CN114835789B - 小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP-7A及其编码基因与应用 - Google Patents

小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP-7A及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP‑7A及其编码基因与应用。本发明从小麦品种百农207中克隆得到的一个新的GLP基因，将其命名为TaGLP‑7A。本发明通过构建用于沉默小麦中TaGLP‑7A基因的大麦条纹花叶病毒诱导性载体，降低TaGLP‑7A基因的表达，得到沉默TaGLP‑7A小麦植株，沉默TaGLP‑7A小麦接种白粉病菌后，白粉病抗性明显降低。而且，本发明进一步构建过表达TaGLP‑7A小麦稳定遗传转化植株，过表达TaGLP‑7A小麦植株的白粉病抗性水平得到显著提高，由此说明TaGLP‑7A在感病小麦植株中的表达量提高后，可显著提高感病小麦植株的白粉病抗性，因此，该基因可用于利用基因工程手段培育抗白粉病小麦。

Description

小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP-7A及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP-7A及其编码基因与应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是人类食物热量的主要来源，中国是小麦种植和产量第一大国，其在保障国内粮食安全中发挥着重要作用。小麦白粉病是由活体营养专性寄生真菌小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp.Tritici)引起的一种世界性病害，通常能导致13％-34％的产量损失，在抽穗和灌浆期发病严重时会导致50％的产量损失，在一些极端感病情况下会导致叶片干枯，甚至植株死亡。随着病菌毒力结构变异、气候变化和某些耕作方式的推行，使中国冬麦区小麦白粉病发病比例逐年增加，并有东扩北移的趋势。
培育抗性品种是减少小麦白粉病损失最经济有效和环境友好的方法之一，中国自上世纪抗白粉病育种以来仅Pm2、Pm3、Pm4、Pm6、Pm8、Pm21等少部分抗病基因曾在中国小麦生产上得到大面积应用，而且大部分小种专化抗病基因的抗性已陆续被新的毒性小种所克服，逐渐失去了在生产上的应用价值，导致实际生产中广泛应用的广谱抗白粉病基因并不多。因此，挖掘新的持久广谱高抗基因，探索小麦抗白粉病育种的新途径来提高小麦对白粉病的持久广谱抗性迫在眉睫。
类萌发素蛋白(germin-like protein，GLPs)属于Cupin超家族中的成员，常由两个外显子和一个内含子组成，编码蛋白约包含220个氨基酸，并且在C端含有保守的Cupin结构域。GLPs在植物防御应答反应中起重要作用，部分GLPs具有草酸氧化酶(OXO)或超氧化物歧化酶(SOD)活性，它们催化草酸等产生的H2O2会促进病原菌侵染部位细胞壁的交联，H2O2作为一种重要的胞内信号还可以激活一系列植物防御相关的信号转导途径，阻止病原菌的入侵。研究表明，花生AhGLP对黄曲霉、花叶病和锈病等胁迫均表现出独特的响应模式；陆地棉中的GhABP19，在棉花对黄萎病的抗性调节中起着重要作用；过表达OsGLP2-1的水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强。以上研究表明GLP类基因在植物抗病方面发挥着重要作用，但是目前在小麦白粉病研究中该类基因的克隆及功能研究相关报道较少。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP-7A及其编码基因与应用。
第一方面，本发明提供了一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，来源于麦类小麦属(Triticum aestivum L.)，将其命名为TaGLP-7A，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C段连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.2由212个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个核苷酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
第二方面，本发明提供了一种编码TaGLP-7A蛋白质的核酸分子。
所述核酸分子的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
第三方面，本发明提供了含有上述第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
第三方面，本发明提供上述第一方面所述蛋白质或上述第二方面所述核酸分子或上述第三方面所述重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒的新用途。
本发明提供了上述第一方面所述TaGLP-7A蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在调控植物白粉病抗性中的应用。
