CN114875176A - 一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，特别是一种基于G4‑ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法及其试剂盒，具体方法包括以从猪瘟病毒样品中提取的病毒RNA为扩增对象、采用等温核酸扩增技术进行等温扩增、然后加入含有Tris‑HCl和KCl的缓冲液，再加硫黄素T促进扩增产物上的G‑四链体折叠并形成复合物、在特定波长的光源激发条件下检测荧光并根据其强弱进行判断。本发明提供了一种不需要特殊的生物素标记或巯基修饰处理的探针、检测成本明显降低的检测方法及试剂盒。

Description

一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法及 其试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别是一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法及其试剂盒。
背景技术
中国发明专利《CN104611462A-一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒》中公开了有关于基于G-四链体荧光特性检测猪瘟病毒的相关方法，但该方法在G-四链体荧光检测反应缓冲液中需要使用到昂贵的荧光基团标记的探针，成本较高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种不需要特殊的生物素标记或巯基修饰处理的探针、检测成本明显降低的检测方法及试剂盒，采用的技术方案如下：
一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法，以从猪瘟病毒样品中提取的病毒RNA为扩增对象，采用等温核酸扩增技术，利用逆转录酶AMV、核糖核酸酶H及T7RNA聚合酶进行等温扩增，产生大量单链RNA扩增产物；然后加入含有Tris-HCl和KCl的缓冲液，再加硫黄素T促进扩增产物上的G-四链体折叠并形成复合物，再对扩增产物以425nm波长的光源激发并检测490nm波长处发射的荧光，根据荧光的强弱进行判断。
所述方法的具体步骤为：
步骤1.NASBA扩增：将纯化好的的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系，体系中包含50mM Tris/HCl pH8.5，10mM MgCl2，90mM KCl，10mM DTT，每种dNTP 1mM，每种NTP 2mM，10％(v/v)DMSO，0.4μM NASBA正向引物和0.4μM NASBA反向引物，反应步骤为加入2μL靶RNA，混合物在65℃温育5分钟以解开靶RNA的二级结构，然后将反应混合物转移至41℃退火5min，再向管中加入5.6μL酶混合物，所述酶混合物包含4mM DTT，2μg BSA，30UT7RNA聚合酶，6U AMV-Rt，0.1U RNase H，得到终体积为25μL，将混合物进一步在41℃温育2小时以进行靶RNA的等温扩增；所述正向引物为E2F-GG29：CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC-CACCACCTGGAAAGAA；所述反向引物为E2R-T7：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTACTGACCA；
步骤2.G-四链体荧光检测反应：取G-四链体扩增产物荧光检测反应缓冲液，反应缓冲液的组成包括50mM的Tris-HCl，pH7.0和50mM的氯化钾，加无菌双蒸水补足为72μl，加入NASBA反应后溶液25μL，然后85℃变性3min后降至室温；加入100μM硫黄素T溶液3μL，然后将溶液转移到96孔酶标板中，将酶标板放入酶标仪或荧光光度计，以425nm波长的光源激发，检测490nm波长处发射的荧光，检测到的荧光强度高于1.0×106RFU即判断为猪瘟病毒阳性。
一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测试剂盒，包括以下物质：
(1)NASBA反应缓冲液包括：50mM Tris/HCl pH8.5，10mM MgCl2，90mM KCl，10mMDTT，每种dNTP 1mM，每种NTP 2mM，10％(v/v)DMSO；
(2)NASBA正向引物和反向引物，包括：0.4μM正向引物E2F-GG29：CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC-CACCACCTGGAAAGAA；0.4μM反向引物E2R-T7：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTACTGACCA；其中正向引物前端包含G-四链体序列GG29的反向互补序列CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC和CSFV-E2结合序列CACCACCTGGAAAGAA，反向引物前端则加上带有保护碱基的T7启动子序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA和CSFV-E2结合序列TACCTCCTACTGACCA；
