CN114813686B - 一种基于NGQDs-MoS2@RGO结合适配体检测GP73的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs）和二硫化钼@还原性氧化石墨烯（MoS2@RGO）的荧光共振能量转移的GP73检测方法，以GP73适配体为识别探针，GP73适配体能够特异性识别和结合GP73蛋白，基于氮掺杂石墨烯量子点(NGQDs)‑GP73适配体和二硫化钼@还原性氧化石墨烯(MoS2@RGO)间的荧光共振能量转移原理，建立一种检测GP73的荧光适配体传感器，用以检测血清中GP73的含量。该方法检测方便，成本低廉，检测限满足检测标准。
Description
技术领域
本发明属于光学传感技术领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的GP73检测方法。
背景技术
高尔基体蛋白73（GP73）又称高尔基体II型跨膜蛋白，目前市场上常用的检测GP73的方法是酶联免疫吸附测定（ELISA），但是该方法存在价格昂贵、稳定性低以及步骤繁琐等问题。发明专利CN113533734A涉及一种磁微粒化学发光检测高尔基体73的试剂盒，包括磁微粒悬浮溶液，生物素化标记GP73抗体溶液，碱性磷酸酶标记高尔基体73抗体溶液，校准品、洗液和底物的溶液，其中，底物在酶的作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，由此可测得GP73浓度。发明专利CN113945713A公开了一种利用新型生物芯片检测GP73等肿瘤标记物的方法，满足了大规模样本检测的需求。两项专利技术还存在GP73的检测准确度低、成本高等缺点。
核酸适配体作为一种人工合出的单链寡核苷酸片段，具有合成容易、化学稳定性强且易于修饰的特点，对于目标物具有较强的特异性结合能力。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET），指在相异的荧光基团中，供体的发射光谱与受体的吸收光谱出现了重合叠加，经供体荧光波长激发而观察到受体基团发射的荧光，同时供体荧光基团自身的荧光强度衰减的现象。传统的荧光检测步骤繁琐、光稳定性差，实用性较低，使用耗时长。开发新的FRET传感体系用于肿瘤标记物检测是一种新的发展方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs）和二硫化钼@还原性氧化石墨烯（MoS2@RGO）的荧光共振能量转移的GP73检测方法，该方法能达到4.54 ng/mL的检测限。
为了解决该技术问题，采用NGQDs作为荧光物质，将氨基化GP73适配体（GP73Apt）与活化了羧基的NGQDs通过氨基键与羧基键脱水缩合进行结合，形成荧光标记的NGQDs-GP73Apt复合物。在NGQDs-GP73Apt溶液中加入MoS2@RGO溶液，NGQDs-GP73Apt复合物与MoS2@RGO通过范德华力结合在一起，发生荧光共振能量转移，使NGQDs-GP73Apt的荧光能量转移到了MoS2@RGO上，整个***的荧光强度就会变低；加入GP73蛋白后，由于GP73Apt的特异性，GP73会优先与NGQDs-GP73Apt结合，适配体结构改变，从MoS2@RGO底面分离，抑制了荧光共振能量转移，从而使NGQDs-GP73Apt的荧光得到恢复。根据反应体系中荧光强度恢复程度的变化，建立GP73浓度和NGQDs-GP73Apt的荧光强度变化的线性关系，实现了GP73灵敏度高、特异性强的定量检测。
本发明按照以下步骤进行：
步骤1：荧光共振供体NGQDs-GP73Apt的制备
NGQDs-GP73Apt的制备：量取NGQDs和氨基化的GP73Apt，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化NGQDs，然后将两者混合在振荡培养箱孵育一定时间，得到NGQDs-GP73Apt溶液。
步骤2：荧光共振能量转移的反应体系的构建
(1)MoS2@RGO的制备：称量石墨烯粉末，加入超纯水定容，放入超声波细胞破碎仪破碎一定时间，破碎后加入抗环血酸放置在搅拌器上搅拌一定时间得到RGO；称量二硫化钼粉末和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末，定容二硫化钼放入超声破碎仪破碎，破碎后将二硫化钼与PVP以及RGO混合在一起，搅拌一定时间，离心，取沉淀，干燥，得到MoS2@RGO；
(2)称量MoS2@RGO粉末，加入超纯水定容，得到MoS2@RGO溶液；
(3)将MoS2@RGO溶液和NGQDs-GP73Apt溶液进行混合，混匀后静置孵育一段时间，使NGQDs的荧光淬灭，形成NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET反应体系。用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，测量其390 nm处荧光强度，记作F0。
步骤3：GP73工作曲线的绘制
