CN114848896B - 一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架及其制备方法与应用，属于免疫医学工程技术领域。本发明提供的一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架，包括磷酸钙支架，在磷酸钙支架上包裹的羟丁基壳聚糖/氧化硫酸软骨素水凝胶，以及在所述支架上装载的CSF‑1R抑制剂。本发明的支架可显著降低肿瘤中M2型巨噬细胞比例并抑制肿瘤生长，同时显著增加肿瘤中M1型巨噬细胞比例并促进肿瘤后的康复。治疗早期释放的抑制剂能有效阻断CSF‑1R通路，抑制巨噬细胞向M2型极化，将M2型重编程为M1型。在抑制剂释放后期，支架可有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。本发明的可阶段性调节巨噬细胞免疫微环境3D打印组织修复支架为肿瘤术后治疗提供了一种新策略。

Description

一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于免疫医学工程技术领域，涉及一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架及其制备方法与应用，具体涉及一种可调控巨噬细胞向M1型极化的可植入支架及其制备方法与应用。
背景技术
巨噬细胞作为一种免疫细胞，是肿瘤微环境的重要组成部分。根据表型和功能的不同，活化的巨噬细胞可分为M1型和M2型，其极化方向受所处微环境的调控。浸润于肿瘤微环境中的巨噬细胞，称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。TAMs在肿瘤微环境中浸润丰富，对肿瘤转移、血管生成、免疫逃逸能产生重要影响。TAMs通过增强肿瘤细胞的遗传不稳定性、滋养肿瘤干细胞、促进浸润转移等方面影响肿瘤的临床治疗效果。因此，靶向TAMs的免疫疗法成为了癌症治疗的热点。
巨噬细胞的两种表型中，M1型巨噬细胞启动促炎性细胞因子反应，不仅可直接吞噬肿瘤细胞，还通过参与高效抗原递呈促进肿瘤杀伤性T辅助性1型细胞反应抑制肿瘤发展。相反的，M2型巨噬细胞常与较差治疗预后关联。肿瘤细胞分泌的集落刺激因子(CSF)通过与巨噬细胞表面受体(CSF-1R)结合，募集巨噬细胞并诱导其向M2型极化，是导致免疫抑制、肿瘤逃逸并快速进展的重要靶点。
研究发现，集落刺激因子-1受体(Colony stimulating factor 1receptor，CSF-1R)抑制剂有潜能重新编程巨噬细胞，减少局部TAMs细胞数量，促进细胞向M1型重极化，从而缓解免疫抑制的肿瘤微环境。更重要的是，CSF-1R抑制剂的释放方式被发现是影响其对肿瘤抑制作用疗效的关键因素，治疗过程中抑制剂需要以一种暂时持续的方式释放并作用于细胞。然而，常规的口服给药的方式使得CSF-1R抑制剂存在滞留时间短、药物富集差和易耐药等问题，其全身给药的用药量大，对人体的毒副作用大。
目前，研究者已开发出多种策略应用于靶向TAMs的免疫治疗，例如抑制免疫检查点、RNA干扰(RNAi)的免疫治疗-化疗联合疗法、放射疗法以及基于TAMs的免疫疗法与其他疗法的联合治疗等。常见的靶向TAMs的抗癌药物主要是通过阻断其促肿瘤信号通路来发挥作用，如集落刺激因子-1受体(Colony stimulating factor 1receptor，CSF-1R)靶向药物，PD-1/PD-L1、CD47免疫检查点抑制剂等。虽然该类药物在部分肿瘤(如黑色素瘤等)治疗中获得了突破性进展，降低了恶化和死亡风险，但在实体瘤治疗中，由于肿瘤微环境的组分复杂性以及药物本身存在的响应性差、易耐药等缺陷，严重影响了其治疗效果。
随着3D打印技术的发展，因疾病和创伤等原因造成的骨组织缺损可逐渐用打印定制的植入体修复，并取得了较好的效果。然而，易复发恶性骨肿瘤难以通过单一的骨修复支架治疗。近来研究表明，巨噬细胞在肿瘤复发和发展中起着重要的作用，肿瘤微环境中的生长因子募集巨噬细胞并诱导其向M2型肿瘤相关巨噬细胞极化，造成免疫抑制，促进肿瘤发生发展。
