CN114854639B - 一株高产肌苷缓解溃疡性结肠炎的假长双歧杆菌及其应用 - Google Patents

一株高产肌苷缓解溃疡性结肠炎的假长双歧杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产肌苷缓解溃疡性结肠炎的假长双歧杆菌及其应用，属于功能性微生物技术领域。本发明提供了的假长双歧杆菌CCFM1253保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62274，保藏日期为2022年3月6日。本发明的假长双歧杆菌CCFM1253的肌苷产量可高达3.4mg/mL；本发明的假长双歧杆菌CCFM1253可以显著缓解结肠炎引起的体重损失，显著降低结肠中IL‑1β，IL‑6和TNF‑α水平和升高IL‑10水平，抑制髓过氧化物酶活性，提高其抗氧化酶活力，促进与结肠紧密连接相关蛋白(ZO‑1，Claudin‑1和Occludin)的表达，可见，本发明的菌株在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中具有巨大的应用前景。

Description

一株高产肌苷缓解溃疡性结肠炎的假长双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株高产肌苷缓解溃疡性结肠炎的假长双歧杆菌及其应用，属于功能性微生物技术领域。
背景技术
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性炎症反应，其发病率逐年的增加。调查发现，溃疡性结肠炎是影响儿童和青少年的最常见的胃肠道慢性疾病之一，17岁之前诊断的病例超过20％。近几年来，越来越多的研究者对溃疡性结肠炎的发病机理及治疗方法进行了深入的探索。溃疡性结肠炎的临床症状典型症状包括大便出血、腹泻、急迫、尿失禁、疲劳、排便频率增加、粘液排出、夜间排便和腹部不适。
目前的溃疡性结肠炎治疗主要通过抗炎和免疫抑制机制控制炎症。治疗溃疡性结肠炎常用的药物包括艾迪莎、美沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、氢化可的松、氢化波尼松和硫唑嘌呤等，它们通过调节相关炎症通途和提高抗氧化酶的活力等来改善溃疡性结肠炎。然而，长期服用这些药物可能产生多种严重的副作用，如高血压、糖尿病、关节炎和肾损伤等，更有甚者严重和潜在威胁生命的感染和肿瘤的风险。为了降低其并发症及其长期服用药物带来一些的副作用，迫切寻求一种更加有效且副作用小的干预方式。近几年来，许多研究者发现一些特异的益生菌对溃疡性结肠炎具有缓解作用。相对药物来说，益生菌对溃疡性结肠炎的干预具有较小的副作用。因此，筛选出具有抑制促炎因子、修护肠道屏障和提高抗氧化酶活力的益生菌对溃疡性结肠炎进行辅助治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudolongum)CCFM1253，所述假长双歧杆菌CCFM1253保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62274，保藏日期为2022年3月6日。
所述假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253来源于正常人粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，提取筛选得到的菌株的基因组进行16S rDNA扩增，获得PCR产物进行测序(上海华大基因科技有限公司)。将获得的序列在NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示，该菌株为假长双歧杆菌，命名为假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253。
所述假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253在MRS固体培养基上的菌落突起，呈光滑、圆形、乳白色、半透明状，直径为1～2mm。
本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中，含有上述假长双歧杆菌CCFM1253，或含有假长双歧杆菌CCFM1253的发酵液，或含有假长双歧杆菌CCFM1253的冻干粉，或含有假长双歧杆菌CCFM1253灭活的菌体、或含有假长双歧杆菌CCFM1253的裂解物，或含有所述假长双歧杆菌CCFM1253提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的制备方法为：
假长双歧杆菌CCFM1253接种到MRS培养基中，然后在36～38℃厌氧条件下培养20～30小时。培养液离心(8000～12000rpm/min，5～20min，0～8℃)，用生理盐水清洗3～5次，添加冻干保护剂，菌液最后的浓度高于1×106CFU/mL，将其重悬液进行真空冷冻干燥，获得菌粉。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂在重悬液中的添加量占总重量的1/2～1/4。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，假长双歧杆菌CCFM1253的含量至少为1×106CFU/g或1×106CFU/mL。
