CN114858917A - 一种实时动态监测细胞跨膜转运有机小分子的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用QCM‑D实时动态监测细胞跨膜转运有机小分子的分析方法，属于细胞跨膜转运小分子过程监测与生物传感器技术领域。本发明创造性地将具有纳克级别灵敏度的QCM‑D与小分子跨膜转运机制结合在一起，提供了一种以QCM‑D技术实时动态监测细胞在不同介质刺激下跨膜转运有机小分子的在线分析新方法，包括传感界面构建、流通池中细胞的黏附、不同介质刺激下黏附细胞跨膜转运有机小分子的监测以及流通体系条件的控制，具有高灵敏度、操作简单、原位无损、实时动态监测等优点，有望在生理学、药理学、基础医学及临床诊断等研究领域推广应用。
Description
技术领域
本发明属于细胞跨膜转运小分子过程监测与生物传感器技术领域，具体涉及小分子跨膜转运和生物传感技术研究领域，特别涉及一种实时动态监测细胞跨膜转运有机小分子的分析方法。
背景技术
体积调节是贯穿细胞生命历程的重要功能之一，与细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生理过程密切相关。在正常的生理条件下，细胞主要是通过质膜上的通道蛋白快速跨膜转运无机离子和有机渗透分子来应对胞外环境不断波动的渗透压胁迫。面对高渗胁迫时，大多数动物细胞是通过积累高浓度渗透调节物质来应对的。有机渗透调节物质虽只占总渗透调节物质10％～20％，但能够参与调节60％～70％的体液渗透压。有机小分子如甘油，是一种常用的有机渗透小分子，不仅参与细胞体积调节，还被用作原料为细胞增殖生长提供能量。医学研究表明，在高渗胁迫下，细胞会快速失水皱缩，然后将甘油分子跨膜转运至胞内使体积逐渐膨胀恢复。传统的甘油跨膜转运速率测定方法主要是通过测量单位时间胞外甘油浓度变化或单位时间细胞体积变化实现的，常采用停留光谱或者光学显微镜进行测量。但停留光谱的光散射信号易受到溶液折射率、细胞运动和质膜褶皱等非体积因素影响，而光学显微镜在测量时边缘光晕、荧光探针光漂白效应及生物毒性均会使实验结果产生较大的误差。然而，目前对有机渗透小分子的转运缺乏高灵敏和实时动态检测技术。
耗散型石英晶体微天平(QCM-D)是一种新兴表面检测技术，可在纳克级别尺度通过共振频率变化(Δf)和耗散因子变化(ΔD)信号来分别追踪界面吸附层的质量变化和粘弹性变化，已广泛应用于生物化学和生物工程领域，用于检测蛋白质和核酸等生物分子或表征生物材料结构。QCM-D能够实时监测细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，因而能在研究细胞黏附、凋亡、氧化损伤等生物学行为，及细胞识别、药物诱导刺激和毒性分析中发挥重要作用。目前，动态监测细胞在高渗介质下跨膜转运甘油分子的技术手段还比较缺乏。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种实时动态监测细胞跨膜转运有机小分子的分析方法。本发明首次建立以QCM-D技术动态监测以甘油为代表的有机小分子的跨细胞膜转运甘油分子的新方法，通过采用耗散型石英晶体微天平对在不同介质环境下，固定在传感器界面上的细胞跨膜转运甘油分子引起的吸附层共振频率变化和耗散因子变化进行监测，从而实现对小分子的跨膜转运进行在线追踪。本发明该方法解决了传统技术不能实时、连续、动态监测细胞跨膜转运小分子的问题，具有实时在线、原位无损、连续动态、灵敏度高、操作简单等技术优越性，可广泛应用于研究细胞生物学行为和生理病理等基础研究领域以及重大疾病的诊断分析中。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种实时动态监测细胞跨膜转运有机小分子的分析方法，包括如下步骤：
(1)对QCM-D芯片进行羧基化，通过与氨基的生物偶联，得到带正电的QCM-D芯片；
(2)将步骤(1)的带正电的QCM-D芯片装入耗散型石英晶体微天平的流通池中，采用自动进样装置，向流通池中通入工作液1，得到稳定的基线；通入5×103～105个/mL待测细胞悬液，通过静电吸附将细胞黏附在带正电的QCM-D芯片上，待曲线走势平缓后，通入所述工作液1冲掉未黏附在QCM-D芯片上的细胞；所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和甘露醇的混合水溶液。
