CN114836369A - 一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗i型糖尿病中的应用 - Google Patents

一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗i型糖尿病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗I型糖尿病中的应用，采用本发明所述的方法能够显著提高诱导性多能干细胞向胰岛分化的诱导分化效率，促进体外分泌胰岛素细胞的成熟，显著提高GCG‑/INS+细胞阳性率，为I型糖尿病的细胞治疗提供了有力的支持，具有良好的临床应用前景。

Description

一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗I型糖 尿病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗I型糖尿病中的应用。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征，由各种致病因素引起胰岛素分泌缺乏或胰岛素抵抗继而引发糖代谢紊乱的疾病。目前，糖尿病分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。其中，Ⅰ型糖尿病患者约占糖尿病患者比例的10％，Ⅰ型糖尿病是一种由T淋巴细胞介导的，以选择性破坏胰岛β细胞为特征的器官特异性自身免疫性疾病，I型糖尿病患者自身胰岛素分泌绝对缺乏，需终身依赖胰岛素治疗，随着病情的发展，患者最终进入“脆性糖尿病阶段”。此外， I型糖尿病患者由于胰腺β细胞被破坏而导致胰岛素分泌相对不足，进而使机体多器官长期暴露于高血糖环境，导致严重的心血管、眼、肾及神经***病变。如治疗不当或不及时将会出现严重的并发症，轻者影响患者的生活质量，重者导致患者死亡。
目前，Ⅰ型糖尿病的标准治疗方案是药物治疗，也即采用口服降糖药物、胰岛素注射、以及胰岛素泵等药物治疗的方式，但是需要患者终身保证不间断高质量的胰岛素注射治疗。Ⅰ型糖尿病患者目前仍无法治愈，尽管通过药物治疗的方式能够有效改善糖代谢，提高患者的生存质量，但是终生药物治疗增加了感染、酮症酸中毒、低血糖等急性并发症及视网膜、神经、肾脏、心脑血管疾病、大血管斑块等慢性并发症的风险。所以，长期外源注射胰岛素，只能缓解糖尿病的高血糖症状，并不能从根本上治疗糖尿病、进而取得良好的干预及治疗效果。因此，本领域亟需一种新型有效的可以减少甚至消除急性并发症和慢性并发症的治疗策略用于Ⅰ型糖尿病的治疗中。
近年来，随着胰岛移植及干细胞移植技术的不断发展，为I型糖尿病的治疗提供了新方法。虽然胰岛移植是治疗I型糖尿病的理想方法，但是面临供体来源缺乏、移植后的免疫排斥反应等难题，大多数患者无法进行胰岛移植，因此，该方法在临床上的应用受限。而干细胞移植近年来逐渐被应用在糖尿病的治疗中。但这种治疗方式面临的难题是能够分泌胰岛素(机体内唯一降低血糖的激素)的胰岛β细胞来源不足及在体内血糖调节功能不能长久维持。相关研究表明，通过对干细胞诱导分化、重编程以及转分化技术获得的有功能的胰岛素分泌细胞具有广阔的前景。胚胎干细胞具有无限增殖能力和多向分化潜能等特点，然而目前胚胎干细胞在临床上的应用受到伦理道德限制，这使得诱导性多能干细胞(Inducedpluripotent stem cells，iPSCs)成为能无限提供分泌胰岛素细胞来源的种子细胞且能够避免潜在的医学伦理问题。
最新的研究表明诱导性多能干细胞不仅能够为患者生成特异性的细胞类型，而且为疾病治疗、药物筛选和再生性医学等创新开辟了新的途径。诱导性多能干细胞作为一种具有多向分化潜能的干细胞，在体外通过相关的化学小分子和细胞生长因子的诱导，即可得到相对成熟且有功能的组织或器官。利用干细胞定向分化得到组织和器官的方法同样可以用于糖尿病的治疗中，为供体不足提供了新的解决方案。然而，目前多能干细胞分化为胰腺内分泌细胞主要是通过联合使用信号分子及其相关抑制剂/激动剂来实现的，一般按照6-7个连续分化阶段进行分化，分别是：定型内胚层、原始胚肠管、后前肠、胰腺内胚层、内分泌前体细胞和β样早期细胞，并进一步分化为成熟胰岛β样细胞。但是上述分化方法产生的仍为不成熟的β细胞，GCG-/INS+细胞单阳性率普遍偏低，其表达的激素有限且不稳定、类型多样而胰岛素含量有限，不能用于移植治疗糖尿病患者。
可见，由于胰岛素注射会导致多种并发症，胰岛移植来源受限以及目前开发的胰岛β细胞分化方案不成熟、数量少、GCG-/INS+细胞单阳性率普遍偏低或不具有葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)功能等原因，使得糖尿病细胞治疗受到了很大的限制，因此，如何从诱导性多能干细胞获得大量的、有功能的、成熟的、稳定的胰岛β细胞是I型糖尿病细胞治疗领域面临的主要问题之一。
发明内容
为了解决目前本领域面临的上述问题，本发明的目的在于提供一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗I型糖尿病中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种诱导iPSCs分化为功能性成熟的胰岛β细胞的诱导分化剂。
进一步，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂、第五阶段诱导分化剂、第六阶段诱导分化剂、第七阶段诱导分化剂；
优选地，所述第一阶段诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂A、第一阶段诱导分化剂B；
更优选地，所述第一阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A、CHIR-99021；
更优选地，所述第一阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A；
优选地，所述第二阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7；
优选地，所述第三阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、TPPB；
优选地，所述第四阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、TPPB；
优选地，所述第五阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌；
优选地，所述第六阶段诱导分化剂包括第六阶段诱导分化剂A、第六阶段诱导分化剂B、第六阶段诱导分化剂C、第六阶段诱导分化剂D；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂A包含β细胞素、红海绵素A；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂A还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂B包含β细胞素；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂B还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂C包含β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂C还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂D包含β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂D还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、胰岛素-转铁蛋白-硒；
优选地，所述第七阶段诱导分化剂包括第七阶段诱导分化剂A、第七阶段诱导分化剂B；
更优选地，所述第七阶段诱导分化剂A包含β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂A还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、三碘甲状腺原氨酸(T3)、 ALK5i II、硫酸锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、猪肠粘膜肝素钠、水溶性维生素E、R428；
更优选地，所述第七阶段诱导分化剂B包含谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素钠、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、Necrostatin-1、Pefabloc；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500)ng/mLActivin A、(0.01-10)μM CHIR-99021、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L 碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100ng/mL ActivinA、3μM CHIR-99021、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM 葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
更优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-10)mM 抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
更优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM 抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、 (10-500)nMLDN193189、(50-500)nM TPPB、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、 (0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(1-100)mM谷氨酰胺、(1-100)mg/L 乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄醇、100nM LDN193189、 200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM 谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
更优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM 抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、 (50-500)nMLDN193189、(10-300)nM TPPB、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、 (0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5) mg/L乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、2ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、0.1μM视黄醇、200nM LDN193189、 100nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM 谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
更优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄醇、(10-500)nM LDN193189、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-10)mM谷氨酰胺、 (0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-10)mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT-1、0.05μM视黄醇、100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、 10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM 葡萄糖、1mM谷氨酰胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500)nMLDN193189、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50) μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-5)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(50-300)nM GSi XX、(0.01-5) μM红海绵素A、(10-500)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、(1-50) ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-500)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、 2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L 乙醇胺、100nM GSi XX、1μM红海绵素A、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂A中各成分的浓度分别为：(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(5-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(0.01-2.5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(0.01-50)μM