CN114868009A - 用于离群聚类无监督学习自动报告(ocular)的***、方法和测定 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于识别液体活检样本中存在的生物结构的***。该***根据其荧光特征和形态识别常见生物结构和稀有生物结构。所识别的生物结构可用于诊断和治疗患有疾病的人。本公开中描述的实例还涉及可与本公开的***一起用于诊断和治疗患有疾病的人的方法和测定。
Description
相关申请的交叉引用
本申请主张于2019年10月14日提交的第62/914,763号美国临时申请的权益，其公开内容以全文引入的方式并入本文。
技术领域
在至少一个方面，提供一种基于生物结构的荧光特征和形态识别液体活检样本中存在的生物结构的***。在另一个方面，提供一种用于识别存在于液体活检样本中的生物结构的方法和测定。其他方面进一步涉及通过使用本文所述的***、方法和测定对患有疾病的人进行诊断和治疗。
背景技术
传统上，癌症中的稀有事件检测领域(通常称为液体活检或循环肿瘤细胞)通过各种富集方法关注具有已知或假定不同表型的某些稀有细胞亚型，这些方法基于其大概已知的表型选择特定靶细胞(例如基于蛋白质的表型；基于形状的表型；或其他基于生物物理、物理、化学的表型)。
然而，癌症及其相关细胞似乎比传统认识的要复杂和多样得多，并且血液中的稀有细胞可能不完全属于特定类别和/或一致类别。
以下出版物是本公开背景的相关技术：Allard，W.J.等人，肿瘤细胞在所有主要癌的外周血中循环，但不在健康受试者或患有非恶性疾病的患者中循环(Tumor cellscirculate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthysubjects or patients with nonmalignant diseases),临床癌症研究，2004.10(20)：第6897-904页；Liu,C.-Y.等人，波形蛋白通过介导细胞骨架组织和病灶粘附成熟促进上皮-间质转化癌细胞机制(波形蛋白contributes to epithelial-mesenchymal transitioncancer cell mechanics by mediating cytoskeletalorganization and focaladhesion maturation)，癌症靶标，2015.6(18)；Vuoriluoto,K.等人，波形蛋白通过控制乳腺癌中的Axl表达来调节Slug和致癌H-Ras的EMT诱导(波形蛋白regulates EMT inductionby Slug and oncogenic H-Ras and migration by governing Axl expression inbreast cancer)，致癌基因，2011.30(12)：第1436-1448页；Lou,X.-L.等人，循环癌细胞和血小板之间的相互作用：临床意义(Interaction between circulating cancer cellsand platelets:clinical implication)，中国癌症研究期刊＝Chung-kuo yen cheng yenchiu,2015.27(5)：第450-460页；Goubran,H.A.等人，血小板对肿瘤生长的影响(Plateletseffects on tumor growth),Semin Oncol,2014.41(3)：第359-69页；Li,N.，血小板在癌症转移中：帮助”反派”做恶(Platelets in cancer metastasis:To help the“villain”todo evil)，国际癌症期刊，2016.138(9)：第2078-2087页；Labelle,M.,S.Begum,RichardO.Hynes,血小板和癌细胞之间的直接信号传导诱导上皮-间质样转化并促进转移(DirectSignaling between Platelets and Cancer Cells Induces an Epithelial-Mesenchymal-Like Transition and Promotes Metastasis)，癌细胞，2011.20(5)：第576-590页；Boraas,L.C.,T.Ahsan,缺乏波形蛋白会损害胚胎干细胞的内皮分化(Lack of波形蛋白impairs endothelial differentiation of embryonic stem cells)，科学报告，2016.6：第30814页；Miettinen,M.,J.F.Fetsch,角蛋白在正常内皮细胞和一系列血管肿瘤中的分布：在肿瘤诊断中的意义(Distribution of keratins in normal endothelialcells and a spectrum of vascular tumors:Implications in tumor diagnosis),人类病理学，2000.31(9)；第1062-1067页；Dellagi,K.等人，波形蛋白中间丝细胞骨架在急性非淋巴细胞白血病中的表达(Expression of波形蛋白intermediate filamentcytoskeleton inacute non lymphoblastic leukemias)，血液，1985.65(6)：第1444-52页；Gustmann,C.等人，大细胞间变性淋巴瘤和其他非霍奇金淋巴瘤中的细胞角蛋白表达和波形蛋白含量(Cytokeratin expression and波形蛋白content in large cellanaplastic lymphomas and other non-Hodgkin's lymphomas),Am J Pathol,1991.138(6)：第1413-22页；Satelli,A.等人，上皮-间质转化的循环肿瘤细胞捕获用于检测肿瘤进展(Epithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells capture fordetecting tumor progression),临床癌症研究：美国癌症研究协会官方期刊，2015.21(4)：第899-906页；Yang,S.,X.Li，富含与癌症相关的非编码RNA的细胞外囊泡的研究进展(Recent advances in extracellular vesicles enriched with non-coding RNAsrelated to cancers)，基因与疾病，2017.5(1)：第36-42页；以及Théry,C.等人，2018年细胞外囊泡研究的最小信息(MISEV2018)：国际细胞外囊泡协会的立场声明和MISEV2014指南的更新(Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018(MISEV2018):aposition statement of the International Society forExtracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines)，细胞外囊泡期刊，2018.7(1)：第1535750-1535750页；Zeuschner,P.,J.Linxweiler,K.Junker,非编码RNA作为液体活检中的生物标记，特别强调泌尿***恶性肿瘤中的细胞外囊泡(Non-codingRNAs as biomarkers in liquid biopsies with a special emphasis onextracellular vesicles in urological malignancies)，分子诊断专家评论，2019：第1-17页。
因此，需要改进检测和表征液体活检样本中稀有和常见事件的技术。
发明内容
在至少一个方面，提供了一种用于识别液体活检样本中存在的生物结构的***。该***根据常见生物结构和稀有生物结构的荧光特征和形态识别常见生物结构和稀有生物结构。所识别的生物结构可用于诊断和治疗患有疾病的人。本公开的实例还涉及可与本公开的***一起用于诊断和治疗患有疾病的人的方法和测定。
另一方面，提供了一种用于识别液体活检样本中存在的生物结构的***(“生物结构识别***”)。该***可包括光学成像***和处理***。液体活检样本可包括生物结构。该生物结构可以用荧光团进行标记。
另一方面，光学成像***可包括适合支持液体活检样本的载体(“液体活检样本载体”)，用于识别生物结构；能够以特定波长(或多个波长)照射液体活检样本的照明***；光检测***；以及光控制***。该光控制***可配置为允许检测液体活检样本的发射的电磁辐射；允许检测由液体活检样本散射、反射和/或透射的电磁辐射；以及将电磁辐射从照明***引导到液体活检样本，并从液体活检样本引导到光检测***。
另一方面，生物结构识别***可配置为通过使用液体活检样本载体接收液体活检样本；用具有特定波长并可被荧光团吸收的电磁辐射照射液体活检样本；检测并确定由荧光团发射的荧光的强度和波长；生成生物结构的图像；使用每个生成的图像检测并确定每种生物结构的形态；基于每种生物结构的特定形态和特定荧光波长，识别每种生物结构的类型；基于识别的生物结构的类型，形成生物结构识别桶(“识别桶”)，其中每个生物结构识别桶包含类型相似的生物结构；并基于识别桶形成一组识别桶(“识别桶组”)。
另一方面，生物结构可以是具有膜、蛋白质、DNA、RNA或其组合的结构。具有膜的结构可以是细胞、囊泡，或其组合。囊泡可以是癌小体(oncome)。癌小体可具有等于或大于一微米的特征尺寸(例如，特征长度或特征直径)。该癌小体可具有大于外来体的特征尺寸(例如，特征长度或特征直径)。
另一方面，液体活检样本可以是非固体生物样本。液体活检样本可以是体液样本。液体活检样本可以包括血液样本、骨髓样本、腹膜液样本、尿液样本、唾液、***液样本、***样本、泪液样本、粘液样本、房水样本、脑脊液(CSF)本，或其组合。液体活检样本可包括血液样本。液体活检样本可包括常见的免疫细胞和稀有生物结构。
另一方面，稀有生物结构可包括具有癌症基因组谱和/或癌症蛋白标记物的癌细胞；渗入循环中的肿瘤微环境细胞，其中这些细胞包括上皮细胞、内皮细胞、***、其他基质细胞、处于各种转化状态的细胞，或其混合物；对肿瘤本身或癌症治疗有反应的免疫细胞；囊泡，或其混合物。稀有生物结构可包括传统的循环肿瘤细胞，其为CK+、波形蛋白-、CD31-和CD45-；循环肿瘤细胞，其为CK+、CD31-、CD45-和波形蛋白+，其中可推定肿瘤细胞处于上皮向间质过渡；肿瘤细胞，其为CK+并涂有血小板，所述血小板为CD31+；内皮细胞，其为CD31+、波形蛋白+和CK-；内皮细胞，其为CD31+、波形蛋白+和CK+；巨核细胞，其为CD31+和波形蛋白-，其中巨核细胞可包括含有单一、大型、多叶、多倍体核的大细胞，负责生产血小板；大细胞，其为CD31+和CK+，其中这些大细胞可存在于取自骨髓的液体活检样本中；细胞，其为DAPI+和波形蛋白+；圆细胞，其为CD45+和CK+；圆细胞，其为CD45+、波形蛋白+和CK+；细胞聚类(“cell cluster”)，其包含至少两个细胞，其中这些细胞是相同类型的细胞和/或不同类型的细胞；细胞，其为DAPI+、CD45-、CD31-和CK-；免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白-；免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白+(III型中间丝蛋白)，细胞外囊泡，或其混合物。
另一方面，液体活检样本可包括常见生物结构和稀有生物结构，其中生物结构的总数是常见生物结构的数量和稀有生物结构的数量之和，并且其中稀有生物结构的部分等于或小于生物结构总数的10％、5％、1％、0.1％或0.01％。