(3)将工作液2以0.1～5mL·min-1的流速通入步骤(2)的流通池中，黏附在芯片上的细胞迅速发生变化，通过记录耗散因子变化-时间曲线(ΔD-t)和频率变化-时间曲线(Δf-t)追踪细胞跨膜转运小分子的过程；
(4)将工作液1通入步骤(3)的流通池中，以移除步骤(3)流通池中的工作液2，直至黏附在芯片上的细胞恢复趋于未通入工作液2前的状态，曲线也恢复趋于未通入工作液2前的共振频率和耗散因子大小；其中，工作液2中含有细胞跨膜转运的小分子；
结果分析：测量加入工作液2后各段的ΔD-t和Δf-t曲线单位时间耗散因子变化和单位时间共振频率变化大小，分别得到信号快速变化段的单位时间耗散因子变化值为细胞快速跨膜转运小分子的速率v1，信号缓慢变化段的单位时间耗散因子变化值为细胞缓慢跨膜转运小分子的速率v2及对应两个信号变化段的单位时间共振频率变化值。
步骤(1)中所述的QCM-D芯片优选为金基底的QCM-D芯片。
步骤(1)中所述的对QCM-D芯片进行羧基化，通过与氨基的生物偶联的方法，包括如下步骤：
1)将所述的QCM-D芯片浸泡到浓度为1～10mmol·L-1的带巯基的酸溶液中，室温孵育1～5h，得修饰好的羧基化QCM-D芯片；
2)将步骤1)修饰好的羧基化QCM-D芯片表面用4～40mmol·L-1氨基偶联试剂孵育1～10h，冲洗，吹干，即得所述的带正电的QCM-D芯片。
步骤1)中所述的带巯基的酸优选为巯基丁二酸和11-巯基十一烷酸中的一种。
步骤1)中所述的带巯基的酸溶液的浓度优选为2mmol·L-1。
步骤1)中所述的室温孵育的时间优选为3h。
步骤2)中所述的氨基偶联试剂优选包括聚赖氨酸溶液。
步骤2)中所述的冲洗优选为用去离子水冲洗。
步骤(1)中所述的对QCM-D芯片进行羧基化的方法，还包括将步骤1)的修饰好的羧基化QCM-D芯片进行活化处理的操作。
将步骤1)的修饰好的羧基化QCM-D芯片进行活化处理的操作优选为：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照(3～8):1摩尔比滴在步骤1)的修饰好的羧基化QCM-D芯片表面，孵育1～2h。
修饰好的羧基化QCM-D芯片经活化处理后，能够使细胞在QCM-D芯片上的黏附效果进一步提高。
步骤(2)中所述的通入工作液1的流速优选为0.1～5mL·min-1。
步骤(2)中所述的工作液1中，NaCl的浓度优选为30～80mM，MgCl2的浓度为0.1～10mM，CaCl2的浓度为1～20mM，HEPES的浓度为10～30mM，甘露醇的浓度为100～150mM。
上述工作液1为工作液2的对照液，其目的是为了在装入芯片通入细胞悬液前获得一个稳定的基线。
步骤(2)中所述的通入待测细胞悬液的流速优选为0.1～5mL·min-1。
步骤(2)中所述的细胞优选为具有细胞体积调节功能的正常组织细胞和癌细胞中的至少一种。
所述的正常组织细胞优选为上皮细胞。
步骤(3)中所述的工作液2优选为可刺激待测细胞跨膜转运有机渗透小分子而产生细胞体积变化的试剂；更优选为高渗溶液、等渗溶液和刺激性药物中的至少一种。
所述的高渗溶液优选为含有机渗透小分子的水溶液、含有机渗透小分子的细胞培养液、甘油与水的混合溶液、山梨醇与水的混合溶液和NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES与甘露醇的混合水溶液中的至少一种。
所述的有机渗透小分子优选包括多元醇类、多糖类、氨基酸类、甲胺类化合物和酰胺类衍生物中的至少一种。
所述的甘油与水的混合溶液优选为10％～14％(v/v)的甘油与水的混合溶液；更优选为12％(v/v)的甘油与水的混合溶液。
所述的山梨醇与水的混合溶液优选为2％～6％(v/v)的山梨醇与水的混合溶液；更优选为4％(v/v)的山梨醇与水的混合溶液。
所述的NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液作为高渗溶液时，NaCl的浓度为30～80mM，MgCl2的浓度为0.1～10mM，CaCl2的浓度为1～20mM，HEPES的浓度为10～30mM，甘露醇的浓度为280～560mM。
