CN114874350B

CN114874350B - 小花清风藤新多糖及其应用

Info

Publication number: CN114874350B
Application number: CN202210509594.3A
Authority: CN
Inventors: 刘呈雄; 李曼姝; 吴思靖; 柯银铅; 贺海波; 邹坤
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: CN114874350A

Abstract

本发明提供一种小花清风藤新多糖，其平均分子质量为4.057×103 Da，由α‑葡萄糖构成，连接方式为1→6，表面粗糙度分析结果表明SPT1主要为球形团聚体。采用水提醇沉、葡聚糖凝胶G‑100和G‑200柱色谱等方法分离纯化，从小花清风藤茎叶水提30%醇沉部位分离得到1个新多糖（SPT1）。SPT1对四氯化碳损伤的L‑O2细胞的保护实验显示其具有保肝护肝活性。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制活性的测定结果表明SPT1对PTP1B酶具有抑制活性。

Description

小花清风藤新多糖及其应用

技术领域

本发明提供一种小花清风藤新多糖及在制药上的应用，属于天然产物分离提取技术领域。

背景技术

小花清风藤(Sabia parvuflora Wall.ex Roxb.)是清风藤属一种常绿木质藤本植物。主要分布在贵州黔西南州等喀斯特地貌的天然丛林或灌木丛中，广西和云南也有零星分布[唐继方,邓朝义,卢永成.黔西南州小花清风藤资源分布及利用状况调查.贵州林业科技,2002,30(3):8-10,18]。以小花清风藤为主要原料开发的“花桅清肝颗粒”(国药准字Z20025804)，该药治疗黄疽性肝炎的有效率达93％。据报道，以小花清风藤茎叶鲜品水煎服或制成的冲剂口服，单药治疗甲型肝炎31例和乙型肝炎12例，前者转阴有效率96.8％，后者93.6％[温迪,孙庆文,潘国吉,等.清风藤属药用植物研究进展.贵州科学,2016,34(3):25-31]。现代药理学研究证明，小花清风藤具有保肝护肝[李建桥,李玉玲,胡建忠,等.小花清风藤水提物对乙酰氨基酚致小鼠药物性肝损伤保护作用.中国药理学与毒理学杂志,2019,33(09):733.；张学学,赵东晓,李建桥,等.小花清风藤茎叶提取工艺优化及保肝活性研究.华中师范大学学报(自然科学版),2020,54(1):65-69,73.]、抗病毒[曲新艳,张会敏,张晓娟,等.小花清风藤水提物体内抗流感病毒的研究.生物技术通讯,2015,26(6):802-804.]、类风湿关节炎[***,王永萍,杨奕樱,等.小花清风藤对类风湿关节炎大鼠TNF-α和MMP-9表达的影响.湖南中医杂志,2018,34(3):154-157.；许欢,潘书涵,王永萍,等.小花清风藤醇提液对RA大鼠相关蛋白的影响.中药药理与临床,2018,34(6):87-92.]、降血脂[Fan D,Wang Q,Wang Y,et al.New compounds inhibiting lipid accumulation from thestems of Sabia parviflora.Fitoterapia,2018,128:218-223.]和抗氧化活性[王小贤,田甜,苏香萍,等.小花清风藤绿茶制备工艺及其抗氧化活性.食品工业,2019,40(7):29-33.]等药理活性。根据文献记载，小花清风藤的化学成分主要分为五环三萜类[陈谨,邓赟,唐天君,等.小花清风藤三萜成分的研究.中草药,2004,1:20-21.]、生物碱类[赵兰君,王玉伟,李志峰,等.小花清风藤化学成分的分离与鉴定.中草药,2018,49(3):544-548.]、芳香苷类[朱仝飞,李萍,孙庆文,等.小花清风藤叶的化学成分研究.广西植物,2019,39(4):511-515.]、苯丙素类[邓赟,陈谨,陈斌,等.小花清风藤生物碱成分的研究.天然产物研究与开发,2003,4:322-323.]、黄酮类[潘国吉,孙庆文,徐文芬,等.小花清风藤中黄酮类成分的研究.中成药,2020,42(3):662-665.]。小花清风藤化学成分研究主要集中在醇提物上，对其水提物的化学成分研究却鲜有报道，其水提物的保肝护肝活性也仅限于水部位总提物的药理活性研究。