另一方面，光学成像***可包括荧光成像***、明视野成像***或其组合。该光学成像***可以包括荧光显微镜、明视野显微镜或其组合。
另一方面，发射的电磁辐射可以是荧光辐射。
另一方面，处理***可以包括控制***、硬件处理器、存储***和信息传输***。
另一方面，生物结构识别***可以具有至少一个荧光通道。在改进中，生物结构识别***包括1至10个荧光通道。在进一步的改进中，生物结构识别***包括4至7个荧光通道。
另一方面，荧光通道的数量可只有四个。这四个荧光通道可以是第一荧光通道，其配置为用于核分割和表征的检测；第二荧光通道，配置为检测细胞角蛋白(CK)的上皮样表型；第三荧光通道，配置为检测波形蛋白的内皮/间质样表型；和第四荧光通道，配置为检测CD31的内皮样表型，以及CD45的免疫细胞表型。这四个荧光通道可为第一荧光通道，其配置为检测蓝色波长区域的荧光发射；第二荧光通道，配置为检测红色波长区域的荧光发射；第三荧光通道，配置为检测橙色波长区域的荧光发射；以及第四荧光通道，配置为检测绿色波长区域的荧光发射。第一免疫荧光通道可配置为检测4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用于核分割和表征。
另一方面，本公开的***可配置为从多个特征中识别内皮细胞和免疫细胞。由于内皮细胞和免疫细胞的形态可以从多个特征中确定，因此内皮细胞和免疫细胞也可以用于识别内皮细胞和免疫细胞。本公开的***可配置为从多个特征(和/或从多个特征确定的内皮细胞和免疫细胞的形态)识别内皮细胞和免疫细胞，并区分内皮细胞和免疫细胞。与免疫细胞相比，内皮细胞可能具有更多的狭长形态，而与内皮细胞相比，免疫细胞可能具有更多的圆形形态。
另一方面，生物结构的形态可以通过使用生物结构的形态的至少一个特征来确定。生物结构的形态可以通过使用生物结构的形态的至少10个特征、至少100个特征、至少500个特征、或至少1000个特征来确定。该特征可与生物结构的形态的大小、形状、纹理和结构有关。
另一方面，液体活检样本可取自患病的患者。液体活检样本可取自患有癌症的人。
另一方面，生物结构识别***可以进一步配置为基于与识别桶组相关的信息形成疾病图，将该疾病图与特定疾病和疾病阶段相关联，并根据相关的特定疾病及其阶段标记该疾病图。该生物结构识别***可进一步配置为基于与识别桶组相关并通过疾病类型和疾病阶段进行标记的信息来存储疾病图，并且其中疾病可能导致形成所述识别桶组的生物结构的形成。该生物结构识别***配置为形成至少两种不同类型的疾病和每种疾病的阶段的疾病图。该生物结构识别***可进一步配置为基于不同疾病类型及其阶段的疾病图，形成疾病图的疾病图谱。
另一方面，生物结构识别***可以进一步配置为基于从患有疾病的人所接收的的液体活检样本来诊断疾病类型及其阶段。生物结构识别***可以进一步配置为基于从患有疾病的人所接收的液体活检样本，通过比较所接收的液体活检样本形成的疾病图与在接收液体活检样本之前存储在生物结构识别***中的疾病图谱的疾病图，来诊断疾病类型及其阶段。
另一方面，生物结构识别***可以进一步包括信息传输***。生物结构识别***可以进一步配置为通过信息传输***向用户传输信息，该信息包含与存在于液体活检样本中的生物结构的类型、生物结构识别桶、疾病图、疾病图谱或其组合相关的信息。
仍在另一方面，提供了一种用于分析液体活检样本的免疫荧光测定。该测定可包括针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体。
仍在另一方面，提供了一种分析液体活检样本的方法。该方法可包括具有包含生物结构的液体活检样本；通过使用液体活检样本制备包含单层生物结构的样本(“单层生物结构样本”)；使用本公开的测定；通过使用四种荧光成分(例如，染料或如荧光团标记的抗体等成分)；使用本公开的生物结构识别***；通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构；并根据识别的生物结构类型形成生物结构识别桶，其中每个生物结构识别桶可包含相似类型的生物结构。
还在另一个方面，提供了一种诊断患者所患的疾病的方法。该方法可包括具有来自患者的包含生物结构的液体活检样本；通过使用液体活检样本制备包含单层生物结构的样本(“单一生物结构层样本”)；用具有四种荧光成分(例如，染料或如荧光团标记的抗体等的成分)的测定对单一生物结构层样本的生物结构进行染色；使用本公开的生物结构识别***；通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构；根据识别的生物结构类型，形成生物结构识别桶(“识别桶”)，其中每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构；基于识别桶，形成一组识别桶(“识别桶组”)；将与识别桶组相关的信息和图谱的信息进行比较；确定患者所患的疾病；以及治疗患者。
通过以下具体方面进一步公开了该***和该方法的示例性特征：
在第一具体方面，用于识别存在于液体活检样本中的生物结构的***包括：
光学成像***；和
处理***；
其中液体活检样本包含生物结构，并且其中生物结构用荧光团标记；
其中光学成像***包括：
适用于支持液体活检样本的载体(“液体活检样本载体”)，用于识别生物结构；
能够以特定波长(或多个波长)照射液体活检样本的照明***；
光检测***；以及
光控制***，该***配置为：
允许检测来自液体活检样本的发射的电磁辐射；
允许检测由液体活检样本散射、反射和/或透射的电磁辐射；以及
将电磁辐射从照明***引导到液体活检样本，并从液体活检样本引导到光检测***；
其中，生物结构识别***配置为：
通过使用液体活检样本载体接收液体活检样本；
用具有特定波长并能被荧光团吸收的电磁辐射照射液体活检样本；
检测并确定荧光团发射的荧光强度和波长；
生成生物结构的图像；
使用每个生成的图像检测并确定每种生物结构的形态；
根据每种生物结构的特定形态和特定荧光波长识别每种生物结构的类型；
基于识别的生物结构类型，形成生物结构识别桶(“识别桶”)，其中每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构；以及
基于识别桶，形成一组识别桶(“识别桶组”)。
在第二个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构是具有膜、蛋白质、DNA、RNA或其组合的结构。
在第三个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得具有膜的结构是细胞、囊泡或其组合。
在第四个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得囊泡是癌小体。
在第五个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得囊泡是具有等于或大于一微米的特征尺寸(例如，特征长度或特征直径)的癌小体。
在第六个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得囊泡是具有大于外来体的特征尺寸(例如，特征长度或特征直径)的癌小体。
在第七个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本是非固体生物样本。
在第八个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本是体液样本。
在第九个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本包含血液样本、骨髓样本、腹膜液样本、尿液样本、唾液、***液样本、***样本、泪液样本、粘液样本、房水样本、脑脊液(CSF)样本，或其组合。
在第十个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本包含血液样本。
在第十一个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本包含常见免疫细胞和稀有生物结构。
在第十二个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得稀有生物结构是：
具有癌症基因组谱和/或癌症蛋白标记物的癌细胞；
渗入循环中的肿瘤微环境细胞，其中这些细胞包含上皮细胞、内皮细胞、***、其他基质细胞、处于各种转化状态的细胞，或其混合物；
对肿瘤本身或癌症治疗有反应的免疫细胞；
囊泡，或
其混合物。
在第十三个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得稀有生物结构包含：
常规循环肿瘤细胞，其为CK+、波形蛋白-、CD31-和CD45-；
循环肿瘤细胞，其为CK+、CD31-、CD45-和波形蛋白+，并且其中可推定肿瘤细胞处于上皮向间质过渡；
肿瘤细胞，其为CK+，并涂有血小板，该血小板为CD31+；
内皮细胞，其为CD31+，波形蛋白+和CK-；
内皮细胞，其为CD31+，波形蛋白+和CK+；
巨核细胞，其为CD31+和波形蛋白-，其中巨核细胞可包含含有单一、大型、多叶、多倍体核的大细胞，负责生产血小板；
大细胞，其为CD31+和CK+，其中这些大细胞可能存在于取自骨髓的液体活检样本中；
细胞，其为DAPI+和波形蛋白+；
圆细胞，其为CD45+和CK+；
圆细胞，其为CD45+、波形蛋白+和CK+；
细胞聚类(“cell cluster”)，其包含至少两个细胞，其中细胞为相同类型的细胞和/或不同类型的细胞；
细胞，其为DAPI+、CD45-、CD31-和CK-；
免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白-；
免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白+(III型中间丝蛋白)，细胞外囊泡，或
其混合物。
在第十四个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本包含常见生物结构和稀有生物结构，其中生物结构的总数是常见生物结构的数量和稀有生物结构的数量之和，并且其中稀有生物结构的部分等于或小于生物结构总数的10％、5％、1％、0.1％或0.01％。
在第十五个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得光学成像***包含荧光成像***、明视野成像***或其组合。
在第十六个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得发射的电磁辐射是荧光辐射。
在第十七个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得光学***包含激发滤光片、发射滤光片、(二向色)镜、透镜、光纤或其组合。
在第十八个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得光学成像***包含荧光显微镜、明视野显微镜或其组合。
在第十九个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得处理***包含控制***、硬件处理器、存储器***和信息传输***。
在第二十个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***具有至少一个荧光通道。
在第二十一个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***具有荧光通道，其中荧光通道的数量在1到10的范围内。
在第二十二个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***具有荧光通道，其中荧光通道的数量在4到7的范围内。