ALK5i II，(1-50)μM硫酸锌、(0.01-5)mM N-乙酰-L-半胱氨酸、(1-50)μg/mL猪肠粘膜肝素钠、(1-50)μM水溶性维生素E、 (1-50)μM R428、(10-100)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、(1-50) ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-100)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂A中各成分的浓度分别为：2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II，10μM硫酸锌、1mM N-乙酰-L-半胱氨酸、10μg/mL猪肠粘膜肝素钠、10μM 水溶性维生素E、2μM R428、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20 ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂B中各成分的浓度分别为：(0.01-10)mM 谷氨酰胺、(0.01-10)mM二水氯化钙、(1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、 (0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(0.01-2)mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)mM烟酰胺、(1-50)μg/mL肝素钠、 (0.01-2.5)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(50-500)μM Necrostatin-1、(0.001-2)μM Pefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂B中各成分的浓度分别为：2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、0.6mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL肝素钠、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin-1、0.1μM Pefabloc。
本发明的第二方面提供了一种诱导iPSCs分化为功能性成熟的胰岛β细胞的诱导分化培养基。
进一步，所述诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基、第二阶段诱导分化培养基、第三阶段诱导分化培养基、第四阶段诱导分化培养基、第五阶段诱导分化培养基、第六阶段诱导分化培养基、第七阶段诱导分化培养基；
优选地，所述第一阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第一阶段诱导分化剂；
优选地，所述第二阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第二阶段诱导分化剂；
优选地，所述第三阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第三阶段诱导分化剂；
优选地，所述第四阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第四阶段诱导分化剂；
优选地，所述第五阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第五阶段诱导分化剂；
优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第六阶段诱导分化剂；
优选地，所述第七阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、50％ Ham’s F-12medium、50％medium 199、本发明第一方面中所述的第七阶段诱导分化剂。
本发明的第三方面提供了一种诱导iPSCs分化为功能性成熟的胰岛β细胞的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)提供iPSCs并在完全培养基中进行单层分化培养；
(2)第一阶段诱导分化，采用第一阶段诱导分化培养基诱导步骤(1)得到的 iPSCs向定型内胚层细胞分化；
(3)第二阶段诱导分化，采用第二阶段诱导分化培养基诱导定型内胚层细胞向原肠管细胞分化；
(4)第三阶段诱导分化，采用第三阶段诱导分化培养基诱导原肠管细胞向后前肠细胞分化；
(5)第四阶段诱导分化，采用第四阶段诱导分化培养基诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化；
(6)第五阶段诱导分化，采用第五阶段诱导分化培养基诱导胰腺祖细胞向胰腺内分泌祖细胞分化；
(7)第六阶段诱导分化，采用第六阶段诱导分化培养基诱导胰腺内分泌祖细胞向胰腺内分泌细胞分化；
(8)第七阶段诱导分化，采用第七阶段诱导分化培养基诱导胰腺内分泌细胞向成熟胰岛细胞分化，得到功能性成熟的胰岛β细胞。
进一步，步骤(1)中所述的完全培养基为E8完全培养基；
优选地，所述E8完全培养基中含有ROCK抑制剂；
更优选地，所述ROCK抑制剂包括Y27632、GSK429286A、RKI-1447、Y-33075dihydrochloride、Thiazovivin、K-115、SLx-2119、Chroman1、SAR407899和/或 SR-3677；
最优选地，所述ROCK抑制剂为Y27632；
最优选地，所述Y27632的浓度为0.001-100μM；
最优选地，所述Y27632的浓度为10μM；
优选地，步骤(1)中所述的iPSCs来源于哺乳动物；
更优选地，步骤(1)中所述的iPSCs来源于人类、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪、猫、兔、狗、狼、马或牛；
最优选地，步骤(1)中所述的iPSCs来源于人类；
最优选地，步骤(1)中所述培养的时间为3天；
最优选地，Day-3至Day-1，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包含基础培养基 MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、激活素、GSK-3 抑制剂；
更优选地，所述激活素包括Activin A、Activin B、Activin AB、Activin AC；
最优选地，所述激活素为Activin A；
更优选地，所述GSK-3抑制剂包括CHIR-99021、CHIR-98014、AZD-2858、SB-216763、AT-7519、TW-S119、KY-19382(A3051)、NP-031112、SB-415286、 AZD-1080、AR-A014418、TDZD-8、LY-2090314；
最优选地，所述GSK-3抑制剂为CHIR-99021；
更优选地，所述第一阶段诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基A 和第一阶段诱导分化培养基B；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A、CHIR-99021；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500) ng/mL Activin A、(0.01-10)μM CHIR-99021、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、 (0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100ng/mLActivin A、3μM CHIR-99021、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM 葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第一阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1天，采用第一阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第2-3天，采用第一阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，Day0-Day2，每天更换新鲜培养基。
进一步，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化培养基包含基础培养基 MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子；
优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、 FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、 FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-10) mM抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L 碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM 抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM 葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第二阶段诱导分化的时间为2天；
最优选地，在诱导第1-2天，采用所述第二阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day3-Day4，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(4)中所述的第三阶段诱导分化培养基包含基础培养基 MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、BMP抑制剂、蛋白激酶C活化物；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、 FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、 FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
最优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
更优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、 LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、 PD161570；
最优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
更优选地，所述蛋白激酶C活化物包括TPPB、PMA；
最优选地，所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
最优选地，所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、(10-500)nMLDN193189、(50-500)nM TPPB、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、 (0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(1-100)mM谷氨酰胺、(1-100)mg/L 乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM 抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄醇、100nM LDN193189、 200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM 谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第三阶段诱导分化的时间为2天；
最优选地，在诱导第1-2天，采用所述第三阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day5-Day6，每天更换新鲜培养基。
进一步，步骤(5)中所述的第四阶段诱导分化培养基包含基础培养基 MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、BMP抑制剂、蛋白激酶C活化物；
优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、 FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、 FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、 LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、 PD161570；
更优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
优选地，所述蛋白激酶C活化物包括TPPB、PMA；
更优选地，所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
