgta gccatgggaa tccgtttcat tattatggta 60

aca 63

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 多肽序列(NKG2DTMD)

<400> 16

Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe

1 5 10 15

Ile Ile Met Val Thr

20

<210> 17

<211> 69

<212> DNA

<213> 核酸序列(DAP10CD)

<400> 17

ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagatggca aagtctacat caacatgcca 60

ggcaggggc 69

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> 多肽序列(DAP10CD)

<400> 18

Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr

1 5 10 15

Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly

20

<210> 19

<211> 126

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD137CD)

<400> 19

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 20

<211> 42

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD137CD)

<400> 20

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 21

<211> 123

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD 28CD)

<400> 21

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 22

<211> 41

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD 28CD)

<400> 22

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 23

<211> 126

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD 137CD)

<400> 23

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 24

<211> 42

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD 137CD)

<400> 24

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 25

<211> 359

<212> DNA

<213> 核酸序列(2B4CD)

<400> 25

tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60

tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120

ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180

gaacctgcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg tccaggaaga 240

ggaaccacag cccttccttc aatagcacta tctatgaagt gattggaaag agtcaaccta 300

aagcccagaa ccctgctcga ttgagccgca aagagctgga gaactttgat gtttattcc 359

<210> 26

<211> 120

<212> PRT

<213> 多肽序列(2B4CD)

<400> 26

Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu

1 5 10 15

Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn

20 25 30

His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser

35 40 45

Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr

50 55 60

Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys

65 70 75 80

Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly

85 90 95

Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu

100 105 110

Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser

115 120

<210> 27

<211> 339

<212> DNA

<213> 核酸序列(CD3ζSD)

<400> 27

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> 多肽序列(CD3ζSD)

<400> 28

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 29

<211> 534

<212> DNA

<213> 核酸序列(DAP10-CD137-CD3ζ)

<400> 29

ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagatggca aagtctacat caacatgcca 60

ggcaggggca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 120

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 180

ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 240

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 300

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct 360

caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 420

gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 480

acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 534

<210> 30

<211> 178

<212> PRT

<213> 多肽序列(DAP10-CD137-CD3ζ)

<400> 30

Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr

1 5 10 15

Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

20 25 30

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

35 40 45

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

50 55 60

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

65 70 75 80

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

85 90 95

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

100 105 110

Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

115 120 125

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

130 135 140

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

145 150 155 160

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

165 170 175

Pro Arg

<210> 31

<211> 893

<212> DNA

<213> 人工序列(T-CAR)

<400> 31

ctagagccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc ttgctgctcc 60

acgccgccag gccgcaggta caatcgaaaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac 120

cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg 180

cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg 240

tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct 300

gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc 360

gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct 420

atcgctccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 480

cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 540

gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg 600

gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg 660

acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc 720

aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg 780

ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta 840

cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 893

<210> 32

<211> 985

<212> DNA

<213> 人工序列(NK-CAR1)

<400> 32

ctagagccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc ttgctgctcc 60

acgccgccag gccgcaggta caatcgaaaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac 120

cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg 180

cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatccattt tttttctgct 240

gcttcatcgc tgtagccatg ggaatccgtt tcattattat ggtaacatgg aggagaaaga 300

ggaaggagaa gcagtcagag accagtccca aggaattttt gacaatttac gaagatgtca 360

aggatctgaa aaccaggaga aatcacgagc aggagcagac ttttcctgga ggggggagca 420

ccatctactc tatgatccag tcccagtctt ctgctcccac gtcacaagaa cctgcatata 480

cattatattc attaattcag ccttccagga agtctggtcc aggaagagga accacagccc 540

ttccttcaat agcactatct atgaagtgat tggaaagagt caacctaaag cccagaaccc 600

tgctcgattg agccgcaaag agctggagaa ctttgatgtt tattccagag tgaagttcag 660

caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa 720

tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat 780

ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa 840

agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa 900

ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct 960

tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 985

<210> 33

<211> 830

<212> DNA

<213> 人工序列(NK-CAR2)

<400> 33

ctagagccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc ttgctgctcc 60

acgccgccag gccgcaggta caatcgaaaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac 120

cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg 180

cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatccattt tttttctgct 240

gcttcatcgc tgtagccatg ggaatccgtt tcattattat ggtaacaata tggagtctgt 300

gcgcacgccc acgccgcagc cccgcccaag atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca 360

ggggcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag 420

tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag 480

gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc 540

agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca 600

agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg 660

aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga 720

tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag 780

ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 830

<210> 34

<211> 6101

<212> DNA

<213> 载体序列(NK-CAR2)