在第二十三个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***只有四个荧光通道。
在第二十四个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***只有四个荧光通道，其中四个荧光通道是：
第一荧光通道，其配置为用于核分割和表征的检测；
第二荧光通道，其配置为检测细胞角蛋白(CK)的上皮样表型；
第三荧光通道，其配置为检测波形蛋白的内皮/间质样表型；以及
第四荧光通道，其配置为检测CD31的内皮样表型，以及CD45的免疫细胞表型。
在第二十五个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***只有四个荧光通道，其中四个荧光通道是：
第一荧光通道，其配置为检测蓝色波长区域的荧光发射；
第二荧光通道，其配置为检测红色波长区域的荧光发射；
第三荧光通道，其配置为检测橙色波长区域的荧光发射；以及
第四荧光通道，其配置为检测绿色波长区域的荧光发射。
在第二十六个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得第一免疫荧光通道配置为检测4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用于核分割和表征。
在第二十七个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***只有四个荧光通道，其中该***、方法和/或测定配置为从多个特征中识别内皮细胞和免疫细胞。由于内皮细胞和免疫细胞的形态可以从多个特征中确定，因此也可以用内皮细胞和免疫细胞来识别内皮细胞和免疫细胞。
在第二十八个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***只有四个荧光通道，其中该***、该方法、和/或测定配置为从多个特征(和/或从由多个特征确定的内皮细胞和免疫细胞的形态)识别内皮细胞和免疫细胞，并区分内皮细胞和免疫细胞，其中内皮细胞与免疫细胞相比具有更多的狭长形态，而免疫细胞与内皮细胞相比具有更多的圆形形态。
在第二十九个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得通过使用生物结构的形态的至少一个特征来确定生物结构。
在第三十个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得通过使用生物结构的形态的至少10个特征、至少100个特征、至少500个特征、或至少1000个特征来确定生物结构的形态。
在第三十一个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得特征与生物结构的形态的大小、形状、纹理和结构有关。
在第三十二个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本获得自患病的患者。
在第三十三个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得液体活检样本获得自患有癌症的人。
在第三十四个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***进一步配置为基于与识别桶组相关的信息形成疾病图，将该疾病图与特定疾病和疾病阶段相关联，并根据相关的特定疾病及其阶段标记该疾病图。
在第三十五个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***进一步配置为基于与识别桶组相关并按疾病类型和疾病阶段标记的信息来存储疾病图，并且其中疾病导致形成所述识别桶组的生物结构的形成。
在第三十六个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***配置为形成至少两种不同类型的疾病和每种疾病的阶段的疾病图。
在第三十七个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***进一步配置为基于不同疾病类型及其阶段形成疾病图的疾病图谱。
在第三十八个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***进一步配置为基于从患有疾病的人所接收到的液体活检样本来诊断疾病类型及其阶段。
在第三十九个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***进一步配置为基于从患有疾病的人所接收的液体活检样本，通过比较所接收的液体活检样本形成的疾病图与在接收液体活检样本之前存储在生物结构识别***中的疾病图谱的疾病图，来诊断疾病类型及其阶段。
在第四十个具体方面，任何前述或以下具体方面的***、方法和/或测定使得生物结构识别***进一步包含信息传输***；其中生物结构识别***进一步配置为向用户传输信息，该信息包含与存在于液体活检样本中的生物结构的类型、生物结构识别桶、疾病图、疾病图谱或其组合相关的信息。
在第四十一个具体方面，用于分析液体活检样本的免疫荧光测定包括针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体。
在第四十二个具体方面，一种分析液体活检样本的方法，包括：
接收包含生物结构的液体活检样本；
通过使用液体活检样本制备包含单层生物结构的样本(“单层生物结构样本”)；
用具有四个荧光染料的测定对单层生物结构样本的生物结构进行染色，这些荧光染料各自可与蛋白质生物标记特异性的抗体结合。
使用前述或以下具体方面中的任一个的生物结构识别***；
通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构；以及
根据识别的生物结构类型形成生物结构识别桶，其中每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构。
在第四十三个具体方面，一种诊断患者所患的疾病的方法，包括：
接收来自患者的包含生物结构的液体活检样本；
通过使用液体活检样本制备包含单层生物结构的样本(“单一生物结构层样本”)；
用具有四种荧光染料的测定对单一生物结构层样本的生物结构进行染色，这些荧光染料各自可以与对蛋白质生物标志物具有特异性的抗体结合；
使用前述和以下任一具体方面的生物结构识别***；
通过稀有生物结构的荧光和形态来识别稀有生物结构；
根据识别的生物结构类型形成生物结构识别桶(“识别桶”)，其中每个生物结构识别桶包含类型相似的生物结构；
根据识别桶形成一组识别桶(“识别桶组”)；
将与识别桶组相关的信息与图谱的信息进行比较；
确定患者所患的疾病；以及
治疗患者。
先前的概述只做解释说明，并不以任何方式进行限定。除上述说明性方面、实施方式和特征外，进一步的方面、实施方式和特征将通过参考附图和以下详细描述而变得清晰易懂。
附图说明
本专利或申请文件至少包含一张彩色附图。该专利或专利申请公开文本的带有彩色附图的副本将由该局在根据要求并支付必要费用后提供。
附图是说明性实例，其并没有说明所有的实例。其他实例可以用来补充或代替。为了节省空间或更有效地解释说明，明显或不必要的细节可能被省略。一些实例可与额外的组件或步骤和/或没有说明的所有组件或步骤来实践。当相同的附图标记出现在不同的图中时，它指的是相同或类似的组件或步骤。
为了进一步理解本公开的性质、目的和优势，应参考以下详细描述，结合以下附图阅读，其中类似的附图标记表示类似的元件，并且其中：
图1A.示出了示例性生物结构识别***的框图。
图1B.示出了示例性生物结构识别***的示意图。
图2.示出了包含识别桶组和识别桶的示例性识别图。
图3.示出了示例性生物结构识别方法。
图4.示出了示例性生物结构识别方法。
图5.示出了示例性方法，该方法用于对患者的生物结构识别、诊断和治疗。
图6.示出了示例性方法，该方法对患者的生物结构识别、诊断和治疗。
图7.常规循环肿瘤细胞(CK+/波形蛋白-/CD31-/CD45-)。
图8.表达波形蛋白的循环肿瘤细胞(CK+/CD31-/CD45-)。癌细胞处于上皮向间质转化。
图9.涂有血小板(CD31+)的癌细胞(CK+)。
图10.不表达CK的内皮细胞(CD31+/波形蛋白+)。
图11.表达CK的内皮细胞(CD31+/波形蛋白+)。
图12.不表达波形蛋白的巨核细胞(CD31+)。含有单一、大型、多叶、多倍体核的大细胞，负责生产血小板。
图13.仅表达波形蛋白的细胞(DAPI+)。
图14.对CD45、CD31、CK 和波形蛋白呈阴性的细胞(DAPI+)。
图15.细胞外囊泡。
图16.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。该患者患有转移性***癌。液体活检样本为取自该患者的血液样本。
图17.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。该患者患有转移性***癌。液体活检样本为取自该患者的血液样本和骨髓样本。
图18.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。
图19.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。
图20.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。该患者为I期非小细胞肺癌(NSCLC)。液体活检样本为取自患者的血液样本。
图21.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。该患者为I期非小细胞肺癌(NSCLC)。液体活检样本为取自患者的血液样本。
图22.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。
图23.通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。该患者患有***癌。液体活检样本为取自该患者的骨髓样本。
图24.表示通过使用本公开的示例性生物结构识别***生成的患者的荧光和形态显微照片的实例。
具体实施方式
现在将详细介绍本发明目前优选的组成、实施方式和方法，它们构成本发明人目前已知的实践本发明的最佳方式。这些附图不一定是按比例绘制的。然而，应该理解的是，所公开的实施方式只是本发明的示例，该示例可以以各种和替代的形式体现。因此，此处公开的具体细节不应解释为限定，而只是作为本发明的任一方面的典型基础和/或作为教导本领域技术人员多方面地运用本发明的典型基础。
除了在实例中，或在另外明确指出的地方，本说明中表示材料的量或反应和/或使用条件的所有数字量都应理解为在描述本发明的最广泛范围时用“约”字进行修饰。一般来说，优选在规定的数字范围内进行实践。另外，除非另有明确说明：百分比、“份数”和比率值均按重量计；将一组或一类材料描述为适合或优选用于与本发明有关的特定目的，意味着该组或该类的任何两个或更多个成员的混合物也同样适合或优选；用化学术语描述的成分是指添加到描述中指定的任何组合时的成分，并不一定排除混合后的混合物成分之间的化学相互作用；首字母缩略词或其他缩写词的第一个定义适用于本文中相同缩写词的所有后续使用，并在必要时适用于最初定义的缩写词的正常语法变型；并且，除非另有明确说明，特性的测量是通过与先前或以后针对相同特性引用的相同技术确定的。
还必须注意的是，除非上下文明确指出，如说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一个/一种(a/an)”、“该/所述(the)”包含复数指称。例如，以单数形式提及一个组件意为包含多个组件。
