CN114854042A - 一种用于悬浮3d生物打印的悬浮介质及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，公开了一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质及其制备方法与应用。本发明悬浮介质包括但不限于以下质量百分数的组分：结冷胶0‑10％，巯基化结冷胶0‑10％，溶剂余量；且结冷胶和巯基化结冷胶含量不同时为零。本发明的悬浮介质，具有良好的触变性和自修复能力，使得3D生物打印机的喷头能够在悬浮介质中自由移动，同时能够保持3D生物打印结构的完整性；解决了传统打印中如胶原蛋白、纤维蛋白等天然高分子材料无法实现自支撑打印的问题，且打印精度可达到200微米级别，保真度达99％，有望用于体外构建负载细胞和活性物质的组织器官结构的打印，具有良好的产业化前景。

Description

一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，特别涉及一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质及其制备方法与应用。
背景技术
3D生物打印作为一种组织工程技术，是在3D打印的基础上，以活细胞和生物材料为原料，精确控制每一层中生物材料、活细胞、功能性成分等的定位，层层打印形成可用于移植的3D支架。
在3D生物打印中，目前用于生物材料累积和成型的主要技术有喷墨式打印、微挤压式打印和光辅助打印。温控的喷墨式打印机加热喷头可使管口产生脉冲气压打印出液滴，声学打印机通过压电式或者超声产生脉冲压；微挤压式打印机使用气动或者机械(活塞或螺旋)驱动***挤出连续的含有材料和细胞的小球或线材；光辅助打印利用光聚焦于一种能量吸收性底物，为生物材料打印提供驱动力。而这些传统的3D生物打印方式都存在一定的缺陷。例如喷墨式打印中打印墨水必须形成具有结构组织和功能的固体3D结构。挤出3D生物打印中，为了制造具有复杂3D结构的支架，例如胃道、肾小管气管和肿瘤血管网络等，往往需要使用辅助支撑结构，因此制备具有空间限定特征的血管化结构是很困难的。
悬浮3D打印是利用悬浮介质材料提供支撑，将液相材料从注射器中挤出到支撑浴中，成型出具有复杂3D结构的支架。悬浮3D打印技术的工作原理要求墨水材料必须迅速凝胶成细丝而不会扩散。该技术在无需额外提供打印支撑结构的情况下提高了力学强度较弱的3D生物打印墨水在打印过程中的成型稳定性。目前常使用的悬浮介质材料主要为明胶微颗粒，颗粒的尺寸和均匀性直接影响打印精度，且该支撑浴的制备工艺复杂。因此，开发具有良好打印性能的悬浮介质材料是促进该技术发展和实现应用的关键问题之一。
结冷胶是一种阴离子细胞外细菌多糖，重复单元由1,3-β-D-葡萄糖、1,4-β-D-葡萄糖醛酸、1,4-β-D-葡萄糖和1,4-α-L-鼠李糖通过糖苷键连接而成。天然结冷胶表现出明显的宾汉流体的流变学行为，具有屈服应力，在一定应力作用下粘度迅速降低，具有很好的触变性，同时结冷胶具有良好的生物相容性，这为结冷胶在3D打印中的应用奠定了基础。
结冷胶可以通过以下方式形成凝胶：在高温下，结冷胶为无规线团构象；当温度降低时，发生热可逆的双螺旋结构转变，这是形成凝胶的先决条件。然后，形成了由反平行双螺旋组成的结构，这些螺旋结构自组装成定向束，称为结区。多糖链的未缠绕区域以螺旋状延伸链的形式连接结区，从而使凝胶的三维网络形成。利用结冷胶的热可逆性，在3D结构打印完成后，通过加热融化结冷胶凝胶浴，取出打印结构。目前未见有基于结冷胶的悬浮介质的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质。
本发明另一目的在于提供一种上述悬浮介质的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述悬浮介质的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括但不限于以下质量百分数的组分：结冷胶0-10％，巯基化结冷胶0-10％，溶剂余量；且结冷胶和巯基化结冷胶含量不同时为零。
进一步的，所述的巯基化结冷胶是通过在结冷胶中引入巯基得到。
更进一步的，本发明的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括但不限于以下质量百分数的组分：结冷胶0-5％，巯基化结冷胶0-5％，溶剂余量；且结冷胶和巯基化结冷胶含量不同时为零。
进一步的，本发明悬浮介质中，还可以含有以下质量百分数的组分：pH敏感性调节剂0-2％，温敏剂0-10％，增稠剂0-2％，增强剂0-2％。
本发明中，所述的pH敏感性调节剂为本领域常规使用的pH调节剂即可，如可包括但不限于海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物等中的至少一种。