本发明还提供了上述第一方面所述TaGLP-7A蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在培育白粉病抗性降低的转基因植物中的应用。
本发明还提供了上述第一方面所述TaGLP-7A蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在白粉病抗性提高的转基因植物中的应用。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可以为拟南芥(Arabidopsis thaliana)，所述单子叶植物可以为小麦(Triticum aestivum L.)、玉米等。
第四方面，本发明提供一种培育白粉病抗性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育白粉病抗性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中TaGLP-7A蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性高于所述受体植物。
上述方法中，所述提高受体植物中TaGLP-7A蛋白质的表达量和/或活性的方法为：在受体植物中过表达TaGLP-7A蛋白质。
上述方法中，所述过表达的方法为将所述TaGLP-7A蛋白质的编码基因导入受体植物。优选地，所述TaGLP-7A蛋白质的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
根据上述的方法，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥(Arabidopsis thaliana)，所述单子叶植物具体可为小麦(Triticumaestivum L.)、玉米等。
第五方面，本发明提供一种培育白粉病抗性降低的转基因植物的方法。
本发明提供的培育白粉病抗性降低的转基因植物的方法包括抑制受体植物中TaGLP-7A蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性低于所述受体植物。
上述方法中，所述抑制受体植物中TaGLP-7A蛋白质的表达量和/或活性的方法为：将抑制TaGLP-7A蛋白质表达的物质导入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的白粉病抗性低于所述受体植物。
根据上述的方法，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥(Arabidopsis thaliana)，所述单子叶植物具体可为小麦(Triticumaestivum L.)、玉米等。
本发明取得的积极有益效果为：
本发明从小麦品种百农207中克隆得到具有Cupin结构域的类萌发素基因，将其命名为TaGLP-7A，并构建了用于沉默小麦中TaGLP-7A基因的病毒诱导性载体，降低TaGLP-7A基因的表达，得到沉默TaGLP-7A小麦，沉默TaGLP-7A小麦接种白粉病菌后，小麦植株显现明显的白粉病抗性降低表型，说明通过沉默手段来抑制小麦中TaGLP-7A基因在植物中的表达，可以降低小麦对白粉病的抗性。而且，本发明进一步通过基因枪法轰击普通小麦百农207幼胚获得稳定过表达TaGLP-7A的转基因株系，对过表达TaGLP-7A的转基因株系的T1代植株进行白粉病抗性鉴定，发现过表达TaGLP-7A能显著提高转基因株系对小麦白粉病的抗病性。以上研究结果表明，TaGLP-7A基因正向调控小麦白粉病抗性，在小麦中过表达TaGLP-7A基因可提高小麦对于白粉病的抗性。
附图说明
图1为百农207接种小麦白粉菌后不同时间点TaGLP-7A基因表达分析；其中横坐标代表利用小麦白粉菌混合菌株侵染百农207后的不同时间点(h:hours postinoculation)；纵坐标代表接种叶片TaGLP-7A基因相对表达量；
图2为沉默TaGLP-7A小麦中TaGLP-7A基因的表达量检测结果图；其中，CK表示侵染BSMV:γ空载对照小麦植株；1和2均表示侵染BSMV:γ-TaGLP-7A小麦植株；
图3为VIGS沉默小麦百农207基因产生的表型。其中，BSMV:γ和BSMV:TaGLP-7A分别表示侵染BSMV:γ空载对照和BSMV:γ-TaGLP-7A植株叶片接种白粉菌的表型；
图4为TaGLP-7A过表达载体PBI220:TaGLP-7A的图谱结构示意图；
图5为PBI220:TaGLP-7A转基因植株T0代PCR鉴定；泳道1为Marker:DL2000 DNA标准分子量；泳道2质粒:PBI220:TaGLP-7A阳性对照；泳道3受体百农207阴性对照；泳道4水对照；泳道5TaGLP-7A-T0-42阴性对照；泳道6、7、8分别是TaGLP-7A-T0-OE1、TaGLP-7A-T0-OE2、TaGLP-7A-T0-OE3阳性转基因植株的扩增结果；
图6为TaGLP-7A基因在TaGLP-7A-T1-OE1、TaGLP-7A-T1-OE2、TaGLP-7A-T1-OE3转基因阳性株系叶片中的表达分析；其中qRT-PCR的数值是由TaTubulin作为内参相对受体材料WT(小麦)的表达量，CK代表转基因阴性对照TaGLP-T1-42；**表示通过one-way ANOVA LSD方法进行的显著性差异分析(P<0.01)；