最优选地，所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、(50-500)nMLDN193189、(10-300)nM TPPB、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、 (0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5) mg/L乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM 抗坏血酸、2ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、0.1μM视黄醇、200nM LDN193189、 100nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM 谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第四阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1-3天，采用所述第四阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day7-Day9，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(6)中所述的第五阶段诱导分化培养基包含基础培养基 MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白 -硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、BMP抑制剂、甲状腺激素、ALK5抑制剂、硫酸锌；
更优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、 LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、 PD161570；
最优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
更优选地，所述甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)；
最优选地，所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸(T3)；
更优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
最优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
最优选地，所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) μMSANT-1、(0.01-10)μM视黄醇、(10-500)nM LDN193189、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-10)mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT-1、0.05μM视黄醇、100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM 葡萄糖、1mM谷氨酰胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第五阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1-3天，采用所述第五阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day10-Day12，每天更换新鲜培养基。
进一步，步骤(7)中所述的第六阶段诱导分化培养基包含基础培养基 MCDB131、BMP抑制剂、甲状腺激素、ALK5抑制剂、硫酸锌、胎牛血清白蛋白、碳酸氢钠、葡萄糖、谷氨酰胺、乙醇胺、γ-分泌素酶抑制剂、红海绵素A、肝细胞生长因子、5羟色胺、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4；
优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、 LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、 PD161570；
更优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
优选地，所述甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸 (T4)；
更优选地，所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸(T3)；
优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、 SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
更优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
优选地，所述γ-分泌酶抑制剂包括GSi XX、GSi IX、GSi XI、GSi XII、GSi XIII、GSi XIV、GSi XVI、GSi XIX、GSi XVII、GSi XXI、RO4929097、LY450139、 MK-0752、BMS-708163、LY411575、LY3039478；
更优选地，所述γ-分泌酶抑制剂为GSi XX；
优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括第六阶段诱导分化培养基A、第六阶段诱导分化培养基B、第六阶段诱导分化培养基C、第六阶段诱导分化培养基D；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、 LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、β细胞素、红海绵素A；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、 LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、β细胞素；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基C包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、 LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基D包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、胰岛素-转铁蛋白-硒、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500) nMLDN193189、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-5)g/L碳酸氢钠、(1-100) mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(50-300)nM GSi XX、 (0.01-5)μM红海绵素A、(10-500)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、 (1-50)ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-500)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100nMLDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、 2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L 乙醇胺、100nM GSi XX、1μM红海绵素A、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化的时间为14天；
最优选地，在诱导第1天，采用第六阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第2-7天，采用第六阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，在诱导第8-9天，采用第六阶段诱导分化培养基C进行诱导分化；
最优选地，在诱导第10-14天，采用第六阶段诱导分化培养基D进行诱导分化；
最优选地，Day13-Day27，每天半换液；
优选地，步骤(8)中所述的第七阶段诱导分化培养基包含第七阶段诱导分化培养基A和第七阶段诱导分化培养基B；
更优选地，所述第七阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、甲状腺激素、ALK5抑制剂、硫酸锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、猪肠粘膜肝素钠、水溶性维生素E、AXL抑制剂、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)；
最优选地，所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸(T3)；
最优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
最优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
最优选地，所述AXL抑制剂包括R428、BMS-907351、BMS-777607、XL184、 TP-0903、XL092、LDC1267、LY2801653、CEP-40783、RU-301、S49076、ONO-7475、 Ningetinib；
最优选地，所述AXL抑制剂为R428；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基A中各成分的浓度分别为： (0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(5-50)mM葡萄糖、(0.01-5) mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(0.01-2.5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5) μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(0.01-50)μM ALK5i II，(1-50)μM硫酸锌、(0.01-5) mM N-乙酰-L-半胱氨酸、(1-50)μg/mL猪肠粘膜肝素钠、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)μM R428、(10-100)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、 (1-50)ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-100)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基A中各成分的浓度分别为：2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II，10μM硫酸锌、1mM N-乙酰-L-半胱氨酸、10μg/mL猪肠粘膜肝素钠、10μM 水溶性维生素E、2μM R428、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM5羟色胺、20 ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
更优选地，所述第七阶段诱导分化培养基B包含Ham’s F-12medium、 medium 199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素钠、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂；
最优选地，所述坏死性凋亡抑制剂包括Necrostatin-1、Necrostatin-2；
最优选地，所述坏死性凋亡抑制剂为Necrostatin-1；
最优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂包括Pefabloc、Benzamidine、MBTI、 PMSF、LBTI；
最优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为Pefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基B中各成分的浓度分别为：50％ Ham’sF-12medium、50％medium 199、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-10)mM二水氯化钙、(1-50)mMN-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、 (0.01-2)mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)mM烟酰胺、(1-50)μg/mL肝素钠、(0.01-2.5)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(50-500)μM Necrostatin-1、(0.001-2)μMPefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基B中各成分的浓度分别为：50％ Ham’sF-12medium、50％medium 199、2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、 10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、0.6mL/L胰岛素- 转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL 肝素钠、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin-1、0.1μM Pefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化的时间为14天；