如本文所使用的术语“约”是指有关的量或值可以是指定的特定值或其附近的一些其他值。一般来说，表示某一数值的术语“约”意为表示该数值的+/-5％以内的范围。例如，短语“约100”表示100+/-5的范围，即从95到105的范围。一般来说，当使用术语“约”时，可以预期根据本发明的相似结果或效果可以在指示值的+/-5％的范围内获得。
如本文所用术语“和/或”意味着可存在所述组的所有元素或仅存在一个元素可以。例如，“A和/或B”应指“只有A，或只有B，或A和B”。在“只有A”的情况下，该术语还包括B不存在的可能性，即“只有A，但没有B”。
还应理解的是，本发明不限于下文描述的具体实施方式和方法，因为具体的组件和/或条件可能不同。此外，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式，并不用于以任何方式进行限定。
术语“包含”与“包括”、“具有”、“含有”或“特征在于……”同义。这些术语是包容的和开放的，不排除额外的、未提及的元素或方法步骤。
短语“由……组成”排除了权利要求中未指明的任何元素、步骤或成分。当该短语出现在权利要求主体的从句中，而不是紧跟在前序之后时，它只限定该从句中规定的元素；其他元素并未从整个权利要求中排除。
短语“基本由……组成”将权利要求的范围限定在指定的材料或步骤，加上那些不会对所要求的主题的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。
短语“由……构成”是指“包括”或“由……组成”。通常情况下，该短语用于表示物体是由材料构成的。
关于术语“包括”、“由……组成”和“基本由……组成”，在本文使用这三个术语中的一个时，目前公开和要求的主题可以包括使用另外两个术语中的任一个。
术语“一个或多个”是指“至少一个”，术语“至少一个”是指“一个或多个”。术语“一个或多个”和“至少一个”包括作为子集的“多个”。
术语“基本地”、“一般地”或“约”可在本文中用于描述公开或要求的实施方式。术语“基本上地”可修饰本公开中公开或要求的数值或相对特征。在这种情况下，“基本地”可表示其修饰的值或相对特征在该值或相对特征的±0％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％之内。
还应该理解的是，整数范围明确地包括所有中间整数。例如，整数范围1-10明确地包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。同样地，1-100的范围包括1、2、3、4....97、98、99、100。同样地，当需要任何范围时，上限和下限之差的增量除以10的中间数字可以作为替代的上限或下限。例如，如果范围是1.1至2.1，可以选择以下数字1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0作为下限或上限。
在本文提出的实例中，浓度、温度、测量条件和反应条件(例如压力、pH值、温度等)可以在实例中提供的数值的±50％四舍五入或保留两个有效数字的情况下进行。在改进中，浓度、温度和反应条件(例如，压力、pH值、温度等)可以在实例中提供的数值的±30％四舍五入或保留两个有效数字的情况下进行。在另一改进中，浓度、温度和反应条件(例如压力、pH值、温度等)可以在实例中提供的数值的±10％四舍五入或保留两个有效数字的情况下进行。
在本公开内容中，不定冠词“a”和短语“一个或多个”和“至少一个”是同义的，并且是指“至少一个”。
诸如“第一”和“第二”等关系术语可仅用于区分一个实体或动作与另一个实体或动作，不一定要求或暗示它们之间的任何实际关系或顺序。当与说明书或权利要求书中的元素列表相结合使用时，术语“包含”及其任何变型是指在表明该列表不是排他性的，可以包括其他元素。同样地，在没有进一步限制的情况下，以“一个/一种(a/an)”开头的元素并不排除相同类型的其他元素的存在。
术语“事件(event)”是指对可观察的成像信号的检测，特别是对荧光信号的检测。
术语“特征”是指表征事件、图像或图像数据的任何可测量参数。例如，特征可包括形状参数、位置参数、纹理参数和量化荧光图像的参数。
术语“聚类(cluster)”是指一组相似的数据点。在改进中，可以根据数据点与聚类的中心趋势测量的接近程度将数据点分组。例如，中心趋势的测量可以是聚类的算术平均值。在这样的实例中，数据点根据它们与聚类中平均值的接近程度而被连接在一起。(例如，分层聚类)。
当提及数据点时，术语“类似”意为数据点可以被置于相同聚类中。也就是说，在聚类分析之后，相似数据点可置于或包括在相同聚类中。在改进中，如果细胞(或其他生物结构)在聚类分析(分层聚类)后属于相同聚类，则该细胞(或其他生物结构)与另一个细胞(或其他生物结构)是相似的，聚类分析(分层聚类)是一种将相似对象分组的算法。OCULAR对高维数据集进行主成分分析，然后对PCA数据集的距离矩阵进行分层聚类。分层算法的输出通过确定每个细胞属于哪个聚类来确定哪些细胞(或其他生物结构)与另一细胞(或其他生物结构)相似。在另一改进中，如果细胞特征组之间的主成分的距离在进行了PCA的大数据集(包括这些细胞特征组)的距离矩阵中发现的所有距离的百分之一之内，那么这组细胞特征(例如生物结构)与另一组细胞特征是相似的。
术语“计算装置”一般指能够执行至少一种功能的任何设备，包括与另一计算装置进行通信。
本文公开的过程、方法或算法可以交付给处理装置、控制器或计算机/由处理装置、控制器或计算机执行，其可包括任何现有的可编程电子控制单元或专用电子控制单元。同样，这些过程、方法或算法可以作为可由控制器或计算机执行的数据和指令以多种形式存储，包括但不限于永久存储在非可写存储介质，例如ROM装置和可变地存储在可写存储介质的信息诸如软盘、磁带、CD、RAM装置和其他磁性和光学介质。这些过程、方法或算法也可以在软件可执行对象中实现。或者，这些过程、方法或算法可以全部或部分地使用合适的硬件组件来体现，诸如特定应用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、状态机、控制器或其他硬件组件或装置，或硬件、软件和固件组件的组合。
在本申请中，如果引用了公开文本、专利或已发表的专利申请，则这些公开文本、专利或已发表的专利申请在此通过全文引用并入本申请，以更全面地描述本发明所涉及的技术状况。
缩写和简称：
+：阳性，当与标记物(如CD31+、CD45+、CK+和波形蛋白+)或化学分子(如DAPI+)相关联时，细胞或生物形成表达该标记或化学分子。
-：阴性，当与标记物(如CD31-、CD45-、CK-和波形蛋白-)或化学分子(如DAPI-)相关时，细胞或生物形成不表达此标记物或化学分子。
AF488:Alexa Fluor 488。
AF555:Alexa Fluor 555。
AF647：Alexa Fluor 647。
CD31：血小板内皮细胞粘附分子-1。
CD45：白细胞共同抗原。
CTC：循环肿瘤细胞。
CDRE：循环性稀有事件
CK：细胞角蛋白。
DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚。
HD-SCA：高清单细胞测定。
OCULAR：离群聚类无监督学习自动报告。
PCA：主成分分析。
TRITC：四甲基罗丹明。
一般来说，本发明提供了一种用于识别液体活检样本中存在的生物结构的***和相关方法。该***根据其荧光特征和形态，识别常见生物结构和稀有生物结构。所识别的生物结构可用于诊断和治疗患有疾病的人。本公开的实例还涉及可与本公开的***一起用于诊断和治疗患有疾病的人的方法和测定。
图1A和1B提供了识别液体活检样本中存在的生物结构的***的实例。生物结构识别***10包括光学成像***12和处理***14。液体活检样本通常包括一种或多种生物结构，其可用荧光团标记。典型地，光学成像***12配置为照射具有用荧光团标记的一种或多种生物结构的液体活检样本，并检测来自液体活检样本的发射的电磁辐射作为图像数据。处理***14配置为从图像数据中生成至少一种生物结构的图像，从图像或图像数据中检测和确定多个特征，并从多个特征中形成生物结构识别桶。每个生物结构识别桶识别相似类型的生物结构。在特别有益的变型中，生物结构识别桶识别细胞(作为生物结构)。通常地，处理***14是或包括计算装置。
在变体中，一种或多种生物结构包括一种或多种稀有生物结构。在改进中，一种或多种生物结构包括同时识别的多种生物结构。
仍然参见图1A和1B，光学成像***12可包括液体活检样本载体16，该载体适合支撑用于识别生物结构的液体活检样本；照明***18，该***能够以可被荧光团吸收的特定波长或多个波长照射液体活检样本；光检测***20，该***配置为检测和确定由荧光团发射的荧光强度和波长；以及光控制***22。光控制***22可配置为允许检测来自液体活检样本的发射的电磁辐射；允许检测由液体活检样本散射、反射和/或透射的电磁辐射；以及将电磁辐射从照明***引导到液体活检样本，并从液体活检样本引导到光检测***。如果图1B还描述了，光学***22可包括光学部件，该光学部件选自由激发滤光片40、发射滤光片42、(二向色)镜44、透镜46、光纤48及其组合所组成的组。图1B还显示了放置在载玻片52上的样本50。在改进中，来自照明***18(例如激光光源)的光通过激发滤光片40，然后到二向色镜44，二向色镜44将激发光穿过透镜46(例如物镜)。透镜46将光聚焦到标本50上。由此产生的发射或散射光穿过透镜46、二向色镜44和发射滤光片42。然后，光检测***20可选地通过光纤48检测荧光。
仍参见图1，处理***14可包括控制***24、硬件处理器26(例如CPU)、存储***28和信息传输***30。处理***14将通过硬件处理器26执行分析步骤。控制***24是执行软件组件，用户用该组件来控制光学成像***12并与之互动，并从由光学成像***收到的图像数据开始分析和构建图像。信息传输***30配置为向用户传输信息，该信息包括与存在于液体活检样本中的生物结构的类型、生物结构识别桶、疾病图、疾病图谱或其组合有关的信息。控制***24和信息传输***30通过在硬件处理器26上执行的程序代码和通过存储在存储***28中的软件和数据来运行。
在变型中，生物结构识别***10配置为通过使用液体活检样本载体16来接收液体活检样本，并用来自照明***18的电磁辐射来照射液体活检样本，该电磁辐射具有可被荧光团吸收的特定波长或多个波长。光检测***20配置为用光检测***20检测和确定由荧光团发射的荧光的强度和波长，或者为这些特征产生输入数据，以便它们可以由处理***12确定。
处理***14配置为从由光检测***20接收的图像数据生成生物结构的图像；使用多个特征从图像和/或图像数据检测并确定每种生物结构的形态；基于此处定义的每种生物结构的特征(可以确定特定形态)识别每种生物结构的类型；基于识别的生物结构类型形成生物结构识别桶(“识别桶”)，以便每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构尤其是含有这种生物结构的细胞；并可选地，基于识别桶形成一组识别桶。在特别有益的变型中，生物结构是置于识别桶和识别桶组中的细胞。在这种情况下，如下文所述，“置于”意为细胞(或其他生物结构)与识别桶和识别桶组之间的关联以计算机可读形式保存。
图2说明了示例性识别桶和识别桶组。从该图中，识别桶组是由多个识别桶构建的。在该图中，识别桶是由较小的方块识别的，这些方块用颜色编码来表示桶中的细胞数量。例如，常见细胞下的黑桶代表这些桶中的细胞(或生物结构)数量多。桶和桶组可以与任何方便用户使用的标签相关联。应该理解的是，识别桶和识别桶组通常存储在计算机可读介质中，特别是在非短暂性计算机可读介质(例如，随机存取存储器、CDROM、DVD、硬盘等)。在改进中，识别桶和识别桶组存储在计算机可读介质中作为具有所存储的值之间的关系的数据结构。可以使用的数据结构的实例包括但不限于阵列、链表、记录、图表、树状数据结构(例如二进制树)、数据框、数据库(例如关系数据库)以及其组合。
在变型中，处理***14进一步配置为基于与生物结构识别桶组相关的信息形成疾病图，将疾病图与特定疾病和疾病阶段相关联，并且根据识别的相关的特定疾病和疾病阶段标记疾病图。