图7为TaGLP-7A转化百农207的T1代阳性植株的白粉病抗性鉴定结果；其中，T1-TaGLP-OE1表示TaGLP-7A阳性株系T1-OE1株系抗性鉴定；T1-TaGLP-7A-OE2表示TaGLP-7A阳性株系T1-OE2株系抗性鉴定；T1-TaGLP-7A-OE3表示TaGLP-7A阳性株系T1-OE3株系抗性鉴定；Negative表示转基因阴性对照株系抗性鉴定。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例一：TaGLP-7A基因的克隆
1、cDNA的获得
以百农207(百农207是河南科技学院通过传统育种以周麦16/百农64杂交选育而来的集丰产性、优质性、抗病性和广适性等多种优良性状于一体的优良品种，百农207在苗期对白粉病表现高感，成株期中抗)经白粉菌诱导24h的叶片为原料，按植物RNA提取试剂盒(Vazyme)的说明书所示步骤提取小麦叶片总RNA。将得到的RNA，以带polyT的引物进行反转录获得cDNA。
2、PCR扩增
以步骤1获得的cDNA为模板，根据TraesCS7A02G178300.1转录本序列设计的引物P1和P2为引物，用高保真酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，引物序列如下：
引物P1：5’-CAGTAGCAAGCCATGGCCAA-3’；
引物P2：5’-GAACTGCACAATTAGCCGCTGC-3’。
上述PCR扩增反应条件：95℃5min；然后95℃15s，56℃15s，72℃1min，32个循环；最后72℃5min。
3、电泳和测序
将上述步骤2获得的PCR扩增产物连接到pMD-19T载体(TaKaRa)上用于测序，通过DNAman软件对测序结果进行拼接，获得了TaGLP-7A基因的全长，将其基因命名为TaGLP-7A，TaGLP-7A基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例二：TaGLP-7A在百农207中的表达分析
1、实验方法：
取普通小麦材料百农207的种子，在室温下用清水浸泡24小时，种子吸涨后倒掉液体，在室温下保持湿润24h，露白后种于盆钵中。在18℃/10h,22℃/14h，湿度为70％的光照培养箱中生长。培养至2叶一心期，用新鲜的白粉菌孢子侵染处理，分别取侵染处理0h、1h、24h、48h的小麦幼苗叶片在液氮中速冻，每个时间点剪取3株植株叶片。将上述叶片材料分别进行研磨，提取总RNA，用试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)(Vazyme)进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，利用引物P3(CAACACCAGCAACCTCATCA)和引物P4(GGTGACGAAGAGGAGCTCAG)扩增TaGLP-7A片段，以TaTubulin内参引物扩增Tubulin片段，分析TaGLP-7A的表达情况。
PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(Roche,德国)上扩增并检测荧光。20uLPCR反应体系中含2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增反应条件为：95℃5分钟，然后95℃15秒、60℃20秒，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用sigmaplot14软件进行分析。
2、实验结果
实时荧光定量PCR的检测结果如图1所示。由图1可知，在小麦百农207中，TaGLP-7A受白粉菌诱导后24h显著上调表达，48h后恢复到原来表达水平。由此说明，TaGLP-7A基因表达能响应白粉菌诱导，当白粉病侵染时TaGLP-7A基因表达量升高。
实施例三：沉默TaGLP-7A小麦的获得及其白粉病抗性研究
1、基因沉默片段的获得：
以含有TaGLP-7A的ORF序列的pMD-18T载体为模板，采用引物P5和P6(P5和P6带有SmaI的酶切位点和15bp与载体互补序列)进行PCR扩增，得到片段长度为248bp的目的基因片段，将其记作TaGLP-7A(VIGS)，用于构建VIGS沉默载体。
其中，上述引物P5和P6的核苷酸序列如下：
P5：5’-TAGCTGAGCGGCCGCCCCGGGGGAACACCATGATGTCGCCCT-3’；
P6：5’-TAGCTGATTAATTAACCCGGGACACCAGCAACCTCATCAAGGC-3’。
PCR扩增反应体系为：1μL质粒模板(30ng/μL)，2μL上游引物P5，2μL下游引物P6，25μL PCR mix，加水至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，30个循环，72℃再延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带后回收。
2、BSMV重组病毒载体的构建：
按照常规分子生物学方法，将上述步骤1获得的沉默片段通过同源重组的方法将TaGLP-7A(VIGS)反向***BSMV-VIGS病毒载体γ的Sma I酶切位点间，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ的其他序列不变，得到重组载体γ-TaGLP-7A。
3、BSMV-VIGS载体***：
BSMV-VIGS病毒载体α、β和γ载体共同构成病毒载体***BSMV:γ。
BSMV-VIGS病毒载体α、β和重组载体γ-TaGLP-7A共同构成可沉默TaGLP-7A基因的病毒沉默载体***BSMV:γ-TaGLP-7A。