针对于肿瘤术后易复发导致生存率难以提高的困境，开发能够调控肿瘤微环境的相关靶向材料或药物成为癌症术后治疗的关键。CSF-1R抑制剂GW2580虽然有一定的巨噬细胞调控作用，但由于其单独给药存在滞留时间短、药物富集差和耐药问题，无法实现对肿瘤术后免疫微环境的靶向给药和高效调控，在实际应用中无法实现对骨肿瘤术后免疫微环境的高效调控和术后患者的康复。
专利文献CN 107029291 A提供了一种仿生纤维内硅化胶原支架浸提液用于诱导巨噬细胞向M2型极化，能够有效调节宿主免疫反应向着促进组织修复及愈合的良性方向发展，最终促进材料与机体的有机整合及骨缺损的修复，而无法调控巨噬细胞向M1型极化，也无法用于肿瘤术后免疫微环境的调控和术后患者的康复。
文献“Graphene-modified CePO4 nanorods effectively treat breastcancer-induced bone metastases and regulate macrophage polarization toimprove osteo-inductive ability，Ge et al.JNanobiotechnol(2021)19:11”公开了一种石墨烯修饰的CePO4纳米棒，其制备的多功能CePO4/CS/GO支架具有调控巨噬细胞极化促进血管形成和诱导骨形成等特点，但该支架是用于促进巨噬细胞向M2型极化。目前尚无使用支架能够实现调控巨噬细胞向M1型极化的报道，虽然相应的抑制剂药物如GW2580具有一定的调控效果，但其全身给药方式无法用于肿瘤术后免疫微环境的精准调控和促进术后患者的康复。
因此，通过调控局部巨噬细胞向M1型极化，将有望达到抑制肿瘤发展并促进骨缺损修复。而设计一种可以功能性调控肿瘤微环境中的巨噬细胞向M1型极化，并能功能性缓释CSF-1R抑制剂的支架，很好解决CSF-1R抑制剂口服给药存在的滞留时间短、药物富集差和易耐药等问题，以及为骨肿瘤治疗提供新方案，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于：一方面解决现有的支架材料无法实现对肿瘤术后微环境中的巨噬细胞进行很好调控，促进其向M1型极化的问题；另一方面解决现有的CSF-1R抑制剂存在滞留时间短、药物富集差、易耐药的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了以下一系列技术方案进行解决：
第一方面，本发明提供了一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架，其中，该支架包括磷酸钙支架、在磷酸钙支架上包裹的羟丁基壳聚糖/氧化硫酸软骨素水凝胶，以及CSF-1R抑制剂。
优选的，本发明中所述的CSF-1R抑制剂为GW2580、PLX3397或BLZ945中的一种，优选为GW2580。
优选的，本发明所述的支架为3D打印支架。
特别说明的是，本发明中所述调控巨噬细胞免疫微环境是指通过本发明所述支架的调控实现抑制巨噬细胞向M2型极化并诱导其向M1型极化。
本发明通过静电相互作用将CSF-1R抑制剂装载到原位交联羟基丁基壳聚糖(HBC)/氧化硫酸软骨素(OCS)水凝胶层覆盖的3D打印自固定磷酸钙支架上，构建了一种可调节肿瘤微环境中局部巨噬细胞行为的定制型组织修复支架。本发明人意外地发现，如实施例所示，将磷酸钙支架与羟基丁基壳聚糖/氧化硫酸软骨素水凝胶的组合，表现出可调控巨噬细胞免疫微环境的功能，支架本身即能够较好实现诱导肿瘤微环境中的巨噬细胞向M1型极化并抑制其向M2型极化的功能，而现有的支架材料很难以实现上述功能。
另一方面，通过将磷酸钙/水凝胶支架负载CSF-1R抑制剂后，如实施例所示，发现二者的结合起到了很好的相互促进作用，能够使得抑制剂的使用剂量大大减小，即可达到高效的治疗效果，大大降低了抑制剂的毒副作用，其降幅达到10倍以上。