本发明的第三个目的是提供了一种高产肌苷的方法，所述方法为采用上述假长双歧杆菌CCFM1253发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将上述假长双歧杆菌CCFM1253添加至培养基中，在37℃条件下培养18小时后，制备得到培养液，将制备得到的培养液离心，得到菌体；将菌体添加至含有10mg/mL腺苷的5mL PBS溶液中，在37℃条件下发酵12小时，获得发酵液，采用高效液相色谱检测发酵液的肌苷浓度。
在本发明的一种实施方式中，将菌株按照109～1010CFU的添加量添加至含有10mg/mL腺苷的5mL PBS溶液中。
本发明的第四个目的是提供了上述假长双歧杆菌CCFM1253或上述微生物菌剂在制备肌苷或含有肌苷的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，假长双歧杆菌CCFM1253的含量至少为1×106CFU/g或1×106CFU/mL。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述假长双歧杆菌CCFM1253、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述保健品含有上述假长双歧杆菌CCFM1253、载体和/或辅料。
本发明的第五个目的是提供了一种产品，所述产品中含有上述假长双歧杆菌CCFM1253或其发酵液，或所述菌株的培养物、或所述菌株的裂解物，或所述菌株的提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，假长双歧杆菌CCFM1253的含量至少为1×106CFU/g或1×106CFU/mL。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述假长双歧杆菌CCFM1253、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述保健品含有上述假长双歧杆菌CCFM1253、载体和/或辅料。
本发明的第六个目的是提供了上述假长双歧杆菌CCFM1253或上述微生物菌剂在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述结肠炎可由细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫等生物引起，亦可由***反应及理化因子引起，根据病因不同，可分为特异性炎性病变和非特异性炎性病变，前者指感染性结肠炎、缺血性结肠炎和伪膜性结肠炎等，后者包括溃疡性结肠炎及结肠Crohn病。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，假长双歧杆菌CCFM1253的含量至少为1×106CFU/g或1×106CFU/mL。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述假长双歧杆菌CCFM1253、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述保健品含有上述假长双歧杆菌CCFM1253、载体和/或辅料。
本发明的第七个目的是提供了上述假长双歧杆菌CCFM1253或其发酵液或所述菌株的培养物或所述菌株的裂解物或所述菌株的提取物在(a)～(e)至少一方面的应用：
(a)在制备降低促炎细胞因子的水平的抗炎生物治疗剂中的应用；
(b)在制备提高结肠组织中抗炎因子水平的抗炎生物治疗剂中的应用；
(c)在制备抑制髓过氧化物酶活力的生物治疗剂中的应用；
(d)在制备缓解结肠炎患者体重的减轻，减少便血的生物治疗剂中的应用；
(e)在制备改善结肠粘膜和调控结肠紧密连接蛋白相关基因表达量的生物治疗剂中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠中促炎因子包括IL-1β,IL-6和TNF-α。所述的抗炎因子包括IL-10。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠组织中抗氧化酶包括T-AOC、SOD和GSH。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠组织中紧密连接蛋白包括ZO-1,Claudin-1和Occludin。
有益效果
1、本发明的假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253能够高产肌苷，肌苷为人体的正常成分，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，使低能缺氧状态下的组织细胞继续顺利进行代谢，有助于肝细胞功能的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收；而本发明的假长双歧杆菌CCFM1253发酵之后得到的上清液中的肌苷含量可高达3.4mg/mL；