发明内容

针对上述技术问题，本发明从茎和叶中的水提物中分离纯化得到SPT1，并鉴定了其结构，评价了其保肝护肝活性和对PTP1B酶的抑制活性，实验结果证明SPT1具有一定的保肝作用和PTP1B酶抑制活性，其结果为民间药物在肝炎治疗中的应用提供了依据。

小花清风藤新多糖，该新多糖平均分子质量为4.057×103Da，由α-葡萄糖构成组成，糖苷键连接方式是1→6，结构式为：

SPT1结构及HMBC和NOESY关键部位。¹³C-NMR显示葡萄糖的6个碳信号，δC 65.7，69.7，70.3，71.5，73.5，97.8。¹H-NMR显示末端质子信号δH 4.98(J＝2.5Hz)。通过NOESY(H-6/H-1)与质子耦合常数的相关性，确定葡萄糖为α型。HMBC表明H-1与C-6有关，说明SPT1的糖苷键连接方式是1→6。

所述的小花清风藤新多糖的提取方法，将小花清风藤新多糖经加水回流提取后，采用质量浓度25-35％的乙醇沉淀，得到的多糖经Sephadex G-100纯化、超纯水洗脱、Sephadex G-200纯化、超纯水洗脱得到小花清风藤新多糖。

本发明的又一技术方案是将所述的小花清风藤新多糖在制备治疗保肝护肝的药物上的应用。具体的，本发明将小花清风藤新多糖在制备治疗四氯化碳损伤的L-O2细胞的保肝护肝的药物上的应用。

本发明还提供一种小花清风藤新多糖在制备治疗或改善2型糖尿病或肥胖症的药物上的应用。所述的小花清风藤新多糖在制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的药物上的应用。

小花清风藤是布依族、苗族的民间用药，用其根茎入药，可用于医治急性黄疸型肝炎。本发明对小花清风藤的茎和叶部位进行水提30％醇沉，通过葡聚糖凝胶柱色谱分离纯化得到单体多糖SPT1，利用NMR、GPC、AFM等波谱学手段鉴定多糖信息，实验结果显示：SPT1由α-葡萄糖构成，连接方式为1→6，其平均分子质量为4.057KDa，其形貌为球形团聚体，MTT实验结果表明新多糖SPT1具有一定的保肝护肝活性。同时，PTP1B抑制活性结果表明，SPT1对PTP1B有抑制作用。抑制PTP1B活性是防治糖尿病及肥胖等代谢性疾病的有效途径。因此,本实验为进一步研究或能够找到潜在的用于治疗或改善2型糖尿病和肥胖症的新的PTP1B抑制剂提供科学依据。

《中国民族药志》记载，小花清风藤茎叶适量，煎水当茶喝可以防治黄疸型传染性肝炎。因此，本实验进一步研究了小花清风藤水提物的化学成分，丰富了小花清风藤化合物保肝活性的研究，为其物质基础研究提供了依据，为民间用药治疗肝炎提供了依据。

附图说明

图1为单糖组成分析结果，其中，A为衍生化混合对照溶液，B为衍生阴性对照溶液，C为衍生化试验溶液。

图2为小花清风藤新多糖的扫描电镜图，其中，A为放大50倍，B为放大200倍，C为放大1000倍，D为放大10000倍，E为放大20000倍。

图3为SPT1的原子力显微镜图像。

图4为SPT1对四氯化碳损伤的L-O2细胞的保护作用效果，注:n＝4；与正常组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