最优选地，在诱导第1-8天，采用所述第七阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第9-11天，采用所述第七阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，Day28-Day40，每天半换液。
本发明的第四方面提供了一种iPSCs来源的功能性成熟的胰岛β细胞或细胞群体。
进一步，所述细胞或细胞群体为采用本发明第三方面所述的方法诱导分化得到的；
优选地，所述胰岛β细胞或细胞群体为功能性的、稳定的、成熟的胰岛β细胞或细胞群体；
优选地，所述胰岛β细胞或细胞群体GCG-/INS+细胞单阳性率为95％。
本发明的第五方面提供了一种用于治疗和/或预防糖尿病的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第四方面所述的细胞或细胞群体；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述糖尿病包括Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期糖尿病；
更优选地，所述糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
本发明的第六方面提供了如下任一方面的应用：
(1)β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子和5羟色胺联合在诱导 iPSCs分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(2)本发明第一方面所述的诱导分化剂在制备诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基中的应用；
(3)本发明第一方面所述的诱导分化剂在诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(4)本发明第二方面所述的诱导分化培养基在诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(5)本发明第四方面所述的细胞或细胞群体在制备治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用；
(6)本发明第五方面所述的药物组合物在治疗和/或预防糖尿病中的应用；
优选地，所述糖尿病包括Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期糖尿病；
更优选地，所述糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明提供了一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗I型糖尿病中的应用，所述方法在第13天使用了抑制骨架蛋白小分子红海绵素A，在第 20天使用了β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4，在第22天使用了肝细胞生长因子 HGF、5羟色胺，在第35天，使用了50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1和丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc，所述方法能够显著提高iPSCs的诱导分化效率，促进体外分泌胰岛素细胞的成熟，并且能够显著提高GCG-/INS+细胞单阳性率，通过该方法能够获得大量的、有功能的、成熟的、稳定的胰岛β细胞。
附图说明
图1为细胞铺种面积筛选和Matrigel胶浓度筛选结果图，其中，A图：采用12 孔板、6孔板、10cm培养皿分别铺种得到的结果图，B图：Matrigel胶浓度筛选结果图，C图：Matrigel胶浓度筛选结果统计图；
图2为第一阶段定型内胚层诱导的检测结果图，其中，A图：qPCR检测阴性对照组(iPSC，iPS)、Activin A组(Act-A)和GDF-8组(GDF-8)的内胚层标记物SOX17、FOXA2和CRCX4mRNA表达水平的结果统计图，B图：免疫荧光检测Activin A组(Act-A)和GDF-8组(GDF-8)的内胚层标记物FOXA2阳性率的结果图；
图3为第二阶段原肠管阶段诱导的检测结果图，其中，A图：免疫荧光检测原肠管标记物HNF1β、FOXA2阳性率的结果图，B图：qPCR检测原肠管标记物HNF1β、 FOXA2阳性率的结果统计图；
图4为第三阶段后前肠阶段诱导的检测结果图，其中，A图：免疫荧光检测后前肠阶段标记物PDX-1、SOX9阳性率的结果图，B图：qPCR检测后前肠阶段标记物PDX-1、SOX9阳性率的结果统计图；
图5为第四阶段胰腺祖细胞阶段诱导的检测结果图，其中，A图：免疫荧光检测后前肠阶段标记物PDX-1、SOX9阳性率的结果图，B图：qPCR检测后前肠阶段标记物PDX-1、SOX9阳性率的结果统计图；
图6为第五阶段胰腺内分泌祖细胞阶段诱导的检测结果图，其中，通过qPCR对对照组(iPSC，iPS)和第五阶段诱导组(Islet)中胰腺内分泌祖细胞标记物NKX6.1、 NGN3、PDX-1mRNA的表达水平进行检测；
图7为第六阶段胰腺内分泌细胞阶段诱导和第七阶段成熟胰岛细胞阶段诱导的检测结果图，A图：qPCR检测A组、B组、对照组(iPSC，iPS)中胰岛细胞标记物INS、GCG、NKX6.1mRNA表达水平的结果统计图，B图：免疫荧光检测A组和B组中胰岛细胞标记物INS、GCG、NKX6.1、MAFA阳性率的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1iPSCs诱导分化为胰岛的方法
1、实验试剂和实验材料
本发明实施例中涉及到的实验试剂、实验材料分别见表1和表2。
表1实验试剂
Figure BDA0003654923610000211
Figure BDA0003654923610000221
表2实验材料
实验材料 厂家 货号
T25培养瓶 nunc 156367
T75培养瓶 nunc 156499
12孔细胞培养板 nunc 150628
0.22μm细胞滤器 pall 4612
过滤装置-500mL容量12个/箱；孔径0.2μm Thermo 5660020
AggreWell<sup>TM</sup>400 6-well 5plates stemcell 34425
1250μL袋装枪头；带刻度无色(QSP) Thermo 112NXL-Q
200μL袋装枪头(QSP)1000个/袋 Thermo T090-Q
袋装枪头10μL(QSP)1000个/袋 Thermo 104-Q
SPL10mL移液管100个/包；4包/箱 SPL SPL91010
移液管5mL 100个/包；2包/箱 QSP 170355N
15mL离心管(QSP)50个/包；500个/箱 QSP 339650
50mL离心管(QSP)25个/包；500个/箱 QSP 339652
移液管25mL 50个/包；4包/箱 QSP 170357N
AggreWell<sup>TM</sup>400 12-well 5plates stemcell 34415
2、iPSCs复苏
本发明所述的诱导性多能干细胞(iPSCs)来源于北京于呈诺医学科技有限公司，采用本公司在先申请的专利201910110768.7中所述的iPSCs制备方法制备得到。
(1)根据复苏所需的培养基量，配制含ROCKi的E8完全培养基，每毫升培养基加1μLROCKi储存液，预热。
(2)准备10-15mL的E8完全培养基，37℃预热。
(3)从液氮罐中取出1支冻存管，立即投入38-39℃热水桶，不断来回摇晃 60-90s，使冻结的细胞悬液彻底融化。
(4)冻存管中的细胞一旦彻底融化(液态)，立即将其从热水桶中取出，用 75％的酒精彻底消毒冻存管表面，放入超净工作台内。冻存管即将融化时，将含有已预热至37℃E8培养基的离心管经酒精消毒后，放置于超净工作台内。
(5)严格无菌操作条件下将冻存管中的细胞悬液取出，注入预热的E8培养基于15mL离心管内，轻轻吹打2-3次，200g×5min离心，离心结束后弃上清。
(6)加入含ROCKi的培养基，轻轻吹打2-3次，从孵箱中取出Matrigel包被的孔板/培养瓶。吸弃包被液，将细胞悬液沿未包被面轻轻加入(勿直接加入包被层上)。将培养皿放置于孵箱中培养。
注意：复苏时根据细胞数量选择接种的容器，一般50-80万细胞接种于6孔板中，80-100万细胞接种于T25瓶内。100万-200万细胞接种于T75瓶。
3、iPSCs传代
(1)配制0.5mM EDTA工作液：吸取5mL DPBS至新的15mL离心管中，再加入5μL 0.5MEDTA原液，混匀后即为0.5mM EDTA工作液。该消化液现用现配。
(2)根据传代所需的培养基量，配制含ROCKi的E8完全培养基，每毫升培养基加1μLROCKi储存液。
(3)从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶，吸弃上清，用DPBS洗两遍(每次 DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1min(洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30-45sec再行吸出)。
(4)加EDTA工作液后，T75瓶加约6mL EDTA工作液，置于培养箱孵育5 min，期间可镜下观察，当集落所有细胞都开始变圆且无较大团块脱落时，轻轻吸去EDTA，勿扰动细胞。
(5)加入E8完全培养基终止消化，终止时，培养基快速滴加为宜，使iPSCs 以团块的形式脱落。切忌将细胞反复吹打，以免将细胞吹散为单个细胞，尽量保持细胞为细胞团块。
(6)配平后离心，200g，5min，离心结束后吸弃上清，轻震离心管底部，加入5mL含ROCKi的E8完全培养基重悬，用巴氏滴管轻柔地吹打细胞沉淀(吹打不超过3次)，将细胞悬液接种于包被有Matrigel的T25瓶中，将培养瓶置于 37℃、5％CO2培养箱内静置培养。
(7)培养24h后，用新鲜的E8完全培养基进行全换液。
(8)此后，每日均进行全换液操作，待细胞汇合度约70％-80％时，进行传代。
(9)iPSCs细胞接种数量约8000个/cm2，根据不同的iPSCs系，可调整传代密度，使iPSCs细胞间隔传代时间为5-7天即可。
4、制备60x Matrigel-coated细胞培养板
(1)提前将12孔板及25mL DMEM\F12培养基放入-20℃预冷约20min。
(2)在冰盒中，借助止血钳打开装有Matrigel的1.5mL EP管。注意无菌操作，不要用手接触，防止复温。
(3)吸取400μL预冷的包被液加入装有Matrigel的EP管中，反复吹打后，将上清吸回预冷离心管中。此过程需重复多次，尽量使Matrigel快速溶解，勿复温。
(4)取出预冷的待包被物，置于冰盒上。用电动移液器将包被液混匀后，用合适的量器按照以下体积进行包被：12孔板：每孔1mL。
(5)将包被后的培养瓶/板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
5、细胞铺种面积筛选
通过图1显示，细胞突起部分阳性细胞率越高，通过筛选不同培养面积，包括：12孔板、6孔板、10cm培养皿，分别铺种，结果显示，培养面积越大，细胞越不容易成团，12孔板起团效果最好(见图1A)。
6、Matrigel胶浓度筛选
12孔板、Matrigel浓度0.05-0.1mg/mL(A组)，12孔板、Matrigel浓度0.1-0.2 mg/mL(B组)，在初始铺板过程中分别采用不同胶浓度A组及B组，诱导到最后观察胰岛产量，结果显示Matrigel浓度为0.1-0.2mg/mL时，诱导产量最高 (见图1B和图1C)，至此，本发明形成了一套最优的初始诱导方式，也即使用 12孔板诱导加0.1-0.2mg/mL Matrigel。
7、iPSC单层分化建立(Day-3至Day-1)
该阶段由2mL E8完全培养基、10μM Y27632组成。从37℃、5％CO2细胞培养箱中取出铺有Matrigel-coated的12孔板，移去液体，每孔加入2mL E8 Medium+10μM Y27632；
扩增时间为3天，在扩增第1天，培养基中Y27632的浓度为10μM；在诱导第2-3天，培养基只更换E8完全培养基；每天更换新鲜培养基。
8、第一阶段：定型内胚层的诱导(Day0-2)
第一阶段为iPSC向定型内胚层细胞分化，第一阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、Activin A和CHIR-99021组成。
在该培养基中，Activin A的浓度为100ng/mL，CHIR-99021的浓度为3μM，胎牛血清白蛋白的浓度为0.5％，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，葡萄糖的最终浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为1mM。
第一阶段诱导的时间为3天，在诱导第1天，培养基中Activin A的浓度为100ng/mL；CHIR-99021的浓度为3μM；在诱导第2-3天，培养基中Activin A 的浓度为100ng/mL；即：诱导第1天使用第一阶段诱导分化培养基A，所述第一阶段诱导分化培养基A由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺 (GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、Activin A和CHIR-99021 组成；诱导第2-3天，使用第一阶段诱导分化培养基B，所述第一阶段诱导分化培养基B由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)和Activin A。每天更换新鲜培养基。
在本阶段中，使用GDF-8组定义为B组，Activin A(Act-A)定义为A组， qPCR检测诱导后获得的内胚层细胞标记物OX17、FOXA2的阳性率。
9、第二阶段：原肠管阶段的诱导(Day3-4)
第二阶段为定型内胚层细胞向原肠管细胞分化，第二阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA (胎牛血清白蛋白)、抗坏血酸和FGF-7组成。
在该培养基中，抗坏血酸的浓度为0.25mM，FGF-7的浓度为50ng/mL，胎牛血清白蛋白的浓度为0.5％，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，葡萄糖的最终浓度为 10mM，谷氨酰胺的浓度为1mM。
第二阶段诱导的时间为2天，在诱导第1-2天中，每天更换新鲜培养基。
10、第三阶段：后前肠阶段的诱导(Day5-6)