本发明中，所述的温敏剂为本领域常规使用的温敏剂即可，如可包括但不限于明胶、胶原、琼脂及上述化合物的衍生物等中的至少一种。
本发明中，所述的增稠剂为本领域常规使用的水溶性高分子增稠剂即可，如可包括但不限于常规的天然胶类(如透明质酸、琼脂、海藻胶、明胶等)，纤维素类(如羧乙基纤维素、羧甲基纤维素等)，聚丙烯酸类(如聚丙烯酸钠等)，聚氨酯类(如水溶性聚氨酯等)与聚氧乙烯类增稠剂以及其改性衍生物等中的至少一种。
本发明中，所述的增强剂为本领域常规使用的增强剂即可，如可包括但不限于丝素蛋白、甲壳素及其衍生物等中的至少一种。
本发明中，所述的溶剂可包括但不限于水、PBS、细胞培养基等中的至少一种。
本发明的悬浮介质是基于结冷胶和/或巯基化结冷胶的体系，其表现出明显的宾汉流体的流变学行为，具有屈服应力，在一定应力作用下，粘度迅速降低，具有很好的触变性，应力消除后，表现出迅速的自修复性能；同时巯基的引入可以使结冷胶之间形成二硫键，属于动态化学键，提高了结冷胶的力学性能、触变性和自愈合性，且可以提高结冷胶的凝胶化速度，使其具有相对于现有明胶体系更优异的力学性能，更适用于悬浮3D生物打印。
本发明还提供一种上述悬浮介质的制备方法，通过将各组分按比例混合，加热溶解后保温，待凝胶化后即可得到。
所述加热溶解的温度可为60-90℃。
所述保温的温度可为20-30℃，优选为25℃。
所述保温的时间可为10min-2h。
本发明还提供上述悬浮介质在悬浮打印中的应用。在本发明悬浮介质中，采用挤出式3D生物打印机，在其中挤出生物墨水进行3D打印，以构建特定结构的3D模型，进一步将打印结构交联固化，去除悬浮介质后，得到打印结构。
所述交联固化指可在打印同时或打印结束后通过调节体系pH、温度、离子强度、光固化等使得生物墨水进一步交联固化。
上述所用的生物墨水可为机械强度较弱的天然高分子生物材料，如胶原、壳聚糖、海藻酸、明胶及其衍生物中等。
本发明的悬浮介质，具有良好的触变性和自修复能力，使得3D生物打印机的喷头能够在悬浮介质中自由移动，同时能够保持3D生物打印结构的完整性；打印结束后，可利用悬浮介质的热可逆性或进行碱处理，从而除去悬浮介质，取出打印结构。
本发明的悬浮介质通过构建双网络结构水凝胶有效提高体系力学性能，同时保持结冷胶/巯基化结冷胶的触变性和凝胶特性，可以实现无法自支撑材料的3D生物打印，直接构建微米级的精细结构，如螺旋状结构、柱状结构等含有悬空部分或中空的结构，解决了传统打印中如胶原蛋白、纤维蛋白等机械强度较弱的天然高分子材料无法实现自支撑打印的问题，有望用于体外构建负载细胞和活性物质的组织器官结构的打印。
本发明基于结冷胶和/或巯基化结冷胶的悬浮介质相较于现有的微球悬浮介质而言，简化了悬浮介质制备的工艺流程，且打印精度可达到200微米级别，保真度达99％，具有良好的产业化前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为结冷胶的粘度与剪切速率关系图。
图2为结冷胶的粘度与时间关系图。
图3为结冷胶的剪切模量与时间关系图。
图4为悬浮3D生物打印装置的示意图；其中，1为打印墨水管，2为打印针头，3为悬浮介质，4为打印得到的模型。
图5为实施例1中打印得到的模型图。
图6为结冷胶与巯基化结冷胶的压缩应力-应变曲线。
图7为结冷胶与巯基化结冷胶的杨氏模量与抗压强度关系图。
图8为结冷胶与巯基化结冷胶的温度扫描图。
图9为实施例5中打印得到的模型图。
图10为实施例7中打印得到的模型图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
下列实施例中所用的巯基化结冷胶是通过在结冷胶中引入巯基制备得到的，可直接购买得到或通过本领域常规方法制备得到，或通过以下方法制备得到，反应式如下式一所示：
将结冷胶加热溶解在水中，得到浓度为1.5wt％的溶液，温度为80℃；然后在25℃下凝胶化；得到的凝胶块放入4℃的混合溶液(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.5mmol、N-羟基琥珀酰亚胺0.5mmol和L-半胱氨酸0.5mmol，溶解于20mL水中)中浸泡12小时。结冷胶的整个巯基化反应在凝胶状态下进行。随后通过透析纯化、冷冻干燥后以供进一步使用。
Figure BDA0003631681370000051
实施例1
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：结冷胶2.8％，水余量。
由如下方法制备得到：按质量百分数，将结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，在25℃下冷却45min，直到结冷胶成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。所得介质具有很好的触变性能，具体的流变数据如图1-图3所示。