可见，本发明的假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253能够在用于制备治疗各种原因引起的白细胞或血小板减少症的药物制剂，以及用于制备治疗急慢性肝炎、胆囊炎和心肌炎、风湿性心脏病、肺原性心脏病、高血压心脏病等的药物制剂，同时在用于制备治疗视神经萎缩、中心性视网膜炎等眼科疾病的药物制剂方面具有巨大的应用前景。
2、本发明提供的假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253可以显著缓解结肠炎引起的体重损失，显著降低结肠中IL-1β,IL-6和TNF-α水平和升高IL-10水平，抑制髓过氧化物酶活性，提高其抗氧化酶活力，促进与结肠紧密连接相关蛋白(ZO-1,Claudin-1和Occludin)的表达，具体体现在：
(1)假长双歧杆菌CCFM1253可显著缓解DSS处理后的体重下降程度；
(2)假长双歧杆菌CCFM1253可显著改善DSS处理后的结肠组织呈现出炎症细胞浸润、杯状细胞数量减少和隐窝结构被破坏等的症状；
(3)假长双歧杆菌CCFM1253可显著降低DSS处理后结肠组织中MPO的活力；
(4)假长双歧杆菌CCFM1253可显著降低DSS处理后结肠组织中IL-1β水平、IL-6水平、TNF-α水平。
(5)假长双歧杆菌CCFM1253可显著升高DSS处理后结肠组织中IL-10水平、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力、还原型谷胱甘肽含量。
(6)假长双歧杆菌CCFM1253可显著性增加DSS处理后结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平。
可见，假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253，分类学命名为Bifidobacterium pseudolongum，已于2022年3月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62274，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1：假长双歧杆菌CCFM1253的菌落形态图。
图2：假长双歧杆菌CCFM1253的产肌苷能力图。
图3：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠体重的影响图。
图4：假长双歧杆菌CCFM1253对小鼠疾病活动指数DAI指数的影响图。
图5：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠组织病理的影响图。
图6：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠髓过氧化物酶的影响图。
图7：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中IL-1β水平的影响图。
图8：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中IL-6水平的影响图。
图9：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中TNF-α水平的影响图。
图10：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中IL-10水平的影响图。
图11：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中总抗氧化能力的影响图。
图12：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中超氧化物歧化酶的影响图。
图13：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中还原型谷胱甘肽的影响图。
图14：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠结肠中紧密连接蛋白转录水平的影响图。
具体实施方式
本发明现提供以下术语和方法的解释，以更好地阐述本发明并引导所属领域技术人员实践本发明。
本文中所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的含义为“包含但不限于”、“包括但不限于”、“具有但不限于”、“含有但不限于”，并且可与相应的短语进行互换使用。
除非上下文另有明确说明，否则本文中所用术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与其互换使用。
除非另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法、材料实例仅具有说明性而并不对本发明进行任何的限定。
技术术语的定义：
本文所用术语“菌株”是指具有共同特征的一种特定物种的微生物。除非指示相反含义，否则术语“菌株”与“细胞”在本文中可互换使用。
本文所用术语“平板”是指平板培养基，是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为培养平板，或平板。
本文所用术语“培养基”是指一种培养基，它包括对于所述微生物的生长所需的化学元素连同至少一个碳源和一个氮源。