在某些方面，生物结构的形态可以通过使用从图像或图像数据中提取的至少一个特征来确定。通常，图像数据将包括从样本发射的荧光的特征(例如，参数)。这些特征可以通过使用已知的软件包(如EBImage，它是作为Bioconductor项目的一部分分发的开源R包)从生成的图像或图像数据中提取。生物结构的形态可通过使用从图像或图像数据中提取的至少10个特征、至少100个特征、至少500个特征、或至少1000个特征来确定。特征可包括形状参数、位置参数、纹理参数和量化荧光图像的参数(例如，特定荧光波长和荧光信号强度等)。该特征可能与生物结构的形态的大小、形状、纹理和结构有关。在一些变型中，部署了图像掩模，其将可观察的图像区域限定在掩膜所包含的区域内。表1提供了可用于分析的特征的非限制性实例。表1中的特征的任何组合都可以被使用。
表1.从掩膜和带有掩膜的图像数据中提取的参数(即，特征)的列表。
在一些改进中，识别桶可以是特定储存库(例如，分类)，其中存储与液体活检样本中识别的特定生物结构相关的信息，其中特定生物结构可具有基本相似的特性，包括基本相似的形态和基本相似的标记物特征。与特定生物结构相关的信息可以是与生物结构相关的任何信息，包括识别桶的标签、在分析的液体活检样本的给定部分中识别的特定生物结构的数量、与特定生物结构相关的特性、与液体活检样本相关的信息等，或其组合。这些与特定生物结构相关的信息可以以任何方便的方式存储。例如，与特定识别桶相关的信息可以存储在存储***中。在一些改进中，该桶是如下所述聚类。
在某些方面，生物结构的至少一个子集可以是具有膜、蛋白质、DNA、RNA或其组合的结构。具有膜的结构可以是细胞、囊泡，或其组合。囊泡可以是癌小体。癌小体可具有等于或大于一微米的特征尺寸(例如，特征长度或特征直径)。该癌小体可具有大于外来体的特征尺寸(例如，特征长度或特征直径)。
在其他方面，液体活检样本可以是非固体生物样本。液体活检样本可以是体液样本。液体活检样本可以包括血液样本、骨髓样本、腹膜液样本、尿液样本、唾液、***液样本、***样本、泪液样本、粘液样本、房水样本、脑脊液(CSF)样本，或其组合。液体活检样本可包括血液样本。液体活检样本可包括常见的免疫细胞和稀有生物结构。
仍在其他方面，稀有生物结构可包括具有癌症基因组谱和/或癌症蛋白标记物的癌细胞；渗入循环中的肿瘤微环境细胞，其中这些细胞包括上皮细胞、内皮细胞、***、其他基质细胞、处于各种转化状态的细胞，或其混合物；对肿瘤本身或癌症治疗有反应的免疫细胞；囊泡，或其混合物。稀有生物结构可包括传统的循环肿瘤细胞，其为CK+、波形蛋白-、CD31-和CD45-；循环肿瘤细胞，其为CK+、CD31-、CD45-和波形蛋白+，其中可推定肿瘤细胞处于上皮向间质过渡；肿瘤细胞，其为CK+，并涂有血小板，该血小板为CD31+；内皮细胞，其为CD31+、波形蛋白+和CK-；内皮细胞，其为CD31+、波形蛋白+和CK+；巨核细胞，其为CD31+和波形蛋白-，其中巨核细胞可包括含有单一、大型、多叶、多倍体核的大细胞，负责生产血小板；大细胞，其为CD31+和CK+，其中这些大细胞可存在于获得自骨髓的液体活检样本中；细胞，其为DAPI+和波形蛋白+；圆细胞，其为CD45+和CK+；圆细胞，其为CD45+、波形蛋白+和CK+；细胞聚类(“cell cluster”)，其包含至少两个细胞，其中这些细胞是相同类型的细胞和/或不同类型的细胞；细胞，其为DAPI+、CD45-、CD31-和CK-；免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白-；免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白+(III型中间丝蛋白)，细胞外囊泡，或其混合物。
在某些方面，液体活检样本可包括常见生物结构和稀有生物结构，其中生物结构的总数是常见生物结构的数量和稀有生物结构的数量之和，并且其中稀有生物结构的部分等于或小于生物结构总数的10％、5％、1％、0.1％或0.01％。
在改进中，光学成像***包括荧光成像***、明视野成像***或其组合。该光学成像***可以包括荧光显微镜、明视野显微镜或其组合。
在某些方面，发射的电磁辐射可以是荧光辐射。
在某些方面，生物结构识别***包括至少一个荧光通道。荧光通道的数量可以是在1至10范围内或在4至7范围内。在改进中，荧光通道的数量可只有四个。这四个荧光通道可以是第一荧光通道，其配置为用于核分割和表征的检测；第二荧光通道，配置为检测细胞角蛋白(CK)的上皮样表型；第三荧光通道，配置为检测波形蛋白的内皮/间质样表型；和第四荧光通道，配置为检测CD31的内皮样表型，以及CD45的免疫细胞表型。这四个荧光通道可为第一荧光通道，其配置为检测蓝色波长区域的荧光发射；第二荧光通道，配置为检测红色波长区域的荧光发射；第三荧光通道，配置为检测橙色波长区域的荧光发射；以及第四荧光通道，配置为检测绿色波长区域的荧光发射。例如，这些区域可由以455nm为中心，带宽为50nm的蓝光波长的发射滤光片；以525nm为中心，带宽为36nm的绿光波长的发射滤光片；以605nm为中心，带宽为52nm的橙色波长的发射滤光片；以及以705nm为中心、带宽为72nm的红色波长的发射滤光片来定义。第一免疫荧光通道可配置为检测4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用于核分割和表征。
在某些方面，本公开的***可配置为从特征和/或从特征确定的内皮细胞和免疫细胞的形态来识别内皮细胞和免疫细胞。特别是，***可配置为从特征(和/或从特征确定的内皮细胞和免疫细胞的形态)识别内皮细胞和免疫细胞，并区分内皮细胞和免疫细胞。与免疫细胞相比，内皮细胞可具有更狭长的形态，而与内皮细胞相比，免疫细胞可具有更圆的形态。在改进中，这种形态是由本文所述的特征确定的。
在某些方面，液体活检样本获得自患病的人。液体活检样本可获得自患有癌症的人。
在一些改进中，生物结构识别***进一步配置为基于与识别桶组相关的信息形成疾病图，将该疾病图与特定疾病和疾病阶段相关联，并根据相关的特定疾病及其阶段标记该疾病图。该生物结构识别***可进一步配置为基于与识别桶组相关并通过疾病类型和疾病阶段进行标记的信息来存储疾病图，并且其中疾病可能导致形成所述识别桶组的生物结构的形成。该生物结构识别***配置为形成至少两种不同类型的疾病和每种疾病的阶段的疾病图。
生物结构识别***可进一步配置为根据不同疾病类型及其阶段的疾病图形成疾病图的疾病图谱(“ATLAS”)。在这方面，通过使用数万亿的细胞数据，对数据集进行PCA，然后选择将创建数据集的细胞来创建图谱，该数据集将有非重叠的在该PCA数据空间中的区域。每个细胞将代表该空间的某个区域，这样任何随后扫描的细胞都必然属于图谱中的细胞。通过应用ATLAS PCA转化并找到最接近的ATLAS细胞，细胞将被分配到ATLAS细胞ID。例如，识别患者的细胞所属的聚类可以用来协助疾病的识别、疾病状态和预后。在这种情况下，“属于”意为该细胞(或其他生物结构)具有代表该聚类的特征值(例如，在该聚类的参数或特征边界内)。在一些改进中，图谱和/或图谱中的疾病图包括元数据，诸如患者身份、临床参数、图像参数等。图谱和/或疾病图可以包括包含在其中的每个细胞(或其他生物结构)的这种数据。在改进中，疾病图谱存储在计算机可读介质中，特别是非短暂性计算机可读介质(例如，随机存取存储器、CDROM、DVD、硬盘等)。在改进中，疾病图谱存储在计算机可读介质中作为具有所存储的值之间的关系的数据结构。可以使用的数据结构的实例包括但不限于阵列、链表、记录、图表、树状数据结构(例如二进制树)、数据库(例如关系数据库)以及其组合。在改进中，疾病图谱存储为数据库，特别是可被查询的关系数据库。
在一些改进中，生物结构识别***进一步配置为基于接收到的来自患有疾病的人的液体活检样本诊断疾病类型及其阶段。生物结构识别***可以进一步配置为基于从患有疾病的人所接收的液体活检样本，通过比较所接收的液体活检样本形成的疾病图与在接收液体活检样本之前存储在生物结构识别***中的疾病图谱的疾病图，来诊断疾病类型及其阶段。
在变体中，提供了一种用于分析液体活检样本的免疫荧光测定。该测定可包括针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体。在改进中，至少一个针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体子集用荧光团标记。在基线测定中，细胞角蛋白(CK)和波形蛋白中的每一个都独立地用荧光团标记，而CD31和CD45中的一个或两个都用荧光团标记。荧光团的实例包括但不限于DAPI、Hoechst 33342、33258(作为核染料)、Alexa Fluor488(用于波形蛋白)、Alexa Fluor 555(用于细胞角蛋白)、以及Alexa Fluor 647(用于CD31/CD45)等。
在一个变型中，提供了一种分析液体活检样本的方法。该方法可包括具有包含生物结构的液体活检样本；通过使用液体活检样本制备包括单层生物结构的样本(“单层生物结构样本”)；用本文所述的荧光测定(具有四种荧光染料)或任何荧光测定对单层生物结构样本的生物结构进行染色；使用本公开的生物结构识别***；通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构；并根据识别的生物结构类型形成生物结构识别桶，其中每个生物结构识别桶可包含相似类型的生物结构。图3和4提供了示例性的液体活检样本分析方法。
参照图3，提供了样本分析方法的流程图。如方框100所述的，液体活检样本按照预先确定的方案进行处理。方框102提供了这种方案的实例。在方框110所述的改进中，样本等分试样可选地储存在冷库中。在下一步(方框120)，使用荧光测定对液体活检样本进行染色(例如，免疫荧光测定，如基线测定(见下文)或任何荧光测定)。方框122提供了这种处理的具体实例。然后如方框130所示，获取图像数据。然后在方框140中，对获得的图像数据进行分析。下面将更加详细地描述OCULAR分析方案，其能应用于这种分析。作为分析的一部分，图像数据能分割成DAPI+(方框150)或DAPI-(方框160)区域。每个区域都要进行下面列出的聚类分析，以确定分类细胞的桶。
参照图4，提供了示例性液体活检样本分析方法的流程图。通常情况下，这种分析是由处理***14或另一个计算装置实现的。如方框200所述，接受荧光图像作为处理***14的输入。作为分析的一部分，生成核和/或细胞掩膜并提取特征(例如，从4张荧光图中提取超过700个特征)。如方框210所述，稀有事件检测的过程如下。对于载玻片上的每个区域，每个事件的数据将经过降维处理，然后将被分层聚类为多个组中。聚类的数量由数据集的大小决定。对于载玻片上的每一个帧(区域)，我们将该区域内的细胞总数除以30，然后将数字四舍五入为整数，该整数是多维数据将聚类的聚类数量。稀有事件被定义为：1)最小的族群聚类内的事件；2)具有与所有事件的所有特征的中值偏差最大的聚类的事件。载玻片上的一个区域内的稀有性是通过聚类分析来定义的。在该区域经过特征提取和主要成分的分层聚类后，聚类通过2个可量化的措施进行分类：1)升序排列的族群大小；2)降序排列的聚类内所有细胞的聚类的均值特征与整个区域的所有细胞的中值特征的欧氏距离(Euclideandistance)。朝向这两个列表顶部的聚类被认为比朝向列表底部的聚类更稀少。在改进中，稀有事件低于预先确定的稀有性阈值。在进一步的改进中，稀有事件低于1.5％的稀有性阈值。稀有性阈值是算法将其定义为稀有的载玻片上的区域内的细胞百分比。稀有性阈值应用于用上述措施对聚类进行分类之后。稀有性阈值是可以通过将其定义为自变数传入算法的值。分别地使用两个分类的聚类列表，算法将把较稀有的聚类加起来，直到细胞的总数超过稀有性阈值。在对两个稀有列表执行这一步骤后，算法将返回这些聚类内的独特的细胞列表。这些是载玻片的区域内的稀有细胞候选。载玻片内的稀有性是通过使用整个载玻片的所有区域内的常见细胞聚类并移除与任何此类常见细胞聚类相似的所有稀有细胞候选的过滤方法进行的。在这种情况下，相似性是由稀有细胞候选和常见细胞聚类特征的PCA数据集确定的。在对合并的PCA数据集进行距离矩阵后，在矩阵中发现的所有距离的1百分位的值将必然被认为是相似的最大距离。如果稀有细胞候选在任何常见细胞聚类的该值范围内，则该稀有细胞候选将不会被标记为稀有，并将添加到与该稀有细胞候选最相似的各自常见细胞聚类中。每个区域将收集到一定的用户定义的区域内总细胞的稀有性百分比。稀有事件特征被单独收集，并通过稀有事件管道作为稀有事件候选发送。每个稀有事件包括该事件在载玻片上的位置。在另一个改进中，稀有生物结构(例如细胞)是指被确定为低于确定的生物结构总量的预定百分比的生物结构。在改进中，这个预定百分比按识别的生物结构总数的递增的偏好顺序5％、4％、3％、2％、1.5％或1％。常见事件被汇总到它们各自的常见事件聚类中，作为聚类内事件的特征的平均值。它们以这种聚合的形式通过常见事件管道被发送。