<400> 34

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420

ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 480

cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 540

ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 600

agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 660

ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 720

ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 780

ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 840

aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa 900

agtaagacca ccgcacagca agcggccact gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 960

ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 1020

agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 1080

agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 1140

gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 1200

gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 1260

ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 1320

gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 1380

taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 1440

caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 1500

tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 1560

aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 1620

aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 1680

gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 1740

aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg 1800

gttaactttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga 1860

cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aattcaaaat 1920

tttatgtgtc gtgacgcgct agagccacca tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc 1980

cgctggcctt gctgctccac gccgccaggc cgcaggtaca atcgaaaacc acgacgccag 2040

cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag 2100

aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg 2160

atccattttt tttctgctgc ttcatcgctg tagccatggg aatccgtttc attattatgg 2220

taacaatatg gagtctgtgc gcacgcccac gccgcagccc cgcccaagat ggcaaagtct 2280

acatcaacat gccaggcagg ggcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac 2340

aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc 2400

cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc 2460

ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg 2520

agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga 2580

gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg 2640

cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt 2700

accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc 2760

cccctcgcct ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 2820

ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga taagatctgc 2880

tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 2940

aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 3000

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 3060

ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa 3120

agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 3180

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 3240

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac 3300

tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 3360

aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 3420

gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt ttgcagagac caaattcgta atcatgtcat 3480

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 3540

gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 3600

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 3660

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 3720

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 3780

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3840

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3900

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 3960

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4020

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 4080

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 4140

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 4200

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 4260

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 4320

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 4380

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 4440

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 4500

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 4560

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 4620

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 4680

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 4740

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 4800

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 4860

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 4920

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 4980

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 5040

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 5100

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 5160

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 5220

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 5280

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 5340

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 5400

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 5460

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 5520

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 5580

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 5640

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 5700

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 5760

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 5820

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 5880

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 5940

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 6000

gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 6060

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct g 6101

Claims

1.一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：包括依次串连的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域；

所述信号肽为Human IgKVIII、Human IL-2或Human insulin；

所述抗原结合区为anti-CD19 scFv、anti-Her-2scFv、anti-ROR1 scFv或anti-BCMAscFv；

所述胞外铰链区为来自CD8、CD28、CTLA4、PD-1、NKG2D、IgG1、含CH2CH3区域的IgG4或不含CH2CH3区域的IgG4的铰链区序列；

所述跨膜结构域为来自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、DAP10、DAP12、NKG2A、NKG2D、PD-1或CTLA的跨膜结构域序列；

所述胞内信号域由DAP10 CD、CD137 CD和CD3ζSD所组成。

2.如权利要求1所述的一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：所述信号肽为CD8SP，所述CD8 SP的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：所述抗原结合区为Her-2scFv，所述Her-2scFv的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

4.如权利要求1所述的一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：所述胞外铰链区为CD8 H、CD28 H或IgG4 H-CH2-CH3，所述CD8 H的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述CD28H的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述IgG4 H-CH2-CH3的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

5.如权利要求1所述的一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：所述跨膜结构域为CD8 TMD、CD28 TMD或NKG2D TMD，所述CD8 TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述CD28 TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述NKG2D TMD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

6.如权利要求1所述的一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：所述DAP10 CD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，所述CD137 CD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，所述CD3ζSD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示。

7.如权利要求6所述的一种CAR细胞疗法用核酸构建体，其特征在于：所述胞内信号域的顺序为DAP10 CD-CD137 CD-CD3ζSD，所述DAP10 CD-CD137CD-CD3ζSD的核酸序列和多肽序列分别如序列表中的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。

8.一种慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体包含如权利要求1至7中任一项所述的CAR细胞疗法用核酸构建体的基因。

9.一种细胞制剂，其特征在于：所述细胞制剂为导入有权利要求8所述的慢病毒载体的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞为T细胞、NK细胞或巨噬细胞，所述免疫效应细胞的来源为自体、同种异体、干细胞分化或特定细胞系。

10.如权利要求9所述的一种细胞制剂在癌症治疗中的应用。