由图1可见，结冷胶的黏度是随着剪切速率的提高而降低，反映了结冷胶具有明显的宾汉流体的流变学行为。为了更好地了解打印期间悬浮介质的流变性能，并且比较不同浓度结冷胶的恢复和支撑性能，进行了静态剪切恢复试验和振荡时间扫描试验。在打印过程中的剪切速率可以依据针头的直径和移动速度来计算。在打印过程中剪切速率约为30s-1-35s-1，在试验中剪切速率进行低-高-低3步切换，结果如图2和图3所示。结果表明结冷胶具有良好的黏度修复性能，且随着浓度的降低，黏度恢复程度越好，其作为悬浮介质的性能越好，但考虑到浓度越低，其强度与支撑能力越弱，因此浓度对于性能的影响较大。图3表明，结冷胶的凝胶-溶胶转变几乎是瞬时的，并且随着结冷胶浓度的提高，储存模量显著提高。
应用：
(1)按质量分数，将20％GelMA溶于60℃去离子水中，均匀搅拌，充分溶解后，在25℃下保存，得到打印所需水凝胶墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，打印示意图如图4所示。以20wt％GelMA水溶液为打印墨水，将其置于打印墨水管中，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印结束后，将材料置于紫外反应仪中照射5min，紫外波长为312nm，辐射强度为50J/cm2，将悬浮介质连同模型一起放入60℃热水中，除去悬浮介质，得到的模型如图5所示。
(3)对打印模型进行体式显微镜拍摄，以打印出来的模型实际高度/径与理论的高度/直径的比值来确定保真度，结果显示保真度为89％。
实施例2
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：巯基化结冷胶2％，水余量。
由如下方法制备得到：按质量百分数，将巯基化结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，在25℃下冷却25min，直到成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。
对实施例1的结冷胶及本实施例的巯基化结冷胶进行力学性能测试，具体力学性能数据如图6-图8所示，可见巯基化结冷胶具有比结冷胶更好的力学性能。
由图6-图8可知，巯基化结冷胶的杨氏模量约为结冷胶的三倍，而其抗压强度非常接近。巯基化结冷胶的断裂应变低于结冷胶，这主要是由于双网络水凝胶中交联密度的增加，因此加入结冷胶可以有效改善巯基化结冷胶的韧性。由温度扫描测试可知，巯基化结冷胶和结冷胶具有相似的溶胶-凝胶转变行为，转变温度约为37℃，即在37℃以下，结冷胶和巯基化结冷胶溶胶就可以转变为凝胶。
应用：
(1)按质量百分数，将5％的壳聚糖溶于2％醋酸中，混合均匀，获得打印所需的水凝胶墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，将上述水凝胶墨水置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型一起放入2％NaOH溶液中，除去悬浮介质同时使打印结构固化。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度可达95％。
实施例3
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：结冷胶1％、巯基化结冷胶2％，水余量。
由如下方法制备得到：按质量分数，将1％结冷胶、2％巯基化结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，在25℃下冷却30min，直到成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。
应用：
(1)按质量百分数，将20％GelMA溶于60℃去离子水中，均匀搅拌，充分溶解后，在25℃下保存，得到打印所需水凝胶墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，将上述水凝胶墨水置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型置于紫外反应仪中照射5min，紫外波长为312nm，辐射强度为50J/cm2，将悬浮介质连同模型一起放入80℃热水中，去除悬浮介质，得到打印的模型。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度可达97％。
实施例4
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：结冷胶1％、巯基化结冷胶2％，水余量。