本发明提供的支架可有效阻断诱导巨噬细胞向TAMs极化的CSF-1R主要通路，实现在低使用剂量下调节免疫抑制微环境并抑制肿瘤发展。同时，本发明的支架还起到了可阶段性调节巨噬细胞免疫微环境的作用，在骨肿瘤术后的早期，能够保护骨修复部分免受微环境中不良生长因子的影响，在治疗后期，可进一步促进肿瘤切除后骨缺损的修复。
本发明中的自固化磷酸钙(CPC)已应用于临床骨修复并表现出良好的骨整合性能，磷酸钙基生物墨水表现出良好的成型性，适合用于骨修复支架的打印构建。发明人意外发现，将CPC与羟基丁基壳聚糖/氧化硫酸软骨素水凝胶组合得到的CPC/水凝胶支架不仅可以提供丰富的磺酸基团稳定装载CSF-1R抑制剂，而且还可以作为遮罩膜保护骨修复部分在治疗早期免受微环境中不良生长因子的影响。体外研究表明，支架逐渐释放的GW2580可有效阻断CSF-1R、AKT和NF-κB通路，从而显著抑制巨噬细胞的M2型极化。在GW2580释放后期，磷酸钙基支架表现出促进骨髓间充质干细胞成骨分化的特性。此外，体内实验表明，支架可在极低药物使用剂量下逐渐释放GW2580，实现有效降低植入后肿瘤部位M2型巨噬细胞比例，抑制肿瘤发展，并增加肿瘤部位M1型巨噬细胞的比例，促进肿瘤术后的康复，且不影响动物的正常行为和生存，大大降低了药物的使用浓度。
第二方面，本发明提供了一种如上所述调控巨噬细胞免疫微环境的支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照已有方法制备磷酸钙支架(CPC支架)；
(2)将羟丁基壳聚糖与氧化硫酸软骨素在支架上进行交联，得到磷酸钙/水凝胶支架；
(3)将CSF-1R抑制剂装载到磷酸钙/水凝胶支架上，得到所述调控巨噬细胞免疫微环境的支架。
进一步的是，步骤(1)中所述磷酸钙支架的制备方法如下：
将自固化磷酸钙粉末与含锂基光引发剂的HAMA水溶液混合，制备出可打印生物墨水，使用3D生物打印机打印支架，通过可见光辐照交联处理，然后在37℃的去离子水中浸泡12-72h进行水化处理，即得磷酸钙支架。
进一步的是，步骤(2)中所述磷酸钙/水凝胶支架的制备方法如下：
将羟丁基壳聚糖配制成溶液滴加于磷酸钙支架上，充分浸润，然后将氧化硫酸软骨素配制成溶液滴到磷酸钙支架上，与羟丁基壳聚糖溶液进行原位交联，得到所得磷酸钙/水凝胶支架。
进一步的是，步骤(3)中将CSF-1R抑制剂溶于二甲基亚砜中，然后滴加到磷酸钙/水凝胶支架上，结合30-720min，将支架烘干后于4℃保存备用。
第三方面，本发明提供了所述的调控巨噬细胞免疫微环境的支架在制备肿瘤术后组织缺损修复的定制式植入体方面的应用，具体的，其是在制备骨肿瘤术后骨缺损修复的定制式植入体方面的应用。
另一方面，本发明所述的调控巨噬细胞免疫微环境的支架在制备巨噬细胞M1极化诱导材料的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明构建了一种能够调节肿瘤微环境中巨噬细胞极化行为的3D打印组织修复支架，可对肿瘤微环境中的巨噬细胞进行阶段性调控，体外实验结果表明，治疗早期释放的抑制剂能有效阻断CSF-1R通路，抑制巨噬细胞向M2型极化，将M2型重编程为M1型，在抑制剂释放后期，支架可有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化；
(2)本发明提供的可植入支架能够大幅度降低抑制剂药物的使用浓度，其用药量降低达到10倍以上；
(3)本发明的支架可显著降低肿瘤中M2型巨噬细胞比例并抑制肿瘤生长，同时显著增加肿瘤中M1型巨噬细胞比例并促进肿瘤后的康复，为肿瘤术后治疗提供了一种新策略。
附图说明
图1为对支架的表征；(a)扫描电子显微镜结果显示CPC支架和CPC/HBC-OCS支架表面形态和孔道结构；(b)EDS结果显示HBC-OCS凝胶在CPC支架上的覆盖效率；(c)CPC/HBC-OCS支架的显微红外光谱分析结果；(d)120小时内CPC支架和CPC/HBC-OCS支架上GW2580的释放曲线(n＝3)。