BSMV-VIGS病毒载体α、β和载体γ-PDS共同构成可沉默TaPDS基因的病毒沉默载体***BSMV:γ-PDS，其中γ-PDS来源于Scofield Laboratory(Scofield et al.2005)，其包含185bp的大麦八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的185bp保守片段，可用于基因沉默的阳性对照，该基因沉默后植株叶片出现白化现象，可直观检测VIGS***的沉默是否有效。
4、BSMV体外转录：
(1)载体的线性化
用MluⅠ酶切BSMV病毒载体α链、γ链、重组载体γ-TaGLP-7A和重组载体γ-PDS，用SpeⅠ酶切BSMV病毒载体β链，分别得到线性化质粒。
(2)以上述步骤(1)获得的线性化质粒为模板进行体外转录，分别得到体外转录成RNA的病毒载体α、β、γ、γ-TaGLP-7A和γ-PDS。体外转录反应按照mMESSAGEmMACHINE T7in vitro transcription kit(Invitrogen)说明书进行操作。转录反应体系和条件分别是：反应总体系10.0μL，包括线性化质粒3μL，10X Reaction Buffer 1μL，2x NTP/CAP 5μL，Enzyme Mix 1μL，在PCR仪中37℃反应2h，转录产物至-80℃保存备用。
5、小麦植株的培养和BSMV接种
选取饱满的百农207种子，至于培养皿中吸涨吸水一天后，倒掉培养皿中的水并冲洗干净，保持种子湿润一天，待种子露白后选取长势一致的小麦种子播种于盆钵中。播种后的小麦置于光照培养箱中生长，温度为12℃/10℃，光照时间为14h光照/10小时黑暗。培养一段时间至小麦长至两叶一心，且第二片叶子与第一片叶子一致时，筛选生长一致的小麦百农207。接种病毒前给小麦浇足水，采用摩擦接种的方式将BSMV:γ-TaGLP-7A重组病毒载体溶液涂抹于小麦的第二片叶片上。接种后的小麦置于23℃的培养箱中，保持黑暗培养24小时，24小时后植株转成23℃，14h光照/10小时黑暗条件下生长，得到侵染BSMV:γ-TaGLP-7A植株(即为沉默TaGLP-7A基因的小麦植株)。
同时，部分植株接种BSMV:γ-PDS病毒载体溶液，得到转BSMV:γ-PDS对照植株，部分植株接种BSMV:γ病毒载体溶液，得到转BSMV:γ空载对照植株。
上述BSMV:γ-TaGLP-7A重组病毒载体溶液是将体外转录产物按照10μLα、10μLβ、10μLγ-TaGLP-7A和225μL FES Buffer(0.1M glycine,0.06M K2HP04buffer containing1％sodium pyrophosphate,1％macaloid,1％celite；pH to 8.5-9.0 with phosphoricacid)的比例混合得到的溶液。
上述BSMV:γ-PDS病毒载体溶液是将体外转录产物按照10μLα、10μLβ、10μLγ-PDS和225μL FES Buffer的比例混合得到的溶液。
上述BSMV:γ病毒载体溶液是将体外转录产物按照10μLα、10μLβ、10μLγ和225μLFES Buffer的比例混合得到的。
6、沉默TaGLP-7A小麦的鉴定
本实验在涂抹病毒载体后14天左右，接种BSMV:γ-PDS病毒载体溶液阳性对照小麦的第4叶出现PDS白化表型，表明该时期和对应叶龄的小麦叶片中基因已经被沉默。由此说明，BSMV-VIGS***可成功应用于小麦品种百农207的基因沉默功能研究。
为了进一步验证BSMV-VIGS***沉默TaGLP-7A基因的效果，利用荧光定量PCR对其表达量进行了检测，具体检测方法如下：将涂抹病毒14天侵染BSMV:γ-TaGLP-7A植株，侵染BSMV:γ空载对照植株，剪取大麦条纹花叶病毒症状明显的的第四叶子提取总RNA，反转录后通过实时荧光定量PCR检测TaGLP-7A基因的相对表达量。以TaTubulin为内参基因，通过2-ΔΔCt方法计算相对表达量。检测表达量所用引物同实施例二。
TaGLP-7A基因的相对表达量的检测结果如图2所示。由图2可知，侵染BSMV:γ-TaGLP-7A植株中TaGLP-7A基因的相对表达量较侵染BSMV:γ空载对照植株、极显著地降低了，说明本实验所选择的沉默序列是有效的。
7、沉默TaGLP-7A小麦的白粉病抗性分析
将有效沉默了TaGLP-7A基因的侵染BSMV:γ-TaGLP-7A植株、侵染BSMV:γ空载对照植株的第4叶的叶段置于6-BA培养基上，并接种新鲜的白粉菌孢子在22℃/18℃，14h光照/8小时黑暗条件下培养6天。6天后观察表型，其结果如图3所示。
由图3可知，侵染BSMV:γ空载对照植株在接种白粉菌后6天发病情况明显弱于侵染BSMV:γ-TaGLP-7A植株，在侵染BSMV:γ-TaGLP-7A植株叶片表面产生大量孢子堆，而对照叶片BSMV:γ产生少量孢子堆。表明在普通小麦百农207中沉默TaGLP-7A基因后削弱了百农207对白粉病的抗性。
实施例四：TaGLP过表达载体Pbi220:TaGLP-7A的构建