(3)NASBA酶反应液，包括：4mM DTT，2μg BSA，30U T7RNA聚合酶，6U AMV-Rt，0.1URNase H；
(4)G-四链体扩增产物检测反应缓冲液，包括：50mM的Tris-HCl pH7.0和50mM的氯化钾；硫黄素T 3μM。
与现有技术《CN104611462A》相比，本申请原理是通过将G-四链体反向互补序列加入NASBA扩增的正向引物，在存在靶RNA的情况下通过NASBA反应直接扩增出带有G-四链体尾标的RNA产物，再通过G-四链体-硫黄素T荧光生物传感器输出荧光信号。体系中有靶RNA情况下扩增产物中形成G-四链体结构与硫黄素T结合后可以检测到明显的荧光增强，而没有靶RNA时则不会扩增出含有G-四链体的产物，进而不会产生荧光增强现象。而《CN104611462A》是无差别的进行NASBA扩增，通过反应后加入可以与特异性扩增产物结合的***G-四链体探针，在存在可以被探针识别的扩增产物时，两个***探针可以形成G4结构，而没有产生特异性扩增产物时，探针则因为无法识别结合而不会形成G4结构。
同时本申请中使用的硫黄素T与G-四链体结合，这是一种新型荧光生物传感器，暂时未有其在病毒检测方面的实际应用研究，该传感器反应条件更加简单，只需要简单的离子环境即可检测到强烈的荧光响应；而《CN104611462A》中则使用原卟啉Ⅳ与探针形成的G4结构结合，反应条件复杂，且荧光响应不明显。
总的来说，两种方法虽然都使用了NASBA作为扩增方法，G-四链体作为检测对象，但是本申请是通过特殊设计的引物即可直接扩增进而可以在产物中形成G-四链体，同时通过G-四链体与硫黄素T构建的荧光生物传感器应用于NASBA方法上进行RNA检测更加有创造性，并且使用该传感器的荧光响应更加强烈与显著，在确保高灵敏度、高准确率的前提下，实现对猪瘟病毒的快速判断，并使检测周期缩短至2小时且无需检测人员特殊技能，所以速度快，引物前端直接加上G-四链体方向互补序列不需要额外的荧光标记程序，也不需要加入昂贵的荧光标记探针，所以成本低。而《CN104611462A》则需要在反应后加入两个***探针，再经过探针识别特异性靶序列才可形成G-四链体，而且使用原卟啉作为荧光染料，反应条件更加复杂，荧光响应不够显著。
附图说明
图1为本发明荧光检测CSFV RNA的原理，先利用三种酶(T7 RNApoly，AMV RT，RNase H)对靶RNA扩增出大量末端带有G4序列的特异性产物；再加入K+和THT促进折叠G4结构的产生；随后产物在425nm的激发光下可以检测到490nm发射光下的显著荧光增强，在无靶RNA存在时无法形成带有G4序列的产物从而不能检测到增强的荧光。
图2为本发明对经猪瘟病毒感染后的PK-15细胞、空白的PK-15细胞以及无菌双蒸水进行检测后利用多功能酶标仪(SpectraMax i3，Molecular Devices产品)荧光分析结果(激发波长为425nm，发射波长为490nm)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。
实施例：
一、配制试剂盒，其组成为：
(1)NASBA反应缓冲液包括：50mM Tris/HCl pH8.5，10mM MgCl2，90mM KCl，10mMDTT，每种dNTP 1mM，每种NTP 2mM，10％(v/v)DMSO；
(2)NASBA正向引物和反向引物，包括：0.4μM正向引物E2F-GG29：CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC-CACCACCTGGAAAGAA；0.4μM反向引物E2R-T7：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTACTGACCA；其中正向引物前端包含G-四链体序列GG29的反向互补序列CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC和CSFV-E2结合序列CACCACCTGGAAAGAA，反向引物前端则加上带有保护碱基的T7启动子序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA和CSFV-E2结合序列TACCTCCTACTGACCA；
(3)NASBA酶反应液，包括：4mM DTT，2μg BSA，30U T7RNA聚合酶(ThermoScientific)，6U AMV-Rt(Promega)，0.1u RNase H(Thermo Scientific)；
(4)G-四链体扩增产物检测反应缓冲液，包括：50mM的Tris-HCl pH7.0和50mM的氯化钾；硫黄素T 3μM。加无菌双蒸水补足为72μl；
到最终用于荧光检测的缓冲液组成包括：25μL的NASBA扩增产物，加入后85℃变性3分钟，加入3μM的硫黄素T，促进扩增产物上的G-四链体折叠并形成复合物后进行荧光检测。
二、按照检测方法对猪瘟病毒培养物的G-四链体荧光进行检测，具体步骤为：