图2为支架释放成分抑制CSF-1R和下游通路；(a)Westernblot影像和(b)相关统计结果显示支架释放成分对信号通路的抑制作用；(n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.对照组；###P<0.001vs.CPC组；●●●P<0.001vs.CPC/凝胶组，单因素方差分析)。
图3为支架释放成分对巨噬细胞极化的作用；(a)流式细胞检测支架释放成分对M2型巨噬细胞标志物表达(CD206)的作用；(b)RT-PCR检测支架释放成分对M1(IL-1β，iNOs)和M2(CD163，CD206)型巨噬细胞相关基因表达的作用；(n＝3，**P<0.01，***P<0.001vs.MCSF+IL4+IL10组；■■P<0.01，■■■P<0.001vs.CPC/hydrogel+低剂量抑制剂，单因素方差分析)。
图4为GW2580负载支架在释放后期对骨髓间充质干细胞功能的作用；(a)CCK-8检测共培养1，3天后支架对干细胞增殖的作用(n＝3)；(b)共聚焦显微镜观察与CPC支架、CPC/水凝胶支架和CPC/水凝胶/GW2580支架共培养细胞的形态；(c)共培养7天后支架释放体系对干细胞成骨分化作用的碱性磷酸酶染色分析图。
图5为GW2580负载支架在释放后期对骨髓间充质干细胞功能的作用；(a)CCK-8检测共培养1，3天后支架对干细胞增殖的作用(n＝3)；(b)共聚焦显微镜观察与CPC支架、CPC/水凝胶支架和CPC/水凝胶/GW2580支架共培养细胞的形态；(c)共培养7天后支架释放体系对干细胞成骨分化作用的碱性磷酸酶染色分析图。
图6为GW2580负载支架有效调节体内4T1肿瘤微环境中巨噬细胞的极化；流式细胞检测结果显示治疗10天后肿瘤中M1(CD86)和M2(CD206)型巨噬细胞比例；(n＝3，*P<0.05vs.未治疗组；#P<0.05vs.CPC组，单因素方差分析)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
对本发明和实施例中出现的名词作出如下定义：
CPC：自固化磷酸钙；HAMA：甲基丙烯酸酯透明质酸；CPC支架：磷酸钙支架；HBC：羟基丁基壳聚糖；OCS：氧化硫酸软骨素；HBC/OCS：羟基丁基壳聚糖和氧化硫酸软骨素得到的水凝胶；CPC/水凝胶支架：磷酸钙支架上覆盖HBC/OCS水凝胶；CPC/水凝胶/GW2580支架：在CPC/水凝胶支架上负载抑制剂GW2580；MCSF：一种蛋白，为巨噬细胞集落刺激因子。
实施例1
(一)实验方法
(1)CPC支架的制备
将CPC粉末(Rebone，上海，中国)与含0.5％w/v锂基光引发剂的5wt％的HAMA水溶液以一定固液比混合，制备出可打印生物墨水。使用3D生物打印机(Cellink，Gothernburg，瑞典)在室温下打印支架，通过可见光(405nm)辐照交联处理一定时间，然后在37℃的去离子水中浸泡过夜进行水化处理，得到CPC支架，将支架烘干并收集备用。上述材料中的HBC、OCS和HAMA均按常规方法制备(HBC的制备参考Q.Q.Wang et al.,Hydroxybutyl chitosanthermo-sensitive hydrogel:A potential drug delivery system.J.Mater.Sci.,48(2013)5614-5623；OCS的制备参考M.Fan et al.,Covalent and injectable chitosan-chondroitin sulfate hydrogels embedded with chitosan microspheres for drugdelivery and tissue engineering.Mater.Sci.Eng.C,71(2017)67-7471；HAMA的制备参考C.Li et al.，Engineered customizable microvessels for progressivevascularization in large regenerative implants.Adv.Healthc.Mater.,(2021)2101836.)，制备后的产物用蒸馏水透析，冷冻干燥后4℃保存。
