CN114836333A - 一种蓝藻净化剂及其制备与应用 - Google Patents

一种蓝藻净化剂及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蓝藻净化剂及其制备方法，本发明先分别制备蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌的种子液，将两种种子液同时接种至发酵罐中进行液态混菌发酵，发酵培养采用分段控温法，发酵前期、中期和后期使用不同的温度进行发酵，发酵完成后，向所得发酵液中添加椰子油，混合搅拌均匀，得到发酵混合液，浓缩混合液，将菌体干燥，检测，包装，即得到蓝藻净化剂。本发明还公开了使用上述方法获得的蓝藻净化剂以及该蓝藻净化剂在水产养殖水体水质改良中的用途。本发明在发酵中采用分段控温法，有效提高了活菌数，液态发酵结束后添加椰子油，提高了芽孢率，增强了菌株抗逆性，保证了产品质量的稳定性，所得蓝藻净化剂用于养殖水体水质改良有很好的效果。

Description

一种蓝藻净化剂及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种蓝藻净化剂的制备方法，本发明还涉及使用该方法制得的蓝藻净化剂，本发明还进一步涉及了该蓝藻净化剂对“蓝藻水华”的生态改良及在现代农业和水环境治理的用途。
背景技术
水是水产养殖动物赖以生存的环境，其好坏直接影响到水产养殖动物的生长发育和养殖的经济效益。
蓝藻是养殖水体中常见的一类有害藻类，主要包括微囊藻、螺旋藻、鱼腥藻、颤藻等，其中以微囊藻最为典型，危害性最大。
蓝藻极易在富营养化水体中大量繁殖，并在水体表面形成一层粘腻、腥臭的蓝绿色薄膜，严重时可以布满整个养殖水体，蓝藻生长速度快，稳定性差，容易因老化而大量死亡，死亡藻体被细菌分解，消耗水体中大量溶氧，导致鱼类缺氧。另外，大多蓝藻具有藻毒素，其中研究最多的微囊藻毒素可直接造成养殖动物的中毒死亡，并且微囊藻毒素具有致癌性，在肝脏毒性和神经毒性上对人类健康构成了很大的威胁。蓝藻水华不仅破坏养殖生态环境，制约着水产养殖经济效益，也严重危害着人类的健康。
目前，养殖水体对“蓝藻水华”的治理方法主要有物理方法、化学方法和生物方法。物理方法包括人工打捞、絮凝、水动力学控制等，安全性好，但工程量大、不易操作，且蓝藻容易再次爆发，治标不治本。化学方法主要是通过投放化学杀藻剂(硫酸铜、高锰酸钾等)杀死蓝藻细胞，该方法不具有特异性和专一性，在杀灭蓝藻的同时可能危害鱼类或其他水生生物，破坏了养殖生态，且化学药物的投放容易造成水体的二次污染，得不偿失。生物治理“蓝藻”的方法主要包括水生植物控蓝藻、滤食性鳙鱼类吃粒状蓝藻和有益藻类抑制蓝藻等，是一种相对经济、安全的控藻方式。
通过培植水生植物与蓝藻竞争营养物质，投放过量鳙鱼捕食粒状蓝藻等方式来控制蓝藻的生长繁殖等，这些利用大型水生动植物调控有害蓝藻的方式具有生态、环保的优点，但见效缓慢，成本高。相比较而言，微生物控藻技术具有特异性强、成本低、容易操作、对环境影响小，安全高效等优点，是最有前途的一种调控蓝藻的方式。
现阶段，利用微生态制剂控制养殖水体蓝藻的研究并不多，且主要集中在微生物溶藻机理等理论研究上，实际应用报道较少，用于水体蓝藻净化的微生态制剂产品几乎没有。主要是因为自然水体中土著微生物竞争激烈，溶藻细菌很难成为优势种并维持一定数量，且其生长、溶藻活性易受水体环境中理化条件及生物因素影响，实际溶藻效果较差。另外多数溶藻细菌是利用肉膏等有机培养基分离和培养的菌种，实际应用时，一方面菌种培养成本耗费很大，另一方面额外增加了水体的营养负荷。
本发明主要用于开发一种高效可以净化水体蓝藻的微生态制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生产成本较低、产品活菌数和芽孢率高，抗逆性强的净化蓝藻的微生态制剂的制备方法。本发明的另一个目的是公开了使用本发明方法所制得的蓝藻净化剂和该净化剂在蓝藻水体改良中的用途。
为达到所述目的，本发明的技术方案如下：
一种蓝藻净化剂的制备方法，包括如下步骤：
(a)制备蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的种子液；
(b)将上述两个菌种的种子液接入同一液态发酵培养基进行混菌发酵培养，在发酵培养过程中采用分段控温法，发酵前期、中期和后期使用不同的温度进行发酵，在发酵前期发酵温度较高，在发酵中期发酵温度较低，在发酵后期发酵温度调高；
在发酵前期，菌体处于停滞期和对数生长早期，较高的罐温有利于加速菌体的萌发，缩短停滞期时间；在发酵中期，菌体进入对数生长旺盛时期，自身代谢产热严重，容易出现局部温度过高，适当降低控制温度避免过热导致菌体衰老死亡；发酵后期，提升罐温，有利与延长发酵时间，提高生产菌数。
(c)发酵完成后，向步骤(b)所得的发酵液中添加椰子油，混合搅拌均匀，得到发酵混合液，浓缩混合液，将菌体干燥，检测，包装，即得到蓝藻净化剂。
其中，上述步骤(b)中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌液的的接种量相等，均为液态发酵培养基重量的3～8％；所述发酵培养条件为：起始pH为7.0～7.5，转速为150～180r/min，罐压为0.04-0.06MPa，发酵时间为24～28h，在1～6h控温35～39℃，6h～20h控温28～32℃，20h至发酵结束控温33～37℃；所述液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蓝藻粉4～6％、硫酸铵0.2～0.5％、磷酸氢二钾0.1～0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至7.0～7.5。