如方框230所述，常见事件聚类的分析如下。由于前一步骤的常见聚类是由载玻片上的单一区域决定的，因此每个常见聚类再按其相似性聚类在一起。随着数据的相继汇聚，这些事件的总和被保存。如方框240所述，常见细胞分类器被应用如下。正在使用的测定的所有已知事件的数据集(被称为“ATLAS”)被应用于每个常见事件聚类。特别地，每个常见事件聚类与所有“ATLAS“数据点进行比较，并被分类为我们确定的细胞类型之一。然后，这些事件可以被列举出来。如方框250所述，稀有事件经历了过滤过程，其中每个稀有事件候选与每个常见事件聚类进行比较。这就清除了载玻片广泛稀有性的稀有事件候选列表，而不是区域稀有性。如方框260所述的，稀有细胞分类器被应用如下。应用测定的所有已知事件的“ATLAS”数据集。每个稀有事件候选将与所有“ATLAS”数据点进行比较，并归类为我们确定的细胞类型之一。这个步骤进一步过滤掉“常见”事件。然后，分类后的事件可以被列举为特定细胞类型。任何未分类在“ATLAS”内的事件都要经过聚类，并收集聚集信息并送至最终报告中。如方框270所述，Dapi-事件聚类的过程如下。从载玻片中收集所有的Dapi-事件，进行降维处理，并将其分层聚类为多个组。每个Dapi-组都有该聚类内的事件特征的平均值。每个Dapi-事件的数据以及它们在载玻片上的位置都被保存下来。聚集的聚类信息被发送到报告中。如方框280所述，每个常见事件聚类在报告中表示该聚类内的样本事件的10个组合，以及该聚类内所有事件的计数和它们的聚集信息。每个非分类的稀有事件聚类也同样以10个样本组合、聚类内的事件计数和它们各自的聚集信息来表示。如果用户想检索某一聚类内的单个事件数据或事件，用户将向服务器发送命令，对各个聚类内的每个事件进行单独组合。与非分类的稀有事件类似，Dapi-事件聚类用10个样本组合、聚类内的事件计数以及它们各自的聚集信息表示。如果用户想检索某一聚类内的事件的单个事件数据，用户将向服务器发送指令，以单独组合各自聚类内的每个事件。分类的稀有事件以及用户发送到服务器用于收集单个事件数据的聚类内的任何事件被单独组合，易于分类和查询，并显示在用户界面中，该界面可以给用户提供载玻片内的所有稀有事件的整体视图。
在某些方面，提供了一种诊断患者所患的疾病的方法。该方法可包括具有来自患者的包含生物结构的液体活检样本；通过液体活检样本制备包含单层生物结构的样本(“单一生物结构层样本”)；用荧光测定对单一生物结构层样本的生物结构进行染色；使用本公开的生物结构识别***；通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构；根据识别的生物结构类型，形成生物结构识别桶(“识别桶”)，其中每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构；基于识别桶，形成一组识别桶(“识别桶组”)；将与识别桶组相关的信息和图谱的信息进行比较；确定患者所患的疾病；以及治疗患者。图5和图6说明了本公开的示例性患者治疗方法。
图5提供了流程图，举例说明了用本文提供的方法治疗患者的方法。对患有疾病的人进行评估(方框300)。液体活检样本获得自患者(方框310)。如方框320所述，制备了单层生物结构样本。基线测定用于对单层生物结构样本进行染色(方框330)。该样本被负载到生物结构识别***(方框340)。如方框350所述，检测和确定生物结构的荧光和形态。如上所述，常见生物结构和稀有生物结构被置于识别桶(方框360)。识别桶组是由识别桶形成的(方框370)。疾病图是由识别桶组形成的(方框370)。对疾病图谱进行查询(方框390)。从查询结果中，可以诊断出疾病和/或其阶段(方框400)。然后可以根据这一诊断对患者进行治疗(方框410)。
图6提供了另一个流程图，举例说明了用本文提供的方法治疗患者的方法。对患有疾病的人进行评估(方框500)。液体活检样本获得自患者(方框510)。如方框520所述，制备了单层生物结构样本。基线测定用于对单层生物结构样本进行染色(方框530)。该样本被负载到生物结构识别***(方框540)。如方框550所述，检测和确定生物结构的荧光和形态。如上所述，创建识别桶(方框560)。识别桶分隔为DAPI+生物结构的桶(方框570)和DAPI-生物结构的桶(方框580)。DAPI+生物结构的桶可以进一步分隔为常见细胞的桶(590)和稀有细胞的桶(600)。DAPI-生物结构桶可分隔为囊泡的桶(方框610)。如方框620所述，创建常见生物结构和稀有生物结构的识别桶组。疾病图是由识别桶组形成的(方框630)。查询疾病图谱(方框640)。根据查询结果，可以诊断出疾病和/或其阶段(方框650)。然后可以根据该诊断对人患者进行治疗(方框660)。
在疾病环境中，除了这些常见的免疫细胞外，液体活检样本可进一步包含稀有细胞，这些稀有细胞可主动逃逸或被动渗入循环并在循环中移动，并可代表疾病。
稀有细胞被定义为通过其图像分析特征在统计学上不同的细胞。这些稀有细胞是通过以下标准提取的。(a)在进行桶分析后，最小的族群桶内的细胞被分类为稀有细胞；以及(b)在统计学上偏离所有细胞的所有特征的中值的聚类内的细胞也被分类为稀有细胞。稀有细胞的数量可低于液体活检样本中识别的细胞总数的5％。稀有细胞的数量可低于液体活检样本中识别的细胞总数的1％。稀有细胞的数量可低于液体活检样本中识别的细胞总数的0.1％。
稀有细胞在循环中的移动可以是短半衰期或长半衰期。稀有细胞移动还可包括沿途在各种组织中的停留。
表示疾病可意味着这些稀有细胞可能是(a)癌细胞，可由其癌症基因组谱和/或癌症蛋白标记物证明；(b)渗入循环的肿瘤微环境细胞，其中这些细胞可包括上皮细胞、内皮细胞、***、其他基质细胞、处于各种转化状态的细胞或其混合物；(c)可对肿瘤本身或癌症治疗有反应的免疫细胞；或(d)其混合物。
稀有细胞的种类和分类的出现在不同的癌症和每种癌症的阶段可能是不同的。本公开的***、方法和测定可识别各种细胞亚类，既可重复性地用于临床实践，同时也能够发现未知物，并能够检测在统一实验中同时涉及的绝大多数。
细胞亚类可以通过蛋白质和细胞核模式以及细胞形态来区分。亚类可以通过下游的基因组或蛋白质组分析进行验证，这对于未来的临床应用可能是必要的，也可能不是必要的。
在另一种变型中，一个实例涉及使用五个标记物来区分数量上大体更多的细胞组的方法。这些标记物是荧光蛋白抗体或标记为四个不同的荧光团或荧光抗体的分子。该计算方法结合了由不同的荧光特征所显示的形态学差异，以区分至少十二种不同的稀有细胞亚型，这些稀有细胞亚型可能存在于液体活检样本中。这些稀有细胞列举如下。
这种方法既利用了新样本处理方案(该方案将五个标记物减少到四个荧光通道中)，又利用了新计算方法，该计算方法通过分析荧光显微镜图像对不同的稀有细胞类型进行分类。这种方法的成功主要是在荧光通道内和跨荧光通道的标记物组合的选择。
该计算方法与其他人所做的不同的是其将“每个事件”放入相似生物结构的桶中。其他人则寻找具体的、已知的东西，这是标准图像分析和机器学习方法的基本限制，因为这些方法总是只能找到已知的东西。另一方面，如果我们强迫计算方法容纳载玻片上的由成像信号(在我们目前的案例中，其为荧光信号，但也可能是明视野信号)定义的每一个事件，我们现在可以对所有事件进行聚类。下一步，我们允许常见事件聚类和稀有事件聚类。事实上，我们并不一定认为所有的“癌症事件”都在稀有的聚类中，相反，我们正在有效地将具有数百个潜在参数的数百万个事件的全部载玻片的维度降低到可容纳常见(高频)和罕见(低频)事件的聚类框架中。从传统的CTC世界可知，CTC和延伸其他疾病相关的事件通常是稀有的。
下面的实施例说明了本发明的各种实施方式。本领域技术人员将认识到在本发明的精神和权利要求的范围内的许多变体。
图7至24中显示了通过使用本公开的***从取自患者的液体活检样本产生的荧光和形态学显微照片。下面的实施例提供了获得此类显微照片的额外细节。
实施例1.稀有事件实例。
在液体活检中可能存在的稀有细胞的实例可以是：
a.传统的循环肿瘤细胞(CK+/波形蛋白-/CD31-/CD45-)；
b.确实表达波形蛋白的循环肿瘤细胞(CK+/CD31-/CD45-)，其中可推定肿瘤细胞处于上皮向间质过渡；
c.涂有血小板(CD31+)的肿瘤细胞(CK+)；
d.不表达CK的内皮细胞(CD31+/波形蛋白+)；
e.表达CK的内皮细胞(CD31+/波形蛋白+)；
f.不表达波形蛋白的巨核细胞(CD31+)，其中巨核细胞可包含含有单一、大型、多叶、多倍体核的大细胞，负责生产血小板；
g.表达CD31(例如CD31+)和细胞角蛋白的大细胞，(例如CK+)，其中这些大细胞可存在于获得自骨髓的液体活检样本中；
h.仅表达波形蛋白的细胞(DAPI+)；
i.表达CD45和CK的圆细胞(例如CD45+/CK+)；
j.表达CD45、波形蛋白和CK的圆细胞(例如CD45+/波形蛋白+/CK+)；
k.由至少两个细胞组成的细胞的聚类，其中细胞包含相同类型的细胞或不同类型的细胞；
l.不表达，即CD45、CD31、CK和波形蛋白阴性的细胞(DAPI+)；
m.不表达波形蛋白的免疫细胞(CD45+)；
n.表达波形蛋白(III型中间丝蛋白)的免疫细胞(CD45+)。
o.细胞外囊泡，或
p.其混合物。
液体活检样本中的这些稀有细胞中的每个或组合的存在可能与癌症有关，或表示存在困扰活体的癌症。
实施例2.基线测定方案。
先前已知的针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体组被用于开发免疫荧光测定，该测定通过这些标记物和细胞形态学两者在适当的分辨率下通过荧光显微镜成像来利用蛋白质表达。使用这些特定的标记物使基线测定方案能够区分上述大量的稀有细胞，其中，将这些特定的标记物分配在三个荧光通道上，同时保留第四个通道给DAPI作为下述的细胞核标记物。
我们分配(a)第一免疫荧光通道分配到荧光染料DAPI，用于核分割和表征；(b)第二个通道分配到细胞角蛋白，用于上皮样表型；(c)第三个通道分配到波形蛋白(一种III型中间丝蛋白)，用于内皮/间质样表型；以及(d)第四个通道分配到CD31用于内皮样表型和分配到CD45用于免疫细胞表型。
基于对不同细胞形态、不同标记物表达、不同细胞分布和不同标记物特异性/敏感性要求的理解，在一个实例中，四个荧光通道可按以下方式使用：
(i)第一通道：DNA/RNA标签
(ii)第二通道：细胞角蛋白(CK)
(iii)第三通道：波形蛋白
(iv)第四通道：CD45和/或CD31。
在另一个实例中，以下荧光团和颜色分配可用于四个荧光通道：
a.第一通道：用于标记DNA/RNA，可使用荧光团DAPI，其在461nm的波长下具有荧光发射最大值。该第一通道可分配为蓝色(“DAPI”通道)。
b.第二通道：用于标记细胞角蛋白(CK)，可使用荧光团Alexa Fluor 555，其在约565nm的波长下具有荧光发射最大值。该荧光团可与抗CK混合物和二级Alexa Fluor 555荧光抗体一起使用。该第二通道可分配为红色(“TRITC”通道)。