所述的等渗溶液优选为磷酸盐缓冲液、生理盐水和NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES与甘露醇的混合水溶液中的至少一种。
所述的磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01M、pH为7.2～7.4。
所述的生理盐水的浓度优选为0.9％(w/v)。
所述的NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液作为等渗溶液时，NaCl的浓度为30～80mM，MgCl2的浓度为0.1～10mM，CaCl2的浓度为1～20mM，HEPES的浓度为10～30mM，甘露醇的浓度为100～150mM。
步骤(4)中所述的工作液1和工作液2的流速均为0.1～5mL·min-1。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明创造性地将具有纳克级别灵敏度的QCM-D与小分子跨膜转运机制结合在一起，提供了一种以QCM-D技术实时动态监测细胞在不同介质刺激下跨膜转运有机小分子的在线分析新方法，包括传感界面构建、流通池中细胞的黏附、不同介质刺激下黏附细胞跨膜转运有机小分子的监测以及流通体系条件的控制，具有高灵敏度、操作简单、原位无损、实时动态监测等优点，有望在生理学、药理学、基础医学及临床诊断等研究领域推广应用。
(2)本发明提供了一种高准确度和更为简单的技术用于实时监测细胞跨膜转运小分子的过程，简化了活细胞跨膜转运小分子的体外研究模型，并为小分子跨膜转运进出细胞的动力学研究提供更为可靠的检测数据。
(3)本方法基于耗散型石英晶体微天平构建，成功通过细胞膜内外甘油分子的进出引起耗散因子和共振频率变化来反映细胞跨膜转运小分子的过程。本发明首次建立以耗散型石英晶体微天平为监测工具，以甘油为代表的有机小分子的跨细胞膜转运所引起传感器的耗散因子和共振频率的变化为监测信号的检测方法，克服了传统技术灵敏度低、不能实时、连续监测等问题，可应用于研究细胞体积调节功能，对细胞生物功能研究以及临床医学基础研究具有重要的科学意义和应用价值。
(4)本发明通过QCM-D技术实时监测了因胞外渗透压变化引起的细胞跨膜转运小分子动力学变化，通过共振频率和耗散因子信号变化研究在不同介质刺激下细胞跨膜转运有机小分子的速率变化。本发明将QCM-D技术应用于实时监测细胞的跨膜转运过程，通过捕捉有机小分子进出细胞的速率变化来反映细胞的体积变化，可提供更多细胞层面上的微观生物信息，而且其高灵敏度是目前其他方法难以达到的。
附图说明
图1为实施例1中在工作液2的刺激条件下细胞的QCM-D图。
图2为实施例2中在工作液2的刺激条件下细胞的QCM-D图。
图3为实施例3中在工作液2的刺激条件下细胞的QCM-D图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
耗散型石英晶体微天平(QCM-D)型号为QCM-Z500，购于KSV Instruments Ltd.，Finland。
实施例1：工作液2刺激下癌细胞跨膜转运甘油分子的监测
一种实时动态监测细胞跨膜转运甘油分子的方法，包括如下步骤：
(1)将金基底的QCM-D芯片浸泡到浓度为10mmol·L-1的巯基丁二酸溶液中，室温孵育3h；然后取200μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比5:1混合均匀的溶液滴在金基底的QCM芯片表面，孵育1.5h，得修饰好的羧基化QCM-D芯片；随后向步骤1)修饰好的羧基化QCM-D芯片表面加入100μL 40mmol·L-1聚赖氨酸溶液继续孵育10h，用去离子水冲洗，吹干，得到带正电的QCM-D芯片。