其中，上述步骤(b)中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的接种量优选均为液体发酵培养基重量的5％；所述发酵培养条件优选为：起始pH值为7.5，转速为180r/min，罐压为0.04～0.06MPa，发酵时间为26h，在1～6h控温37℃，6h～20h控温30℃，20h至发酵结束控温35℃；所述液态发酵培养基各组分含量优选为：按重量百分比记，蓝藻粉5％、硫酸铵0.3％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.5。
其中，上述步骤(c)中发酵完成后向发酵液中添加的椰子油体积为发酵液体积的8～12％，混合搅拌时间为1～2小时。优选的，添加的椰子油体积为发酵液体积的10％，混合搅拌时间为2小时。浓缩混合液的方法为板框过滤后收集菌体；菌体干燥的方法为常规物理烘干法。
用上述方法获得的蓝藻净化剂和所述蓝藻净化剂在养殖水体水环境改良中的用途也属于本发明的保护范围。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明采用复合微生态制剂分解蓝藻、降解藻毒素，相较于传统的化学杀藻产品，具有高效、环保，对养殖动物安全的优点；
(2)本发明蓝藻净化剂的制备采用高密度液态混菌发酵工艺。本技术发酵液以蓝藻粉为基质，降低生产成本的同时提高了制剂应用时对环境的快速适应性和有效性。通过混菌发酵联合分段控温技术，提高活菌数，发酵结束后添加10％体积椰子油，混合搅拌2h，提高芽孢率，增强菌株抗逆性，保证了产品质量的稳定性；
(3)本发明蓝藻净化剂可有效去除蓝藻，降解蓝藻毒素，操作简单，成本低廉，易于推广应用。
本发明的详细内容可通过后述的说明及所附图而得到。
附图说明
图1为本发明蓝藻净化剂液态混菌发酵方法的工艺路线图。
图2为不同温度控制方式下发酵液中活菌数增长状况比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料
本发明所用到的菌种均购于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)产品编号为：ACCC03320，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)产品编号为：ACCC03538。
实施例1蓝藻净化剂的制备
1.将购买来的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌株分别接种于装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到这两个菌种的种子液。
2.将步骤1所得的两种种子菌液均按液态发酵培养基重量的5％接种到同一液态发酵培养基进行混菌发酵培养。液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蓝藻粉5％、硫酸铵0.3％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水。按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.5。在发酵培养过程中采用分段控温法，起始pH值为7.5，转速为180r/min，罐压为0.04～0.06MPa，发酵时间为26h，在1～6h控温37℃，6h～20h控温30℃，20h至发酵结束控温35℃。
3.发酵完成后，向步骤2所得的发酵液中添加椰子油，添加的椰子油体积为发酵液体积的10％，混合搅拌均匀，混合搅拌时间为2小时，得到发酵混合液。
4.浓缩混合液，将菌体干燥，检测，包装，即得到蓝藻净化剂。
实施例2蓝藻净化剂的制备
1.将购买来的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌株分别接种于装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到这两个菌种的种子液。
2.将步骤1所得的两种种子菌液均按液态发酵培养基重量的8％接种到同一液态发酵培养基进行混菌发酵培养。液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蓝藻粉6％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水。按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.5。在发酵培养过程中采用分段控温法，起始pH值为7.5，转速为165r/min，罐压为0.04～0.06MPa，发酵时间为24h，在1～6h控温35℃，6h～20h控温32℃，20h至发酵结束控温33℃。
3.发酵完成后，向步骤2所得的发酵液中添加椰子油，添加的椰子油体积为发酵液体积的8％，混合搅拌均匀，混合搅拌时间为2小时，得到发酵混合液。
4.浓缩混合液，将菌体干燥，检测，包装，即得到蓝藻净化剂。
实施例3蓝藻净化剂的制备