以含有TaGLP-7A的ORF序列的pMD-18T载体为模板，设计引物P7(GGAGAGAACACGGGGGATCCATGGCCAACGCAATGCTGCTC，下划线标记出的是BamHI识别碱基序列)和P8(AACGTCGTATGGGTAAGGCCTGCCGCTGCCGCCGAGCA，下划线标记出的是StuI识别碱基序列)进行PCR扩增；其中引物P7带有BamHI的酶切位点，引物P8带有StuI的酶切位点，回收PCR扩增片段。通过同源重组法将扩增产物***到经BamHI和StuI双酶切后的载体pBI220(Jefferson RA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6:3901-3907.)，将TaGLP-7A置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因TaGLP-7A克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:TaGLP-7A(其结构示意图如图4所示)。经测序验证，表明载体构建成功。
实施例五：过表达TaGLP-7A小麦植株获取
利用基因枪转化方法将上述实施例4构建的过表达pBI220:TaGLP-7A转入苗期感白粉病受体百农207小麦愈伤组织中，来获取过表达TaGLP-7A小麦植株。
具体的实验步骤为：
(1)挑取预培养7天约2000块百农207幼胚愈伤组织，在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理4–5小时；
(2)将携有目的基因TaGLP-7A的过表达载体pBI220:TaGLP-7A和携带有bar标记的pAHC 25载体通过基因枪轰击法共转化到百农207愈伤组织，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。
(3)将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周；
(4)将经步骤(3)处理后的愈伤组织转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)筛选培养2周；
(5)将经步骤(4)筛选得到的具有除草剂抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺1mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+KT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中。
(6)至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵。获得再生植株共80棵。
提取所有再生植株基因组DNA，对再生植株利用启动子内部引物P9(AGTGGAAAAGGAAGGTGGCT)和基因内部引物P10(CATGATGTCGCCCTTGTAGAGC)进行PCR扩增，以鉴定过表达TaGLP-7A的阳性植株。
PCR反应体系为：100ng基因组DNA模板，10μM的P9和P10各0.4μl；5μl 2×mix；3.2μl ddH2O。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃15s，59℃45s，72℃50s，26个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。经PCR扩增检测，3株再生植株可以扩增出目的条带，鉴定为阳性植株(记作T0代阳性植株)。图5所示为T0代部分阳性植株的筛选，包括T0-OE1、T0-OE2、T0-OE3。
实施例六：过表达TaGLP-7A小麦植株白粉病抗性鉴定
分别收获实施例五筛选得到的TaGLP-7A转基因T0代阳性植株T0-OE1、T0-OE2、T0-OE3的种子，并将收获的T0代阳性植株T0-OE1、T0-OE2、T0-OE3的种子种于盆钵，得到T1-OE1植株、T1-OE2植株和T1-OE3植株。在二叶一心期对3个鉴定出的阳性株系提取RNA进行qRT-PCR分析，具体实验方法同实施例二，结果表明发现TaGLP-7A阳性株系T1-OE1植株、T1-OE2植株和T1-OE3植株的表达水平显著高于阴性对照T1-42(图6)。在三叶期对T1-OE1植株、T1-OE2植株和T1-OE3植株在三叶一心期剪取第3叶的叶段置于6-BA培养基上，同时以感病受体百农207和转基因阴性植株为阴性为对照，并接种新鲜的白粉菌孢子在22℃/18℃，14h光照/8小时黑暗条件下培养6天。接种白粉菌孢子后6天，观察表型，其结果如图7示。
由图7可知，感病对照植株百农207和转基因阴性对照植株对白粉菌表现高感，叶片上布满白粉菌孢子堆；T1-OE1植株、T1-OE2植株和T1-OE3植株叶片上均只有少量的白粉菌孢子。由此说明，与未转化百农207和再生阴性株系相比，转基因T1代阳性植株(T1-OE1植株、T1-OE2植株和T1-OE3植株)白粉病抗性水平得到显著提高，T1-OE1植株、T1-OE2植株和T1-OE3植株三个株系均表现抗病。
以上鉴定结果表明：TaGLP-7A在感病小麦植株中的表达量提高后，可显著提高感病小麦植株的白粉病抗性，因此，该基因可用于利用基因工程手段培育抗白粉病小麦。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 小麦抗白粉病相关蛋白TaGLP-7A及其编码基因与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 1
atggccaacg caatgctgct ccccgtgctc atctccttcc tcgtcctgcc cttctccgcc 60
ctggccctga cccaggactt ctgcgtcgcc gacctgtcct gcagcgacac gccggccggg 120