第三阶段为原肠管细胞向后前肠细胞分化，第三阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、抗坏血酸、FGF-7、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189和TPPB组成。
在该培养基中，抗坏血酸的浓度为0.25mM，FGF-7的浓度为50ng/mL， SANT-1的浓度为0.25μM，视黄醇的浓度为1μM，LDN193189的浓度为100nM， TPPB的浓度为200nM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，碳酸氢钠的浓度为2.5g/L，葡萄糖的最终浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为1mM，乙醇胺的浓度为1mg/L，胰岛素-转铁蛋白-硒的浓度为0.5％。
第三阶段诱导的时间为2天，在诱导第1-2天中，每天更换新鲜培养基。
11、第四阶段：胰腺祖细胞阶段的诱导(Day7-9)
第四阶段为后前肠细胞向胰腺祖细胞分化，第四阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、抗坏血酸、FGF-7、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、TPPB组成。
在该培养基中，抗坏血酸的浓度为0.25mM，FGF-7的浓度为2ng/mL， SANT-1的浓度为0.25μM，视黄醇的浓度为0.1μM，LDN193189的浓度为200nM， TPPB的浓度为100nM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，碳酸氢钠的浓度为2.5g/L，葡萄糖的最终浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为1mM，乙醇胺的浓度为1mg/L，胰岛素-转铁蛋白-硒的浓度为0.5％。
第四阶段诱导的时间为3天，在诱导第1-3天中，每天更换新鲜培养基。
12、第五阶段：胰腺内分泌祖细胞阶段的诱导(Day10-12)
第五阶段为胰腺祖细胞向胰腺内分泌祖细胞分化，第五阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂 BSA(胎牛血清白蛋白)、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、 LDN193189、甲状腺激素(T3)、ALK5i II、硫酸锌组成。
在该培养基中，SANT-1的浓度为0.25μM，视黄醇的浓度为0.05μM， LDN193189的浓度为100nM，甲状腺激素(T3)的浓度为1μM，ALK5i II的浓度为10μM，硫酸锌的浓度为10μM，胎牛血清白蛋白浓度为2％，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，葡萄糖的最终浓度为20mM，谷氨酰胺的浓度为1mM，胰岛素-转铁蛋白-硒的浓度为0.5％，乙醇胺的浓度为1mg/L。
第五阶段诱导的时间为3天，在诱导第1-3天中，每天更换新鲜培养基。
13、第六阶段：胰腺内分泌细胞阶段的诱导(Day13-27)
第六阶段为胰腺内分泌祖细胞向胰腺内分泌细胞分化，本阶段诱导的时间为 14天，诱导第1天的准备工作如下：
(1)24孔板400μM微孔板加入抗低吸附液体500μL。配平1300g离心5min；移除气泡，若微孔还有气泡就再离心，弃液；
(2)使用基底培养基或DPBS冲洗每个孔，24孔板2mL，使用时弃液；
(3)配置TD消化液Tryple：DPBS(TD)＝1：1；
(4)使用DPBS将细胞洗一遍，使用TD消化液消化5min，1孔500μL消化液，先消化1孔，使用M3主培进行终止，后计数，估算出细胞总量，24孔板400μM微孔板每个微孔1500-2000个细胞左右；
(5)将12孔板的所有细胞消化完毕后，快速使用吸液泵吸弃消化液，使用枪头吸取主培一孔一孔终止，收集到50mL离心管后，离心5min，后使用完全培养基重悬铺种至抗吸附包被的微孔板中，每孔1mL，放入培养箱沉降20min， 300g，5min，离心完毕后，放入培养箱，1-14天每天半换液。
本阶段A组第1-14天的第六阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、甲状腺激素(T3)、ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌素酶抑制剂组成；
本阶段B组第1天的第六阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、甲状腺激素(T3)、ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌素酶抑制剂、β细胞素、红海绵素A组成；
B组第2-7天的第六阶段诱导分化培养基同第1天，不包含红海绵素A；
B组第8-9天的第六阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、胰岛素- 转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、甲状腺激素(T3)、ALK5i II、硫酸锌、γ- 分泌素酶抑制剂、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4组成；
B组第10-14天的第六阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、乙醇胺、LDN193189、甲状腺激素(T3)、ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌素酶抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺组成。
在该培养基中，LDN193189的浓度为100nM，甲状腺激素(T3)的浓度为 1μM，ALK5iII的浓度为10μM，硫酸锌的浓度为10μM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，葡萄糖的最终浓度为20mM，谷氨酰胺的浓度为1mM，乙醇胺的浓度为1mg/L，γ-分泌素酶抑制剂的浓度为100nM，红海绵素A的浓度为1μM，肝细胞生长因子的浓度为50ng/mL，5羟色胺的浓度为10μM，β细胞素的浓度为20ng/mL，毛喉素的浓度为10μM，艾塞那肽4的浓度为50ng/mL。
14、第七阶段：成熟胰岛细胞阶段的诱导(Day28-40)
第七阶段为胰腺内分泌细胞向成熟胰岛细胞分化
本阶段A组第1-11天的第七阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、甲状腺激素、ALK5i II、硫酸锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、猪肠粘膜肝素钠、水溶性维生素E、AXL抑制剂R428组成，每天半换液。
本阶段B组第1-8天的第七阶段诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、甲状腺激素、ALK5i II、硫酸锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、猪肠粘膜肝素钠、水溶性维生素E、AXL抑制剂R428、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺组成，每天半换液。
在该培养基中，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，葡萄糖的最终浓度为20mM，谷氨酰胺的浓度为1mM，乙醇胺的浓度为1mg/L，胰岛素-转铁蛋白-硒的浓度为0.5％，甲状腺激素的浓度为1μM，ALK5i II的浓度为10μM，硫酸锌的浓度为10μM，N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为1mM，猪肠粘膜肝素钠的浓度为10μg/mL、水溶性维生素E的浓度为10μM、AXL抑制剂 R428的浓度为2μM，肝细胞生长因子的浓度为50ng/mL，5羟色胺的浓度为10 μM，β细胞素的浓度为20ng/mL，毛喉素的浓度为10μM，艾塞那肽4的浓度为50ng/mL。
本阶段B组第9-11天的第七阶段诱导分化培养基由50％Ham’s F-12medium、 50％medium 199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1、丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc组成，每天半换液。
在该培养基中，谷氨酰胺的浓度为2mM，二水氯化钙的浓度为2.5mM， N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸的浓度为10mM，脱脂BSA(胎牛血清白蛋白) (BSA)的浓度为2％，胰岛素-转铁蛋白-硒的浓度为0.6mL/L，乙醇胺的浓度为1 mg/L，水溶性维生素E的浓度为10μM，烟酰胺的浓度为10mM，肝素钠的浓度为10μg/mL，脱氧核糖核酸酶Ⅰ的浓度为1U/mL，坏死性凋亡抑制剂 Necrostatin-1的浓度为100μM，丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc的浓度为0.1μM。
实施例2qPCR检测各诱导分化阶段标志基因mRNA的表达情况、免疫荧光检测各诱导分化阶段的细胞阳性率情况
1、实验方法
1.1RNA提取
(1)上述收集的胰岛细胞样品补加500μL Trizol溶液，室温裂解5min，加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀15s，在室温下孵育3分钟；
(2)于4℃，12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
(3)加入1倍体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇！)，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中10,000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；
(4)加500μL去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液；
(5)加入700μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm 离心60秒，弃掉废液；
(6)加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；
(7)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(8)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50μL RNase free wate(事先在65-70℃孵育)；
(9)室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟，或者另外再加30μL RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液；
(10)洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积最好不少于50μL，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。
1.2反转录
(1)根据总RNA浓度进行计算，按1μg浓度进行反转；
(2)按照如下表3中所述的反应体系将试剂与总RNA进行预混；
表3反应体系
组分 体积
Total RNA 1μg
Oligo dT 1μL
2XTS Reaction Mix 10μL
RI/RT Enzyme Mix 1μL
gDNA Remover 1μL
RNase-free Water Variable
Total volume 20μL
(3)将预混液转移至PCR仪中，使用cDNA模板进行反应(42℃孵育30min， 85℃孵育5s)；
(4)迅速将反转完成的cDNA转移置冰上1min进行降温；
(5)-20℃保存，使用前可按所需浓度进行稀释。(注意：放入PCR仪之前检查离心管是否盖好以免高温蒸发；从PCR仪中拿出之后检查高温是否将离心管盖崩开。
1.3qPCR实验方法
1.3.1引物测试
(1)根据DNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。
(2)得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。qPCR检测基因的引物序列具体信息见表4。
表4 qPCR检测基因的引物序列信息
Figure BDA0003654923610000321
1.3.2样品排放
(1)一个样品的加样尽可能安排在同一行；
(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板。
1.3.3正式实验
(1)按下表5中所示的反应体系进行预混；
表5反应体系
组分 体积
Forward Primer(10μM) 0.4μL
Reverse Primer(10μM) 0.4μL
2xTransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μL
Nuclease-free Water 7.2μL
cDNA 2μL
Total volume 20μL
(2)将预混后的试剂，加入八连管中，每孔18μL；
(3)迅速在八连管中加入cDNA 2μL，盖上盖子，把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒；
(4)放入Light cycler仪器中按照3步法进行反应，循环数为40；
模板如下表6所示；
表6模板
Figure BDA0003654923610000331
注意事项：cDNA用灭菌纯水1:4稀释，如遇到基因表达低的样品，cDNA 按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。
1.3.4上机
打开qPCR仪电源开关；打开样品架，放入八连管，关上样品架，设置好模板；点击Start键，开始运行程序；程序运行完毕后，取出样品架上的八连管；在软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件；反应完成后，八连管应装到封口袋中保存。