本实施例中，小花清风藤茎和叶采自贵州省黔西南布依族苗族自治州兴义市册亨县，经三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室王玉兵教授鉴定为小花清风藤(Sabia parviflora Wall.ex Roxb.)。受试细胞：L-O2细胞(人正常肝细胞)，购于北纳生物科技有限公司。

本实施例所用的仪器如下：高效液相色谱仪(Dionex Ultimate 3000，美国戴安公司)；核磁共振波谱仪(Bruker AV 400，瑞士布鲁克公司)；低温冷冻干燥机(美国Labconco公司)；电子天平(AL204-IC，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；CO₂培养箱(3111，美国赛默飞世尔Thermo公司)；洁净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司)；涡旋振荡器(Vortex-Genie 2，美国Scientific Industries)；高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；InfiniteM200 Pro酶标仪(瑞士TECAN集团公司)。

Sephadex G-100、Sephadex G-200(北京索莱宝科技有限公司)；H₂O₂、正丁醇、DMSO、CCL₄、KH₂PO₄和CH₂CL₂(国药集团化学试剂有限责任公司)；二甲基噻唑二苯基四哗溴盐(MTT)(Sigma公司)；葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、PMP和三氟乙酸(麦克林生化科技有限公司)；NaOH(天津市天力化学试剂有限公司)；胎牛血清FBS、RPMI1640培养基(美国Gbico公司)；青链霉素(美国Hyclone公司)。

实施例1

新多糖的提取与纯化

将小花清风藤的茎叶干燥并粉碎，过筛，称量25.6kg。以料液比为1:20(m:v＝1:20)的水提取，100℃加热回流共提取3次，每次1h，合并滤液，布氏漏斗过滤后，经旋转蒸发器浓缩至合适浓度后，喷雾干燥，得到总提取物干粉1.5kg。

再用30％乙醇沉淀100g的总提物干粉，离心后得到30％乙醇沉淀物。通过水溶解沉淀物，过氧化氢除去色素，savage试剂法除蛋白质，得到粗多糖。用Sephadex G-100对粗多糖进行分离纯化，100mL·h^-1的超纯水洗脱，得Fr.1-50。经高效液相色谱法分析，将Fr.29-41合并，用Sephadex G-100进一步纯化，4.8mL·h^-1的超纯水洗脱，得Frs.1-40。经高效液相色谱法分析，将Frs.26用Sephadex G-200进一步纯化，1.8mL·h^-1的超纯水洗脱，得到小花清风藤新多糖化合物SPT1。

根据参考文献[赖戈娜,贾文玉,罗思婉,等.猪苓多糖的PMP柱前衍生化-HPLC指纹图谱研究.中国药房,2020,31(07):788-793.]的方法，将SPT1进行多糖的水解和乙酰化。通过高效液相色谱法比较样品与标准品单糖的保留时间，分析SPT1的单糖组成。标准品：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖。色谱条件：C₁₈色谱柱，流动相A为0.1mol·L^-1的磷酸盐缓冲液(pH6.8)，B为纯水，洗脱比例A：B(v:v)＝22:78，流速为1mL·min^-1。

多糖分子量测定

SPT1的分子量用凝胶渗透色谱仪(Waters515)、十八角度激光光散射仪(WyattDawn Heleos11)和示差折光检测器(Optilab T-rex)测定。色谱柱：Shodex OHpak SB-806HQ串接SB-804HQ，流动相:超纯水(0.02％叠氮化钠)，PH＝6；流速1.0mL·min-1，柱温25℃，进样量100μL，Mw测量范围:200～10°Daltons。