(2)将步骤(1)的带正电的QCM-D芯片装入耗散型石英晶体微天平的流通池中，采用自动进样装置，向流通池中以0.1mL·min-1的流速通入工作液1，得到稳定的基线；然后以0.1mL·min-1的流速通入5×103个/mL的人非小细胞肺癌细胞(即NCI-H1299，购于ATCC)，通过静电吸附将细胞黏附在带正电的QCM-D芯片上，待曲线走势平缓后，以0.1mL·min-1的流速通入工作液1冲掉未黏附在QCM-D芯片上的细胞；所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和甘露醇的混合水溶液，工作液1中NaCl的浓度为70mM，MgCl2的浓度为0.5mM，CaCl2的浓度为1mM，HEPES的浓度为20mM，甘露醇的浓度为140mM；
(3)将工作液2以0.1mL·min-1的流速通入步骤(2)的流通池中，黏附在芯片上的细胞迅速发生变化，通过记录耗散因子变化-时间曲线(ΔD-t)和频率变化-时间曲线(Δf-t)追踪细胞跨膜转运小分子的过程；其中，工作液2为12％(v/v)的甘油与水的混合溶液；
(4)将工作液1以0.1mL·min-1的流速通入步骤(3)的流通池中，以移除流通池中的工作液2，直至黏附在芯片上的细胞恢复趋于未通入工作液2前的状态，曲线也恢复趋于未通入工作液2前的共振频率和耗散因子大小；
结果分析：测量加入工作液2后各段的ΔD-t和Δf-t曲线单位时间耗散因子变化和单位时间共振频率变化大小，分别得到信号快速变化段的斜率1为细胞快速跨膜转运小分子的速率v1，信号缓慢变化段的斜率2为细胞缓慢跨膜转运小分子的速率v2。
结果如图1所示，在通入人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)后，细胞逐渐黏附在带正电的QCM-D芯片上；在工作液2通入后，QCM-D传感界面感应到工作液2的流入，随后产生灵敏信号。信号快速变化段为黏附在芯片上的人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)快速跨膜转运水分子的过程，其速率v1即单位时间耗散因子变化值为4.31×10-6·min-1(n＝3，RSD＝2.1％)，同时获得单位时间共振频率变化值为12.34Hz·min-1(n＝3，RSD＝3.3％)；信号缓慢变化段为人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)慢速跨膜转运甘油分子和水分子过程，其速率v2即单位时间耗散因子变化值为0.24×10-6·min-1(n＝3，RSD＝3.0％)，同时获得单位时间共振频率变化值为0.81Hz·min-1(n＝3，RSD＝3.9％)。两个阶段动力学变化具有显著性差异(P<0.05)，信号快速变化段反映黏附细胞因受高渗胁迫发生快速失水皱缩，信号缓慢变化段反映该皱缩细胞通过缓慢转运甘油分子和水分子至胞内来调节体积以逐渐恢复趋于未受高渗刺激前的状态。
实施例2：工作液2刺激下癌细胞跨膜转运山梨醇分子的监测
一种实时动态监测细胞跨膜转运山梨醇分子的方法，包括如下步骤：
(1)将金基底的QCM-D芯片浸泡到浓度为5mmol·L-1的巯基丁二酸溶液中，室温孵育3h；然后取200μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比8:1混合均匀的溶液滴在金基底的QCM芯片表面，孵育1.5h，得修饰好的羧基化QCM-D芯片；随后向步骤1)修饰好的羧基化QCM-D芯片表面加入100μL 20mmol·L-1聚赖氨酸溶液继续孵育6h，用去离子水冲洗，吹干，得到带正电的QCM-D芯片。
(2)将步骤(1)的带正电的QCM-D芯片装入耗散型石英晶体微天平的流通池中，采用自动进样装置，向流通池中以2mL·min-1的流速通入工作液1，得到稳定的基线；然后以2mL·min-1的流速通入5×103个/mL的人非小细胞肺癌细胞(即NCI-H1299，购于ATCC)，通过静电吸附将细胞黏附在带正电的QCM-D芯片上，待曲线走势平缓后，以2mL·min-1的流速通入工作液1冲洗QCM-D芯片，以冲掉未黏附在QCM-D芯片上的细胞；所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和甘露醇的混合水溶液，工作液1中NaCl的浓度为40mM，MgCl2的浓度为10mM，CaCl2的浓度为20mM，HEPES的浓度为10mM，甘露醇的浓度为120mM；