c.第三通道：用于标记波形蛋白，可以使用荧光基团Alexa Fluor 488，其在约519nm的波长下具有荧光发射最大值。该荧光基团可与直接结合的抗体波形蛋白一起使用。该第三通道可分配为橙色(“FITC”通道)。
d.第四通道：用于标记CD45和/或CD31，可以使用荧光团Alexa Fluor647，其在约665nm的波长下具有荧光发射最大值。该荧光团可与CD45和/或CD31的直接结合的抗体一起使用。该第四通道可被分配为绿色(“Cy5”通道)。
内皮细胞和免疫细胞(其可存在于同一液体活检样本中)尽管由相同的荧光绿色通道识别，但仍可根据它们在形态上的差异相互区分。相对而言，内皮细胞具有高度狭长的形态，而免疫细胞相对而言具有更圆的形态。因此，即使在这些表型中表达的标记物可以结合在一个通道中，即Cy5通道中，我们仍然可以将它们分开。我们也可以接受在区分内皮细胞和免疫细胞方面存在一定程度的不确定性，因为我们可能对广泛的平均值，或例如通过荧光光谱观察到的内皮细胞的平均数更感兴趣。
内皮细胞通常表达大量的波形蛋白，加上上述分离表达波形蛋白的免疫细胞的论点，即使对这一类细胞也仍然成立。
内皮细胞表型也可能表达低水平的细胞角蛋白。另外，上皮细胞向***的转化可导致共同表达。我们现在可以通过CK+/波形蛋白+/CD31-/CD45-将它们分开。
最传统的癌细胞可能是CK+/波形蛋白-/CD31-/CD45-。
出于这个原因，该基线测定方案可使液体活检样本中存在的稀有细胞类型在适当的精度和准确性下基本完整地区分。
实例3.血液处理程序
包含血液样本的液体活检样本可根据以下程序进行处理：
1.接收样本：
血液接收到无细胞DNA管中(4mL-10mL)；
样本应在环境温度下运输/储存；
样本必须在抽取后的18-30小时内处理；’
从包装中取出样本并检查试管(与提供的任何文件相比较)。
2.采集血浆：
在室温下以2000g离心10分钟血液试管(10分钟)；
将4mL血浆(上相)转移到2个2mL的Eppendorf试管中(注意不要搅动血沉棕黄层！)(1分钟)；
在室温下，将Eppendorf试管在台式离心机中以14000RPM旋转10分钟(10min)；
将4mL上清液转移到4个1mL细粒透镜低温小瓶中(橙色瓶盖)，暂时储存在4℃，直到打印出条形码(1分钟)；
血浆最终储存在-80℃的OncoScope指定的位置(1分钟)；
在原血液试管中加入4mL 1X PBS pH7.4，以重新建立初始体积(1分钟)；
将血液试管放在摇杆上5分钟，使血液均质化(5分钟)。
3.红细胞溶解：
目视检查血液试管中是否有凝块。尽可能用移液管将固体块从液体样本中手动分离出来。丢弃固体块(1分钟)；
使用血液分析仪(Hematology Analyzer)进行白细胞计数，并确定待溶解的血液体积，以制作共12-16张载玻片。
4.计算分离出350万个WBC/载玻片所需的血液体积：
不要溶解超过8mL的血液，并且只溶解整数体积的血液(即不要溶解4.7mL或4.3mL，而是溶解5mL)；
(x mL血液*WBC计数[百万个]/mL)/(3.5[百万个]WBC/载玻片)＝y载玻片
5.计算重新悬浮WBC沉淀物的体积：
将溶解的血液量可能的载玻片数量乘以0.75mL；
y载玻片*.75mL/载玻片＝mL PBS来重悬WBC沉淀物(3分钟)；
用ddH2O将10倍的储备液制成1X溶解缓冲液(不要使用PBS，溶解将无法进行)。
6.计算1X溶解缓冲液的体积：
将溶解的血液体积乘以5；
x mL血液*5mL 10X溶解缓冲液/1mL血液＝1X溶解液(1分钟)；
在使用前将1X溶解缓冲液的pH值调整为7.40±0.02(如果在初始准备后30分钟内未使用，则重新制作)(1分钟)；
每1mL血液加入5mL 1X溶解缓冲液，以在50mL Falcon试管中进行溶解(1分钟)；
将血液加入上一步的Falcon试管中，并摇晃管5分钟。溶解后的血液看起来很清澈，呈深红色的(延长溶解时间可能会损害WBC和CTC！)；
***注意：在这2x 5分钟的步骤中，清洗载玻片(5分钟)
在室温下以800g离心溶解的血液5分钟；
在继续下一步之前，请确保有细胞沉淀物(5分钟)；
使用真空管和玻璃巴斯德吸管将上清液抽真空。确保在不搅动WBC沉淀物的情况下去除尽可能多的溶解的RBC至关重要。要非常小心！不要搅动沉淀物，因为可能会导致CTC损失(2分钟)。
7.清洗载玻片。
拿起塑料载玻片染色缸(coplin jar)并填充入1X PBS pH7.4(注意：8个载玻片适合一个塑料载玻片染色缸)(1分钟)；
使用铅笔，在载玻片的结霜区域标记患者ID(1分钟)；
目的是洗掉保护性蓝色涂层而不让载玻片变干；
将所有载玻片和载玻片染色缸拿到水槽边。将水调至微温(注意：水压不要太高)；
水应该是微温的，水压正常到中等；
清洗一张载玻片，直到保护层完全消失；
在不让载玻片干燥的情况下，转移到载玻片染色缸中(注意：一旦蓝层被洗掉，小心不要接触活性区域)。干燥的载玻片可能会影响细胞的结合。
8.WBC/CTC铺板。
将细胞沉淀物重新悬浮在1mL的1X PBS pH7.4中，轻轻地上下移液，直到溶液均匀(避免产生气泡)(1分钟)；
根据你的计算加入剩余体积的1X PBS pH7.4，并轻轻搅拌使其均匀(不要让沉淀物放置太久，因为WBC可能会聚集在一起)(1分钟)；
将750μL重新悬浮的细胞溶液均匀地逐滴铺在载玻片的活性区域(5-20分钟)；
小心地摇晃载玻片，使细胞溶液均匀地扩散。黑色边界是疏水性的，会使溶液保留在孔中(1分钟)；
将载玻片放入免疫染色水分室，并对其余的载玻片进行重复操作(1分钟)
将载玻片室放入设置在37℃的孵化器中40分钟，以便细胞附着。在温育步骤中，确保你已经完成了以下工作：
在OncoScope中注册试管(参考第5页“在OncoScope中注册样本”)；
取出盒子并剪下标签；
制备7％的BSA pH7.40。如果已经制备好，请从冰箱中取出，使其达到室温；
设置载玻片干燥器为37℃，40分钟。
9.干燥载载玻片：
将载玻片上的细胞溶液以约45°角从每张载玻片的右上角倾倒入废瓶中，并在每张载玻片的角加入750μL的7％BSA，并在活性区域轻轻涂抹开。在室温下温育5分钟；
将BSA溶液从每张载玻片倒出，用Kim Wipe擦去每张载玻片底部的多余水分(5分钟)；
垂直握住载玻片，让多余的BSA滴落到纸巾上。注意不要用任何东西接触活性区域(5分钟)；
将载玻片放在载玻片干燥器上5至12分钟，直到活性区域干燥(不要过度干燥载玻片，因为这将导致BSA表面出现裂纹并扰乱细胞！)(5-12分钟)；
将载玻片从加热块取下，将盖玻片贴在活性区域上。将条形码贴在每张载玻片的活性区域的反面(确保条形码标签的剪裁与载玻片的宽度相适应，且两边不重叠)(5-20分钟)；
用一张铝箔纸包裹每张载玻片，并贴上患者的姓名和载玻片编号(5-10分钟)；
将包裹好的载玻片放入事先标记有试管条形码的白色小型冷冻存储箱中(1分钟)；
将盒子放在-80℃的指定冷冻架位置，直到准备好被染色(1分钟)。
实例4.OCULAR稀有细胞检测
“OCULAR”计算(稀有)细胞分类的目的是既要将基线测定方案确定的细胞类型分类到正确的桶中，又要确定新的细胞类型。所有稀有细胞类型的细胞信息，以及常见细胞聚类的聚集细胞信息可以分别保持。这种结合的无偏方法允许对已知细胞类型进行可重复的表征，并从HD-SCA载玻片中检测出更稀有的细胞和细胞类型。它还可以实现向后兼容，仍然可以找到先前检测到的原型CTC细胞。通过这种方式，OCULAR的结果可以与使用先前分析方法来寻找CTC和稀有细胞类型的先前HD-SCA结果进行比较。由于无监督的性质，OCULAR对扫描仪图像结果的差异也不敏感(即曝光/增益/聚焦/方案的差异)。
OCULAR方法包括对现有方法的整合，使得改进了细胞核形状掩膜，并将所有荧光通道纳入其中，以建立细胞掩膜，产生更准确的形态学和荧光特征提取。此外，可以检测到不含结构化核物质的潜在细胞外囊泡，并将其放入单独的种类。
OCULAR可使用无监督聚类方法来分析每个细胞的超过700个特征，以检测稀有细胞，将它们收集到相似的稀有细胞组中。这种方法不是随机的，在同一数据集上重复运行时复制相同的稀有细胞和组。每个稀有事件的所有特征都储存在关系数据库中，该数据库可从任何能够访问上述数据库的应用程序中查询。稀有细胞组、常见细胞组和Dapi-事件组以其聚集形式(该组内每个特征的平均值)存储在RDS文件中，该文件是可由R读取的文件格式。
OCULAR还可以包含基于网络的方法，用于将稀有细胞检测分析的结果呈现给经过培训的用户，以快速、容易地验证或重新分类各种稀有细胞组中的细胞。在分析了足够的置信度或足够大的HD-SCA样本量后，OCULAR可能会生成数据集，该数据集将反映任何潜在的细胞。换句话说，任何OCULAR看到的细胞都可能通过数据相似性属于该数据集中的某一行。这个数据集，以下称为ATLAS，实际上可能是静态数据集，并且只有在发现新细胞类型时更新。可以进一步分析ATLAS，以发现循环中的新细胞类型，并对跨患者和癌症类型的细胞和细胞组进行关联和计数。
此外，OCULAR方法可与任何可使用DAPI标记细胞核的荧光标记方法一起使用。
这种测定方案和计算方法可与现有的基于荧光的全载玻片扫描方法、下游单细胞基因组以及蛋白质组分析方法完全兼容。
每个载玻片可能有300万个事件，我们可以通过四种颜色的成像来识别。稀有事件，其在大约300万个事件中识别出稀有的细胞，其范围可能在少于1个事件至1000个事件和1个事件到100万个事件内。OCULAR方法可以对每个事件进行分析，并询问在给定的一组图像分析参数下，载玻片上是否已经出现过类似事件。如果是，则这个事件可以被放在同一个桶/聚类中；如果不是，这个事件可以被放在一个新的桶/聚类中。然后，通过OCULAR方法，确定常见细胞桶的组数目(有效地代表了免疫细胞的总谱)和稀有细胞桶的组数目。
常见细胞桶可用于描述免疫***的状态，类似于血细胞分类计数。由于聚类算法是固定的，稀有细胞桶可能是无偏的和可重复的。然后，我们可以有“免提”分析管道来产生这些稀有细胞桶，这反过来又为我们提供了在特定临床预期用途和跨疾病状态下进行生物解释的起点。
尽管上面描述了示例性实施方式，但这些实施方式并不旨在描述本发明的所有可能形式。相反，说明书中使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且应当理解为在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变。此外，可以组合各种实施实施方式的特征以形成本发明的进一步实施方式。
Claims (47)
1.一种生物结构识别***，包括：
光学成像***，其配置为照射具有用荧光团标记的一种或多种生物结构的液体活检样本，并配置为检测来自所述液体活检样本的发射的电磁辐射作为图像数据；以及
处理***，其配置为从图像数据生成一种或多种生物结构的图像、从所述图像或所述图像数据检测和确定多个特征以及从多个特征形成生物结构识别桶，每个生物结构识别桶识别相似类型的生物结构。
2.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述一种或多种生物结构包括一种或多种稀有生物结构。
3.权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述一种或多种生物结构包括同时识别的多种生物结构。
4.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述光学成像***包括：
液体活检样本载体，其适合于接收支持所述液体活检样本；
照明***，其能够以特定的波长或可被荧光团吸收的波长照射所述液体活检样本；
光检测***，其配置为检测和确定由所述荧光团发射的荧光的强度和波长；以及
光控制***，其配置为允许检测来自所述液体活检样本的发射的电磁辐射；允许检测由所述液体活检样本散射、反射和/或通过所述液体活检样本传输的电磁辐射；以及将电磁辐射从所述照明***引导到所述液体活检样本，并从所述液体活检样本引导到所述光检测***。