本文所用术语“培养”是指对所述微生物持续一段时期的培养直到达到一种希望的目标为止。
本文所用术语“缓解结肠炎”是指预防以及降低结肠炎的频率和/或发生率和/或严重程度和/或缩短其持续时间；发生率是指任何肠炎的数量；频率是指相同肠炎的数量；
此预防涵盖降低该肠炎在以后生活中的频率和/或严重程度。
本文所用术语“发酵液”是指液体培养基接入微生物菌种，经过一段时间培养后，微生物利用培养基中的营养成分，合成菌体及分泌产物，这种经微生物代谢后的液体叫发酵液。
本文所用术语“菌株提取物”是指通过假长双歧杆菌乳杆菌菌株的发酵获得提取物，将其接种至合适的培养基中，在常规发酵条件下进行发酵，以合成和向培养基中分泌所述产物，并之后纯化。
本文所用术语“菌株的裂解物”是指将培养后的假长双歧杆菌乳杆菌接种至菌体裂解液中，在常规的条件下裂解后，离心、纯化后得到菌株的裂解物。
下述实施例中涉及SPF级7周龄雄性C57BL/J小鼠采购于维通利华实验动物有限公司；下述实施例中涉及的ELISA试剂盒采购于南京森贝伽生物科技有限公司；上述实施例中涉及的脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、多聚甲醛均采购于国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的HE染色液购自南京烁朴生物科技有限公司。
下述实施例中所涉及的假长双歧杆菌MEC12L42是本发明同期筛选的菌株。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、牛肉膏10g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L、七水硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温80 1mL/L，pH 6.8。
MRS固体培养基(g/L)：在1L的MRS液体培养基添加20g琼脂。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
肌苷的检测方法：
采用高效液相色谱法测定，具体方法如下：采用Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm)，检测波长245nm，流动相为甲醇：0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液＝8:92(V/V)，流速0.2mL/min.。
疾病活动指数(Disease activity index，DAI)的检测方法：
DAI评分主要参照Murthy的评分***，主要包括体重变化率、粪便性状和便血情况，DAI评分＝体重变化分值+粪便性状分值+便血分值。体重分值：体重下降率小于1％(0分)、体重下降1～5％(1分)、体重下降5～10％(2分)、体重下降11～15％(3分)和体重下降大于15％(4分)；粪便性状分值：正常(0分)、松散(2分)和稀便(4分)；便血分值：隐血阴性(0或1分)、隐血阳性(2或3分)和肉眼血便(4分)。
结肠长度的检测方法：
小鼠安乐处死后，解剖，取结肠，采用直尺测量结肠长度。
结肠组织病理学特征的观察方法：
取离***10毫米处用5毫米结肠组织用***进行固定12小时。将结肠组织依次用不同浓度乙醇溶液进行脱水(30分钟/次)，分别为70％、80％和90％(v/v)的乙醇。再用95％和无水乙醇进行透水2次，每次20分钟。将结肠组织置于二甲苯和酒精混合液(1:1)中15分钟，再取出依次放置于二甲苯I和二甲苯II各15分钟；再取出样品依次放入65℃的石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ液体各60分钟。采用石蜡包埋机将结肠包埋于重新融化的蜡块中，再采用组织切片机对样品进行切片，其厚度为3微米。粘片后晾干，置于65℃下进行干燥。石蜡切片经二甲苯、脱蜡各5分钟，然后依次放入不同浓度乙醇(100％、95％、90％、80％、70％)中各5～7分钟，再置于双蒸水中5分钟；将样品取出置于苏木精染色液中(约20秒)，用蒸馏水将从苏木***中取出的样品除去苏木精残留物。将切片浸入伊红染色液，立即取出。将切片快速来回放入95％(v/v)乙醇溶液2次，然后浸入80％(v/v)乙醇溶液1分钟，最后浸入100％(v/v)乙醇2分钟。样品放入二甲苯和酒精混合液(1:1)中1分钟，接着来回放入二甲苯中2次，每次3分钟，最后用中性树胶封片。等树胶凝固后用乙醇擦除，在Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描并拍照。
结肠组织生化指标的测定：
称取一定质量的结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液(含有1％(v/v)蛋白酶抑制剂和1％(v/v)磷酸酶抑制剂)，在组织匀浆机的作用下，对其样品进行破碎。离心获得上清液，采用ELISA试剂盒测定上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平，采用生化试剂盒测定MPO、T-AOC、SOD和GSH的活力。
结肠紧密连接蛋白相关基因表达量的测定