(1)将不同浓度的GP73溶液加入到NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET反应体系，在一定温度下孵育反应一段时间，检测310 nm处的峰值变化；用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，测量其390 nm处荧光强度，记作F1；
(2)用(F1-F0)/F0作为纵坐标，GP73浓度作为横坐标，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限。
步骤4：实际样品中GP73的检测
(1)将待测样品加入到步骤2中的NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET的反应体系，在一定温度下孵育反应一段时间，采用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，记录390 nm处的荧光强度；
(2)根据步骤3所得到的GP73的工作曲线，计算待测样品中GP73的浓度。
作为优选：
所述步骤1中GP73Apt的DNA序列为5′-TGG CCT GCA TCA TCG TCT TG-NH2-3′；
所述步骤1中GP73Apt浓度为1 μmol/L；
所述步骤1中NGQDs溶液的浓度为8 μg/mL；
所述步骤1中EDC浓度为1.0 mg/mL；
所述步骤1中活化时间为40 min，震荡箱孵育时间为1 h，此时的归一化强度高，并且物质表现出的荧光强度较好；
所述步骤2中石墨烯溶液和二硫化钼溶液浓度都为1.0 mg/mL；
所属步骤2中PVP与二硫化钼和石墨烯的质量比为5:1:1；
所述步骤2中石墨烯溶液和二硫化钼溶液破碎时间分别为2 h和1 h；
所述步骤2中石墨烯溶液搅拌时间为6 h；
所述步骤2中RGO和二硫化钼、PVP的混合溶液搅拌时间为12 h；
所述步骤2中MoS2@RGO溶液浓度为0.8 mg/mL；
所述步骤2中MoS2@RGO溶液和NGQDs-GP73Apt溶液的体积比为1:1；
所述步骤2中孵育温度为25°C，孵育时间为20分钟，此时物质已经进入稳定状态，可进行下一步实验；
所述步骤2、步骤3和步骤4中荧光分光光度计的激发波长为310 nm，发射波长390nm。
所述步骤3和步骤4中孵育温度为25°C，孵育时间为80分钟，此时FRET反应体系的荧光恢复效果最好。
其中，步骤1提供了一种发出蓝色荧光的NGQDs的荧光材料和NGQDs- GP73Apt探针，为步骤2提供荧光共振能量转移反应体系的荧光能量供体。步骤2提供MoS2@RGO材料，是荧光能量转移受体；利用NGQDs-GP73Apt中的核酸适配体碱基与MoS2@RGO通过范德华力和π=π共轭作用，使得NGQDs-GP73Apt和MoS2@RGO紧密接近，发生FRET现象，呈现出NGQDs-GP73Apt的荧光猝灭。步骤3当GP73导入NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO的FRET反应体系中，由于GP73Apt优先结合GP73并伴随其结构变化，极大地削弱了NGQDs-GP73Apt和MoS2@RGO之间的相互作用力。因此，NGQDs-GP73Apt与MoS2@RGO分离，FRET过程被抑制，从而使NGQDs-GP73Apt的荧光恢复。步骤3的GP73的工作曲线为步骤4的实际样本中GP73浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用NGQDs-GP73Apt和MoS2@RGO间的荧光共振能量转移原理建立一种GP73的检测方法。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本专利形成的荧光受体MoS2@RGO在GP73的检测上具有独特的功能和优势，MoS2@RGO对GP73适配体链的吸附能力强，能够有效吸附更多的适配体链，使得NGQDs的荧光强度有效淬灭，从而提高了其检测灵敏度及检测范围。此外，本专利选用适配体而非抗体来构建识别探针，其原因在于适配体比抗体更易被化学方法标记和修饰，这些处理有助于纳米粒子和其表面的功能化和以荧光共振能量转移原理为基础的荧光分析方法的构建。
2、该体系采用以GP73适配体为识别探针检测GP73的方法，这种生物探测方法具有背景干扰小的特点，能够有效提高检测的精确度，该方法的最低检测限为4.54 ng/mL。
附图说明
图1 基于NGQDs-MoS2@RGO的荧光传感器用于检测GP73的原理图；
图2 NGQDs和NGQDs-GP73Apt的荧光光谱图；
图3 A是MoS2@RGO的扫描电镜图；B是MoS2@RGO的X射线衍射光谱图；