由如下方法制备得到：按质量分数，将1％结冷胶、2％巯基化结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，在25℃下冷却30min，直到成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。
应用：
(1)将35mg/mL的胶原蛋白与0.24Mol/L醋酸以2:1的体积比稀释，充分混合，在3000g下离心5分钟，以去除气泡，得到酸化的胶原生物墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，将上述水凝胶墨水置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型置于紫外反应仪中照射5min，紫外波长为312nm，辐射强度为50J/cm2，将悬浮介质连同模型一起放入80℃热水中，去除悬浮介质，得到打印的模型。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度可达95％。
实施例5
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：结冷胶2％、巯基化结冷胶1.5％，pH敏感性调节剂2％(海藻酸钠)，水余量。
由如下方法制备得到：按质量百分数，将2％结冷胶、1.5％巯基化结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，将2％海藻酸钠加入其中充分溶解，在25℃下冷却30min，直到成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。
应用：
(1)按质量百分数，将5％的壳聚糖溶于2％醋酸中，混合均匀，获得打印所需的水凝胶墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，将上述水凝胶墨水置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型一起放入2％NaOH溶液中，除去悬浮介质同时使打印结构固化，得到的模型如图9所示。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度可达99％。
实施例6
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：结冷胶2％、巯基化结冷胶1％，温敏剂2％(明胶)，水余量。
由如下方法制备得到：按质量百分数，将2％结冷胶、1％巯基化结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，将2％明胶加入其中充分溶解，在25℃下冷却30min，直到成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。
应用：
(1)按质量百分数，将20％的可光交联的甲基丙烯酸酯胶原(ColMA)溶于水中，混合均匀，获得打印所需的水凝胶墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，将上述水凝胶墨水置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型置于紫外反应仪中照射5min，紫外波长为312nm，辐射强度为50J/cm2，将悬浮介质连同模型一起放入60℃热水中，除去悬浮介质，得到打印的模型。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度可达98％。
实施例7
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：结冷胶2％、巯基化结冷胶1％，增强剂2％(丝素蛋白)，水余量。
由如下方法制备得到：按质量百分数，将2％结冷胶、1％巯基化结冷胶溶于80℃水中，搅拌均匀，充分溶解后，将2％丝素蛋白加入其中充分溶解，在25℃下冷却30min，直到成为凝胶状态，即可得到悬浮介质。
应用：
(1)按质量分数，将20％GelMA溶于60℃去离子水中，均匀搅拌，充分溶解后，在25℃下保存，得到打印所需水凝胶墨水。
(2)以本发明悬浮介质为打印悬浮介质进行3D生物打印，将上述水凝胶墨水置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，在上述悬浮介质中打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型置于紫外反应仪中照射5min，紫外波长为312nm，辐射强度为50J/cm2，将悬浮介质连同模型一起放入80℃热水中，除去悬浮介质，得到打印的模型如图10所示。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度可达97％。
对比例1