采用Trizol法提取结肠组织中总RNA，并用Nanodrop型核酸定量仪测定其浓度和纯度。采用Takala试剂盒将RNA反转为cDNA，CFX96TM实时***进行实时定量PCR，检测紧密连接蛋白相关基因表达量，以GAPDH为内参，2-△△Ct计算基因相对表达。
总抗氧化能力的检测：
称取一定量的结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加生理盐水，进行组织匀浆，离心(12000rpm，10min，4℃)，获得上清液。采用试剂盒(A015-2-1，南京建成，中国)测定期总抗氧化能力。
实施例1：假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253的筛选、鉴定和鉴定
(1)筛选
以来源于正常人粪便为样本，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL 0.85％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃厌氧环境培养48小时，挑取单一菌落在MRS平板进行划线，放置37℃厌氧环境培养48小时。挑起单一菌落接种到MRS液体培养基上进行培养，获得假长双歧杆菌CCFM1253菌液。
(2)鉴定
提取筛选得到的菌株的基因组进行16S rDNA扩增，获得PCR产物进行测序(上海华大基因科技有限公司)。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将获得的序列在NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为假长双歧杆菌，命名为假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253。
按照上述方法同期筛选得到了一株假长双歧杆菌，命名为假长双歧杆菌MEC12L42。
实施例2：假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253的培养和观察
挑取假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253的单菌落接入MRS固体培养基上，放置37℃厌氧工作站中培养48小时，观察假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudolongum)CCFM1253在MRS固体培养基上的菌落特征。由图1观察可得，假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)CCFM1253在MRS固体培养基上的菌落突起，呈光滑、圆形、乳白色、半透明状，直径为1～2mm。
将假长双歧杆菌CCFM1253接入MRS液体培养基中37℃厌氧工作站中培养24小时,将其混匀，将其菌液转移至无菌离心管中，离心除去培养液，用无菌生理盐水进行清洗2次，再离心获得沉淀，添加30％甘油保藏，得到菌株CCFM1253。
实施例3：假长双歧杆菌CCFM1253的产肌苷能力
1、肌苷发酵液的制备
(1)将假长双歧杆菌CCFM1253和假长双歧杆菌MEC12L42分别添加至MRS培养基中，在37℃条件下培养18小时后，制备得到培养液，将制备得到的培养液离心，得到菌体；
(2)将步骤(1)得到的菌体按照109CFU的接种量，将假长双歧杆菌CCFM1253接种在含有10mg/mL腺苷的PBS溶液中，放置厌氧箱中12小时，离心，取上清液，过0.22μm滤膜，分别得到含有肌苷的上清液。
2、肌苷的含量的检测
采用液相色谱进行测定。
其中，采用假长双歧杆菌CCFM1253制备得到的上清液含有3.4mg/mL肌苷，而采用另外一株假长双歧杆菌MEC12L42制备得到的上清液仅有0.2mg/mL(图2)。
实施例4：假长双歧杆菌CCFM1253对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎小鼠体重的影响
(1)配制2.5％的DSS溶液：将葡聚糖硫酸钠(DSS)用无菌水配成2.5％(w/v)的DSS溶液。
(2)假长双歧杆菌CCFM1253菌悬液的制备
从甘油管中蘸取假长双歧杆菌CCFM1253的菌液在MRS固体培养基上划线，在37℃厌氧工作站中培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，在37℃厌氧工作站中培养24h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。将制备得到的菌液接种至MRS液体培养基上进行培养，获得假长双歧杆菌CCFM1253菌悬液，菌液浓度为5×109CFU/mL。
(3)取7周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠24只，随机分为3组(每组8只)，即：空白对照组(NC)、造模组(DSS)、假长双歧杆菌CCFM1253干预组(CCFM1253组)；实验方案和各组小鼠的处理方式如下：
空白对照组(NC)组处理方法为：实验1～14天，每天灌胃200μL的蒸馏水，自由饮用蒸馏水。
模型组(DSS)处理方式：实验1～7天，每天灌胃200μL的蒸馏水，自由饮用蒸馏水。第8-14天，每天灌胃200μL的蒸馏水，自由饮用含2.5％的DSS溶液。