1.将购买来的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌株分别接种于装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到这两个菌种的种子液。
2.将步骤1所得的两种种子菌液均按液态发酵培养基重量的3％接种到同一液态发酵培养基进行混菌发酵培养。液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蓝藻粉4％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水。按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.0。在发酵培养过程中采用分段控温法，起始pH值为7.0，转速为150r/min，罐压为0.04～0.06MPa，发酵时间为28h，在1～6h控温39℃，6h～20h控温28℃，20h至发酵结束控温37℃。
3.发酵完成后，向步骤2所得的发酵液中添加椰子油，添加的椰子油体积为发酵液体积的12％，混合搅拌均匀，混合搅拌时间为1小时，得到发酵混合液。
4.浓缩混合液，将菌体干燥，检测，包装，即得到蓝藻净化剂。
对照例 不添加椰子油的蓝藻净化剂的制备
1.将购买来的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌株分别接种于装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到这两个菌种的种子液。
2.将步骤1所得的两种种子菌液均按液态发酵培养基重量的5％接种到同一液态发酵培养基进行混菌发酵培养。液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蓝藻粉5％、硫酸铵0.3％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水。按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.5。在发酵培养过程中采用分段控温法，起始pH值为7.5，转速为180r/min，罐压为0.04～0.06MPa，发酵时间为26h，在1～6h控温37℃，6h～20h控温30℃，20h至发酵结束控温35℃。
3.发酵完成后浓缩发酵液，将菌体干燥，检测，包装，即得到不添加椰子油的蓝藻净化剂。
试验例1分段控温法与常规控温法发酵效果对比
1.试验方法
按照实施例1所述步骤1制备蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的种子液，在步骤2中，设置三组试验进行发酵效果对比，其中：
处理A：发酵全程控温30℃；
处理B：发酵全程控温37℃；
处理C：采用分段控温法，对温度进行分段控制，在1～6h控温37℃，6h～20h控温30℃，20h至发酵结束控温35℃。
发酵过程中每4h抽取每组的发酵液检测其活菌数，结果见图2；发酵结束时检测每组发酵液的活菌数，结果见表1。
2.试验结果
2.1发酵过程中活菌数增长状况比较
从图2可知，处理A全程控温在30℃的较低温度，前期菌数上升缓慢，随着进入对数增长期，菌数增长较快但高度有限并快速进入稳定期，菌数在发酵后期只能维持在一定的水平，无进一步的提高；处理B全程控温在37℃的较高温度，前期菌数上升快，但菌种老化也快，发酵中后期菌数增长速率不及处理A和处理C；处理C采用分段控温法分段控制温度，相较于处理A和处理B有明显优势，前期菌数上升快，同时中期可实现高速率的对数增长，发酵后期菌数还有缓慢的提高。
2.2不同温度控制方式下发酵液中活菌数的比较
表1不同温度控制方式下发酵液中活菌数比较
A组(30℃) B组(37℃) C组(分短控温)
活菌数(亿/mL) 79 70 114
表1数据显示，采用分段控温方式发酵液中菌数达到114亿/mL，明显优于全程固定温度30℃和37℃的常规控温方式所得的发酵液菌数。
试验例2不同后处理的芽孢率比较
1.试验方法
比较本发明实施例1、实施例2、实施例3和对照例，浓缩干燥前的发酵混合液的芽孢率，结果见表2。
芽孢率(％)＝(芽孢数/总菌数)×100％
检测培养基为牛肉膏蛋白胨培养基
2.试验结果
表2为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对照例，浓缩干燥前的发酵混合液的芽孢率比较结果。
表2不同后处理的芽孢率比较
实施例1 实施例2 实施例3 对照例
活菌数(亿/ml) 114 108 105 114
芽孢率(％) 99.8 98.4 98.5 81.3
如表2所示，实施例1、实施例2、实施例3的芽孢率高于对照例20％以上，表明发酵完成后，向发酵液中添加椰子油，混合搅拌均匀，可明显提高发酵液的芽孢率，增强菌株抗逆性，保证产品质量的稳定性。
试验例3本发明在实际养殖池塘中的应用
本试验于2020年8月20日-2020年9月9日在武汉市江夏区保福乡多福科技农庄养殖场进行。夏季8、9月份气温高、养殖进入中后期阶段，池塘积累了较多残余饲料和***物，水体富营养化严重，是蓝藻的高发季。试验挑选了4个蓝藻情况比较严重的草鱼养殖池塘A、B、C和D，这4个池塘水面都有大片蓝藻漂浮，池水老化发黑，经检测4个池塘蓝藻细胞数均超过9×105cell/mL，微囊藻毒素(简称“MC”)含量均超过0.2μg/L。