(2)CPC/水凝胶支架的制备
配制浓度为1wt％、2wt％、4wt％的HBC溶液，分别滴加于支架上浸润15min，观察支架内大孔连通性并优化HBC溶液的浓度。随后，将40mg/mL的OCS溶液滴到支架上，与HBC溶液进行原位交联，制备得到HBC/OCS水凝胶覆盖的CPC支架，记为CPC/水凝胶支架，将支架在室温下干燥备用。
(3)CPC/水凝胶/GW2580支架的制备
将GW2580溶于一定浓度的二甲基亚砜中，滴加100μL于水凝胶包覆的支架上结合120min，制备得到负载抑制剂的支架，记为CPC/水凝胶/GW2580支架，将所得支架烘干后在4℃保存备用。
(二)支架的表征及检测方法
体外实验用支架打印成长方体形状(边长＝10mm，高度＝2mm)，体内实验用支架打印成圆盘状(直径＝8mm，高度＝2mm)。使用扫描电镜(SEM，TESCAN Inc Warrendale，PA，美国)验证原位交联水凝胶对CPC支架的包覆效果，使用显微镜成像红外光谱仪(Thermofisher，Waltham，MA，美国)和能量色散光谱仪(EDS，TESCAN Inc.)观察HBC/OCS水凝胶在CPC支架上的包裹情况。体外实验中，大部分情况下每个打印支架滴入10μM GW2580溶液制备负载抑制剂的支架，只有在巨噬细胞极化实验中，分别制备负载10μM和100μM的GW2580溶液的打印支架，作为低剂量组和高剂量组。
(1)GW2580自支架上的释放情况
采用上述方法分别制备CPC支架、CPC/水凝胶支架、CPC/水凝胶/GW2580支架，并制备负载相同剂量GW2580的CPC支架作为对照组。将每个支架置于含2mL磷酸盐缓冲液(PBS)的12孔板中，37℃孵育，在设定的时间点提取上清液，用紫外分光光度计(Eppendorf，德国)测定浓度进行GW2580释放率分析，每次取液后加入等量的新鲜PBS进行后续实验。
(2)浸提液的制备
CPC支架、CPC/水凝胶支架、CPC/水凝胶/GW2580支架浸提液按如下方法制备：
首先，将每个支架逐一放入24孔板中，加入条件培养液1mL，恒温培养24小时后提取上清液保存于4℃待用，用于检测浸提液对通路抑制作用的条件培养基为含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的标准培养基(α-MEM)。
用含有30ng/mL MCSF(PeproTech，美国)的标准培养液作为条件培养液，检测浸提液对小鼠骨髓源性单核细胞(BMMs)增殖的影响。含30ng/mL MCSF和100ng/mL核因子-κB配体受体激活剂(RANKL，PeproTech，美国)的破骨细胞诱导液作为条件培养基，考察浸提液对破骨细胞分化的影响。以含20ng/mL IL-10、IL-4和MCSF(Peprotech，美国)的极化诱导培养液为条件培养基，检测浸提液对BMMs向M2型极化的影响。以成骨分化诱导培养液(CyagenBiosciences，中国)为条件培养基，检测浸提液对间充质干细胞成骨分化的影响。
(3)支架浸提液的离子浓度
采用α-MEM制备CPC、CPC/水凝胶和CPC/水凝胶/GW2580支架的浸提液，以新鲜α-MEM为空白对照。用电感耦合等离子体发射光谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)检测液体中磷和硫元素的浓度。
(4)Westernblot检测通路的抑制
首先，将RAW264.7细胞以8×105个/孔的密度接种于6孔板并用支架浸提液孵育4小时。接下来，先后用标准培养基培养24小时，用10ng/mL MCSF刺激2小时并提取蛋白质。采用Western blot法检测样品中Phospho CSF1R、CSF1R、Phospho-AKT、总AKT、Phospho-NF-κB、总NF-κB、Phospho-ERK、总ERK、actin抗体(Sangon Biotech，中国)的含量，使用Image J软件(美国国家卫生研究所)对结果进行量化分析。