平均分子量结果

表1 GPC分析结果

用凝胶渗透色谱法测定多糖的分子量。结果表明，SPT1的平均分子量为4.057×10³Da，且分散指数为1.133。

结构鉴定

SPT1在真空中干燥，然后溶解在含有重水(D₂O)的核磁共振管中，并通过400MHz核磁共振波谱仪进行¹³C-核磁共振、¹H-核磁共振、NOESY、DEPT、HSQC和HMBC的测量。SPT1水解衍生化后，通过比较保留时间，色谱图表明SPT1是由葡萄糖组成的。¹³C-NMR显示葡萄糖的6个碳信号，δC 65.7，69.7，70.3，71.5，73.5，97.8。¹H-NMR显示末端质子信号δH4.98(J＝2.5Hz)。通过NOESY(H-6/H-1)与质子耦合常数的相关性，确定葡萄糖为α型。HMBC表明H-1与C-6有关，说明SPT1的糖苷键连接方式是1→6。

扫描电镜(SEM)观察

取适量不同纯化程度的多糖干样品SPT1，粘着于附有铜胶带的样品台上，样品台置于离子溅射仪中镀上一层导电金粉；然后将其安放在蔡司sigma300扫描电镜下观察。工作条件：加速电压3kV，观测倍数分别选用50倍、200倍、1000倍、10000倍、20000倍。进行相应的清晰度调试，直至得到理想的观察视野，并选取适当视野拍照记录，每个样品拍照重复3次，排除样品干扰及***误差。

观察多糖(SPT1)扫描电镜图中代表性的多糖结构。当SPT1被放大50倍时(图A)，样品呈颗粒状，聚集分布；当SPT1被放大200倍时(图B)，表面部分似粉末状或不规则的薄片状结构；将SPT1放大到1000倍时(图C)，多糖颗粒表面略微凹凸不平，部分有粉末状或片状结构；放大到10000和20000倍(图D、图E)，SPT1表现平整、光滑的平面结构。即使提高放大倍率,也是光滑表面,没有清晰细节，不能获得多糖聚集体的微观形貌信息。扫描电镜图谱上显示粒度为1～200μm，同时，晶体间有非常微小的空隙，使得多糖并未完全集合。这说明多糖分子间相互存在排斥力，分子间吸引力较为弱小。

原子力显微镜(AFM)观察

取适量待测样品溶液滴到云母表面，吸附一定时间，然后用超纯水冲洗，并用滤纸吸去云母表面多余的液体，用氮气轻轻吹扫云母表面得到干燥的样品。干燥后的样品放置在样品台上。本文所用的AFM仪器为NanoscopeⅣa MultiMode(Digital Instruments,Santa Barbara,CA)，采用轻敲模式(Tapping Mode)，使用探针为TESP硅探针，弹性系数为42N/m，针尖半径约为10nm，为获得高质量的图像，实验过程中扫描速率均小于1Hz，分辨率为512×512，扫描角度为0°。使用仪器自带的分析软件对得到的图片进行平滑处理并分析，可以得到样品的形貌、高度、宽度等信息。SPT1的表面形貌二维和三维图像如图3所示，SPT1主要是球形聚集体，每个聚集体长0.550～0.983μm，宽1.059～2.275μm,高208～450nm。

细胞复苏与培养

预热1640完全培养基。30分钟后，向离心管中加入3.0mL预热的培养基，取出液氮冷冻的L-O2细胞，快速将其放入41℃水浴锅中，不断摇动。取出冷冻保存管，用75％酒精擦洗消毒，将冷冻细胞悬液吸入离心管中，混合均匀，离心，弃上清，用1mL培养基吹打成单细胞悬液，转移到含有3mL培养基的培养瓶中，移入37℃、5％CO₂的培养箱中培养。当细胞单层生长到80％时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。对数生长期的肝细胞L-O2用0.25％胰蛋白酶消化，然后悬浮在含10％胎牛血清的1640培养基中，用移液枪轻轻吹打成单细胞悬液中。在倒置显微镜下，用血细胞计数板计数，将细胞浓度调节至1×10⁵个/mL。将细胞接种在96孔板中，每孔100μL，并置于37℃，5％CO₂培养箱中24h。