tacccgtgca agaccggcgt cggcgcgggg gacttctact accacggcct cgccgccgcg 180
ggcaacacca gcaacctcat caaggcggcc gtgaccccgg ccttcgtcgg ccagttcccc 240
ggcgtgaacg ggctcggcat ctccgcggcg aggctcgaca tcgccgtggg cggcgtcgtg 300
ccgctgcaca cccacccggc cgcctctgag ctcctcttcg tcaccgaggg caccatcctg 360
gcgggcttca tcagctcctc ctccaacacc gtgtacacca agacgctcta caagggcgac 420
atcatggtgt tcccccaggg cctgctccac taccagtaca acggcggcgg ctcggcagcg 480
gtggcgctcg ttgcgttcag cggccccaac cccggcctgc agatcactga ctacgcgctc 540
ttcgccaaca acctgccgtc cgccgtcgtt gagaaggtca ccttcttgga cgacgcgcag 600
gtgaagaagc tcaagtccgt gctcggcggc agcggctaa 639
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 2
Met Ala Asn Ala Met Leu Leu Pro Val Leu Ile Ser Phe Leu Val Leu
1 5 10 15
Pro Phe Ser Ala Leu Ala Leu Thr Gln Asp Phe Cys Val Ala Asp Leu
20 25 30
Ser Cys Ser Asp Thr Pro Ala Gly Tyr Pro Cys Lys Thr Gly Val Gly
35 40 45
Ala Gly Asp Phe Tyr Tyr His Gly Leu Ala Ala Ala Gly Asn Thr Ser
50 55 60
Asn Leu Ile Lys Ala Ala Val Thr Pro Ala Phe Val Gly Gln Phe Pro
65 70 75 80
Gly Val Asn Gly Leu Gly Ile Ser Ala Ala Arg Leu Asp Ile Ala Val
85 90 95
Gly Gly Val Val Pro Leu His Thr His Pro Ala Ala Ser Glu Leu Leu
100 105 110
Phe Val Thr Glu Gly Thr Ile Leu Ala Gly Phe Ile Ser Ser Ser Ser
115 120 125
Asn Thr Val Tyr Thr Lys Thr Leu Tyr Lys Gly Asp Ile Met Val Phe
130 135 140
Pro Gln Gly Leu Leu His Tyr Gln Tyr Asn Gly Gly Gly Ser Ala Ala
145 150 155 160
Val Ala Leu Val Ala Phe Ser Gly Pro Asn Pro Gly Leu Gln Ile Thr
165 170 175
Asp Tyr Ala Leu Phe Ala Asn Asn Leu Pro Ser Ala Val Val Glu Lys
180 185 190
Val Thr Phe Leu Asp Asp Ala Gln Val Lys Lys Leu Lys Ser Val Leu
195 200 205
Gly Gly Ser Gly
210

Claims (4)

1.氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的蛋白质或编码所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物白粉病抗性中的应用；
或，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的蛋白质或编码所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌在培育白粉病抗性提高的转基因植物中的应用；
其中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为小麦。
2.一种培育白粉病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的白粉病抗性高于所述受体植物；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述植物为小麦。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提高受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为：在受体植物中过表达所述的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述过表达的方法为将所述蛋白质的编码基因导入受体植物。
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