5.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述处理***配置为：
使用每张图像检测和确定每种生物结构的形态；
从多个特征中识别每种生物结构的类型；
形成所述生物结构识别桶的多个特征；以及
基于识别桶形成识别桶组。
6.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述一种或多种生物结构的至少一个子集包括选自由具有膜、蛋白质、DNA、RNA及其组合的结构所组成的组的成分。
7.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述一种或多种生物结构的至少一个子集是具有膜的结构，所述具有膜的结构选自由细胞、囊泡和其组合所组成的组。
8.根据权利要求7所述的生物结构识别***，其中，所述囊泡是癌小体。
9.根据权利要求7所述的生物结构识别***，其中，所述囊泡是具有等于或大于一微米的特征尺寸的癌小体。
10.根据权利要求7所述的生物结构识别***，其中，所述囊泡是具有大于外来体的特征尺寸的癌小体。
11.权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本是非固体生物样本。
12.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本是体液样本。
13.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本包括血液样本、骨髓样本、腹膜液样本、尿液样本、唾液、***液样本、***样本、泪液样本、粘液样本、房水样本、脑脊液(CSF)样本，或其组合。
14.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本包括血液样本。
15.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本包括常见免疫细胞和稀有生物结构。
16.根据权利要求15所述的生物结构识别***，其中，所述稀有生物结构是：
具有癌症基因组谱和/或癌症蛋白标记物的癌细胞；
渗入循环中的肿瘤微环境细胞，其中，这些细胞包括上皮细胞、内皮细胞、***、其他基质细胞、处于各种转化状态的细胞，或其混合物；
对肿瘤本身或癌症治疗有反应的免疫细胞；
囊泡，或
其混合物。
17.根据权利要求15所述的生物结构识别***，其中，所述稀有生物结构包括：
常见循环肿瘤细胞，其为CK+、波形蛋白-、CD31-和CD45-；
循环肿瘤细胞，其为CK+、CD31-、CD45-和波形蛋白+，并且其中可推定肿瘤细胞处于上皮向间质过渡；
肿瘤细胞，其为CK+，并涂有血小板，所述血小板为CD31+；
内皮细胞，其为CD31+、波形蛋白+和CK-；
内皮细胞，其为CD31+、波形蛋白+和CK+；
巨核细胞，其为CD31+和波形蛋白-，其中巨核细胞包括含有单一、大型、多叶、多倍体核的大细胞，负责生产血小板；
大细胞，其为CD31+和CK+，其中这些大细胞可能存在于获得自骨髓的液体活检样本中；
细胞，其为DAPI+和波形蛋白+；
圆细胞，其为CD45+和CK+；
圆细胞，其为CD45+、波形蛋白+和CK+；
包含至少两个细胞的细胞聚类，其中所述细胞为同一类型的细胞和/或不同类型的细胞；
细胞，其为DAPI+、CD45-、CD31-和CK-；
免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白-；
免疫细胞，其为CD45+和波形蛋白+(III型中间丝蛋白)，细胞外囊泡，或其混合物。
18.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本包含常见生物结构和稀有生物结构，使得生物结构的总数为常见生物结构的数量和稀有生物结构的数量之和，并且其中，所述稀有生物结构存在的量等于或小于生物结构总数的10％、5％、1％、0.1％或0.01％。
19.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述发射的电磁辐射是荧光辐射。
20.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述光学成像***包括激发滤光片、发射滤光片、(二向色)镜、透镜、光纤，或其组合。
21.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述光学成像***包括荧光显微镜、明视野显微镜或其组合。
22.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述处理***包括控制***、硬件处理器、存储***以及信息传输***。
23.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***具有至少一个荧光通道。
24.根据权利要求21所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***应用1至10个荧光通道。
25.根据权利要求21所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***具有4到7个荧光通道。
26.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***只有4个荧光通道。
27.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***只有四个荧光通道，其中所述四个荧光通道是：
第一荧光通道，其配置为用于核分割和表征的检测；
第二荧光通道，其配置为检测细胞角蛋白(CK)的上皮样表型；
第三荧光通道，其配置为检测波形蛋白的内皮样表型/间质样表型；以及
第四荧光通道，其配置为检测CD31的内皮样表型，以及CD45的免疫细胞表型。
28.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***只有四个荧光通道，其中所述四个荧光通道为：
第一荧光通道，其配置为检测蓝色波长区域的荧光发射；
第二荧光通道，其配置为检测红色波长区域的荧光发射；
第三荧光通道，其配置为检测橙色波长区域的荧光发射；以及
第四荧光通道，其配置为检测绿色波长区域的荧光发射。
29.根据权利要求28所述的生物结构识别***，其中，所述第一荧光通道配置为检测4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用于核分割和表征。
30.根据权利要求28所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***只有四个荧光通道，并配置为从多个特征中识别内皮细胞和免疫细胞。
31.根据权利要求28所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***只有四个荧光通道，并配置为从多个特征中识别所述内皮细胞和所述免疫细胞，并区分所述内皮细胞和所述免疫细胞，其中所述内皮细胞与所述免疫细胞相比具有更狭长形态，而所述免疫细胞与所述内皮细胞相比具有更圆的形态。
32.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构的形态是通过使用来自图像或图像数据的至少一个特征来确定的。
33.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构的形态是通过来自图像或图像数据的至少10个特征、至少100个特征、至少500个特征、或至少1000个特征来确定的。
34.根据权利要求33所述的生物结构识别***，其中，所述至少一个特征子集与所述一种或多种生物结构的尺寸、形状、纹理和结构有关。
35.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本获得自患病的人。
36.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述液体活检样本获得自患有癌症的人。
37.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述处理***进一步配置为，基于与生物结构识别桶组相关的信息形成疾病图，将所述疾病图与特定疾病和疾病阶段相关联，并根据识别的相关特定疾病和疾病阶段标记所述疾病图。
38.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***进一步配置为，基于与一个或多个识别桶组相关并按疾病类型和疾病阶段进行标记的信息来储存疾病图，并且其中困扰受试者的疾病导致形成所述一个或多个识别桶组的生物结构的形成。
39.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***配置为形成至少两种不同的疾病类型和疾病阶段的疾病图。
40.权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***进一步配置为，从不同的疾病类型和疾病阶段的疾病图中形成疾病图的疾病图谱。
41.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***进一步配置为，基于从患有疾病的人接收的液体活检样本诊断疾病类型及其阶段。
42.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***进一步配置为，基于从患有疾病的人接收的液体活检样本，通过比较所接收的液体活检样本形成的疾病图与在接收液体活检样本之前存储在生物结构识别***中的疾病图谱的疾病图，来诊断疾病类型及其阶段。
43.根据权利要求1所述的生物结构识别***，其中，所述生物结构识别***进一步包括信息传输***，所述信息传输***配置为向用户传输与存在于液体活检样本中的生物结构的类型、生物结构识别桶、疾病图、疾病图谱或其组合有关的信息。
44.一种用于分析液体活检样本的免疫荧光测定，包含针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体。
45.根据权利要求44所述的免疫荧光测定，其中，针对细胞角蛋白(CK)、波形蛋白、CD31和CD45的抗体的至少有一个子集是用荧光团标记的。
46.一种分析液体活检样本的方法，包含：
接收包含生物结构的所述液体活检样本；
制备包含来自所述液体活检样本的单层生物结构的样本，所述单层生物结构样本包括单层生物结构；
用荧光测定对所述单层生物结构样本的生物结构进行染色；以及
用生物结构识别***分析所述样本，所述生物结构识别***配置为通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构，并基于识别的生物结构类型形成生物结构识别桶，其中每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构。
47.一种诊断疾病的方法，包括：
接收来自患者的包含生物结构的液体活检样本；
从液体活检样本制备包含单一生物结构层样本的样本，所述单一生物结构层样本是单层生物结构；
用荧光测定对单层生物结构样本的生物结构进行染色；以及
用生物结构识别***分析所述样本，所述生物结构识别***配置为通过稀有生物结构的荧光和形态识别稀有生物结构，并基于识别的生物结构类型形成一个或多个生物结构识别桶，其中每个生物结构识别桶包含相似类型的生物结构；
从一个或多个生物结构识别桶形成识别桶组；
将与识别桶组相关的信息与疾病图的图谱的信息进行比较；
确定患者所患的疾病；以及
治疗患者。
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