细胞活力测试

实验分为调零组、正常组(空白对照组)、模型组和给药组(高、中、低剂量)。吸取10mL四氯化碳，将其溶解在100mL含10％胎牛血清的1640培养基中，制成饱和四氯化碳培养基溶液。用饱和四氯化碳介质溶液将药物溶解至不同浓度，药物浓度分别为25、50和100μg·mL^-1，每个浓度设置4个复孔。

调零组不加细胞，不加药，每孔加入100μL不含四氯化碳的完全培养基；正常组加100μL/孔含10％FBS的1640培养基；模型组加100μL/孔饱和四氯化碳培养基溶液，给药组加100μL/孔含药物的饱和四氯化碳培养基。将96孔培养板置于37℃、5％CO2的培养箱中24h。24h后，每孔加入5mg·mL^-1的MTT溶液10μL/孔，继续培养4h后，弃上清，并向每个孔中加入150μL二甲基亚砜，在微孔震荡板上，500rpm，3min，晶体完全溶解。然后用酶标仪测量每个孔在492nm处的吸光度(OD值)，以计算L-O2肝细胞的存活率。

在本研究中，上述方法用于跟踪整个分离过程的活性。

L-O2细胞被10％四氯化碳损伤，MTT结果显示模型组细胞存活率显著低于正常组，说明模型建立成功。将不同浓度的药物添加到损伤的细胞中，24h后，给药组细胞存活率显著高于模型组，实验表明SPT1对损伤的L-O2细胞具有呈剂量依赖性的保护作用。

PTP1B抑制活性的测定

测定方法按照文献(Xu J,Cao J Q,Yue J Y,et al.New triterpenoids fromacorns of Quercusliaotungensis and their inhibitory activity againstα-glucosidase,α-amylase and protein-tyrosine phosphatase 1B.Journal ofFunctional Foods,2018,41:232-239.)进行。将p-NPP作为反应底物，酶标仪405nm下筛选PTP1B的活性。根据PTP1B水解p-NPP的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B的活性。化合物SPT1及阳性对照

均用反应体系进行溶解，在反应体系(pH 6.6，2mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、1mmol/L DTT、50mmol/L柠檬酸)中加10μL样品溶液(浓度梯度为500、1000、2000μg/mL)，150μL酶溶液(用反应体系配制)，放置37℃恒温箱中，孵育30min，加入10μL底物p-NPP，放置37℃恒温箱中，孵育15min，并设置空白对照组(不含酶溶液)。加入2mmol/L NaOH终止液20μL，终止反应。

PTP1B抑制率(％)＝1-[(A_样品组－A_{样品空白组})·(A_酶活性组－A_酶空白组)^-1]×100％.

每组各重复3次，用软件origin9.1计算IC50值.

结果表明，SPT1对PTP1B有一定的抑制作用，IC₅₀为29.68μmol/L，阳性药IC50为26.94μmol/L。

Claims

1.小花清风藤新多糖，其特征在于，该新多糖平均分子质量为4.057×103 Da，由α-葡萄糖构成组成，糖苷键连接方式是1→6，结构式为：

。

2.权利要求1所述的小花清风藤新多糖的提取方法，其特征在于，将小花清风藤新多糖经加水回流提取后，采用质量浓度25-35%的乙醇沉淀，得到的多糖经Sephadex G-100纯化、超纯水洗脱、Sephadex G-200纯化、超纯水洗脱得到小花清风藤新多糖。

3.权利要求1所述的小花清风藤新多糖在制备治疗保肝护肝的药物上的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，小花清风藤新多糖在制备治疗四氯化碳损伤的L-O2细胞的保肝护肝的药物上的应用。

5.权利要求1所述的小花清风藤新多糖在制备治疗或改善2型糖尿病或肥胖症的药物上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的小花清风藤新多糖在制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的药物上的应用。