(5)抑制BMMs向M2性极化
实验前1小时制备含20ng/mL MCSF、IL-4、IL-10的巨噬细胞M2型极化诱导培养基。通过将支架与上述的极化诱导培养基孵育，制备支架浸提液。5×104BMMs均匀地接种于24孔板的每孔中，分别与支架浸提液共孵育。培养24小时后，收集细胞进行分析。通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析M1巨噬细胞(IL-1β，诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synase，iNOs)和M2巨噬细胞(CD163和CD206)的特异性标志物表达；对特异性标记物CD206进行染色后，用流式细胞仪进一步检测M2巨噬细胞表型比例。
(6)对骨髓间充质干细胞的作用
分析GW2580释放后期支架对骨髓间充质干细胞增殖、粘附和成骨分化的影响。CPC、CPC/水凝胶和CPC/水凝胶/GW2580支架分别置于24孔培养板中，加入1mL标准培养液孵育。培养液每天更新一次，孵育7天后收集支架进行后续研究。根据文献方法分离小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)(分离方法参照C.Li et al.，Patient-specific scaffolds witha biomimetic gradient environment for articular cartilage-subchondral boneregeneration.ACS Appl Bio Mater，3(2020)4820-4831.)，以1×104个/支架的密度接种在24孔板中每个支架上共培养。培养24和72h后，用CCK-8试剂盒检测观察支架对细胞增殖的影响，将标准培养基中培养的细胞作设置为对照组。
将mBMSCs均匀接种于每个支架(1×104个/支架)共培养3天后，用4％多聚甲醛溶液固定，经罗丹明-鬼笔环肽和DAPI染色后用Zeiss共聚焦激光扫描显微镜检测细胞在支架上的粘附形态。为评估支架对细胞功能的影响，将mBMSCs均匀接种于24孔板(5×104个/孔)与支架浸提液培养。培养7天后，细胞经多聚甲醛溶液固定，用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(Beyotime，中国)染色并在光学显微镜下观察。
(7)在小鼠4T1乳腺癌模型中的抗肿瘤作用
健康雌性BALB/c小鼠18只(4周龄，20g)购自上海吉辉实验动物有限公司，分为3个实验组：(1)未处理组；(2)CPC组；(3)CPC/水凝胶/GW2580组(GW2580浓度：50mg/kg)。将4T1乳腺癌细胞(1×105个)分别皮下注射至每只小鼠腹股沟。当肿瘤平均体积接近100mm3时开始植入支架治疗。用戊巴比妥(1mL/kg)麻醉小鼠，将支架植入肿瘤附近皮下。术后每隔一天测量肿瘤体积和小鼠体重。术后10天处死动物，收集肿瘤和支架进行处理分析。
(8)肿瘤样品的流式细胞学检测
将收集的肿瘤组织处理制备为单细胞悬液。对CD11b+巨噬细胞分离和表型定量后，检测CD86和CD206的表达以确定肿瘤中M1和M2型巨噬细胞的比例。
(三)实验结果
(1)支架的表征结果
通过SEM和EDS分析HBC/OCS水凝胶在支架上的包覆情况。如图1中a部分显示：CPC支架和CPC/水凝胶支架的孔径约为500μm，适合于促进骨组织再生。对打印的CPC支架进行水化处理可使其完全固化并提高机械强度。此外，可见水化后CPC支架表面覆盖着针状羟基磷灰石纳米颗粒(如图1中a部分)。
经浓度和组装过程方法优化，HBC/OCS水凝胶包覆过程对支架的孔连通性和结构没有影响。HBC/OCS水凝胶均匀覆盖支架表面羟基磷灰石并形成一层薄的遮罩层。从EDS图谱结果(如图1中b部分)可以看出，HBC中的氮(N)元素、OCS中的硫(S)元素，以及HBC和OCS中存在的氧(O)在支架中呈现出相似且均匀的大孔结构分布，验证了HBC/OCS水凝胶的良好包覆。