假长双歧杆菌CCFM1253干预组(CCFM1253组)的处理方法为：实验第1-7天，每天灌胃200μL的5×109CFU/mL假长双歧杆菌CCFM1253，自由饮用蒸馏水；实验第8-14天，每天灌胃200μL的5×109CFU/mL假长双歧杆菌CCFM1253，自由饮用含2.5％的DSS溶液。
造模期间，检测各组小鼠体重(检测结果见图3)及各组小鼠疾病活动指数DAI指数(结果见图4)。
结果显示，DSS处理后，模型组中小鼠体重明显下降，而假长双歧杆菌CCFM1253干预后，小鼠体重下降得到很大程度上的缓解。从图4可知，DSS处理后DAI显著性增加，在假长双歧杆菌CCFM1253干预后小鼠体重的下降率仅有9％，证明本发明的假长双歧杆菌CCFM1253缓解了DSS处理后体重的下降程度。
实施例5：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织病变的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，小鼠禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，将样品进行固定，脱水，包埋，HE染色，在PannoramicMIDI数字切片扫描仪的辅助下，观察不同组别小鼠结肠组织HE染色(检测结果见图5)。
结果显示，DSS处理后，小鼠结肠组织呈现出炎症细胞浸润、杯状细胞数量减少和隐窝结构被破坏。而假长双歧杆菌CCFM1253干预后，这些症状明显减少，证明本发明的假长双歧杆菌CCFM1253缓解了DSS处理后结肠组织呈现出炎症细胞浸润、杯状细胞数量减少和隐窝结构被破坏的症状。
实施例6：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中MPO活力的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，小鼠禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1：9的比例添加组织裂解液，匀浆，测量其匀浆液中髓过氧化物酶MPO的含量。
结果见图6，结果显示，空白组中髓过氧化物酶MPO的活力为0.43±0.30U/mg蛋白，DSS处理后，能明显增加髓过氧化物酶MPO的活力(模型组MPO活力为1.88±0.59U/mg蛋白)，而假长双歧杆菌CCFM1253干预后，其结肠组织中髓过氧化物酶MPO活力明显下降(MPO活力为0.68±0.34U/mg蛋白)。
实施例7：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中IL-1β的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，小鼠禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1：9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量其蛋白含量及其IL-1β水平。
IL-1β是由髓样细胞浸润产生的，是结肠炎发展的主要监测因子。IL-1β的增加可通过诱导未成熟髓样细胞加速癌细胞的生长。结果如图7所示。
结果显示，空白组的结肠组织中IL-1β水平的为3.89±1.06pg/mg蛋白，DSS处理后，增加了结肠组织中IL-1β水平，使其高达5.55±0.56pg/mg蛋白(模型组)。而假长双歧杆菌CCFM1253处理可以显著降低IL-1β水平至3.88±1.92pg/mg蛋白。
实施例8：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中IL-6的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量其蛋白含量及其IL-6水平。
IL-6通过促进中性粒细胞和辅助性T细胞17的分化以及抑制T细胞的分化，在几种炎症性疾病的病理生理学中发挥着重要作用。过度分泌IL-6可导致上皮细胞增殖增加，甚至诱发结直肠癌。结果如图8所示。
结果显示，空白组的结肠组织中IL-6水平的为5.60±1.04pg/mg蛋白，DSS处理后，增加了结肠组织中IL-6水平，使其高达10.63±1.56pg/mg蛋白(模型组)。而假长双歧杆菌CCFM1253处理可以显著降低IL-6水平至6.20±1.97pg/mg蛋白。
实施例9：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中TNF-α的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量其蛋白含量及其TNF-α水平。
TNF-α在许多与炎症相关的疾病中起着关键作用，其生物学特性是通过与TNFR1和TNFR221相互作用实现的。此外，TNF-α的促炎特性表现为一系列促炎细胞因子的分泌，包括IL-6和IL-1β。结果如图9所示。
结果显示，空白组的结肠组织中TNF-α水平的为42.23±8.21pg/mg蛋白，DSS处理后，增加了结肠组织中TNF-α水平，使其高达69.51±8.82pg/mg蛋白。而假长双歧杆菌CCFM1253处理可以显著降低TNF-α水平至32.12±8.87pg/mg蛋白。