图4 A是不同GP73浓度下NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET***的荧光恢复强度图；B是NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO荧光适配体传感器的荧光恢复强度((F1-F0)/F0)与GP73浓度的标准工作曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于NGQDs-MoS2@RGO的荧光共振能量转移结合适配体检测GP73的方法，检测原理见图1。MoS2@RGO为FRET反应体系的受体荧光基团； NGQDs-GP73Apt为FRET反应体系的供体荧光基团。二者共同构建了NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET反应体系。
未导入GP73时，由于NGQDs与MoS2@RGO之间存在π=π共轭，这会导致NGQDs跟MoS2@RGO之间的距离小于10 nm，FRET反应可以发生，NGQDs-GP73Apt即供体荧光基团表现为荧光猝灭的状态；当GP73被导入后， GP73适配体与GP73特异性结合，NGQDs-GP73Apt与MoS2@RGO之间的π=π共轭被中止，所构建的FRET***也被中止，供体荧光基团在310 nm的激发波长下的荧光信号恢复，导入GP73的浓度越高，荧光恢复效果越好。由此便建立了一种GP73蛋白的检测方法，通过荧光分光光度计测量荧光强度的变化，可以有效的对GP73蛋白实现定量分析。实施步骤如下：
1、NGQDs-GP73Apt的制备
（1）用电子天平精密称取10 mg NGQDs固体，并用10 mL pH=7.4 PBS缓冲液将其溶解，充分震荡，梯度稀释至8 μg/mL，对该浓度的NGQDs溶液进行荧光测量，记录此时的荧光强度。
（2）取100 μL NGQDs（8 μg/mL）放入30 μL EDC（1 mg/mL），超声活化处理40 min，这是为了激活NQGDs上的羧基。
（3）取上述活化过后的NGQDs溶液100 μL与等量氨基修饰的GP73适配体（1.5 μM）充分混合放入震荡培养箱，25℃的环境温度下震荡孵育1 h，此时溶液中的NGQDs和GP73适配体将进行缩合反应并最终得到NGQDs-GP73Apt，用荧光分光光度计测量记录孵育完成后该溶液的荧光强度。图2是NGQDs和NGQDs-GP73Apt的荧光光谱图，二者的荧光光谱基本一致，NGQDs-GP73Apt的荧光强度较NGQDs的荧光强度大，说明了NGQDs与GP73Apt已成功连接。
、荧光共振能量转移的反应体系的构建
（1）用电子天平精密称取20 mg氧化石墨烯放入50 mL烧杯中，随后在烧杯中加入20 mL超纯水，充分混合后放入超声波细胞破碎仪超声破碎2 h。然后精密称取42 mg抗环血酸，加到破碎后的溶液中，充分混匀，添加转子后在烧杯口盖上保鲜膜。处理完成后将其放置在数显恒温搅拌器上搅拌6 h，由此将GO还原成RGO。
（2）用电子天平精密称取20 mg二硫化钼和100 mg PVP，将二硫化钼放入50 mL烧杯中，随后在烧杯中加入20 mL超纯水，充分混合后放入超声波细胞破碎仪超声破碎1 h。1h之后，将破碎后的二硫化钼和100 mg PVP放入RGO溶液中，搅拌器调至合适转速，搅拌过夜，得到MoS2@RGO复合物溶液，多次离心取下层沉淀物放入电热鼓风干燥箱之中，80 ℃干燥6 h，得到MoS2@RGO固体。图3B是MoS2@RGO的XRD分析图，该图证明了材料的成功合成，图3A是MoS2@RGO的扫描电镜图。
（3）用电子天平精密称取5 mg MoS2@RGO溶解于5 mL超纯水中，用振荡器充分震荡均匀，之后用移液枪取300 μL溶解后的溶液和300 μL NGQDs-GP73Apt溶液，加入到300 μLpH为7.0的混合缓冲溶液中，混匀后在25 ℃下孵育20 min，得到NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGOFERT***。用荧光分光光度计测量，固定激发波长为310 nm，测量其在390 nm处的荧光强度，记作F0。
、GP73工作曲线的绘制
将步骤2中测定了荧光强度后的NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FERT***均匀分成9组，然后按浓度梯度加入50 μL GP73蛋白溶液（0 ng/mL ，5 ng/mL，8 ng/mL，10 ng/mL ，20ng/mL，40 ng/mL，60 ng/mL，80 ng/mL，100 ng/mL），震荡混和均匀后在25 ℃下反应80分钟，用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，测定其在390 nm处的荧光强度，记作F1。不同GP73浓度下NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FERT***的荧光光谱图见图4A，可看出NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO荧光适配体传感器的荧光恢复强度((F1-F0)/F0)与GP73浓度的呈正相关。当GP73蛋白浓度范围为5.0 ng/mL~100 ng/mL时，NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO荧光适配体传感器的荧光恢复值与GP73浓度之间的关系是呈线性的，工作曲线为Y=0.00156X+0.00141（其中Y指荧光恢复强度，X是GP73蛋白的浓度），相关系数R2=0.99756，NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO荧光适配体传感器的最低检测限为4.54 ng/mL。