使用显微红外成像光谱仪对支架上HBC和OCS的特征基团进行分析(如图1中c部分)，分别在1,650cm-1和1,715.3cm-1处出现N-H和C＝O的特征峰验证了HBC和OCS的成功组装，以及OCS分子链上还存在自由醛基。
为延长抑制剂的释放时间，设计了GW2580通过静电作用与支架结合。根据显微红外光谱结果，部分抑制剂还可以通过席夫碱反应与OCS原位交联。计算得到的释放曲线(如图1中d部分)显示，与CPC支架相比，GW2580在CPC/水凝胶支架上的释放速度明显减缓，在一周内逐渐从支架上的水凝胶结合层中释放出来。
(2)对信号通路的抑制
MCSF是巨噬细胞增殖分化的关键细胞因子。肿瘤微环境中存在的大量MCSF与M2样TAMs的募集和极化有关，易导致局部免疫抑制、肿瘤生长和转移，高水平MCSF与骨肿瘤预后不良相关。因此，首先研究了GW2580释放对CSF-1R信号通路抑制的影响。
巨噬细胞分别与CPC支架、CPC/水凝胶支架、CPC/水凝胶/GW2580支架浸提液培养4小时后，换为标准培养液正常培养24小时，再用含MCSF的培养基刺激2小时，然后进行Westernblot检测。从图2可以看出，在含有释放GW2580的培养液中孵育后，细胞的CSF-1R的磷酸化得到了有效的抑制(P<0.001)。此外，释放的GW2580也显著抑制了AKT和NF-κB信号通路的磷酸化。而众所周知，NF-κB和AKT信号通路的激活在恶性肿瘤的进展中至关重要。
(3)对巨噬细胞的调控
上述制备了含有MCSF、IL-10、IL-4的支架浸提液来分析负载GW2580的支架对巨噬细胞M2型极化的抑制作用。根据流式细胞学检测结果(如图3中a部分)，对照组巨噬细胞经生长因子诱导培养后有效极化为M2型，而CPC/水凝胶/GW2580组CD206 M2巨噬细胞比例明显低于其他各组。
RT-PCR检测结果与流式细胞学检测结果一致(如图3中b部分)。CPC/水凝胶/GW2580组中M2型巨噬细胞基因表达(CD206和CD163)较对照组低，M1型巨噬细胞基因表达(IL-1β和iNOS)较对照组高(P<0.001)，验证了其对巨噬细胞极化的调控作用。此外，结果表明调控作用与GW2580负载剂量密切相关。与低剂量组相比，GW2580高剂量组中M2型巨噬细胞基因表达较低，M1型巨噬细胞基因表达较高。由此可见，装载CSF-1R抑制剂的支架能够以GW2580浓度依赖的方式抑制巨噬细胞向M2型极化。
从图3可以看出，CPC/水凝胶组对巨噬细胞向M2型极化也有一定的抑制作用，这一抑制作用可能由于释放的OCS与MCSF、IL-4竞争性结合，从而干扰了其与巨噬细胞表面受体的结合。同时CPC/水凝胶/GW3580组对巨噬细胞向M2型极化的效果最佳，二者组合后能够显著降低抑制剂GW3580的用量，后续实验结果显示，GW3580的用药浓度可从100μM降低至10μM，降幅达10倍以上。
(4)对骨髓间充质干细胞功能的作用
通过钙磷成分的释放，磷酸钙支架具有促进骨再生的作用，因此检测了GW2580释放后期支架对骨髓间充质干细胞增殖，黏附和成骨分化的影响。从图4中a部分可以看出，分别与CPC支架、CPC/水凝胶支架和CPC/水凝胶/GW2580支架培养24和72小时后，mBMSCs的增殖情况相似，对照组与支架组间无显著差异。在共聚焦显微镜下观察mBMSCs在支架上培养72小时后的黏附情况可以看到(如图4中b部分)，mBMSCs在HBC/OCS水凝胶覆盖支架上比在CPC支架上伸展得更好，这一现象可能是由于水凝胶中HBC的游离氨基通过与细胞膜的电荷亲和力促进细胞在支架上的扩散。此外，CPC/水凝胶组和CPC/水凝胶/GW2580组之间没有显著差异。
随后，使用ALP试剂盒检测支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响(如图4中c部分)。结果表明，各支架组诱导的ALP阳性区域均比对照组大，CPC组、CPC/水凝胶组和CPC/水凝胶/GW2580组之间没有显著差异。