实施例10：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中IL-10的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量其蛋白含量及其IL-10水平。
IL-10通过促进B细胞增殖和维持Treg抑制功能，进而促进抗体分泌，在某些疾病中起着重要的免疫抑制作用。结果如图10所示。
结果显示，空白组的结肠组织中IL-10水平的为85.05±10.74pg/mg蛋白，DSS处理后，减少了结肠组织中IL-10水平，使其高达24.75±2.79pg/mg蛋白。而假长双歧杆菌CCFM1253处理可以显著升高IL-10水平至46.10±9.03pg/mg蛋白。
实施例11：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中总抗氧化能力的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量其蛋白含量及总抗氧化能力(T-AOC活力)。结果由图11所示。
结果显示，空白组的总抗氧化能力(T-AOC活力)为2.15±0.76U/mg蛋白，模型组中总抗氧化能力显著性的降低(为：0.65±0.34U/mg蛋白)，灌胃假长双歧杆菌CCFM1253组的小鼠结肠组织中总抗氧化能力(T-AOC活力)得到明显的增加(为：1.62±0.31U/mg蛋白)。
实施例12：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中超氧化物歧化酶活力的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量其蛋白含量及超氧化物歧化酶活力。结果如图12所示。
由图12可知，空白组的超氧化物歧化酶为0.32±0.02U/mg蛋白，模型组中超氧化物歧化酶活力显著性的降低(为：0.18±0.02U/mg蛋白)，灌胃假长双歧杆菌CCFM1253组的小鼠结肠组织中超氧化物歧化酶得到明显的增加(为：0.27±0.04U/mg蛋白)。
实施例13：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中还原型谷胱甘肽的影响
动物模型的建立方法同实施例4，实验结束后，禁食12小时后，麻醉小鼠，以颈椎脱臼法处死。解剖，取出结肠组织，按照组织重量：组织裂解液为1:9的比例添加组织裂解液，匀浆，离心获得上清液，测量还原型谷胱甘肽的蛋白含量。结果如图13所示。
由图13可知，空白组的还原型谷胱甘肽的蛋白含量为0.34±0.05μmol/g蛋白，模型组小鼠结肠组织中还原型谷胱甘肽显著性的降低(含量为：0.21±0.03μmol/g蛋白)，灌胃假长双歧杆菌CCFM1253组的小鼠结肠组织中还原型谷胱甘肽显著性增加(含量为：0.32±0.04μmol/g蛋白)。
实施例14：假长双歧杆菌CCFM1253对结肠炎小鼠中结肠组织中紧密连接蛋白转录水平的影响
采用Trizol法提取结肠组织中总RNA，并用Nanodrop型核酸定量仪测定其浓度和纯度。采用Takala试剂盒将RNA反转为cDNA，CFX96TM实时***进行实时定量PCR，检测紧密连接蛋白相关基因表达量，以GAPDH为内参，2-△△Ct计算基因相对表达，其中引物序列如表1所示。
表1：RT-qPCR引物序列
紧密连接蛋白是结肠的重要组成成分，结肠的病变及发展与结肠组织中紧密连接蛋白的含量呈现正相关。结果如图14所示。
与空白组相比(2.31±0.20、3.25±0.32和2.96±0.25)，模型组小鼠结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平显著下降(1.02±0.33、0.98±0.51和1.02±0.72)，表明DSS处理后会引起ZO-1、Claudin-1和Occludin含量减少。
然而，灌胃假长双歧杆菌CCFM1253组的小鼠结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平显著性增加(1.83±0.36、2.43±0.61,和2.87±0.51)。表明灌胃假长双歧杆菌CCFM1253能够缓解DSS诱导结肠炎小鼠的结肠组织中紧密连接蛋白表达减少。
实施例15：假长双歧杆菌CCFM1253的应用
假长双歧杆菌CCFM1253可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
(1)菌株的活化：从甘油管中蘸取假长双歧杆菌CCFM1253的菌液在MRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养24h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。
(2)将步骤(1)得到的菌液按2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h得到发酵液，将得到的发酵液在12000rpm下离心10min后收集菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后备用，并调整活菌数1×1011CFU/mL。
(3)冻干保护剂的主要包含：11％谷氨酸钠、14％脱脂乳和9.0％海藻糖和余量的水混合后得到冻干保护剂。