(3)将工作液2以2mL·min-1的流速通入步骤(2)的流通池中，黏附在芯片上的细胞迅速发生变化，通过记录耗散因子变化-时间曲线(ΔD-t)和频率变化-时间曲线(Δf-t)追踪细胞跨膜转运小分子的过程；所述工作液2为4％(v/v)的山梨醇与水的混合溶液；
(4)将工作液1以2mL·min-1的流速通入步骤(3)的流通池中，以移除流通池中的工作液2，直至黏附在芯片上的细胞恢复趋于未通入工作液2前的状态，曲线也恢复趋于未通入工作液2前的共振频率和耗散因子大小；
结果分析：测量加入工作液2后各段的ΔD-t和Δf-t曲线单位时间耗散因子变化和单位时间共振频率变化大小，分别得到信号快速变化段的斜率1为细胞快速跨膜转运小分子的速率v1，信号缓慢变化段的斜率2为细胞缓慢跨膜转运小分子的速率v2。
结果如图2所示，在通入人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)后，细胞逐渐黏附在带正电的QCM-D芯片上；在工作液2通入后，QCM-D传感界面感应到工作液2的流入，随后产生灵敏信号。信号快速变化段为黏附在芯片上的人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)快速跨膜转运水分子的过程，其速率v1即单位时间耗散因子变化值为1.40×10-6·min-1(n＝3，RSD＝2.4％)，同时获得单位时间共振频率变化值为9.96Hz·min-1(n＝3，RSD＝3.4％)；信号缓慢变化段为人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)慢速跨膜转运山梨醇分子和水分子过程，其速率v2即单位时间耗散因子变化值为0.01×10-6·min-1(n＝3，RSD＝3.5％)，同时获得单位时间共振频率变化值为0.71Hz·min-1(n＝3，RSD＝4.1％)。两个阶段动力学变化具有显著性差异(P<0.05)，信号快速变化段反映黏附细胞因受高渗胁迫发生快速失水皱缩，信号缓慢变化段反映该皱缩细胞通过缓慢转运山梨醇分子和水分子至胞内来调节体积以逐渐恢复趋于未受高渗刺激前的状态。
实施例3：工作液2刺激下正常组织细胞跨膜转运甘油分子的监测
一种实时动态监测细胞跨膜转运甘油分子的方法，包括如下步骤：
(1)将金基底的QCM-D芯片浸泡到浓度为1mmol·L-1的巯基丁二酸溶液中，室温孵育3h；然后取200μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比3:1混合均匀的溶液滴在金基底的QCM芯片表面，孵育1.5h，得修饰好的羧基化QCM-D芯片；随后向步骤1)修饰好的羧基化QCM-D芯片表面加入100μL 4mmol·L-1聚赖氨酸溶液继续孵育1h，用去离子水冲洗，吹干，得到带正电的QCM-D芯片。
(2)将步骤(1)的带正电的QCM-D芯片装入耗散型石英晶体微天平的流通池中，采用自动进样装置，向流通池中以5mL·min-1的流速通入工作液1，得到稳定的基线；然后以5mL·min-1的流速通入5×103个/mL的人正常肺上皮细胞(即BEAS-2B，购于ATCC)，通过静电吸附将细胞黏附在带正电的QCM-D芯片上，待曲线走势平缓后，以5mL·min-1的流速通入工作液1冲洗QCM-D芯片，以冲掉未黏附在QCM-D芯片上的细胞；所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和甘露醇的混合水溶液，工作液1中NaCl的浓度为60mM，MgCl2的浓度为6mM，CaCl2的浓度为10mM，HEPES的浓度为30mM，甘露醇的浓度为100mM；
(3)将工作液2以5mL·min-1的流速通入步骤(2)的流通池中，黏附在芯片上的细胞迅速发生变化，通过记录耗散因子变化-时间曲线(ΔD-t)和频率变化-时间曲线(Δf-t)追踪细胞跨膜转运小分子的过程；所述工作液2为12％(v/v)的甘油与水的混合溶液；
(4)将工作液1以5mL·min-1的流速通入步骤(3)的流通池中，以移除流通池中的工作液2，直至黏附在芯片上的细胞恢复趋于未通入工作液2前的状态，曲线也恢复趋于未通入工作液2前的共振频率和耗散因子大小；