1.4免疫荧光
(1)将鉴定用的各阶段细胞用DPBS清洗三遍，4％PFA室温固定40min，避光，(PFA恢复室温再用)；
(2)DPBS清洗三遍，0.5％TritonX-100(DPBS溶解)，穿孔20min；
(3)5％BSA封闭液+0.1％TritonX-100，4℃过夜封闭；
配制溶液：PBST-1(清洗用)：DPBS+0.1％TritonX-100；PBST-2(溶解一抗、二抗用)：DPBS+0.1％TritonX-100+1％BSA；
孵一抗，一抗:PBST-2＝1:200，4℃过夜；
回收一抗溶液，PBST-1摇床清洗三遍，每次10min；
孵二抗，二抗:PBST-2＝1:500，4℃过夜，避光。(赶时间也可以室温1h，摇床)从加荧光二抗起，后面所有操作步骤避光处理；
PBST-1摇床清洗三遍，每次10min；
DAPI稀释1000×孵育2-3min，避光。DPBS清洗1～2遍；
直接拍照观察。
2、实验结果
(1)第一阶段检测结果见图2A和图2B。结果显示，经过诱导分化的iPSC 细胞形态发生改变，该阶段细胞密度持续增大，同时也伴随细胞死亡，相比于未分化的干细胞，此时内胚层细胞的核质比显著降低，并且细胞之间接触之处存在明显界限；
iPSC经诱导后，用SOX17、FOXA2作为内胚层的标记物，内胚层的阳性率要高于50％，本发明实施例中，使用GDF-8组定义为B组，Activin A定义为A 组，诱导后获得的内胚层细胞经qPCR检测发现，A组表达的SOX17基因是B 组的4.5倍，是阴性对照组iPSC的500倍；A组表达的FOXA2基因是B组的7 倍，是阴性对照组iPSC的110倍；A组表达的CRCX4基因是B组的2倍，是阴性对照组iPSC的3倍。经检测FOXA2/DAPI(免疫荧光)，表达率>50％。表明了采用Activin A、CHIR-99021联合对iPSC进行诱导，诱导的效率更高，所得内胚层细胞的数量更大、SOX17及FOXA2的阳性率更高，显著高于采用GDF-8 的诱导效果。
(2)第二阶段检测结果见图3A和图3B。结果显示，经过诱导分化的iPSC 细胞形态发生改变，该阶段末期开始出现条索状、球状细胞。条索状、球状细胞团阳性细胞表达最高；
本阶段用HNF1β、FOXA2作为原肠管的标记物，原肠管的阳性率要高于60％，诱导后获得的内胚层细胞经qPCR检测发现，HNF1β基因阳性率约为60％， FOXA2基因阳性率约为80％。
(3)第三阶段检测结果见图4A和图4B，结果显示，经过诱导分化的iPSC 细胞形态发生改变，该阶段条索状、球状细胞团持续增多；
本阶段用PDX-1、SOX9作为后前肠阶段的标记物，后前肠阶段的阳性率要高于70％，诱导后获得的后前肠细胞经qPCR检测发现，PDX-1基因阳性率高于 60％，SOX9基因阳性率高于25％。
(4)第四阶段检测结果见图5A和图5B，结果显示，经过诱导分化的细胞形态发生改变，该阶段球状结构继续大量形成，且逐渐变得致密；
本阶段用PDX-1、SOX9作为后前肠阶段的标记物，后前肠阶段的阳性率要高于70％，诱导后获得的后前肠细胞经qPCR检测发现，PDX-1基因阳性率高于 90％，SOX9基因阳性率高于50％。
(5)第五阶段检测结果见图6。结果显示，经过诱导分化的iPSC细胞形态发生改变，细胞继续堆叠生长，球状结构连接成片；
本阶段用NKX6.1、NGN3、PDX-1作为内分泌祖细胞表型，可见经经第五阶段诱导得到的细胞的标志基因NKX6.1 mRNA的表达水平约为iPSC的50倍，标志基因NGN3 mRNA的表达水平约为iPSC的80倍、标志基因PDX-1mRNA 的表达水平约为iPSC的200倍。
(6)第六阶段和第七阶段检测结果见图7A和图7B，结果显示，本阶段用INS、GCG、NKX6.1、MAFA作为胰岛细胞表型，B组的标志基因NKX6.1 mRNA的表达水平约为A组的1.1倍，B组的标志基因GCG mRNA的表达水平约为A组的2倍，B组的标志基因INS mRNA的表达水平约为A组的17倍。免疫荧光结果显示，B组INS单阳性率约为95％，而A组INS和GCG共表达，即B组的 GCG-/INS+细胞单阳性率显著提高。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 呈诺再生医学科技（北京）有限公司
<120> 一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗I型糖尿病中的应用
<141> 2022-05-20
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccctacgcc aacatgaact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgagatgta cgagtagggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgtgtgca agcctgagat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatataccg cggagctggc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggaggggat cagtgaaaat gc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcggtctta aaacgaaggc 20
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacttctgaa cgagagcgag a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgttcttca ccgacttcct c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccaagaagaa gcaggactcg 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcaacagctg cgtgattttc 20
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcaatcgaa tgcacaacct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctatgcgcag cgtttgagtc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaagctcac gcgtggaaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttttccact tcatgcggcg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcacacctg gtggaagctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agctggtaga gggagcagat 20
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggcaacgtt cccttcaaga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaatgtgccc tgtgaatggc 20

Claims (10)

1.一种诱导iPSCs分化为功能性成熟的胰岛β细胞的诱导分化剂，其特征在于，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂、第五阶段诱导分化剂、第六阶段诱导分化剂、第七阶段诱导分化剂；
优选地，所述第一阶段诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂A、第一阶段诱导分化剂B；
更优选地，所述第一阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A、CHIR-99021；
更优选地，所述第一阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A；
优选地，所述第二阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7；
优选地，所述第三阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、TPPB；
优选地，所述第四阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、TPPB；
优选地，所述第五阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5iII、硫酸锌；
优选地，所述第六阶段诱导分化剂包括第六阶段诱导分化剂A、第六阶段诱导分化剂B、第六阶段诱导分化剂C、第六阶段诱导分化剂D；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂A包含β细胞素、红海绵素A；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂A还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂B包含β细胞素；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂B还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂C包含β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂C还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂D包含β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂D还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5iII、硫酸锌、GSi XX、胰岛素-转铁蛋白-硒；
优选地，所述第七阶段诱导分化剂包括第七阶段诱导分化剂A、第七阶段诱导分化剂B；
更优选地，所述第七阶段诱导分化剂A包含β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂A还包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、猪肠粘膜肝素钠、水溶性维生素E、R428；
更优选地，所述第七阶段诱导分化剂B包含谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素钠、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、Necrostatin-1、Pefabloc；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500)ng/mL ActivinA、(0.01-10)μM CHIR-99021、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L 碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100ng/mL Activin A、3μM CHIR-99021、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
更优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-10)mM抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
更优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、(10-500)nM LDN193189、(50-500)nM TPPB、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(1-100)mM谷氨酰胺、(1-100)mg/L乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄醇、100nM LDN193189、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
更优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、(50-500)nM LDN193189、(10-300)nM TPPB、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、2ng/mLFGF-7、0.25μM SANT-1、0.1μM视黄醇、200nM LDN193189、100nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