A、NASBA扩增：选取猪瘟病毒样品200μl，利用RNA提取试剂得到目标基因RNA。取制备好的RNA 2μL，加入到25μL的NASBA反应缓冲液体系中，该25μL体系包括0.4μM正向引物和0.4mM反向引物。反应步骤：65℃变性5分钟，42℃退火5分钟。然后加入NASBA酶反应液进行反应，等温扩增反应条件为：41℃反应2小时，最终得到RNA扩增产物。
B、G-四链体荧光检测反应：取G-四链体荧光检测反应缓冲液，反应缓冲液的组成包括50mM的Tris-HCl(pH7.0)和50mM的氯化钾，加无菌双蒸水补足为72μl，加入25μl的RNA扩增产物。然后85℃变性3min；冷却至室温，加入硫黄素T 3μM，然后将溶液转移到96孔酶标板中，将酶标板放入酶标仪，以425nm波长的光源激发，检测490nm波长处发射的荧光。
结果判定：如果检测到的荧光强度高于1.0×106RFU即可判断为猪瘟病毒阳性；低于5.0×105RFU即可判断为猪瘟病毒阴性；如果荧光强度在5.0×105RFU和1.0×106RFU之间的，则需要重新测定。

Claims (3)

1.一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法，其特征在于：以从猪瘟病毒样品中提取的病毒RNA为扩增对象，采用等温核酸扩增技术，利用逆转录酶AMV、核糖核酸酶H及T7RNA聚合酶进行等温扩增，产生大量单链RNA扩增产物；然后加入含有Tris-HCl和KCl的缓冲液，再加硫黄素T促进扩增产物上的G-四链体折叠并形成复合物，再对扩增产物以425nm波长的光源激发并检测490nm波长处发射的荧光，根据荧光的强弱进行判断。
2.根据权利要求1所述的一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1.NASBA扩增：将纯化好的的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系，体系中包含50mM Tris/HCl pH8.5，10mM MgCl2，90mM KCl，10mM DTT，每种dNTP 1mM，每种NTP2mM，10％(v/v)DMSO，0.4μM NASBA正向引物和0.4μMNASBA反向引物，反应步骤为加入2μL靶RNA，混合物在65℃温育5分钟以解开靶RNA的二级结构，然后将反应混合物转移至41℃退火5min，再向管中加入5.6μL酶混合物，所述酶混合物包含4mM DTT，2μg BSA，30U T7RNA聚合酶，6U AMV-Rt，0.1URNase H，得到终体积为25μL，将混合物进一步在41℃温育2小时以进行靶RNA的等温扩增；所述正向引物为E2F-GG29：CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC-CACCACCTGGAAAGAA；所述反向引物为E2R-T7：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTACTGACCA；
步骤2.G-四链体荧光检测反应：取G-四链体扩增产物荧光检测反应缓冲液，反应缓冲液的组成包括50mM的Tris-HCl，pH7.0和50mM的氯化钾，加无菌双蒸水补足为72μl，加入NASBA反应后溶液25μL，然后85℃变性3min后降至室温；加入100μM硫黄素T溶液3μL，然后将溶液转移到96孔酶标板中，将酶标板放入酶标仪或荧光光度计，以425nm波长的光源激发，检测490nm波长处发射的荧光，检测到的荧光强度高于1.0×106RFU即判断为猪瘟病毒阳性。
3.一种基于G4-ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于包括以下物质：
(1)NASBA反应缓冲液包括：50mM Tris/HCl pH8.5，10mM MgCl2，90mM KCl，10mM DTT，每种dNTP 1mM，每种NTP 2mM，10％(v/v)DMSO；
(2)NASBA正向引物和反向引物，包括：0.4μM正向引物E2F-GG29：CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC-CACCACCTGGAAAGAA；0.4μM反向引物E2R-T7：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTACTGACCA；其中正向引物前端包含G-四链体序列GG29的反向互补序列CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC和CSFV-E2结合序列CACCACCTGGAAAGAA，反向引物前端则加上带有保护碱基的T7启动子序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA和CSFV-E2结合序列TACCTCCTACTGACCA；
(3)NASBA酶反应液，包括：4mM DTT，2μg BSA，30U T7RNA聚合酶，6UAMV-Rt，0.1U RNaseH；
(4)G-四链体扩增产物检测反应缓冲液，包括：50mM的Tris-HCl pH7.0和50mM的氯化钾；硫黄素T 3μM。
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