结果分析：测量加入工作液2后各段的ΔD-t和Δf-t曲线单位时间耗散因子变化和单位时间共振频率变化大小，分别得到信号快速变化段的斜率1为细胞快速跨膜转运小分子的速率v1，信号缓慢变化段的斜率2为细胞缓慢跨膜转运小分子的速率v2。
结果如图3所示，在通入人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)后，细胞逐渐黏附在带正电的QCM-D芯片上；在工作液2通入后，QCM-D传感界面感应到工作液2的流入，随后产生灵敏信号。信号快速变化段为黏附在芯片上的人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)快速跨膜转运水分子的过程，其速率v1即单位时间耗散因子变化值为2.85×10-6·min-1(n＝3，RSD＝2.6％)，同时获得单位时间共振频率变化值为4.36Hz·min-1(n＝3，RSD＝3.2％)；信号缓慢变化段为人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)慢速跨膜转运甘油分子和水分子过程，其速率v2即单位时间耗散因子变化值为0.03×10-6·min-1(n＝3，RSD＝3.7％)，同时获得单位时间共振频率变化值为0.80Hz·min-1(n＝3,RSD＝4.4％)。两个阶段动力学变化具有显著性差异(P<0.05)，信号快速变化段反映黏附细胞因受高渗胁迫发生快速失水皱缩，信号缓慢变化段反映该皱缩细胞通过缓慢转运甘油分子和水分子至胞内来调节体积以逐渐恢复趋于未受高渗刺激前的状态。
上述实施例通过测量斜率v1和v2，对不同介质刺激下细胞跨膜转运小分子的过程进行了实时、连续的在线检测，有效构建了动态分析平台，有望在基础医学和疾病诊断中推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种以耗散型石英晶体微天平技术实时动态监测细胞跨膜转运有机小分子的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对QCM-D芯片进行羧基化，通过与氨基的生物偶联，得到带正电的QCM-D芯片；
(2)将步骤(1)的带正电的QCM-D芯片装入耗散型石英晶体微天平的流通池中，采用自动进样装置，向流通池中通入工作液1，得到稳定的基线；通入5×103～105个/mL待测细胞悬液，通过静电吸附将细胞黏附在带正电的QCM-D芯片上，待曲线走势平缓后，通入所述工作液1冲掉未黏附在QCM-D芯片上的细胞；所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和甘露醇的混合水溶液；
(3)将工作液2以0.1～5mL·min-1的流速通入步骤(2)的流通池中，黏附在芯片上的细胞迅速发生变化，通过记录耗散因子变化-时间曲线ΔD-t和频率变化-时间曲线Δf-t追踪细胞跨膜转运小分子的过程；其中，工作液2中含有细胞跨膜转运的小分子；
(4)将工作液1通入步骤(3)的流通池中，以移除步骤(3)流通池中的工作液2，直至黏附在芯片上的细胞恢复趋于未通入工作液2前的状态，曲线也恢复趋于未通入工作液2前的共振频率和耗散因子大小；
结果分析：测量加入工作液2后各段的ΔD-t和Δf-t曲线单位时间耗散因子变化和单位时间共振频率变化大小，分别得到信号快速变化段的单位时间耗散因子变化值为细胞快速跨膜转运小分子的速率v1，信号缓慢变化段的单位时间耗散因子变化值为细胞缓慢跨膜转运小分子的速率v2及对应两个信号变化段的单位时间共振频率变化值。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的QCM-D芯片为金基底的QCM-D芯片。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的对QCM-D芯片进行羧基化，通过与氨基的生物偶联的方法，包括如下步骤：
1)将所述的QCM-D芯片浸泡到浓度为1～10mmol·L-1的带巯基的酸溶液中，室温孵育1～5h，得修饰好的羧基化QCM-D芯片；