更优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄醇、(10-500)nM LDN193189、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-10)mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT-1、0.05μM视黄醇、100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500)nM LDN193189、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-5)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(50-300)nM GSi XX、(0.01-5)μM红海绵素A、(10-500)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、(1-50)ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-500)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、100nM GSi XX、1μM红海绵素A、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂A中各成分的浓度分别为：(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(5-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(0.01-2.5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(0.01-50)μM ALK5i II，(1-50)μM硫酸锌、(0.01-5)mM N-乙酰-L-半胱氨酸、(1-50)μg/mL猪肠粘膜肝素钠、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)μM R428、(10-100)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM5羟色胺、(1-50)ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-100)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂A中各成分的浓度分别为：2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II，10μM硫酸锌、1mM N-乙酰-L-半胱氨酸、10μg/mL猪肠粘膜肝素钠、10μM水溶性维生素E、2μM R428、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂B中各成分的浓度分别为：(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-10)mM二水氯化钙、(1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(0.01-2)mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)mM烟酰胺、(1-50)μg/mL肝素钠、(0.01-2.5)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(50-500)μMNecrostatin-1、(0.001-2)μM Pefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂B中各成分的浓度分别为：2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、0.6mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL肝素钠、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin-1、0.1μM Pefabloc。
2.一种诱导iPSCs分化为功能性成熟的胰岛β细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基、第二阶段诱导分化培养基、第三阶段诱导分化培养基、第四阶段诱导分化培养基、第五阶段诱导分化培养基、第六阶段诱导分化培养基、第七阶段诱导分化培养基；
优选地，所述第一阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第一阶段诱导分化剂；
优选地，所述第二阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第二阶段诱导分化剂；
优选地，所述第三阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第三阶段诱导分化剂；
优选地，所述第四阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第四阶段诱导分化剂；
优选地，所述第五阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第五阶段诱导分化剂；
优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第六阶段诱导分化剂；
优选地，所述第七阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、权利要求1中所述的第七阶段诱导分化剂。
3.一种诱导iPSCs分化为功能性成熟的胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提供iPSCs并在完全培养基中进行单层分化培养；
(2)第一阶段诱导分化，采用第一阶段诱导分化培养基诱导步骤(1)得到的iPSCs向定型内胚层细胞分化；
(3)第二阶段诱导分化，采用第二阶段诱导分化培养基诱导定型内胚层细胞向原肠管细胞分化；
(4)第三阶段诱导分化，采用第三阶段诱导分化培养基诱导原肠管细胞向后前肠细胞分化；
(5)第四阶段诱导分化，采用第四阶段诱导分化培养基诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化；
(6)第五阶段诱导分化，采用第五阶段诱导分化培养基诱导胰腺祖细胞向胰腺内分泌祖细胞分化；
(7)第六阶段诱导分化，采用第六阶段诱导分化培养基诱导胰腺内分泌祖细胞向胰腺内分泌细胞分化；
(8)第七阶段诱导分化，采用第七阶段诱导分化培养基诱导胰腺内分泌细胞向成熟胰岛细胞分化，得到功能性成熟的胰岛β细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的完全培养基为E8完全培养基；
优选地，所述E8完全培养基中含有ROCK抑制剂；
更优选地，所述ROCK抑制剂包括Y27632、GSK429286A、RKI-1447、Y-33075dihydrochloride、Thiazovivin、K-115、SLx-2119、Chroman1、SAR407899和/或SR-3677；
最优选地，所述ROCK抑制剂为Y27632；
最优选地，所述Y27632的浓度为0.001-100μM；
最优选地，所述Y27632的浓度为10μM；
优选地，步骤(1)中所述的iPSCs来源于哺乳动物；
更优选地，步骤(1)中所述的iPSCs来源于人类、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪、猫、兔、狗、狼、马或牛；
最优选地，步骤(1)中所述的iPSCs来源于人类；
最优选地，步骤(1)中所述培养的时间为3天；
最优选地，Day-3至Day-1，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、激活素、GSK-3抑制剂；
更优选地，所述激活素包括Activin A、Activin B、Activin AB、Activin AC；
最优选地，所述激活素为Activin A；
更优选地，所述GSK-3抑制剂包括CHIR-99021、CHIR-98014、AZD-2858、SB-216763、AT-7519、TW-S119、KY-19382(A3051)、NP-031112、SB-415286、AZD-1080、AR-A014418、TDZD-8、LY-2090314；
最优选地，所述GSK-3抑制剂为CHIR-99021；
更优选地，所述第一阶段诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基A和第一阶段诱导分化培养基B；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A、CHIR-99021；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、Activin A；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500) ng/mLActivin A、(0.01-10)μM CHIR-99021、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100ng/mL ActivinA、3μM CHIR-99021、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第一阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1天，采用第一阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第2-3天，采用第一阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，Day0-Day2，每天更换新鲜培养基。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子；
优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-10)mM抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.5％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺；
最优选地，所述第二阶段诱导分化的时间为2天；
最优选地，在诱导第1-2天，采用所述第二阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day3-Day4，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(4)中所述的第三阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、BMP抑制剂、蛋白激酶C活化物；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
最优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
更优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
最优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
更优选地，所述蛋白激酶C活化物包括TPPB、PMA；
最优选地，所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
最优选地，所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(10-200)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、(10-500)nMLDN193189、(50-500)nM TPPB、(0.01-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-10)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(1-100)mM谷氨酰胺、(1-100)mg/L乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄醇、100nM LDN193189、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第三阶段诱导分化的时间为2天；
最优选地，在诱导第1-2天，采用所述第三阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day5-Day6，每天更换新鲜培养基。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的第四阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、BMP抑制剂、蛋白激酶C活化物；
优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
更优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
优选地，所述蛋白激酶C活化物包括TPPB、PMA；
更优选地，所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
最优选地，所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-5)μM视黄醇、(50-500)nMLDN193189、(10-300)nM TPPB、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、2ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、0.1μM视黄醇、200nM LDN193189、100nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、10mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒；
最优选地，所述第四阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1-3天，采用所述第四阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day7-Day9，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(6)中所述的第五阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、SANT-1、视黄醇、BMP抑制剂、甲状腺激素、ALK5抑制剂、硫酸锌；
更优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
最优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
更优选地，所述甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)；
最优选地，所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸(T3)；
更优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