、实际血清样本中GP73的检测
将浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、60 ng/mL的GP73标准溶液与正常人血清样本以1:1的比例充分混合，制成混合液。然后用制备好的NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO 荧光适配体传感器检测混合液的荧光恢复强度值。根据步骤3所得到的工作曲线Y=0.00156X+0.00141，计算可得到对应的实际血清样本中GP73的浓度，检测结果见表1。可以得出，NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO荧光适配体传感器回收率为97.21%-100.83%，而相对标准偏差在0.04%-0.53%之间，在肝癌的临床诊断领域有潜在应用。
。
Claims (5)
1.一种非诊断目的氮掺杂石墨烯量子点NGQDs和二硫化钼@还原性氧化石墨烯MoS2@RGO的荧光共振能量转移的GP73检测方法，按以下步骤进行：
步骤1：荧光共振供体NGQDs-GP73Apt的制备
取氮掺杂石墨烯量子点NGQDs和氨基化的高尔基体蛋白73适配体GP73Apt，用EDC活化NGQDs，将两者混合在振荡培养箱孵育，得到NGQDs-GP73Apt溶液；
步骤2：荧光共振能量转移的反应体系的构建
（1）二硫化钼@还原性氧化石墨烯MoS2@RGO的制备：称取石墨烯粉末，加入超纯水定容，破碎；加入抗环血酸，搅拌，得到RGO溶液；
称量二硫化钼粉末和聚乙烯吡咯烷酮PVP粉末，定容；二硫化钼破碎，破碎后将二硫化钼与PVP以及RGO混合，搅拌，离心；取沉淀，干燥，得到MoS2@RGO粉末；
称量MoS2@RGO粉末，加入超纯水定容，得到MoS2@RGO溶液；
（3）将MoS2@RGO溶液和NGQDs-GP73Apt溶液混合，静置孵育，使NGQDs的荧光淬灭，形成NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET反应体系；
用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，测量其390 nm处荧光强度，记作F0；
步骤3：GP73工作曲线的绘制
（1）将不同浓度的GP73溶液加入到NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET反应体系，孵育，检测310 nm处的峰值变化；用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，测量其390 nm处荧光强度，记作F1；
（2）用(F1-F0)/F0作为纵坐标，GP73浓度作为横坐标，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤4：实际样品中GP73的检测
（1）将待测样品加入到步骤2中的NGQDs-GP73Apt-MoS2@RGO FRET的反应体系，孵育；采用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为310 nm，记录390 nm处的荧光强度；
（2）根据步骤3所得到的GP73的工作曲线，计算待测样品中GP73的浓度。
2.按照权利要求1所述的GP73检测方法，其特征在于：步骤1中所述GP73Apt浓度为 1 μM，NGQDs溶液的浓度为8 μg/mL；EDC浓度为1.0 mg/mL，活化时间为40 min；震荡箱孵育时间为1 h。
3.按照权利要求1所述的GP73检测方法，其特征在于：步骤2中所述石墨烯溶液浓度为1.0 mg/mL，破碎时间为2 h；所述的二硫化钼溶液浓度为1.0 mg/mL，破碎时间为1 h；所述PVP与二硫化钼和石墨烯的质量比为5:1:1，所述石墨烯溶液搅拌时间为6 h，RGO和二硫化钼、PVP的混合溶液搅拌时间为12 h；所述MoS2@RGO溶液浓度为0.8 mg/mL，和NGQDs-GP73Apt溶液的体积比为1:1。
4.按照权利要求1所述的GP73检测方法，其特征在于：步骤2中所述孵育温度为25°C，孵育时间为20分钟。
5.按照权利要求1所述的GP73检测方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述孵育温度为25°C，孵育时间为80分钟。
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