2)将步骤1)修饰好的羧基化QCM-D芯片表面用4～40mmol·L-1氨基偶联试剂孵育1～10h，冲洗，吹干，即得所述的带正电的QCM-D芯片。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，
步骤1)中所述的带巯基的酸为巯基丁二酸和11-巯基十一烷酸中的一种；
步骤1)中所述的带巯基的酸溶液的浓度为2mmol·L-1；
步骤1)中所述的室温孵育的时间为3h；
步骤2)中所述的氨基偶联试剂包括聚赖氨酸溶液；
步骤2)中所述的冲洗为用去离子水冲洗。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的对QCM-D芯片进行羧基化的方法，还包括将步骤1)的修饰好的羧基化QCM-D芯片进行活化处理的操作；
将步骤1)的修饰好的羧基化QCM-D芯片进行活化处理的操作为：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照3～8:1摩尔比滴在步骤1)的修饰好的羧基化QCM-D芯片表面，孵育1～2h。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的通入工作液1的流速为0.1～5mL·min-1；
步骤(2)中所述的工作液1中，NaCl的浓度为30～80mM，MgCl2的浓度为0.1～10mM，CaCl2的浓度为1～20mM，HEPES的浓度为10～30mM，甘露醇的浓度为100～150mM；
步骤(2)中所述的通入待测细胞悬液的流速为0.1～5mL·min-1。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的细胞为具有细胞体积调节功能的正常组织细胞和癌细胞中的至少一种；
步骤(3)中所述的工作液2为可刺激待测细胞跨膜转运有机渗透小分子而产生细胞体积变化的试剂；
步骤(4)中所述的工作液1和工作液2的流速均为0.1～5mL·min-1。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，
所述的正常组织细胞为上皮细胞；
所述的可刺激待测细胞跨膜转运有机渗透小分子而产生细胞体积变化的试剂为高渗溶液、等渗溶液和刺激性药物中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，
所述的高渗溶液为含有机渗透小分子的水溶液、含有机渗透小分子的细胞培养液、甘油与水的混合溶液、山梨醇与水的混合溶液和NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES与甘露醇的混合水溶液中的至少一种；
所述的有机渗透小分子包括多元醇类、多糖类、氨基酸类、甲胺类化合物和酰胺类衍生物中的至少一种；
所述的甘油与水的混合溶液为10％～14％v/v的甘油与水的混合溶液；
所述的山梨醇与水的混合溶液为2％～6％v/v的山梨醇与水的混合溶液；
所述的NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液作为高渗溶液时，NaCl的浓度为30～80mM，MgCl2的浓度为0.1～10mM，CaCl2的浓度为1～20mM，HEPES的浓度为10～30mM，甘露醇的浓度为280～560mM。
10.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，
所述的等渗溶液为磷酸盐缓冲液、生理盐水和NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES与甘露醇的混合水溶液中的至少一种；
所述的NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液作为等渗溶液时，NaCl的浓度为30～80mM，MgCl2的浓度为0.1～10mM，CaCl2的浓度为1～20mM，HEPES的浓度为10～30mM，甘露醇的浓度为100～150mM。
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