最优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
最优选地，所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄醇、(10-500)nM LDN193189、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(1-50)mM葡萄糖、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-10)mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT-1、0.05μM视黄醇、100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺；
最优选地，所述第五阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1-3天，采用所述第五阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，Day10-Day12，每天更换新鲜培养基。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(7)中所述的第六阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、BMP抑制剂、甲状腺激素、ALK5抑制剂、硫酸锌、胎牛血清白蛋白、碳酸氢钠、葡萄糖、谷氨酰胺、乙醇胺、γ-分泌素酶抑制剂、红海绵素A、肝细胞生长因子、5羟色胺、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4；
优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
更优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
优选地，所述甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)；
更优选地，所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸(T3)；
优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
更优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
优选地，所述γ-分泌酶抑制剂包括GSi XX、GSi IX、GSi XI、GSi XII、GSi XIII、GSiXIV、GSi XVI、GSi XIX、GSi XVII、GSi XXI、RO4929097、LY450139、MK-0752、BMS-708163、LY411575、LY3039478；
更优选地，所述γ-分泌酶抑制剂为GSi XX；
优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括第六阶段诱导分化培养基A、第六阶段诱导分化培养基B、第六阶段诱导分化培养基C、第六阶段诱导分化培养基D；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、β细胞素、红海绵素A；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、β细胞素；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基C包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基D包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、乙醇胺、LDN193189、三碘甲状腺原氨酸(T3)、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、胰岛素-转铁蛋白-硒、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500)nMLDN193189、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(1-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.01-5)g/L碳酸氢钠、(1-100)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(50-300)nM GSi XX、(0.01-5)μM红海绵素A、(10-500)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、(1-50)ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-500)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100nM LDN193189、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、100nM GSi XX、1μM红海绵素A、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第六阶段诱导分化的时间为14天；
最优选地，在诱导第1天，采用第六阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第2-7天，采用第六阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，在诱导第8-9天，采用第六阶段诱导分化培养基C进行诱导分化；
更优选地，在诱导第10-14天，采用第六阶段诱导分化培养基D进行诱导分化；
最优选地，Day13-Day27，每天半换液；
优选地，步骤(8)中所述的第七阶段诱导分化培养基包含第七阶段诱导分化培养基A和第七阶段诱导分化培养基B；
更优选地，所述第七阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、甲状腺激素、ALK5抑制剂、硫酸锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、猪肠粘膜肝素钠、水溶性维生素E、AXL抑制剂、β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子、5羟色胺；
最优选地，所述甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)；
最优选地，所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸(T3)；
最优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
最优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
最优选地，所述AXL抑制剂包括R428、BMS-907351、BMS-777607、XL184、TP-0903、XL092、LDC1267、LY2801653、CEP-40783、RU-301、S49076、ONO-7475、Ningetinib；
最优选地，所述AXL抑制剂为R428；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基A中各成分的浓度分别为：(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(5-50)mM葡萄糖、(0.01-5)mM谷氨酰胺、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(0.01-2.5)％胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、(0.01-50)μM ALK5i II，(1-50)μM硫酸锌、(0.01-5)mM N-乙酰-L-半胱氨酸、(1-50)μg/mL猪肠粘膜肝素钠、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)μM R428、(10-100)ng/mL肝细胞生长因子、(1-50)μM 5羟色胺、(1-50)ng/mLβ细胞素、(1-50)μM毛喉素、(10-100)ng/mL艾塞那肽4；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基A中各成分的浓度分别为：2％胎牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、20mM葡萄糖、1mM谷氨酰胺、1mg/L乙醇胺、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM ALK5iII，10μM硫酸锌、1mM N-乙酰-L-半胱氨酸、10μg/mL猪肠粘膜肝素钠、10μM水溶性维生素E、2μM R428、50ng/mL肝细胞生长因子、10μM 5羟色胺、20ng/mLβ细胞素、10μM毛喉素、50ng/mL艾塞那肽4；
更优选地，所述第七阶段诱导分化培养基B包含Ham’s F-12medium、medium199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素钠、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂；
最优选地，所述坏死性凋亡抑制剂包括Necrostatin-1、Necrostatin-2；
最优选地，所述坏死性凋亡抑制剂为Necrostatin-1；
最优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂包括Pefabloc、Benzamidine、MBTI、PMSF、LBTI；
最优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为Pefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基B中各成分的浓度分别为：50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-10)mM二水氯化钙、(1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(0.01-2)mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、(0.01-5)mg/L乙醇胺、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)mM烟酰胺、(1-50)μg/mL肝素钠、(0.01-2.5)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(50-500)μM Necrostatin-1、(0.001-2)μMPefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基B中各成分的浓度分别为：50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、0.6mL/L胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/L乙醇胺、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL肝素钠、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin-1、0.1μMPefabloc；
最优选地，所述第七阶段诱导分化的时间为14天；
最优选地，在诱导第1-8天，采用所述第七阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第9-11天，采用所述第七阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，Day28-Day40，每天半换液。
8.一种iPSCs来源的功能性成熟的胰岛β细胞或细胞群体，其特征在于，所述细胞或细胞群体为采用权利要求3-7中任一项所述的方法诱导分化得到的；
优选地，所述胰岛β细胞或细胞群体为功能性的、稳定的、成熟的胰岛β细胞或细胞群体；
优选地，所述胰岛β细胞或细胞群体GCG-/INS+细胞单阳性率为95％。
9.一种用于治疗和/或预防糖尿病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求8所述的细胞或细胞群体；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述糖尿病包括Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期糖尿病；
更优选地，所述糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)β细胞素、毛喉素、艾塞那肽4、肝细胞生长因子和5羟色胺联合在诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(2)权利要求1所述的诱导分化剂在制备诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基中的应用；
(3)权利要求1所述的诱导分化剂在诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(4)权利要求2所述的诱导分化培养基在诱导iPSCs分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(5)权利要求8所述的细胞或细胞群体在制备治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用；
(6)权利要求9所述的药物组合物在治疗和/或预防糖尿病中的应用；
优选地，所述糖尿病包括Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期糖尿病；
更优选地，所述糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
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