以明胶微粒作为悬浮介质，进行打印，并与结冷胶和/巯基化结冷胶悬浮介质的打印模型的保真度进行对比。
一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，包括以下质量百分数的组分：明胶2％、0.25％
Figure BDA0003631681370000101
F-127、***树胶0.1％，乙醇、盐酸余量。
由如下方法制得：按质量百分数，将2.0％的明胶、0.25％
Figure BDA0003631681370000102
F-127和0.1％的***树胶溶解在装有45℃的50％乙醇溶液的烧杯中，并通过添加1Mol/L盐酸调整pH至6.25。将烧杯置于搅拌器下，用保鲜膜密封以尽量减少蒸发，并在搅拌过夜的同时冷却至室温。然后将所得浆液分别倒入锥形管中，并离心5分钟，以压实明胶微粒。然后去除上清液，将明胶微粒重新悬浮在pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水中，以去除乙醇和
Figure BDA0003631681370000111
F-127。然后用pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤明胶浆料三次，持续2分钟。打印前，在真空室中将浆料抽真空15分钟，然后在2000g下离心5分钟。去除上清液，得到明胶微粒作为悬浮介质。
应用：
(1)将35mg/mL的胶原蛋白与0.24Mol/L醋酸以2:1的体积比稀释，充分混合，在3000g下离心5分钟，以去除气泡，得到酸化的胶原生物墨水。
(2)以上述的明胶微粒悬浮介质为打印悬浮介质，将上述酸化的胶原蛋白置于3D生物打印机的墨水管内，打印针头直径为200微米，打印目标结构模型，打印后将悬浮介质连同打印模型置于紫外反应仪中照射5min，紫外波长为312nm，辐射强度为50J/cm2，将悬浮介质通过物理手段剥离，得到打印模型。
(3)对得到的固化打印模型进行保真度测量，结果显示保真度为78％。相比于明胶微粒的保真度较低，本发明的双组分体系具有更高的保真度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于包括但不限于以下质量百分数的组分：结冷胶0-10％，巯基化结冷胶0-10％，溶剂余量；且结冷胶和巯基化结冷胶含量不同时为零。
2.根据权利要求1所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于还含有以下质量百分数的组分：pH敏感性调节剂0-2％，温敏剂0-10％，增稠剂0-2％，增强剂0-2％。
3.根据权利要求2所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于：所述的pH敏感性调节剂包括海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于：所述的温敏剂包括明胶、胶原、琼脂及上述化合物的衍生物中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于：所述的增稠剂包括天然胶类、纤维素类、聚丙烯酸类、聚氨酯类、与聚氧乙烯类增稠剂以及其改性衍生物中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于：所述的增强剂包括丝素蛋白、甲壳素及其衍生物中的至少一种。
7.根据权利要求2所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质，其特征在于：所述的溶剂包括水、PBS、细胞培养基中的至少一种。
8.一种权利要求1-7任一项所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质的制备方法，其特征在于通过将各组分按比例混合，加热溶解后保温，待凝胶化后得到。
9.权利要求1-7任一项所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质在悬浮打印中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于具体为：在权利要求1-7任一项所述的用于悬浮3D生物打印的悬浮介质中，采用挤出式3D生物打印机，在其中挤出生物墨水进行3D打印，以构建特定结构的3D模型，进一步将打印结构交联固化，去除悬浮介质后，得到打印结构。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757276A (zh) * 2023-12-22 2024-03-26 中国科学技术大学苏州高等研究院 一种支持细胞生长的悬浮打印支撑材料及其制备方法和应用

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