以上结果表明，负载抑制剂的支架在GW2580释放后期并没有影响干细胞的功能，具有促成骨潜能。
(5)体内免疫调节和抗肿瘤作用
在体内功能验证方面，本实验构建了免疫调节策略评估常用的4T1乳腺肿瘤体内模型来分析免疫调节支架的治疗效果。荷瘤小鼠随机分为：(1)未处理组；(2)CPC支架组；和(3)CPC/水凝胶/GW2580支架组。当注射4T1细胞5天后，肿瘤体积达到100mm3，将支架植入肿瘤附近开始实验。为了检测支架的抗肿瘤作用，每隔一天检测肿瘤大小和小鼠体重变化。
已知GW2580用于抗肿瘤的有效口服剂量为20-80mg/kg，每天两次。如图5中a部分显示，负载GW2580支架组比CPC支架组更有效地抑制肿瘤生长。CPC支架抗肿瘤效果不明显。可见，通过CPC/水凝胶支架对药物的富集和缓释，大大降低了抑制剂的使用剂量。在小鼠体重变化方面，三组间未观察到显著性差异(如图5中b部分)，表明所研制的支架具有良好的组织相容性。植入10天后，处死动物，切除肿瘤采用流式细胞学检测负载GW2580支架对肿瘤中巨噬细胞表型的调控作用，结果显示，GW2580支架可显著降低M2型巨噬细胞(CD11b，CD206)的比例(P<0.001)，并增加M1型巨噬细胞(CD11b，CD86)比例(如图6)。

Claims (11)

1.一种调控巨噬细胞免疫微环境的支架，其特征在于，所述支架包括磷酸钙支架、在磷酸钙支架上包裹的羟丁基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶，以及CSF-1R抑制剂。
2.根据权利要求1所述的调控巨噬细胞免疫微环境的支架，其特征在于，所述CSF-1R抑制剂为GW2580、PLX3397或BLZ945中的一种。
3.根据权利要求1所述的调控巨噬细胞免疫微环境的支架，其特征在于，所述支架为3D打印支架。
4.根据权利要求1所述的调控巨噬细胞免疫微环境的支架，其特征在于，所述调控巨噬细胞免疫微环境是指抑制巨噬细胞向M2型极化并诱导其向M1型极化。
5.一种如权利要求1-4任一项所述调控巨噬细胞免疫微环境的支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备磷酸钙支架；
（2）将羟丁基壳聚糖与氧化硫酸软骨素在支架上进行交联，得到磷酸钙/水凝胶支架；
（3）将CSF-1R抑制剂装载到磷酸钙/水凝胶支架上，得到所述调控巨噬细胞免疫微环境的支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述磷酸钙支架的制备方法如下：
将自固化磷酸钙粉末与含锂基光引发剂的HAMA水溶液混合，制备出可打印生物墨水，使用3D生物打印机打印支架，通过可见光辐照交联处理，然后在37℃的去离子水中浸泡12-72h进行水化处理，即得磷酸钙支架。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述磷酸钙/水凝胶支架的制备方法如下：
将羟丁基壳聚糖配制成溶液滴加于磷酸钙支架上，充分浸润，然后将氧化硫酸软骨素配制成溶液滴到磷酸钙支架上，与羟丁基壳聚糖溶液进行原位交联，得到所述磷酸钙/水凝胶支架。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中将CSF-1R抑制剂溶于二甲基亚砜中，然后滴加到磷酸钙/水凝胶支架上，结合30-720 min，将支架烘干后于4℃保存备用。
9.如权利要求1-4任一项所述调控巨噬细胞免疫微环境的支架在制备肿瘤术后组织缺损修复的定制式植入体方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，是将该支架用于制备骨肿瘤术后骨缺损修复的定制式植入体。
11.如权利要求1-4任一项所述调控巨噬细胞免疫微环境的支架在制备巨噬细胞M1极化诱导材料的应用。
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