对其中池塘A作投施实施例1(蓝藻净化剂)处理，于试验开始当天水样采集完后全池泼洒，用量为200g/亩·米；池塘B作投施对照例(不添加椰子油的蓝藻净化剂)处理，于试验开始当天水样采集完后全池泼洒，用量为200g/亩·米；池塘C按常规处理蓝藻的方式在下风塘边局部泼洒硫酸铜杀藻，2天后换掉1/3池水；池塘D为不做处理的对照。试验期间，各池均不再投施其他投入品，只进行正常投喂和管理，每隔5天采样1次，检测水体中蓝藻细胞数量和MC含量的变化情况，结果见表3：
表3蓝藻细胞数量和MC含量的变化情况
Figure BSA0000232072440000081
通过表3可以看到，试验期间，各池塘的各项指标变化如下：
池塘A投施了本专利蓝藻净化剂后，蓝藻数量由92006cell/mL逐渐降到1057cell/mL，MC含量由0.229μg/L逐渐降到0.002μg/L，去除率分别达到98.85％和99.12％，且能持续控制蓝藻的繁殖，防治蓝藻再度爆发。
池塘B投施不添加椰子油的蓝藻净化剂后，蓝藻数量由91893cell/mL逐渐降到23547cell/mL，MC含量由0.217μg/L逐渐降到0.058μg/L，去除率分别为74.38％和73.27％，去除蓝藻和MC效果明显，但略差于本专利蓝藻净化剂。
池塘C投施硫酸铜后，蓝藻数量迅速下降到极低的水平，10天后，蓝藻又再度快速生长形成优势，蓝藻数量和MC含量较处理前不降反升，养殖环境更加恶化。
池塘D不做任何处理，蓝藻数量和MC含量仍在不断升高。
以上详描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，本发明的技术构思内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蓝藻净化剂的制备方法，包括如下步骤：
(a)制备蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的种子液；
(b)将上述两个菌种的种子液接入同一液态发酵培养基进行发酵培养，在发酵培养过程中采用分段控温法，发酵前期、中期和后期使用不同的温度进行发酵，在发酵前期发酵温度较高，在发酵中期发酵温度较低，在发酵后期发酵温度调高；
(c)发酵完成后，向步骤(b)所得的发酵液中添加椰子油，混合搅拌均匀，得到发酵混合液，浓缩混合液，将菌体干燥，检测，包装，即得到蓝藻净化剂。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(b)中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌液的接种量均为液态发酵培养基重量的3～8％；
所述发酵培养条件为：起始pH为7.0～7.5，转速为150～180r/min，罐压为0.04-0.06MPa，发酵时间为24～28h，在1～6h控温35～39℃，6h～20h控温28～32℃，20h至发酵结束控温33～37℃。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(b)中液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比计，蓝藻粉4～6％、硫酸铵0.2～0.5％、磷酸氢二钾0.1～0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水。按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.0～7.5。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(c)中发酵完成后向发酵液中添加的椰子油体积为发酵液体积的8～12％，混合搅拌时间为1～2小时。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(c)中浓缩混合液的方法为板框过滤后收集菌体；菌体干燥的方法为常规物理烘干法。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述步骤(b)中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的接种量均为液态发酵培养基重量的5％；
所述发酵培养条件为：起始pH值为7.5，转速为180r/min，罐压为0.04～0.06MPa，发酵时间为26h，在1～6h控温37℃，6h～20h控温30℃，20h至发酵结束控温35℃。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述步骤(b)中液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蓝藻粉5％、硫酸铵0.3％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.05％、硫酸锰0.01％、氯化钠0.01％，余量为水。按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.5。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述步骤(c)中发酵完成后向发酵液中添加的椰子油体积为发酵液体积的10％，混合搅拌时间为2小时。
9.按照权利要求1～8任何一项所述方法获得的蓝藻净化剂。
10.按照权利要求9所述的蓝藻净化剂在养殖水体水环境改良中的用途。
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