(4)向步骤(2)中得到的菌泥中添加上述配置好的冻干保护剂，其中冻干保护剂的重量为菌泥重量的3倍，混合均匀后进行真空冷冻干燥，获得假长双歧杆菌CCFM1253菌粉。
实施例16：假长双歧杆菌CCFM1253的应用
假长双歧杆菌CCFM1253可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下
(1)菌株的活化：从甘油管中蘸取假长双歧杆菌CCFM1253的菌液在MRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养24h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。
(2)将步骤(1)得到的菌液按2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h得到发酵液，将得到的发酵液在12000rpm下离心10min后收集菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后备用，并调整活菌数1×1011CFU/mL。
(3)将步骤(2)得到的菌液和海藻酸钠溶液按1:10的比例混合均匀后倒入耐压瓶中，使用微胶囊造粒仪经高频振荡将海藻酸钠和菌悬液的混合液体滴加到3％CaCl2溶液中，使液滴颗粒无连结且均匀，造粒结束后固化40分钟。离心得到样品，用生理盐水洗去微胶囊表面的CaCl2残留液，制得成品微胶囊，置于-20℃保存。
实施例17：假长双歧杆菌CCFM1253的应用
假长双歧杆菌CCFM1253可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
假长双歧杆菌CCFM1253菌粉的制备方法同实施例15。将菌粉和脱脂乳以配研法混匀,将粉料经压片机以2.4t压力压片,获得假长双歧杆菌CCFM1253片剂，其质量控制在250mg±10mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株高产肌苷缓解溃疡性结肠炎的假长双歧杆菌及其应用
<130> GBAA220615B
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1408
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaagtcgaa cgggatccct ggacagcttg ctgccggggt gagagtggcg aacgggtgag 60
taatgcgtga ccgacctgcc ccatgcaccg gaatagctcc tggaaacggg tggtaatgcc 120
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gtggcctaac ccttgtgggg ggagccgt 1408

Claims (10)

1.一株假长双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum）CCFM1253，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62274，保藏日期为2022年3月6日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，含有权利要求1所述的假长双歧杆菌CCFM1253，或含有假长双歧杆菌CCFM1253的发酵液，或含有假长双歧杆菌CCFM1253的冻干粉。
3.一种高产肌苷的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的假长双歧杆菌CCFM1253发酵制备得到。
4.权利要求1所述的假长双歧杆菌CCFM1253或权利要求2所述的微生物菌剂在制备肌苷或含有肌苷的产品中的应用。
5.一种含有权利要求1所述的假长双歧杆菌CCFM1253或其发酵液的产品。
6.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品为药品。
7.权利要求1所述的假长双歧杆菌CCFM1253或权利要求2所述的微生物菌剂在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为药品。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述产品中，假长双歧杆菌CCFM1253的含量至少为1×106 CFU/g或1×106 CFU/mL。
10.权利要求1所述的假长双歧杆菌CCFM1253或其发酵液在（a）~（d）至少一方面的应用：
（a）在制备降低促炎细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平的抗炎生物治疗剂中的应用；
（b）在制备提高结肠组织中抗炎因子IL 10水平的抗炎生物治疗剂中的应用；
（c）在制备抑制髓过氧化物酶活力的生物治疗剂中的应用；
（d）在制备改善结肠粘膜和调控结肠紧密连接蛋白相关基因Claudin-1和Occludin表达量的生物治疗剂中的应用。
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